用于肝癌光熱治療和核磁影像的antiGPC3-PB NPs及其制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于肝癌光熱治療和核磁影像GPC3抗體修飾普魯士藍納米顆粒（antiGPC3-PB?NPs）及其制備方法。所述antiGPC3-PB?NPs由檸檬酸作為表面保護劑形成的普魯士藍納米顆粒核心，和在其表面通過EDC/NHS共價偶聯(lián)連接的GPC3抗體構(gòu)成。本發(fā)明antiGPC3-PB?NPs對肝癌細胞HepG2具有良好的靶向識別功能，有效地進入細胞內(nèi)部；同時對HepG2細胞具有優(yōu)秀的光熱殺傷功能，能夠用于肝癌細胞的光熱治療；具有良好的核磁共振造影成像功能，具有成為新一代靶向磁共振造影劑的潛力。
【專利說明】用于肝癌光熱治療和核磁影像的antiGPC3-PB NPs及其制備和應用
(-)【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于肝癌光熱治療和核磁影像GPC3抗體修飾普魯士藍納米顆粒(antiGPC3-PB NPs)及其制備方法和應用。
(二)【背景技術(shù)】
[0002]肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。據(jù)統(tǒng)計，全球每年新增肝癌患者約60萬，其致死率達到第3位，僅僅稍次于肺癌和胃癌。我國是原發(fā)性肝癌的主要發(fā)病國，每年新增發(fā)病人數(shù)約占全球55% ;在福建，肝癌位居所有惡性腫瘤死因第一位。肝癌治愈的關鍵是早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療。其中早期診斷是關鍵，即在患者出現(xiàn)臨床癥狀前或在癌癥發(fā)生浸潤前得以確診，從而得到及時治療，達到提高治愈率、降低死亡的目的。然而由于肝癌發(fā)病具有高度隱匿性，傳統(tǒng) 的診斷影像學因其主要以組織或者器官的性質(zhì)改變?yōu)榛A而使其應用具有很大的局限性，目前難以準確對肝癌進行早期診斷。
[0003]分子影像學技術(shù)可作為早期診斷的方法，利用它可以在臨床癥狀還未出現(xiàn)時就檢測到腫瘤的早期生物學特性。納米技術(shù)的發(fā)展為分子影像學提供了堅實的基礎，納米分子探針是實現(xiàn)這一技術(shù)的首要條件。其中，MRI分子探針已成功應用于細胞表面受體表達異常、細胞代謝異常、酶活性異常、細胞凋亡、腫瘤血管生成等病理過程的活體可視化檢測。目前在臨床上使用得較多的主要是基于元素GcUMn或Fe這三種納米探針，但由于它們在體內(nèi)容易釋放出相應的離子而表現(xiàn)出高毒性。
[0004]普魯士藍(Prussian blue)是一種歷史悠久的藍色染料，其制備過程非常簡單且價格便宜。美國食品與藥物管理局(FDA)于2003年批準將其作為治療銫和鉈輻射中毒的臨床用藥，它在人體內(nèi)的生物安全性和代謝途徑非?？煽俊hokouhimehr等研究證明普魯士藍納米粒子(PB NPs)可以作為一種新型的T1加權(quán)核磁共振分子探針，除此之外，GuangleiFu等又發(fā)現(xiàn)PB NPs具有良好的光熱轉(zhuǎn)換性能，可以用于腫瘤光熱治療(Photothermaltherapy, PTT)。與其他具有PTT功能的納米顆粒(如:石墨烯、金納米顆粒、碳納米管等)相t匕，PB NPs具有非常優(yōu)秀的光熱轉(zhuǎn)換效率，在很低的濃度且有近紅外光的照射下，就可以有效地殺傷HeLa腫瘤細胞，能夠用于腫瘤的光熱治療并且其制備過程“綠色”簡單。除此之外，已有研究表明，普魯士藍納米粒子可以通過胞吞等生物途徑被細胞攝取，其細胞相容性很好；在血清和模擬胃酸中的穩(wěn)定性很高，在生物體內(nèi)不會釋放游離的金屬離子和毒性HCN,不易產(chǎn)生活性氧等有害物質(zhì)。這些為普魯士藍納米粒子的進一步研究和應用奠定了一定的生物醫(yī)學基礎。
[0005]關于PB NPs的MRI功能和PTT功能分別有研究報道，但是目前關于具有腫瘤靶向能力特別是肝癌靶向PB NPs的研究仍然較為少見。實現(xiàn)對腫瘤的靶向治療不僅能夠特異、高效地殺傷腫瘤細胞，而且對腫瘤周圍的正常組織細胞不易產(chǎn)生毒副作用，因此靶向治療技術(shù)具有非常大的應用優(yōu)勢。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (glypican-3，GPC3)是一種細胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白(heparin sulfate proteoglycan, HSPG), GPC3基因在肝癌組織中高表達，而在正常肝組織不表達，有可能是目前發(fā)現(xiàn)的在AFP陰性肝癌中表達率最高的基因，因此GPC3成為肝癌組織的一個特異性靶點。
[0006]經(jīng)查找相關專利和文獻發(fā)現(xiàn)，目前還未見采用共價偶聯(lián)的方法將GPC3抗體連接到檸檬酸作為保護劑的PB NPs表面得到antiGPC3-PB NPs用于肝癌特異靶向的核磁共振造影成像和光熱治療的相關報道。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是克服普魯士藍納米顆粒在應用于肝癌腫瘤組織核磁共振造影成像和光熱治療時沒有特異靶向性缺點，提供一種將GPC3抗體作為靶向基團，通過共價偶聯(lián)技術(shù)合成出能夠特異靶向肝細胞癌、并具有核磁影像和光熱治療雙功能的antiGPC3-PBNPs及其制備方法和應用，并在細胞和動物水平研究其納米生物學效應，以期為肝癌的早期診斷與治療做出貢獻。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0009]用于肝癌光熱治療和核磁影像的GPC3抗體修飾普魯士藍納米顆粒(antiGPC3_PBNPs),由檸檬酸作為表面保護劑形成的普魯士藍納米顆粒核心，和在其表面通過EDC/NHS共價偶聯(lián)連接的GPC3抗體構(gòu)成。
[0010]所述antiGPC3-PB NPs核心是檸檬酸作為保護劑的普魯士藍納米顆粒，其表面具有大量的羧基集團，通過EDC/NHS共價偶聯(lián)的方法，將GPC3抗體連接到普魯士藍納米粒子表面，賦予了納米顆粒通過抗體-受體識別作用而具有了特異靶向到肝癌細胞的功能，此外，這種修飾作用不會改變普魯士藍納米顆粒的MRI造影成像和光熱轉(zhuǎn)換功能，因此，得到的antiGPC3-PB NPs能夠應用于肝癌的靶向核磁共振造影成像診斷和光熱治療。
[0011]具體的，所述納米顆粒為立方體結(jié)構(gòu)，粒徑20~25nm。研究表明，粒徑介于20~150nm之間的納米顆粒能夠有效地避免被機體清除機制所清除而更有效地到達靶組織，這是因為粒徑小于150nm的納米粒子更容易通過增強滲透滯留效應(Enhanced permeabilityand retention effect,EPR)和有效避開網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的清除作用而從血管中溢出進入腫瘤微環(huán)境。因此，制備的AntiGPC3-PB NPs具有合適的納米尺寸，在進入機體內(nèi)代謝過程中，更易在靶組織區(qū)域進行輸送和吸收。
[0012]優(yōu)選的，所述納米顆粒外還可包覆一層陰離子聚合物一聚天冬氨酸(PASP)保護層，具體可以利用陰離子聚合物一聚天冬氨酸(PASP)通過靜電相互作用對antiGP3-PB NPs進行包裹對顆粒進行保護，包裹后的顆粒到達腫瘤部位后PASP在微酸性條件下離解，裸露出來的antiGP3-PBNPs可通過受體介導作用迅速進入肝腫瘤細胞中。
[0013]本發(fā)明還涉及制備所述GPC3抗體修飾普魯士藍納米顆粒的方法，所述方法包括:
[0014](I)配制含200~300mM檸檬酸的0.8~1.5mM K4[Fe (CN)6]的水溶液，記為A液；
[0015](2)配制含200~300mM檸檬酸的0.8~1.5mM FeCl3的水溶液，記為B液；
[0016](3)于55~65°C (優(yōu)選60°C )下將等體積的A液緩慢滴加至B液中(A液中K4[Fe(CN)6]與B液中FeCl3的摩爾用量之比優(yōu)選為1:1)，不斷攪拌30~60min后，冷卻至室溫，離心、去離子水洗滌2~3次，取沉淀物50~60°C真空干燥得到檸檬酸修飾的普魯士藍納米粒子；
[0017](4)用PBS緩沖液溶解步驟(3)所得檸檬酸修飾的普魯士藍納米粒子使納米粒子濃度為200~300ppm，并調(diào)節(jié)pH為4.8~5.2，向此溶液中加入0.5~2.0mg/mL的EDC(1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和I~3mg/L的Sulfo-NHS (N-羥基硫代琥珀酰亞胺)，震蕩下室溫活化I~2h ;
[0018](5)向步驟(4)反應體系中加入GPC3抗體使抗體終濃度為8~11 μ g/mL,混合均勻，振蕩下室溫反應2~4小時后，置于4°C冰箱內(nèi)震蕩反應過夜，反應結(jié)束后調(diào)節(jié)混合體系pH至7.0，用PBS緩沖液離心洗滌2~3次，得到所述GPC3抗體修飾普魯士藍納米顆粒(antiGPC3-PB NPs)。制得的antiGPC3_PB NPs可加入PBS緩沖液重新分散均勻，配置成濃度為500ppm的antiGPC3-PB NPs溶液，置于4°C冰箱內(nèi)保存待用。具體的，所述方法可如下步驟進行:
[0019](I)配制 20mL 含 0.5mmol 朽1 檬酸的 1.0mM K4[Fe (CN) 6]水溶液,記為 A 液;
[0020](2)配制20mL含0.5mmol檸檬酸的1.0mM FeCl3水溶液，記為B液；
[0021](3)于60°C下將A液緩慢滴加至B液中，不斷攪拌30~60min后，冷卻至室溫，離心、去離子水洗滌2~3次，取沉淀物50°C真空干燥得到檸檬酸修飾的普魯士藍納米粒子；
[0022](4)用4.0mL PBS緩沖液溶解步驟(3)所得檸檬酸修飾的普魯士藍納米粒子使納米粒子濃度為250ppm，并調(diào)節(jié)pH為5.0,向此溶液中加入4.0mg的EDC和8.0mg的Sulfo-NHS，震蕩下室溫活化I~2h ;
[0023](5)向步驟(4)反 應體系中加入GPC3抗體使抗體終濃度為10.0 μ g/mL，混合均勻，振蕩下室溫反應2~4小時后，置于4°C冰箱內(nèi)震蕩反應過夜，反應結(jié)束后調(diào)節(jié)混合體系pH至7.0，用PBS緩沖液離心洗滌2~3次，得到所述GPC3抗體修飾普魯士藍納
[0024]米顆粒。
[0025]所述顆粒外包裹PASP保護層的具體方法如下:
[0026]向antiGPC3_PB NPs 溶液中加入等體積的 PASP 溶液(antiGPC3_PB NPs 與 PASP 溶液濃度之比為2:1)，充分搖勻后置于搖床上反應15~20min，用PBS緩沖液離心洗滌2~3次，棄上清液，得到PASP包裹的antiGP3-PB NPs。
[0027]本發(fā)明還涉及所述的GPC3抗體修飾普魯士藍納米顆粒在制備肝癌靶向的核磁共振成像造影劑和光熱治療藥物中的應用。
[0028]本發(fā)明antiGPC3_PB NPs靶向診療制劑可通過全身遞送(靜脈注射)，動脈內(nèi)，腫瘤內(nèi)，胃腸外，肺腔內(nèi)，局部給藥等遞送形式進入體內(nèi)。可以依據(jù)肝癌細胞類型、組織及肝癌患者的一般醫(yī)學狀況，以各種不同形式的單位劑量進行給藥。例如，分別用于核磁共振造影成像和光熱治療的藥品準確劑量和濃度可由臨床醫(yī)生例行確定。此外，用藥方案的制定還需考慮到肝癌細胞類型、組織或腫瘤是分散還是局部、患者健康程度及年齡等因素。通過參照其他相關診療制劑的用藥方案，本領域技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明藥物的最佳有效劑量及濃度。
[0029]本發(fā)明antiGPC3_PB NPs對肝癌細胞H印G2具有良好的靶向識別功能，有效的進入細胞內(nèi)部；同時對H印G2細胞具有優(yōu)秀的光熱殺傷功能，能夠用于肝癌細胞的光熱治療；具有良好的核磁共振造影成像功能，具有成為新一代靶向磁共振造影劑的潛力。(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1表示antiGPC3-PB NPs的SEM和TEM圖片。其中A表SEM圖片，B圖為粒子電子衍射圖，C和D圖為TEM圖片。
[0031]圖2表示antiGPC3_PB NPs的能譜成分分析圖(EDS)。
[0032]圖3表示antiGPC3_PB NP的UV-Vis吸收光譜圖。A表示偶聯(lián)GPC3抗體前后納米粒子的紫外吸收光譜圖，B圖為以PBS為基線的不同濃度的納米粒子在培養(yǎng)基中的吸收光譜圖，C圖為納米粒子在808nm處吸收值的線性擬合(以濃度為X軸)，D圖為以培養(yǎng)基(含10%血清)為基線的不同濃度的納米粒子在培養(yǎng)基中的吸收光譜圖。
[0033]圖4表示不同濃度antiGPC3_PB NPs樣品溶液的Tl和T2核磁共振加權(quán)圖像。
[0034]圖5表示antiGPC3_PB NPs體外升溫曲線圖。A為不同濃度的納米粒子溶液IOmin內(nèi)升溫曲線，B圖為90.0ppm的納米粒子溶液在連續(xù)光照三個循環(huán)內(nèi)的升溫曲線。
[0035]圖6考察不同濃度的antiGPC3_PB NPs溶液對!fepG2細胞的光熱殺死效果。
(五)【具體實施方式】
[0036]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:
[0037]實施例 1:
[0038]精確稱量5.4mg的FeCl3.6H20藥品，于潔凈的三口燒瓶中加入20.0mL去離子水溶解得到濃度為1.0mM的FeCl3溶液，然后加入0.5mmol (即98.0mg)的無水檸檬酸,機械攪拌，加熱至60°C。精確稱量8.4mg的K4[Fe (CN) 6].3H20藥品，于潔凈的容量為50.0mL的燒杯中加入20.0mL的去離子水溶解得到濃度為1.0mM的K4 [Fe (CN) 6]水溶液，然后加入0.5mmol (即98.0mg)的無水檸檬酸,機械攪拌，加熱至60°C。
[0039]實施例2:
[0040]將所配的含0.5mmol檸檬酸的1.0mM K4[Fe (CN) 6]水溶液于60°C緩慢滴加到所配的含0.5mmol檸檬酸的1.0mM FeCl3水溶液中，不斷機械攪拌，可以發(fā)現(xiàn)混合溶液中出現(xiàn)清晰明亮的藍色，表明生成了普魯士藍納米顆粒，此時混合體系pH~2.8。繼續(xù)攪拌30min，冷卻至室溫，于30000rpm轉(zhuǎn)速下離心15min收集沉淀，去離子水分散離心洗滌，此過程重復三次。最后收集沉淀物去50°C真空干燥過夜得到藍黑色的干燥固體物，稱重定量之后，于常溫干燥處保存。此步驟合成出來的普魯士藍納米粒子表面采用檸檬酸作為保護劑修飾的，檸檬酸可以通過其結(jié)構(gòu)中的羧基和Fe3+進行配位，在Fe3+和亞鐵氰根混合形成普魯士藍晶體的過程中，檸檬酸可以有效的控制普魯士藍納米粒子的粒徑大小，有效地阻止粒子發(fā)生聚集。
[0041]實施例3:
[0042]取4.0mL采用PBS緩沖液溶解的濃度為250ppm的檸檬酸修飾的普魯士藍納米粒子溶液，利用濃度為0.2N的稀HCl調(diào)節(jié)pH至5.0。分別精確稱量4.0mg的EDC和8.0mg的Sulfo-NHS先后加入到上述溶液中，機械振蕩下室溫活化1-2小時。
[0043]實施例4:
[0044]加入4.0 μ L 濃度為 10.0mg/mL 的 GPC3 抗體(monoclonalantibody produced inmouse，安必奇生物科技有限公司)混合均勻，機械振蕩下室溫反應3小時后，置于4°C冰箱內(nèi)機械振蕩繼續(xù)反應過夜。采用0.2N的NaOH溶液調(diào)節(jié)混合體系pH至7.0，于30000rpm轉(zhuǎn)速下離心15min收集沉淀，用PBS緩沖液重新分散離心洗滌，重復三次。最后收集的沉淀用2.0mL的PBS分散配置成含有500ppm的antiGPC3_PB NPs溶液，置于4°C冰箱內(nèi)保存待用。此步驟合成出來的antiGPC3-PB NPs已經(jīng)具有特異靶向到肝癌細胞H印G2的功能；在近紅外光處有較強的吸收，有效地將光能轉(zhuǎn)換為熱能，殺傷腫瘤細胞；具有核磁共振造影成像功能，是一種潛在具有靶向性的磁共振造影劑。
[0045]使用掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)、紫外-可見-近紅外分光光度計(UV-Vis-NIR)、光熱升溫曲線及對H印G2細胞光熱殺傷等方法表征前述制得的antiGPC3-PB NPs，具體測試結(jié)果如下描述:
[0046](I)掃描電子顯微鏡(SEM)和透射電子顯微鏡(TEM)表征
[0047]利用SEM和TEM技術(shù)對制備的antiGPC3_PB NPs進行了形貌和納米尺寸表征。結(jié)果參見圖1，A為SEM電鏡圖，表示在Ι.Ομπι的標尺下，拍攝到的antiGPC3-PB NPs粒徑分布及總體形貌，其粒徑大小為20nm左右且粒徑非常均一，形貌一致。B圖為TEM電鏡圖，表示的是在標尺為20nm時的antiGPC3-PB NPs形貌，其粒徑在20nm左右，與SEM結(jié)果一致。
[0048](2)能譜成分分析(EDS)
[0049]利用TEM-EDS對制備的antiGPC3_PB NPs進行元素成分定性分析，結(jié)果參見圖2所，可以明顯看到樣品中鐵元素的峰，證實了普魯士藍納米顆粒中鐵元素的存在。
[0050](3)紫外-可見-近紅外分光光度計(UV-Vis-NIR)
[0051]采用UV-Vis-NIR分光光度計測定制備的antiGPC3_PB NPs在vis-NIR處的光吸收情況，以考察其在近紅外區(qū)的吸收。結(jié)果參見圖3，A表示的是偶聯(lián)GPC3抗體前后納米粒子的紫外吸收光譜圖，B圖為以PBS為基線的不同濃度(20，40，60，80，IOOppm)的納米粒子在培養(yǎng)基中的吸收光譜圖，C圖為納米粒子在808nm處吸收值的線性擬合(以濃度為X軸)，D圖為以培養(yǎng)基(含10%血清)為基線的不同濃度(20，40，60，80，IOOppm)的納米粒子在培養(yǎng)基中的吸收光譜圖。從圖中看出普魯士藍納米顆粒的特征吸收峰在715nm左右，且偶聯(lián)GPC3抗體前后，吸收峰的位置為發(fā)生明顯的變化，但是吸收值有一定的降低；在PBS緩沖液或者培養(yǎng)基中，antiGPC3-PB NPs在近紅外區(qū)都有較強的光吸收，且隨著濃度的增大，吸收逐漸增加；通過對其在808nm處光吸收值進行線性擬合(以anti GPC3-PB NP濃度為X軸)，發(fā)現(xiàn)吸收值與其濃度有良好的線性關系，這也說明了制備的antiGPC3-PB NPs在PBS或者培養(yǎng)基中具有良好的分散性。
[0052](4) MRI 成像
[0053]利用核磁共振儀(磁場強度11.2T)測試不同濃度(0，10，50，100，300ppm)antiGPC3-PB NPs樣品溶液的Tl和T2加權(quán)的MRI成像圖，結(jié)果參見圖4，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的依次增加，Tl圖像越來越亮，而T2圖像越來越暗，這表明其具有良好的Tl和T2加權(quán)的核磁共振造影成像效果。
[0054](5)光熱升溫曲線
[0055]利用2W808nm激光器對含有不同濃度(45.5，90.9ppm)antiGPC3-PB NPs溶液進行輻射，熱電偶測量輻射IOmin內(nèi)的溫度變化，作出光熱升溫曲線。結(jié)果參見圖5，曲線表示不同濃度的antiGPC3-PB NPs升溫特性(考察光熱轉(zhuǎn)換性能，其中以去離子水作為空白對照)，從圖中可以看出antiGPC3-PB NPs溶液濃度僅為90.9ppm時，體系溫度從30.8°C升到69.5°C，升高了 38.7°C，而去離子水的溫度變化不大，這表明了 antiGPC3_PB NPs具有優(yōu)秀的光熱轉(zhuǎn)換性能。此外，經(jīng)過多次照射循環(huán)，其光熱轉(zhuǎn)換升溫性能依然良好，說明其光熱穩(wěn)定性很好。
[0056](6 )對!fepG2細胞光熱殺傷
[0057]配置不同濃度(0，1,3,5,10，15，20ppm)antiGPC3_PBNPs 溶液(用含 10% 血清的細胞培養(yǎng)基配置)，于96孔板上與H印G2細胞共同孵育4個小時，利用2W808nm激光器分別對其輻照8min，之后利用細胞增殖與活性檢測試劑盒(CCK8) (Yeasen公司)檢測細胞活力，采用無光照作為對照組。結(jié)果參見圖6，從圖中可以發(fā)現(xiàn)隨著antiGPC3-PB NPs濃度的增加，其對細胞的光熱殺傷能力越強；當濃度僅為15.0ppm時，細胞活力就降到了 10%以下，說明本發(fā)明制備的antiGPC3-PB NPs 對肝癌細胞H印G2具有優(yōu)秀的光熱治療效果。
【權(quán)利要求】
1.用于肝癌特異靶向的光熱治療和核磁影像的GPC3抗體修飾普魯士藍納米顆粒，由檸檬酸作為表面保護劑形成的普魯士藍納米顆粒核心，和在其表面通過EDC/NHS共價偶聯(lián)連接的GPC3抗體構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求1所述的GPC3抗體修飾普魯士藍納米顆粒，其特征在于所述納米顆粒為立方體結(jié)構(gòu)，粒徑為20~25nm。
3.如權(quán)利要求1或2所述的GPC3抗體修飾普魯士藍納米顆粒，其特征在于所述納米顆粒外還包覆有一層陰離子聚合物一聚天冬氨酸保護層。
4.制備如權(quán)利要求1所述GPC3抗體修飾普魯士藍納米顆粒的方法，所述方法包括: (1)配制含200~300mM檸檬酸的0.8~1.5mM K4 [Fe (CN) 6]的水溶液，記為A液； (2)配制含200~300mM檸檬酸的0.8~1.5mM FeCl3的水溶液，記為B液； (3)于55~65°C下將等體積的A液緩慢滴加至B液中，不斷攪拌30~60min后，冷卻至室溫，離心、去離子水洗滌2~3次，取沉淀物50~60°C真空干燥得到檸檬酸修飾的普魯士藍納米粒子； (4)用PBS緩沖液溶解步驟(3)所得檸檬酸修飾的普魯士藍納米粒子使納米粒子濃度為200~300ppm，并調(diào)節(jié)pH為4.8~5.2，向此溶液中加入0.5~2.0mg/mL的EDC和I~3mg/L的Sulfo-NHS，震蕩下室溫活化I~2h ; (5)向步驟(4)反 應體系中加入GPC3抗體使抗體終濃度為8~11μ g/mL，混合均勻，振蕩下室溫反應2~4小時后，置于4°C冰箱內(nèi)震蕩反應過夜，反應結(jié)束后調(diào)節(jié)混合體系pH至7.0，用PBS緩沖液離心洗滌2~3次，得到所述GPC3抗體修飾普魯士藍納米顆粒。
5.如權(quán)利要求1所述的GPC3抗體修飾普魯士藍納米顆粒在制備肝癌靶向的核磁共振成像造影劑中的應用。
6.如權(quán)利要求1所述的GPC3抗體修飾普魯士藍納米顆粒在制備肝癌靶向的光熱治療藥物中的應用。
【文檔編號】A61K49/06GK103784979SQ201410021277
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】劉小龍, 劉景豐, 李正林, 黃愛民 申請人:福州市傳染病醫(yī)院