一種o型口蹄疫ctl表位肽及篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種O型口蹄疫CTL表位肽及其篩選方法和應(yīng)用。所述CTL表位肽是由九個(gè)氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為：Ala-Thr-Arg-Val-Thr-Glu-Leu-Leu-Tyr。該表位肽能夠與來源于不同品系豬的SLA-Ⅰ蛋白均有較強(qiáng)的結(jié)合能力并能夠引起細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答，適用于多種品系豬口蹄疫病毒的防治疫苗的制備，應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明利用構(gòu)建的六品系豬SLA-I單鏈分子在體外結(jié)合口蹄疫病毒的CTL模擬表位肽，質(zhì)譜測(cè)定篩選能夠與復(fù)合體結(jié)合的多肽，并經(jīng)過ELISPOT檢測(cè)，確定能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生T細(xì)胞免疫應(yīng)答能力的模擬表位肽。本發(fā)明為今后大量篩選和鑒定口蹄疫病毒CTL表位提供了方法，并為研制豬口蹄疫多表位疫苗奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】一種O型口蹄疫CTL表位肽及篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及SLA-1結(jié)合并能夠引起細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答的O型口蹄疫CTL表位肽以及利用SLA-1復(fù)合體篩選和鑒定所述CTL表位肽的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]豬主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibility complex, MHC),亦即豬的白細(xì)胞抗原(swine leukocyte antigen, SLA),是豬重要的免疫應(yīng)答分子。SLA共分為三類，分別為SLA-1、SLA-1I, SLA-1II。其中SLA-1類分子包括重鏈和輕鏈，重鏈具有多態(tài)性，功能基因主要為SLA-1, -2, -3ο而輕鏈由Beta 2微球蛋白(Beta 2 microglobulin,β2πι)基因編碼。在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，SLA-1重鏈、抗原多肽與輕鏈以非共價(jià)鍵結(jié)合，形成SLA-1-p印tides復(fù)合物，經(jīng)高爾基體加工后，遞呈到細(xì)胞表面，與⑶8+ T淋巴細(xì)胞受體結(jié)合，引起細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)免疫應(yīng)答，CTL釋放細(xì)胞因子并殺死被病毒感染的靶細(xì)胞。能夠與SLA-1類分子結(jié)合并能引起細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答的多肽即為CTL表位。
[0003]口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus, FMDV)是危害偶蹄類動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病的病原，血清型分為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asial型，各型之間無交互免疫力。由于口蹄疫病毒的流行株不斷變異，傳統(tǒng)的疫苗已經(jīng)不能適應(yīng)口蹄疫防治的要求。含有多種血清型和不同流行株的表位疫苗可以起到防治不同血清型口蹄疫病毒的要求。研制口蹄疫病毒表位疫苗的關(guān)鍵是確定表位，細(xì)胞表位包括B細(xì)胞表位、輔助性T細(xì)胞(T helper, Th)表位和CTL表位。目前，多個(gè)B細(xì)胞表位和Th表位已經(jīng)報(bào)道?？谔阋邔儆趪?yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物，體液免疫固然重要，但細(xì)胞免疫必不可少。近來的研究表明，在FMDV急性發(fā)作期的控制主要是由中和抗體發(fā)揮作用，而在FMDV持續(xù)性感染期的免疫方面則主要由CTL發(fā)揮作用。最近，一些學(xué)者開始研究口蹄疫病毒的CTL表位。2006年，Barfoed (Antiviral Res, 2006, 72 (3): 178-89)等證實(shí)了一個(gè)小鼠 H_2Kd 限制性的來源于口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C的CTL表位`KYKEAKEWL，能夠在小鼠體內(nèi)引起CTL反應(yīng)。另外，Guzman 等(J Gen Virol, 2008, 89 (Pt 3): 667-75)最近也證實(shí)了一個(gè)牛 BoLA N*02201 限制性的口蹄疫病毒CTL表位，該表位位于O型口蹄疫UKG/2001株結(jié)構(gòu)蛋白的795- 803氨基酸殘基，該表位能夠引起靶細(xì)胞殺傷效應(yīng)。然而，到目前為止，所有報(bào)道的口蹄疫病毒CTL表位都是通過小鼠、牛等動(dòng)物加以驗(yàn)證，至今還未報(bào)道經(jīng)豬SLA-1類分子直接遞呈的口蹄疫病毒CTL表位。
[0004]研究表明，利用體外構(gòu)建MHC I重鏈分子、肽及輕鏈復(fù)合體的方法可以在體外篩選病毒表位。White 等(J Immunol, 1999，162 (5): 2671-6)用一個(gè) Linker 將小鼠 MHC-1 的重鏈和輕鏈連接，構(gòu)建了 MHC-1分子，并證明了它可以和抗原肽分子特異結(jié)合。Denberg等(Eur J Immunol, 2000, 30 (12): 3522-32)用一個(gè)多肽、Linker、重鏈及輕鏈 β 2m 構(gòu)建了人的HLA-A2單鏈分子，并證明構(gòu)建的結(jié)合多肽的單鏈分子具有識(shí)別細(xì)胞受體的功能。在課題組前期研究中，已經(jīng)構(gòu)建了六品系豬SLA-1復(fù)合體蛋白，并且在pMAL-p2X進(jìn)行了表達(dá)，經(jīng)檢測(cè)表達(dá)蛋白為可溶性蛋白，并保持良好的蛋白構(gòu)象。本發(fā)明在前期研究的基礎(chǔ)上，利用構(gòu)建的六品系豬SLA-1單鏈分子在體外結(jié)合口蹄疫病毒的CTL模擬表位肽，質(zhì)譜測(cè)定篩選能夠與復(fù)合體結(jié)合的多肽?？山Y(jié)合的多肽經(jīng)過ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)多肽的CTL活性。本發(fā)明為今后大量篩選口蹄疫病毒CTL表位提供了方法，并為研制豬口蹄疫病毒多表位疫苗奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種能夠與SLA-1分子結(jié)合并能夠引起細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答的O型口蹄疫CTL表位肽。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為一種O型口蹄疫CTL表位肽，所述O型口蹄疫CTL表位肽命名為Q01，其由九個(gè)氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為:Ala-Thr-Arg-Val-Thr-Glu-Leu- Leu-TyrCSEQ ID No:1),即丙氨酸-蘇氨酸-精氨酸-繳氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-亮氨酸-酪氨酸。
[0007]所述O型口蹄疫CTL表位肽(Q01)來源于O型口蹄疫病毒VPl蛋白，其與來源于不同品系豬的SLA-1蛋白均有較強(qiáng)的結(jié)合能力，且能誘導(dǎo)豬PBMC極顯著釋放IFN- Y。
[0008]本發(fā)明所述O型口蹄疫CTL表位肽(QOl)應(yīng)用于口蹄疫多肽疫苗的制備。
[0009]如上所述的O型口蹄疫CTL表位肽(Q01)的篩選方法，其包括如下步驟:
(O 利用生物學(xué)信息軟件 netMHCpan2.4 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan)，輸入口蹄疫病毒VPl蛋白序列，選擇九肽，在SLA基因下預(yù)測(cè)得到能與SLA-1蛋白結(jié)合，并提呈到細(xì)胞表面引起細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答的CTL模擬表位肽，以人工化學(xué)法合成上述預(yù)測(cè)得到的CTL模擬表位肽；
(2)將步驟(1)得到的CTL模擬表位肽和SLA-1蛋`白的體外結(jié)合反應(yīng)，反應(yīng)混合物經(jīng)C-18柱除鹽、精制、冷凍干燥后得到固體粉末狀SLA-1 -多肽復(fù)合物；
(3)SLA-1 -多肽復(fù)合物經(jīng)質(zhì)譜測(cè)定篩選能與SLA-1結(jié)合的CTL模擬表位肽；
(4)以能夠與SLA-1蛋白結(jié)合的CTL模擬表位肽為抗原，以分離得到的口蹄疫感染的豬脾臟淋巴細(xì)胞為待測(cè)細(xì)胞，進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)，確定能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生T細(xì)胞免疫應(yīng)答能力的CTL模擬表位肽。
[0010]上述CTL表位肽的篩選和鑒定方法中，步驟(1)所述CTL模擬表位肽的氨基酸序列優(yōu)選為SEQ ID No:1~4。
[0011]上述CTL表位肽的篩選方法中，步驟(1)所述口蹄疫病毒VPl蛋白序列可以來源于不同血清型的口蹄疫病毒，其血清型可以為O、A、C、SATU SAT2、SAT3和Asial型等。
[0012]上述CTL表位肽的篩選方法中，所述SLA-1蛋白來源于長(zhǎng)白豬、大約克豬、托佩克豬、荷包豬、煙臺(tái)豬或萊蕪黑豬中的一種或多種。
[0013]利用質(zhì)譜法測(cè)定SLA-1單鏈分子與多肽的結(jié)合，可以非常精確的篩選出能夠與SLA-1分子結(jié)合的多肽，特異性高。本發(fā)明的 申請(qǐng)人:通過前期研究已經(jīng)構(gòu)建巴馬小型豬SLA-1單鏈分子，并進(jìn)行了體外結(jié)合篩選口蹄疫病毒多肽，從而證明了該方法的科學(xué)性。然而，由于SLA-1類分子存在限制性，來源于不同品系豬的SLA-1可能結(jié)合不同的多肽。另外，由于SLA-1類分子限制性的多肽表位可能具有共同錨定殘基，不同品系豬SLA-1也可能會(huì)結(jié)合共同的多肽表位。如果能分離和篩選共同適應(yīng)于多種品系豬SLA-1的多肽，則會(huì)有助于研制具有防治效果的口蹄疫病毒多表位疫苗。本發(fā)明通過上述方法篩選和鑒定出與來源于長(zhǎng)白豬、大約克豬、托佩克豬、荷包豬、煙臺(tái)豬或萊蕪黑豬的SLA-1蛋白均具有良好的結(jié)合能力，并能夠誘導(dǎo)豬PBMC顯著釋放IFN-Y的CTL表位肽(QOl )。本發(fā)明的CTL表位肽適用于多種品系豬口蹄疫病毒的防治疫苗的制備，應(yīng)用范圍廣。
[0014]本發(fā)明的有益效果:①本發(fā)明的O型口蹄疫CTL表位肽(QOl)與來源于不同品系豬的SLA-1蛋白均有較強(qiáng)的結(jié)合能力并能夠引起細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答，適用于多種品系豬口蹄疫病毒的防治疫苗的制備，應(yīng)用范圍廣。②本發(fā)明為今后大量篩選和鑒定口蹄疫病毒CTL表位提供了方法，并為研制豬口蹄疫多表位疫苗奠定了基礎(chǔ)。③本發(fā)明的表位多肽也可用于今后與SLA-1蛋白進(jìn)行體外結(jié)晶研究等，有利于研究防治口蹄疫中的分子、細(xì)胞作用機(jī)制。
【專利附圖】

【附圖說明】[0015]圖1為經(jīng)Amylose親和層析得到的融合蛋白SLA-1-MBP的SDS-PAGE電泳圖，其中:M，代表低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，1-6，分別代表長(zhǎng)白豬、大約克豬、托佩克豬、荷包豬、煙臺(tái)黑和萊蕪黑豬SLA-1-MBP純化蛋白；
圖2為Factor Xa切割后的SLA-1-MBP的SDS-PAGE電泳圖，其中:M，代表低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，1-6，分別代表長(zhǎng)白豬、大約克豬、托佩克豬、荷包豬、煙臺(tái)黑和萊蕪黑豬SLA-1切割后的蛋白，其中SLA-1蛋白大小為41.6kDa，融合蛋白的大小為84.1 kDa ；
圖3為DEAE-葡聚糖凝膠陰離子交換柱純化后的SLA-1的SDS-PAGE電泳圖，其中:M，代表低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，1-6，分別代表長(zhǎng)白豬、大約克豬、托佩克豬、荷包豬、煙臺(tái)黑和萊蕪黑豬SLA-1純化蛋白；
圖4為QOl與六品系豬SLA-1的體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果；
圖5為Q02與六品系豬SLA-1的體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果；
圖6為AS3與六品系豬SLA-1的體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果；
在所述圖4~圖6中，所述A、B、C、D、E和F分別表示，相應(yīng)多肽與長(zhǎng)白豬SLA-1體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果、大約克豬SLA-1體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果、托佩克豬SLA-1體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果、煙臺(tái)黑豬SLA-1體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果和萊蕪黑豬SLA-1體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果;
圖7為ELISPOT檢測(cè)多肽誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN- Y能力，其中:**代表待測(cè)多肽與對(duì)照肽相比較差異極顯著(P < 0.01)。
[0016]【具體實(shí)施方式】
下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0017]實(shí)施例1六個(gè)品系豬SAL-1蛋白的準(zhǔn)備
(I)六個(gè)品系豬SLA-1/pMAL-p2X重組大腸桿菌的準(zhǔn)備
六個(gè)品系豬SLA-1/pMAL-p2X重組大腸桿菌，均為大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。所述六個(gè)品系豬包括長(zhǎng)白、大約克、托佩克、荷包、煙臺(tái)和萊蕪黑豬。所述SLA-1/pMAL-p2X重組大腸桿菌由高鳳山等(Gene, 2012, 502 (2): 147-153)中所述的方法獲得。[0018](2)誘導(dǎo)表達(dá)SLA-1重組大腸桿菌
分別取六個(gè)品系豬的SLA-1/pMAL-p2X重組大腸桿菌菌液5mL接種至500mL LB培養(yǎng)基，在170rpm的37度溫箱中振蕩培養(yǎng)，隔一段時(shí)間檢測(cè)其0D_，待生長(zhǎng)至OD6tltl介于0.6至
0.8之間時(shí)，加入IPTG至0.5mmol/L, 37度誘導(dǎo)5小時(shí)。
[0019](3)融合蛋白MBP-SLA-1親和純化
將在上述(2)中用IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)5小時(shí)的菌體，3000r/min、離心10min，棄上清，加入 50mL 過柱緩沖液 A [20 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4),200 mmol/L NaCl, lmmol/L EDTA(pH8.0), I mmol/L疊氮鈉，I mmol/L DTT]重懸菌體。菌體經(jīng)超聲破碎lOmin,90W,破碎5min停5min。菌體超聲后4000r/min,離心10min,棄沉淀,取上清液。上清液中含有可溶性的融合蛋白SLA-1-MBP，利用麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)與柱子中特異性配體結(jié)合的性質(zhì)，進(jìn)行Amylose親和層析,融合蛋白SLA-1-MBP被吸附到Amylose柱子上,用12倍柱體積的上述過柱緩沖液A洗脫除掉未結(jié)合雜蛋白后，再利用麥芽糖可以與MBP優(yōu)勢(shì)結(jié)合的性質(zhì)，用3倍柱體積含有10 mmol/L麥芽糖的洗脫緩沖液(過柱緩沖液A + 10mmol/L麥芽糖)洗脫目的蛋白，洗脫后的液體進(jìn)行濃縮，得到可溶性的SLA-1-MBP蛋白濃縮液。SLA-1-MBP蛋白濃縮液用SDS-PAGE電泳，檢驗(yàn)?zāi)康牡鞍椎臈l帶大小和純度。結(jié)果見圖1。圖1結(jié)果顯示，六品系豬SLA-1-MBP純度約85%，大小為84.lkDa，符合預(yù)期SLA-1-MBP蛋白大小。
[0020](4 )融合蛋白切除MBP、分離純化
由于MBP本身分子量較大，可能會(huì)干擾到目的蛋白分子與抗原肽的特異性結(jié)合，故需要將融合蛋白中的MBP切除。pMAL-p2X載體上在malE基因和多克隆位點(diǎn)之間，有一個(gè)被Xa因子識(shí)別的氨基酸序列，Ile-Glu-Gly-Arg，可以切除MBP。
[0021]具體切除方法為:
將步驟(3)得到的MBP-S LA-1融合蛋白用Factor Xa切割，切割條件為:lmol/L NaCl100 μ L, 100 mmoL/L CaCl2 20 μ L, lmol/L Tris-HCl 20 μ L，步驟(3)得到的 SLA-1-MBP蛋白濃縮液 400 μ L (約 I mg SLA-1-MBP 蛋白)，F(xiàn)actor Xa (I U 酶切割 50 mg) 20 U，加滅菌去離子水至I mL。21°C切割20 h，切割后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白切割情況，結(jié)果見圖2。圖2結(jié)果顯示，在43kDa處，六個(gè)品系豬SLA-1-MBP均切割出一條約41kDa條帶，與目的蛋白SLA-1大小41.6kDa 一致。
[0022]切割后的蛋白混合物首先經(jīng)過Amylose柱純化，收集過柱緩沖液A洗脫的蛋白樣品。收集得到的蛋白樣品再經(jīng)過DEAE Ceramic HyperD F陰離子交換柱分離純化蛋白，用10個(gè)柱體積含0.15 mo I/L NaCl的過柱緩沖液(0.15 moL/L NaCl的20mmoL/LTris-HCKpH 8.0))洗脫，根據(jù)分光光度計(jì)檢測(cè)，收集洗脫峰，濃縮后，SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白SLA-1，結(jié)果見圖3。圖3結(jié)果顯示，最終收集得到的蛋白呈現(xiàn)單一的條帶，大小為41.6kDa，純度達(dá)到了 95%以上，符合進(jìn)行蛋白功能研究的要求。
[0023]實(shí)施例2 口蹄疫病毒模擬表位肽的設(shè)計(jì)
利用生物學(xué)信息軟件 netMHCpan2.4 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan)，輸入O型口蹄疫病毒VPl氨基酸序列(AJ539138)及Asial型口蹄疫病毒VPl氨基酸序列(EF149009)，選擇九肽，在SLA基因下預(yù)測(cè)得到能與SLA-1蛋白結(jié)合，并提呈到細(xì)胞表面引起細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答的CTL 模擬表位肽，共設(shè)計(jì)了 3條來源于所述口蹄疫病毒VPl蛋白的9肽，分別命名為QOl、Q02、AS3，其氨基酸序列以及其他基本信息見表1。其中QOl和Q02均來源于O型口蹄疫的當(dāng)前國(guó)內(nèi)外流行毒株Tibet/CHA/99 ；AS3來源于Asial型口蹄疫毒株流行株Asia l/Jiangsu/China/2005。另外,設(shè)計(jì)和合成了非相關(guān)對(duì)照肽Co,其相關(guān)信息見表1。各表位肽以凍干狀態(tài)儲(chǔ)存于_80°C，備用。
__表1/CTL表位肽及其相關(guān)信息 _
CTL表序列表中的
氨基酸序列分子量 a 位肽____SEQ-1D-No
QOlAla-Thr-Arg-Val-Thr-Glu-Leu-Leu-Tyr1065.24SEQ-1D ?No:1
Q02Thr-Val -Tyr-Asn-Gly-Asn-Cys-Lys-Tyr1061.19SEQ-1D-No: 2
AS3Thr-Val-Tyr-Asn -Gly -Thr-Ser-Lys-Tyr1032.13SEQID-No: 3
CoGln-Pro-Asn-Glu-Ala-1le-Arg-Ser-Leu1026.67SEQ-1D-No: 4
[0024]實(shí)施例3 SLA-1蛋白與口蹄疫病毒模擬表位肽的結(jié)合與篩選
將實(shí)施例1純化得到的六品系豬SLA-1蛋白各ImL(蛋白含量lmg/mL)分別與5mL PBS溶液混合，4500r/min離心20min,去掉濾液,加PBS至總體積約為5mL,重復(fù)離心3次,取上層的PBS溶液(含有31^-1)分別與多肽溶液(001、002433或Co)混合，肽與目的蛋白的摩爾比為10: 1，37°C過夜。將混合物加入30K超濾管，4500r/min離心45min。加入PBS，37°C水浴2min，4500r/min離心，至終體積為IOOuL左右。將5mL檸檬酸-磷酸鹽緩沖液加入到混合液中，室溫放置2min。轉(zhuǎn)入5K超濾管,4500r/min離心5min,收集濾液約5mL。濾液分別經(jīng)C-18柱除鹽,方法如下:將Sep-Pak C18連入5ml注射器,用2~3ml乙腈(acetonitrile)洗柱；用2~3mL雙蒸餾水(ddH20)洗柱`；加入ImL檸檬酸一 Na2HPO4緩沖液洗出的多肽混合物，讓其自然依靠重力流下；用5ml雙蒸餾水(ddH20)洗柱；最后用0.5ml 60%乙腈/40%ddH20洗脫目的蛋白(多肽)，最后收集樣品于ImL eppendorf管中，然后放入冷凍干燥機(jī)，冷凍干燥12小時(shí)，得到固體粉末狀SLA-1-多肽復(fù)合物。取0.5Pg樣品點(diǎn)到樣品靶上，覆上8mg/mL CHCA基質(zhì)(50%乙腈，0.1% TFA)。待干燥后將樣品靶放入4800 MALD1-TOFTOF(Foster City, Applied Biosystems)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。一級(jí)質(zhì)譜激光強(qiáng)度3700,質(zhì)量范圍 800-4000，shots 值 750，加速電壓 20KV。
[0025]QOl與六品系豬SLA-1的體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果見圖4。
[0026]Q02與六品系豬SLA-1的體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果見圖5。
[0027]AS3與六品系豬SLA-1的體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果見圖6。
[0028]圖4~圖6中，A、B、C、D、E和F分別表示，相應(yīng)多肽與長(zhǎng)白豬SLA-1體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果、大約克豬SLA-1體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果、托佩克豬SLA-1體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果、煙臺(tái)黑豬SLA-1體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果和萊蕪黑豬SLA-1體外結(jié)合質(zhì)譜測(cè)定結(jié)果。
[0029]圖4結(jié)果顯示，QOl與所有品系豬SLA-1蛋白結(jié)合呈現(xiàn)較強(qiáng)的目標(biāo)峰，說明QOl可與所有的SLA-1蛋白結(jié)合。
[0030]圖5結(jié)果顯示，Q02與長(zhǎng)白和大約克豬SLA-1蛋白呈現(xiàn)很弱的目標(biāo)峰，與其他品系豬無可檢測(cè)到的目標(biāo)峰，說明Q02與所有的SLA-1蛋白基本不能結(jié)合。
[0031]圖6結(jié)果顯示，AS3與長(zhǎng)白、大約克、托佩克及萊蕪黑豬SLA-1蛋白呈現(xiàn)很弱的目標(biāo)峰，而與荷包豬及煙臺(tái)黑豬SLA-1蛋白呈現(xiàn)中等強(qiáng)度的目標(biāo)峰，說明AS3可與荷包豬及煙臺(tái)黑豬SLA-1蛋白結(jié)合，但與其他品系豬SLA-1蛋白的結(jié)合程度很弱。
[0032]將六品系豬SLA-1與對(duì)照肽Co在體外結(jié)合，質(zhì)譜測(cè)定可以結(jié)合的肽，未檢測(cè)到樣品肽信號(hào)，說明對(duì)照肽Co與所述品系豬SLA-1分子不結(jié)合，本發(fā)明的方法設(shè)計(jì)的表位肽具有特異性，篩選方法具有科學(xué)性。
[0033]利用質(zhì)譜法測(cè)定SLA-1單鏈分子與多肽的結(jié)合，可以非常精確的篩選出能夠與SLA-1分子結(jié)合的多肽，特異性高。本發(fā)明的 申請(qǐng)人:通過前期研究已經(jīng)構(gòu)建巴馬小型豬SLA-1單鏈分子，并進(jìn)行了體外結(jié)合篩選口蹄疫病毒多肽，從而證明了該方法的科學(xué)性。然而，由于SLA-1類分子存在限制性，來源于不同品系豬的SLA-1可能結(jié)合不同的多肽。另外，由于SLA-1類分子限制性的多肽表位可能具有共同錨定殘基，不同品系豬SLA-1也可能會(huì)結(jié)合共同的多肽表位。如果能分離和篩選共同適應(yīng)于多種品系豬SLA-1的多肽，則會(huì)有助于研制具有防治效果的口蹄疫病毒多表位疫苗。圖4結(jié)果顯示，QOl與所有品系豬SLA-1蛋白結(jié)合呈現(xiàn)較強(qiáng)的目標(biāo)峰，說明QOl可與所有的SLA-1蛋白結(jié)合，QOl可適用于多種品系豬口蹄疫病毒的防治疫苗的制備，應(yīng)用范圍廣。
[0034]實(shí)施例4 ELISPOT檢測(cè)表位肽的活性
由于具有活性的CTL表位肽可以刺激特異性⑶8+細(xì)胞分泌Y -干擾素，利用這一特性，以篩選得到的CTL表位肽為抗原，以分離得到的口蹄疫感染的豬脾臟淋巴細(xì)胞為待測(cè)細(xì)胞，進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)。
[0035]具體檢測(cè)方法為如下:
選取一月齡的純種長(zhǎng)白豬(公豬)4頭，抗體檢測(cè)確定無FMDV抗體。留2頭為對(duì)照組，其余2頭每頭豬分別接種O型和Asial型口蹄疫病毒，作為實(shí)驗(yàn)組。豬攻毒10天后采血分離外周血淋巴細(xì)胞(PBMC)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)后，利用ELISPOT試劑盒(MABTECH AB, Sweden)測(cè)定待測(cè)多肽誘導(dǎo)PBMC釋放IFN- Y的能力。將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的豬PBMC以2 X IO5細(xì)胞/孔的細(xì)胞濃度接種于ELISPOT試劑盒96孔板中，同時(shí)按一定的濃度加入各組受試樣品。以不加任何樣品為空白對(duì)照組(Blank)，以加入陰性對(duì)照肽Co (終濃度為10 μg/ml)為刺激物設(shè)置陰性對(duì)照組，以樣品肽(Q01、Q02和AS3，終濃度均為10 μ g/ml)為刺激物作為待測(cè)樣品組，每組樣品設(shè)3個(gè)平行孔。按照試劑盒所述的方法測(cè)定待測(cè)多肽誘導(dǎo)PBMC釋放IFN-Y的能力。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照 組的測(cè)定結(jié)果見圖7。
[0036]圖7結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)組中，QOl刺激產(chǎn)生的平均斑點(diǎn)最多，然后為AS3，Q02,陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組QOl與對(duì)照肽Co相比，差異極顯著0° < 0.01 )，說明與實(shí)驗(yàn)組對(duì)照肽Co相比，QOl能夠誘導(dǎo)PBMC極顯著釋放IFN- Y，而Q02及AS3不能明顯刺激PBMC釋放IFN- Y。另外，實(shí)驗(yàn)組QOl與對(duì)照組QOl刺激產(chǎn)生的平均斑點(diǎn)數(shù)差異極顯著Z7 < 0.01)，因此QOl可以被認(rèn)為是口蹄疫病毒CTL表位多肽。其他多肽Q02和AS3盡管與對(duì)照組相應(yīng)多肽刺激產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)相比較差異顯著0° < 0.05)，但由于與對(duì)照肽相比較差異不顯著，因此Q02和AS3不能被認(rèn)為是有效的CTL表位肽。每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少重復(fù)3次。讀板儀上讀取斑點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)分析。
[0037]ELISPOT技術(shù)又叫做酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)，它是ELISA技術(shù)的延伸，不同之處在于，ELISPOT以斑點(diǎn)的形式反映出分泌特定細(xì)胞因子的細(xì)胞。特異性的CD8+T淋巴細(xì)胞在活性表位肽的刺激下可以分泌Y-干擾素，即IFN-Y。ELISPOT產(chǎn)生的每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌IFN-Y的細(xì)胞，斑點(diǎn)數(shù)反映了多肽刺激⑶8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-Y的能力，從而間接證明了多肽的CTL活性。根據(jù)圖7顯示的結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)組中，與對(duì)照肽Co相比，QOl能夠誘導(dǎo)PBMC極顯著釋放IFN- Y，而Q02及AS3不能明顯刺激PBMC釋放IFN- Y。結(jié)果說明QOl為優(yōu)勢(shì)表位肽，其他兩個(gè)口蹄疫表位肽Q02和AS3刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答能力較弱，不是優(yōu)勢(shì)表位肽。
[0038]對(duì)照肽Co測(cè)定組及空白對(duì)照組也有少部分斑點(diǎn)產(chǎn)生，這是由于淋巴細(xì)胞中除了⑶8+ T淋巴細(xì)胞以外，還有自然殺傷細(xì)胞(NK)、巨噬細(xì)胞等在未經(jīng)抗原刺激的情況下仍有一定的分泌IFN-Y的能力。`
【權(quán)利要求】
1.一種O型口蹄疫CTL表位肽，其特征在于:所述CTL表位肽的氨基酸序列為:Ala-Thr- Arg-Val-Thr-Glu-Leu-Leu-Tyr0
2.如權(quán)利要求1所述的C`TL表位肽在制備防治口蹄疫多肽疫苗中應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K39/135GK103864905SQ201310742940
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】高鳳山 申請(qǐng)人:大連大學(xué)