瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白多肽CSP I-plus 在制備抗瘧疾藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了來源于瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白即CSP的肽段CSPI-plus治療瘧原蟲感染的新用途。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)子孢子蛋白CSP在瘧原蟲子孢子黏附、入侵肝細(xì)胞的過程中起著重要作用，而瘧原蟲子孢子侵入肝細(xì)胞是瘧疾感染的關(guān)鍵，因此阻斷子孢子的侵入，即可防止瘧疾感染。CSPI-plus是CSP的重要功能域，可特異性結(jié)合肝細(xì)胞表面分子－硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，并能阻斷CSP與肝細(xì)胞的結(jié)合。因此，CSPI-plus有望通過阻斷CSP介導(dǎo)的瘧原蟲子孢子黏附、入侵肝細(xì)胞從而開發(fā)成為治療惡性瘧原蟲感染的新型小分子多肽類藥物，而包含CSPI-plus編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒有望進(jìn)一步開發(fā)成為抗瘧疾的新型基因藥物，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
【專利說明】瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白多肽CSP ι-plus在制備抗瘧疾藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白多肽CSP 1-Plus在制備抗瘧疾藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 [0002]瘧疾是由瘧原蟲寄生于人體引起的一種傳染病，是我國五大寄生蟲病之一，世界六大熱帶病之一。全球109個國家有瘧疾流行，約33億人口受到瘧疾威脅，每年約有5億人感染瘧疾，其中有100萬人因此死亡。WHO指出國際間因瘧疾的財(cái)政支出由2004年的2億美金上升到2009年的15億美金，瘧疾已為一些發(fā)展中國家?guī)砹顺林氐慕?jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。盡管目前有磷酸氯喹、磷酸伯氨喹和青蒿素等治療藥物，但由于存在著瘧原蟲的生活史復(fù)雜、產(chǎn)生耐藥性、復(fù)發(fā)率高等問題，瘧疾的治療仍然是目前面臨的一道難題。
[0003]環(huán)子孢子蛋白(circumsporozoite protein, CSP)是覆蓋于痕原蟲子孢子表面的主要蛋白，通過與肝細(xì)胞表面分子一硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)特異性結(jié)合，可介導(dǎo)子孢子特異性粘附于肝細(xì)胞膜上，進(jìn)而入侵肝細(xì)胞。子孢子侵入肝細(xì)胞是瘧疾感染的關(guān)鍵，而阻斷蟲體的侵入，即可防止瘧疾感染。因此，阻斷環(huán)子孢子蛋白與宿主肝細(xì)胞硫酸乙酰肝素蛋白聚糖之間的結(jié)合，從而有效阻斷瘧原蟲子孢子入侵肝細(xì)胞，是治療瘧疾的有效措施之一。不同種屬的痕原蟲都有環(huán)子孢子蛋白的存在，環(huán)子孢子蛋白以40~60kDa的前體蛋白形式合成，隨后加工成相對分子質(zhì)量為40~60kDa的成熟表面蛋白，具有典型的信號肽，位于N端；在C端則有一疏水序列由糖基磷脂酰肌醇錨于子孢子膜上。瘧原蟲屬內(nèi)所有蟲體的CSP蛋白結(jié)構(gòu)都相似，均有位于中央的串聯(lián)重復(fù)區(qū)，具有種屬特異性，在惡性瘧原蟲該重復(fù)四肽為天冬酰胺一丙氨酸一天冬酰按一脯氨酸(Asn—AI a—Asn—Pro，NANP)。重復(fù)區(qū)兩端是兩個高度保守序列。位于N端的I區(qū)包含I個保守的KLKQP基序，位于C端的II區(qū)與血小板凝血酶反應(yīng)蛋白I型重復(fù)區(qū)(repeat ofthrombospondin,TSR)同源。最近的研究發(fā)現(xiàn)，包含CSP保守I區(qū)和其上游序列的19個氨基酸的小肽段(CSP 1-plus)是環(huán)子孢子蛋白粘附結(jié)合肝細(xì)胞的主要功能域，可特異性靶向結(jié)合肝細(xì)胞表面分子HSPG，并能阻斷環(huán)子孢子蛋白與肝細(xì)胞的結(jié)合，因此CSP 1-plus有望通過阻斷環(huán)子孢子蛋白介導(dǎo)的瘧原蟲子孢子黏附、入侵肝細(xì)胞，從而進(jìn)一步開發(fā)成為治療惡性瘧原蟲感染的新型小分子多肽類藥物。
[0004]迄今為止，未見瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白多肽CSP 1-plus抗瘧疾的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白多肽CSP 1-plus在制備抗瘧疾藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的另一個目的是提供瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白多肽CSP 1-plus編碼基因在制備抗瘧疾藥物中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的另一個目的是提供含有瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白多肽CSP 1-plus編碼基因的重組質(zhì)粒在制備抗瘧疾藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CSP 1-Plus可抑制瘧原蟲子孢子入侵人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株，而小鼠體內(nèi)給予CSP 1-plus 30分鐘后，自尾靜脈接種瘧原蟲子孢子，結(jié)果顯示CSP1-Plus可顯著抑制瘧原蟲子孢子入侵小鼠肝細(xì)胞。以上結(jié)果表明瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白多肽CSP 1-plus可明顯阻斷瘧原蟲子孢子與肝細(xì)胞的結(jié)合，從而抑制瘧原蟲感染。因此，CSP1-plus有望進(jìn)一步開發(fā)成為治療瘧原蟲感染的新型小分子多肽類藥物，用于預(yù)防瘧原蟲感染和/或用于治療瘧疾，包含CSP 1-plus基因的重組質(zhì)粒有望進(jìn)一步開發(fā)成為抗瘧疾的新型基因藥物，具有良好的臨床應(yīng)用前景。瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白多肽CSP 1-plus的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]說明書附圖
圖1.免疫熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測CSP ι-plus特異性結(jié)合肝細(xì)胞表面分子HSPG的結(jié)果。
[0010]圖2.熒光顯微鏡觀察CSP ι-plus結(jié)合模式與HSPG免疫分布是一致的結(jié)果。
[0011]圖3.CSP 1-plus與肝細(xì)胞預(yù)孵后，再以瘧原蟲子孢子攻擊肝細(xì)胞，肝細(xì)胞感染寄生蟲數(shù)量顯著減少的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，可參照本領(lǐng)域常規(guī)方法條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的方法和條件，或按照制造產(chǎn)品廠商所建議的條件進(jìn)行。
[0013]實(shí)施例1
S1.瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白多肽CSP 1-Plus的固相化學(xué)合成:按SEQ ID N0:1的氨基酸殘基的序列，委托北京中科亞光有限公司按照常規(guī)多肽合成方法合成多肽，經(jīng)純化達(dá)到95%以上的純度。
[0014]S2.CSP 1-plus特異性結(jié)合肝細(xì)胞表面分子HSPG研究:以H印G2.2.15細(xì)胞為人肝細(xì)胞模型，加入帶FITC標(biāo)記的CSP 1-plus置濕盒37°C 30分鐘，PBS洗滌，封片，熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示CSP 1-plus主要結(jié)合在肝細(xì)胞膜上。以可特異降解HSPG的肝素酶處理肝細(xì)胞2小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)其均呈濃度依賴性地抑制CSP 1-plus與肝細(xì)胞的結(jié)合(圖1)，表明CSP 1-plus可特異結(jié)合肝細(xì)胞表面分子HSPG。進(jìn)一步研究了 CSP 1-plus與肝細(xì)胞表面分子HSPG的關(guān)系，取小鼠肝臟切片加入帶FITC標(biāo)記的CSP 1-plus與鼠源HSPG單克隆抗體(1.200)混合物置濕盒37°C 30分鐘，熒光顯微鏡觀察顯示CSP 1-plus的肝組織結(jié)合模式與HSPG的免疫分布基本一致(圖2)。
[0015]S3.CSP 1-plus體外抑制瘧原蟲子孢子入侵人肝細(xì)胞研究:以人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞為體外實(shí)驗(yàn)對象，HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清(FCS)、100單位/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，37°C、5% CO2培養(yǎng)。每I X 10 5細(xì)胞加入I X IO5瘧原蟲子孢子，37°C、5% CO2培養(yǎng)于24孔板內(nèi)(孔內(nèi)放入玻片)。實(shí)驗(yàn)組在加入瘧原蟲子孢子之前加入不同濃度的CSP 1-plus (0、5、10、50、100nM)預(yù)孵30分鐘，對照組則加入等量生理鹽水。于第6天收集玻片，PBS洗兩遍，檢測細(xì)胞內(nèi)寄生蟲數(shù)量，并按下列公式計(jì)算抑制率:抑制率(%)=(對照組原蟲數(shù)量-實(shí)驗(yàn)組原蟲數(shù)量)/對照組原蟲數(shù)量X 100%
結(jié)果顯示CSP 1-plus可顯著抑制瘧原蟲子孢子入侵!fepG2細(xì)胞，并呈濃度依賴性(見圖3)。
[0016]S4.CSP 1-plus體內(nèi)抑制瘧原蟲子孢子入侵鼠肝細(xì)胞研究:預(yù)備2組BALB/c小鼠，每組12只，一組為實(shí)驗(yàn)組，一組為對照組，實(shí)驗(yàn)組給予CSP 1-plus (200 μ g /只)、對照組給予等量的生理鹽水，30分鐘后分別自尾靜脈接種瘧原蟲子孢子(5X103)。感染后2~12天連續(xù)查血，觀察小鼠的蟲現(xiàn)前期及原蟲血癥。結(jié)果顯示對照組小鼠在感染后7天內(nèi)全部出現(xiàn)原蟲血癥，而實(shí)驗(yàn)組即CSP 1-plus給藥組小鼠只有2/12在感染后第11~12天才自血中檢出原蟲(見表1)。另取24只Wister大鼠平均分成兩組，分別給予CSP 1-plus、等量的生理鹽水，30 min后分別自尾靜脈接種瘧原蟲子孢子40萬/只，感染后42 h取肝臟，用Cornoy’ s液固定，常規(guī)石蠟包埋，做連續(xù)切片，HE染色后光鏡下觀察肝臟內(nèi)的原蟲感染情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照鼠全部感染成功肝臟內(nèi)可見大量發(fā)育成熟的裂殖體，而CSP 1-plus實(shí)驗(yàn)組小鼠肝臟內(nèi)均未找到原蟲。
[0017]表1 CSP 1-plus體內(nèi)抑制瘧原蟲子孢子入侵小鼠肝細(xì)胞的結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白多肽CSP1-Plus在制備治療惡性瘧原蟲感染藥物中的應(yīng)用。
2.瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白多肽CSP1-plus編碼基因在制備治療惡性瘧原蟲感染藥物中的應(yīng)用。
3.含有權(quán)利要求2所述瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白多肽CSP1-plus編碼基因的重組表達(dá)質(zhì)粒在制備治療惡性瘧原蟲感染藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述應(yīng)用，其特征在于，所述藥物為惡性瘧原蟲子孢子感染抑制劑。`
【文檔編號】A61K48/00GK103611151SQ201310649160
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】朱家勇, 盧雪梅, 金小寶, 汪潔 申請人:廣東藥學(xué)院