一種具抗病毒功效的絡(luò)新婦屬蜘蛛有效部位及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具抗病毒功效的絡(luò)新婦屬蜘蛛有效部位及其制備方法。具體而言，本發(fā)明涉及絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位在制備抑制皰疹病毒感染的藥物中的應(yīng)用。該有效部位由粉碎或未粉碎的蜘蛛目絡(luò)新婦亞科絡(luò)新婦屬（Nephila?spp.）蟲體用溶劑提取、濃縮提取回收溶劑、大孔吸附樹脂柱層析、水洗、醇水溶液梯度洗脫方法純化；得到的有效部位經(jīng)減壓濃縮至無醇味、減壓濃縮或冷凍干燥，粉碎而得。本發(fā)明人經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，該有效部位具有抑制單純皰疹病毒HSV-1的功效，可以預(yù)期用于治療單純皰疹病毒引發(fā)的病毒感染和/或口腔潰瘍疾病。
【專利說明】一種具抗病毒功效的絡(luò)新婦屬蜘蛛有效部位及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體而言，具體而言，本發(fā)明涉及一種抑制單純皰疹病毒感染活性的絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位及其制備方法和醫(yī)藥用途。
技術(shù)背景
[0002]單純皰疹病毒在全球廣泛流行，人類是其唯一宿主。其直徑約為120~150微米，含有DNA的核位于中間，向外依次由包膜、體被、衣殼三種同心結(jié)構(gòu)組成,衣殼表面為162個殼微粒組成的3:3:2軸對稱的20面體，在低溫下可生存數(shù)月，濕熱50°C及干燥90°C 30分鐘滅活。單純皰疹病毒可分為I型和II型二種，I型皰疹病毒(HSV-1)主要感染腰以上部位的皮膚粘膜和器官，HSV-1主要通過呼吸道、皮膚和粘膜密切接觸傳播，99%的口唇粘膜、鼻前庭、眼結(jié)膜、咽喉部的炎癥及皰疹，口和口周圍發(fā)生的皰疹都是由I型皰疹病毒感染引起的。在發(fā)達(dá)國家如美國其感染率分別為兒童期(20-40%)和成年期(50-70%)。
[0003]單純皰疹病毒感染及其導(dǎo)致的口腔潰瘍易反復(fù)發(fā)作，目前尚無特效治療方法，臨床上主要的治療措施包括局部治療和全身治療，西醫(yī)治療以局部用碘甘油及維生素B1、B2和維生素C 口服，一般療效不甚明顯。嚴(yán)重、頑固的口腔潰瘍則需內(nèi)服激素類藥品、抗菌素類藥品等，使用此類藥物又存在較大的毒副作用和易使病人產(chǎn)生耐藥性和菌群失調(diào)的不足之處。如目前臨床常用的單純皰疹病毒感染治療藥物無環(huán)鳥苷即阿昔絡(luò)韋，主要適用于病毒復(fù)制的原發(fā)性感染和復(fù)發(fā)性感染，對潛伏感染難以發(fā)揮作用。
[0004]中藥對抗單純皰疹病毒感染所用之外用藥包括錫類散、冰硼散等外用制劑，但治療效果不十分理想；內(nèi)服藥包括牛黃解毒丸、牛黃上清丸等，又對本病癥無顯著的針對性。近期出現(xiàn)的不少新的口腔含片類藥物制劑如西瓜霜含片、華素片和溶菌酶含片等分別在口感、殺菌、抗炎方面有所進(jìn)步。但是有些又不適于哺乳期婦女、甲狀腺功能亢進(jìn)患者和碘過敏者。
[0005]因此，應(yīng)用現(xiàn)代病毒藥理學(xué)技術(shù)，開發(fā)出新的抗HSV-1感染以及治療口腔潰瘍天然藥物是十分必要的。避開核苷類抗病毒藥物的副作用，尋找創(chuàng)新性的先導(dǎo)化合物骨架，以期開發(fā)出新型抗單純皰疹病毒感染藥物或與已上市之抗HSV-1感染藥物聯(lián)用，是本發(fā)明的目的。
[0006]近期，隨著對生物資源和動物藥源的開發(fā)越來越取得進(jìn)展，伴隨著中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程加快，我國加大對傳統(tǒng)中醫(yī)藥資源研究開發(fā)的力度，越來越多的動物類藥物得到開發(fā)和利用。例如以大理學(xué)院主持研發(fā)的美洲大蠊醇提物純化制成的產(chǎn)品“康復(fù)新”，在燒傷、燙傷等外傷創(chuàng)面的良好療效。從美洲大蠊醇提物中純化精制而成的“心脈龍注射液”，具強(qiáng)心升壓，改善微循環(huán)，興奮呼吸，利尿，增加心、腦、肺、腎的血流量?！靶拿}龍注射液”主治:右心衰，也可治急慢性心衰，失血性休克，低血壓,室性早博,病竇性綜合癥,心腦缺血性疾病，為2004年通過SFDA審批的國家二類新藥(中藥)。上述藥物上市后，每年為藥物企業(yè)帶來15億元的年產(chǎn)值。大理學(xué)院云南省藥用昆蟲和蛛形類資源開發(fā)工程實驗室暨藥用特種昆蟲國家地方聯(lián)合工程研究中心進(jìn)一步用美洲大蠊中提取分離得到有效部位證實有強(qiáng)效抗病毒作用，已經(jīng)獲得2項授權(quán)國家發(fā)明專利(戴志明；楊榮新；張成桂；巫秀美；趙昱，一種蟑螂多肽類物質(zhì)的制備方法及其抗皰疹病毒醫(yī)藥用途，ZL201210137422.4 ;王曉雨、劉光明、宋麗艷、楊雷香、何正春、巫秀美、彭芳、董光平、朱孝慈、趙昱，美洲大蠊有效部位的用途，ZL200810060885.9)?；谏鲜龀晒膯l(fā)，在對云貴高原的藥用昆蟲抗病毒活性系列研究過程中，我們對蛛型綱絡(luò)新婦屬動物進(jìn)行了綜合采集、種屬鑒定和抗病毒活性藥效學(xué)研究。
[0007]蜘蛛入藥在我國早已有之?！短票静荨吩?“主蛇毒，溫瘧，霍亂，止嘔逆”；《日華子本草》云:“冷，無毒；斑蜘蛛治瘧疾，疔腫”；《長沙藥解》云:“炒枯存性研細(xì)用；破瘀消腫”；《本草綱目》云:“主口，脫肛，疔腫，胡臭”;《吉林中草藥》云:“治瘰疬，疔瘡，蜂、蝎蜇傷”;《中藥大辭典》云:“祛風(fēng)，消腫，解毒。治狐疝偏墜，中風(fēng)口，小兒慢驚、口噤。疳積；疔腫，瘰疬，瘡瘍，蜈蚣、蜂、蝎蜇傷”。以上歷史記錄表明其體內(nèi)必應(yīng)具有某些特殊的物質(zhì)和其特有的作用機(jī)制。
[0008]根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)，在針對藥物應(yīng)用方面，“蜘蛛”多為復(fù)方中的一味，公開資料中幾乎沒有蜘蛛作為單方應(yīng)用于防治單純皰疹病毒感染相關(guān)疾病的報導(dǎo)。用于治療“口腔疾病”、“口腔潰瘍”、“ 口瘡”方面的復(fù)發(fā)有:“一種治療治療皮膚潰爛和口腔潰瘍的藥液及加工工藝”(CN1205945C，王化金)，是用蜈蚣、蜘蛛、蜂王漿和酒精組成的復(fù)方；“一種治療口瘡疾病的藥物及其制備方法”(ZL201010280462.5，屈廣花，楊其偉，李根)，是由明礬、干地龍、無毒蜘蛛、吳茱萸、維生素B2、強(qiáng)的松6味藥物組成的中西藥復(fù)方，其中蜘蛛僅作為配伍用的小量輔助性用藥而已。已經(jīng)公開的其它幾個發(fā)明專利:(1)CN101972288A，張萬榮，“一種治療口腔疾病的藥粉及其制備方法”，是由5種藥材組成的復(fù)方制劑，用于治療小兒鵝口瘡、糜爛性口腔炎、爛嘴唇、牙周炎、牙痛等口腔疾病；(2) CN1895290A，姚茂龍，“喉凈散配方及制作方法”，是由3種藥材組成的復(fù)方制劑；用于治療白喉、扁桃體炎；(3)CN1387864A，路明正，“一種治療口腔潰瘍和咽喉疼痛的藥及其制備方法”，是由6種藥材組成的復(fù)方制劑，主要治療口瘡和咽喉疼痛；(4)CN1110146A，王仁學(xué)，“一種速效口瘡散”，是由5種藥材組成的復(fù)方制劑；主治各種口腔疾病，兼治一般疔瘡癤癬；(5)CN101632690A，聞恪玉，“一種治療膿毒的藥物”，是由7種藥材組成的復(fù)方制劑；治療慢性咽炎和口腔炎等癥；(6)CN101352463A，海棠，“一種治療腮腺炎的膏藥”，是由5種藥材組成的復(fù)方制劑；在上述公開資料中，蜘蛛均是作為配伍用的輔助性用藥?？梢姡瑢τ谶@一豐富的藥物資源，前人對其有一定的臨床藥用知識方面的認(rèn)識，但是對其抗病毒活性未經(jīng)系統(tǒng)和科學(xué)的研究開發(fā)，因此將其作為抗病毒藥物方面的科研及應(yīng)用仍屬空白。
[0009]絡(luò)新婦蛛，Nephila, silk spider,屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)蛛型綱(Arachnida)絡(luò)新婦亞科絡(luò)新婦屬昆蟲，云貴高原州廣泛分布。結(jié)大型金黃色網(wǎng)，網(wǎng)的直徑可達(dá)一公尺以上，以拉絲懸于樹間；生活在溫暖地區(qū)。約60種，云南省分布有3種。該屬蛛體色艷麗，雌成蛛個體較大，雄蛛小數(shù)倍。
[0010]根據(jù)《中藥大辭典》，其基元是指園網(wǎng)蛛科大腹園網(wǎng)蛛等全蟲。動物分類學(xué)中，將此屬歸為圓蛛總科絡(luò)新婦亞科絡(luò)新婦屬，是云南省優(yōu)勢資源。為明確云貴高原藥源廣泛分布的絡(luò)新婦屬蜘蛛是否具有抗單純皰疹病毒活性，及其抗病毒有效部位，指導(dǎo)進(jìn)一步弄清其中起主要藥理作用的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，從分子藥理學(xué)基礎(chǔ)上闡明絡(luò)新婦屬蜘蛛多種生物活性的作用機(jī)制，發(fā)明人對民間習(xí)用的絡(luò)新婦屬進(jìn)行了綜合采集和藥效學(xué)活性研究。本發(fā)明使用不同溶劑系統(tǒng)，測試了該生藥材的大孔樹脂提取物抑制I型單純皰疹病毒HSV-1的藥理活性。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位對HSV-1病毒具有較強(qiáng)的抑制活性，可以作為抗HSV-1病毒天然藥物進(jìn)一步深入開發(fā)，從而構(gòu)成本發(fā)明。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明的目的是提供了一種絡(luò)新婦屬蜘蛛具有抑制單純皰疹病毒活性的有效部位，該有效部位通過以下方法獲得:用溶劑提取經(jīng)粉碎或未粉碎的絡(luò)新婦屬蜘蛛蟲體、濃縮提取回收溶劑、大孔吸附樹脂柱層析、水洗、醇水溶液梯度洗脫方法純化；得到的抑制單純皰疹病毒活性有效部位經(jīng)減壓濃縮至無醇味、減壓濃縮或冷凍干燥，粉碎得產(chǎn)品。
[0012]本發(fā)明的另一目的是提供了將絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位應(yīng)用于制備抑制單純皰疹病毒感染的藥物中的用途。
[0013]本發(fā)明的再一目的是提供了一種絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位在制備治療口腔潰瘍的藥物中的用途。
[0014]本發(fā)明的又一目的是提供了一種防治由單純皰疹病毒引發(fā)的病毒感染和/或口腔潰瘍的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位和可藥用輔料。其制劑形式包括散劑、口服液、噴霧劑、沖劑、貼膜、注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、透皮吸收制劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑，及其控釋或緩釋劑型或納米制劑。
[0015]本發(fā)明中提供絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位的動物藥材可以選用絡(luò)新婦屬蜘蛛蟲體的任一部位，或它們的混合物?？梢允歉稍锶x，也可以是未經(jīng)干燥的全蟲或活體全蟲。
[0016]至今為止，以往文獻(xiàn)中并未發(fā)現(xiàn)有以本發(fā)明的工藝對絡(luò)新婦屬蜘蛛進(jìn)行提取的文獻(xiàn)報道，本大孔樹脂提取法精制純化得到的多肽類物質(zhì)具有意想不到的新的藥效活性效果。并且，迄今為止，中外文獻(xiàn)并無針對云南采集到的絡(luò)新婦屬蜘蛛進(jìn)行針對I型單純皰疹病毒HSV-1抑制活性研究的報道，本針對性的研究尚屬首次，其具有顯著的抑制體外培養(yǎng)HSV-1生長的活性也屬于意想不到的結(jié)果，因而可以預(yù)期進(jìn)一步開發(fā)成為治療單純皰疹病毒疾病的藥物或藥物組合物。由此完成了本發(fā)明。
[0017]本發(fā)明的有益之處在于:首次用大孔樹脂分離材料制備出絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位，并首次發(fā)現(xiàn)了其在開發(fā)防治HSV-1病毒感染藥物領(lǐng)域中的潛力，對于開發(fā)抑制單純皰疹病毒或治療口腔潰瘍創(chuàng)新型藥物提供了新的物質(zhì)基礎(chǔ)。本發(fā)明再一特點是:該屬蜘蛛生長繁殖能力旺盛，在云貴高原廣泛分布，便于養(yǎng)殖，每頭雌蛛每年可以孵育600-800只子代，有利于成為穩(wěn)定的生物藥物資源，同時也有利于貧困山區(qū)農(nóng)民養(yǎng)殖此類藥源性動物達(dá)到脫貧目的。具有潛在的巨大社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。該藥物原料來源于天然養(yǎng)殖，制備步驟簡便，成本低，污染小，利于大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實施方案
[0018]為了更好地理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面分別用該類絡(luò)新婦屬蜘蛛經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析精致純化過程，以及得到的絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位對單純皰疹病毒HSV-1生長的抑制作用實驗結(jié)果，說明其在抗病毒藥物研究領(lǐng)域中的新用途。
[0019]必須說明的是:本發(fā)明的制備及實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0020]實施例1:用D-101大孔吸附樹脂富集斑絡(luò)新婦有效部位
[0021]1.1斑絡(luò)新婦醇提物的制備
[0022]新鮮捕捉到的斑絡(luò)新婦蜘蛛250頭(采自思茅地區(qū)，活體標(biāo)本由大理學(xué)院云南省藥用昆蟲及蛛形類資源利用開發(fā)工程實驗室楊自忠教授鑒定為斑絡(luò)新婦Nephila piIipesFabricius)，先浸入溫度為5°C的90%甲醇水溶液中半小時，取出在組織勻漿機(jī)下勻漿，蟲體勻漿以75%甲醇水溶液150毫升，于10°C下浸泡提取3次，每次4小時。過濾出提取液，合并提取液，在10°C下減壓濃縮至干，真空冷凍干燥，即得斑絡(luò)新婦甲醇水溶液提取物。
[0023]1.2D - 101大孔吸附樹脂柱層析制備斑絡(luò)新婦提取物有效部位
[0024]斑絡(luò)新婦甲醇水溶液提取物1.0克，用2克D - 101大孔吸附樹脂吸附拌樣，上25克D - 101大孔吸附樹脂柱(柱內(nèi)直徑15毫米，高度25毫米)，先用雙蒸水150毫升洗脫，續(xù)用30%乙醇-水溶液150毫升洗脫；續(xù)用65%乙醇-水溶液200毫升洗脫，取65%乙醇-水溶液洗脫液100毫升減壓濃縮至干，冷凍真空干燥，即得斑絡(luò)新婦提取物有效部位49.0暈克。
[0025]實施例2:用D-101大孔吸附樹脂富集棒絡(luò)新婦有效部位
[0026]2.1棒絡(luò)新婦乙醇水溶液提取物的制備
[0027]將捕捉到的棒絡(luò)新婦蜘蛛160頭(采自大理地區(qū)，活體標(biāo)本由大理學(xué)院云南省藥用昆蟲及蛛形類資源利用開發(fā)工程實驗室楊自忠教授鑒定為棒絡(luò)新婦Nephila clavataL.Koch)，用沸水燙死，之后曬干，研缽磨粉，蟲體粉以70%乙醇水溶液50毫升，于75°C下加熱提取3次，每次I小時。過濾出提取液，合并提取液，在10°C下減壓濃縮至干，真空冷凍干燥，即得棒絡(luò)新婦乙醇水提取物。
[0028]2.2D - 101大孔吸附樹脂柱層析制備棒絡(luò)新婦提取物有效部位
[0029]棒絡(luò)新婦甲醇水溶液提取物0.5克，用2克D - 101大孔吸附樹脂吸附拌樣，上25克D - 101大孔吸附樹脂柱(柱內(nèi)直徑15，高度25)，先用雙蒸水100毫升洗脫，續(xù)用25%乙醇-水溶液100毫升洗脫；續(xù)用65%乙醇-水溶液200毫升洗脫，取70%乙醇-水溶液洗脫液100毫升減壓濃縮至干，冷凍真空干燥，即得棒絡(luò)新婦提取物有效部位21.6毫克。
[0030]本發(fā)明中制備得到的絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位原料藥用制藥領(lǐng)域中的常規(guī)方法，結(jié)合中、西藥制藥中常規(guī)的可藥用輔料，可以制成各種藥物組合物，如散劑、口服液、噴霧劑、沖劑、貼膜、注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、透皮吸收制劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑，或上述劑型的控釋或緩釋劑型或納米制劑。這些藥物組合物可以用于預(yù)防或/和治療由單純皰疹病毒HSV-1引發(fā)的病毒感染和/或口腔潰瘍。
[0031]本發(fā)明所涉及的絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位及其藥物組合物和各種制劑還可以與現(xiàn)已上市的治療單純皰疹病毒感染、口腔潰瘍的常用藥物聯(lián)合或交叉使用，制備得到具有治療單純皰疹病毒感染、口腔潰瘍的組合物或復(fù)方制劑?？山M合的藥劑例子包括阿昔絡(luò)韋ACV及其衍生物VCV、FCV、泛昔絡(luò)韋PCV、阿糖腺苷(ara-T)、溴乙烯去氧鳥苷(BVDU)、膦甲酸(PFA)、更昔絡(luò)韋(GCV)等。此外，其還可以與神經(jīng)痛鎮(zhèn)痛藥物以及解熱鎮(zhèn)痛藥物合并用藥。
[0032]下面通過藥理相關(guān)實施例的方式說明該類經(jīng)大孔吸附樹脂柱層析后的斑絡(luò)新婦提取物有效部位和棒絡(luò)新婦提取物有效部位凍干粉原料對I型單純皰疹病毒抑制作用的藥理實驗結(jié)果。實驗結(jié)果說明其在抑制I型單純皰疹病毒感染和防治口腔潰瘍的藥物研究領(lǐng)域中的用途。藥理實施例給出了代表性有效部位的部分活性數(shù)據(jù)。同樣必須說明，本發(fā)明的藥理實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實質(zhì)對本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0033]藥理實施例1:采用MTT法測定斑絡(luò)新婦提取物有效部位對Vero細(xì)胞的細(xì)胞毒性，以及用微量細(xì)胞病變抑制(CPE)法研究斑絡(luò)新婦提取物有效部位對HSV-1的抑制作用試驗
[0034]1.1實驗材料與樣品
[0035]1.1.1病毒:單純抱疫病毒-1型(Herpes simplex virus-l, HSV-1),大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫教研室提供。
[0036]1.1.2細(xì)胞:Vero細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞用含10%小牛血清得RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，維持液為含1.0%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。
[0037]1.1.3 試劑:
[0038]1.1.3.1RPMI1640 培養(yǎng)基購自 Gibco 公司；
[0039]1.1.3.2MTT =Amresco公司產(chǎn)品，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司分裝；
[0040]1.1.3.3小牛血清:杭州四季青生物工程有限公司；
[0041]1.1.3.4青霉素: 石家莊制藥集團(tuán)有限公司；
[0042]1.1.3.5鏈霉素:石家莊制藥集團(tuán)有限公司；
[0043]1.1.3.6細(xì)胞消化液:含0.25%胰蛋白酶，0.02%EDTA_Na2，用Hank，s液配制；
[0044]1.1.3.7阿昔絡(luò)韋:湖北科益藥業(yè)股份有限公司，0.25克/支。
[0045]1.1.4 儀器:
[0046]1.1.4.1CO2 培養(yǎng)箱:2306-2 型，Shellab 公司；
[0047]1.1.4.2倒置顯微鏡:XD_2型，重慶光電儀器有限公司；
[0048]1.1.4.3 生物安全柜:A/B3 型，Labconco 公司；
[0049]1.1.4.4 酶標(biāo)儀:Synergy-HT 型，B1-TEK 公司；
[0050]1.1.4.5立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器:LDZX-40BI型，上海申安醫(yī)療器材廠；
[0051]1.1.4.6紫外分光光度計:UV-1201型，北京瑞利分析儀器公司；
[0052]1.1.4.7 除菌過濾器:Sterifil500 型，Millipore 公司；
[0053]1.1.4.8超純水系統(tǒng):UPWS-1_60D型，杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司。
[0054]1.2細(xì)胞培養(yǎng)和病毒傳代:
[0055]將Ve1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%滅活小牛血清，10U/毫升青霉素和100微克/毫升的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37°C，5% 二氧化碳，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將HSV-1加入長有單層Vero細(xì)胞的細(xì)胞瓶中，置37°C，5 %二氧化碳，100 %相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，收集培養(yǎng)上清，置低溫下保存。
[0056]1.3實驗方法:
[0057]1.3.1采用MTT [3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽]法測定斑絡(luò)新婦提取物有效部位對Vero細(xì)胞生長的抑制作用:
[0058](I)測試藥物:實施例1制備得到的斑絡(luò)新婦提取物有效部位；阿昔洛韋(ACV)為陽性對照藥物。
[0059](2)取對數(shù)生長期的Vero細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成IXlO5/毫升，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100微升，在37°C，5%二氧化碳，100%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后加入用培養(yǎng)基稀釋的斑絡(luò)新婦提取物有效部位，濃度分別為800微克/毫升，400微克/毫升，200微克/毫升和40微克/毫升,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),培養(yǎng)72小時后,每孔加入MTT試劑10微升，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄去培養(yǎng)基，每孔加入二甲亞砜200微升，用振蕩器振蕩20分鐘，在570nm波長下用酶標(biāo)儀測定OD值。以只加培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔為對照孔。
[0060]抑制率(%)=(對照孔OD值-實驗組OD值)/對照孔OD值X 100%。
[0061]實驗重復(fù)三次。根據(jù)不同濃度下對細(xì)胞生長的抑制率，計算對細(xì)胞生長的半數(shù)抑制濃度(TD50)。
[0062]1.3.2用微量細(xì)胞病變抑制法測定樣品對病毒生長抑制作用:取對數(shù)生長期的Vero細(xì)胞，用培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋成I X 15/毫升，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37°C，5 %二氧化碳，100%相對濕度培養(yǎng)24小時，加入10TCId50的病毒100微升，傾出病毒，分別加入不同濃度的斑絡(luò)新婦提取物有效部位，同時設(shè)正常細(xì)胞對照和病毒感染對照，37°C，5%二氧化碳，100%相對濕度培養(yǎng)48小時后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變。以五級標(biāo)準(zhǔn)作為判斷細(xì)胞病變的標(biāo)準(zhǔn)；一:細(xì)胞無變化，分值為 8分；+:25 %以下細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為6分；++:25%~50%細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為4分；+ + +:50%~75%細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為2分；+ + + +:75%以上細(xì)胞出現(xiàn)病變，分值為O分。計算半數(shù)抑制濃度(IC5tl)。同時用阿昔洛韋作為陽性對照藥。
[0063]計算樣品治療指數(shù):TI =半數(shù)中毒濃度(TD5tl) /半數(shù)抑制濃度(IC5(I)。
[0064]1.4實驗結(jié)果:
[0065]結(jié)果如表一顯示，斑絡(luò)新婦提取物有效部位能確切抑制HSV-1的復(fù)制，其對HSV-1的半數(shù)抑制濃度和治療指數(shù)如表所示。
[0066]表一.斑絡(luò)新婦提取物有效部位對HSV-1的抑制作用
[0067]

【權(quán)利要求】
1.一種絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位，其特征是:該有效部位是用溶劑提取經(jīng)粉碎或未粉碎的絡(luò)新婦屬蜘蛛蟲體、濃縮提取回收溶劑、大孔吸附樹脂柱層析、水洗、醇水溶液梯度洗脫方法純化，減壓濃縮至無醇味、減壓濃縮或冷凍干燥，粉碎而得；其中大孔吸附樹脂柱層析所用材料是D-1Ol大孔吸附樹脂。
2.權(quán)利要求1所述的絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位在制備抑制皰疹病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位在制備抑制I型單純皰疹病毒HSV-1感染的藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位在制備治療口腔潰瘍的藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位，其特征是:絡(luò)新婦屬蜘蛛蟲體是指絡(luò)新婦屬蜘蛛蟲體的任一部位，或它們的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位，其特征是:絡(luò)新婦屬蜘蛛蟲體是指絡(luò)新婦屬蜘蛛干燥全蟲、未經(jīng)干燥的全蟲或活體全蟲。
7.一種用于防治由單純皰疹病毒引發(fā)的病毒感染和/或口腔潰瘍的藥物或藥物組合物，其含有治療有效量的絡(luò)新婦屬蜘蛛提取物有效部位和可藥用輔料。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，其制劑形式是散劑、口服液、噴霧劑、沖劑、貼膜、注射劑、片劑、膠囊劑、氣霧劑、栓劑、透皮吸收制劑、滴丸劑、外用搽劑、軟膏劑。
【文檔編號】A61P31/22GK104042632SQ201310625000
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月1日
【發(fā)明者】楊自忠, 朱振東, 馬艷滟, 張成桂, 趙昱 申請人:大理學(xué)院