一種豬圓環(huán)病毒2型的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種應用生物反應器培養(yǎng)pK-15A1#細胞生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型的生產(chǎn)工藝，包括如下技術(shù)步驟：（1）選擇pK-15A1#細胞作為增殖圓環(huán)病毒2型用細胞；（2）采用生物反應器為細胞培養(yǎng)的工具；（3）同步接毒的病毒培養(yǎng)工藝；（4）pK-15A1#細胞在生物反應器中微載體上的培養(yǎng)；（5）豬圓環(huán)病毒2型病毒在生物反應器微載體上細胞內(nèi)的增殖培養(yǎng)；（6）豬圓環(huán)病毒2型病毒培養(yǎng)物的收獲。本發(fā)明能降低生產(chǎn)成本，投入產(chǎn)出比較傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶生產(chǎn)工藝提高5-10倍。生產(chǎn)周期短，占用場地小，易于快速擴大生產(chǎn)規(guī)模，環(huán)境污染少且易于處理，自動化程度高，用人少，質(zhì)量穩(wěn)定，可顯著降低成本、提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。
【專利說明】—種豬圓環(huán)病毒2型的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種應用生物反應器細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)疫苗的方法，可用于工業(yè)化生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型疫苗，替代傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法生產(chǎn)工藝。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗生產(chǎn)國內(nèi)主要都采用細胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方法實現(xiàn)，該傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)半成品抗原效價低，難以達到配苗要求，需要進行勞動強度大，耗時長、效率低，生產(chǎn)成本高；容易被環(huán)境污染；不同生產(chǎn)批次間或同一生產(chǎn)批次不同瓶間的差異大；難以擴大生產(chǎn)；容易出現(xiàn)被細菌或其它病毒污染而致的疫苗質(zhì)量隱患，涉及生物安全和公共衛(wèi)生問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有細胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)法技術(shù)存在的不足之處，提供一種應用生物反應器細胞微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗的方法。該方法可以大量降低生產(chǎn)成本，而且生產(chǎn)周期短，占用場地小，易于快速擴大生產(chǎn)規(guī)模，環(huán)境污染少且易于處理，自動化程度高，用人少，質(zhì)量易于實現(xiàn)均衡穩(wěn)定。可顯著提高疫苗產(chǎn)量和質(zhì)量。
[0004]為達到上述目的，本發(fā)明采取了如下的技術(shù)方案:
[0005]—種豬圓環(huán)病毒2型的生產(chǎn)方法,是選擇生物反應器作為培養(yǎng)工具；選擇微載體作為細胞貼附的生長載體；選擇PK-15A1#細胞作為制苗用細胞；
[0006](I)、制苗用細胞的傳代與接種
[0007]將致密單層的PK-15A1#細胞經(jīng)消化液消化分散后取樣計數(shù)，用含10%NBCS的MEM生長液將PK-15A1#細胞調(diào)整為2-3X IO5個/ml，再接種到生物反應器上進行培養(yǎng)；所述培養(yǎng)條件為:溫度為 37.00C ( ±0.2°C )，pH 值為 7.40，DO 為 40%_80%，轉(zhuǎn)速為 40rpm-80rpm ；
[0008](2)、制苗用細胞的接毒
[0009]將在生物反應器中培養(yǎng)的pK-15Al#細胞按照體積比1%_5%接種PCV2病毒，接毒后按照所述培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)；
[0010](3)、接毒后的培養(yǎng)
[0011]接毒后在細胞培養(yǎng)12h時補加200μπιΟ1/1的必需氨基酸；在細胞培養(yǎng)約24h時更換含10%NBCS的MEM生長液一次；在細胞培養(yǎng)48h時，細胞長滿微載體50%_60%，吸出MEM生長液后，用預熱的無菌PBS洗滌兩次，再加入含2%NBCS和1%D-氨基葡萄糖的MEM維持液繼
續(xù)培養(yǎng)；
[0012](4)、病毒的收獲與效價檢測
[0013]維持液培養(yǎng)后約54h后停止攪拌,靜置5min后吸出上清作為一收,此后加入MEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)48h，靜置后吸出上清，收獲為二收，此后加入MEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)48h，此時將微載體和培養(yǎng)液一起全部收獲，凍融三次后作為抗原保存。
[0014]上述技術(shù)方案中，生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧、攪拌速度等參數(shù)，適用于微載體培養(yǎng)的生物反應器，容積為3L-3000L。
[0015]上述技術(shù)方案中，微載體微載體，微載體在使用前需清洗、滅菌，方法如下:
[0016]I)用PBS浸泡微載體2小時以上；
[0017]2 )用PBS清洗微載體3遍；
[0018]3)用PBS浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌三十分鐘。
[0019]上述技術(shù)方案中，胰酶消化液配方為:質(zhì)量分數(shù)分別是0.25%的胰酶(1:250)消化液；細胞生長液的配方 為=MEM的體積比例為88%，NBCS的比例為10%，雙抗的比例為1%，L-Glutamin 的比例為 1%。
[0020]上述技術(shù)方案中，種毒接種量為1_5%，病毒培養(yǎng)液配方為:含血清1-2%的MEM液、加適量的雙抗，pH調(diào)整為7.2-7.4。培養(yǎng)溫度為37.0±0.2) °C。
[0021]上述技術(shù)方案中，生物反應器設定參數(shù)為:培養(yǎng)溫度培養(yǎng)溫度33-38 °C、pH6.5-7.68、溶氧 30%-70%、攪拌速度 40_80rpm。
[0022]健康細胞的接毒采用細胞同步接毒工藝，細胞同步接毒工藝為:
[0023](I)采用無支原體和PCV2/PCV1污染的pK_15Al#細胞作為制苗用細胞；
[0024](2)細胞接種到微載體上的密度為2-3X IO5個/ml ；
[0025](3)細胞在生物反應器上培養(yǎng)的條件為:溫度:37.0°C(±0.2°C)，pH值:7.40，D0:40%-80%，轉(zhuǎn)速為 40rpm-80rpm ；
[0026](4)細胞接毒按照1%_5% (體積比)接種PCV2種毒，接毒后按照之前既定的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)；
[0027](5)在細胞培養(yǎng)12h時應酌情補加200 μ mo I/L的必須氨基酸；在細胞培養(yǎng)約24h
時應換細胞培養(yǎng)用生長液一次；
[0028](6)在細胞培養(yǎng)至約48h時取樣觀察細胞應該長滿微載體約60%_70%，此時應該吸出生長液，加入適量預熱的無菌PBS洗滌兩次并抽出PBS，加入含2%NBCS和1%D_氨基葡萄糖的MEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)；
[0029](7)維持液培養(yǎng)后約54h后停止攪拌,靜置5min后吸出上清作為一收；
[0030](8)此后加入適量的MEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)48h，靜置后吸出上清，收獲為二收；
[0031]此后加入適量的MEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)48h，此時將微載體和培養(yǎng)液一起全部收獲，凍融三次后作為抗原保存為三收。
[0032]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0033](I)用生物反應器微載體細胞培養(yǎng)技術(shù)代替轉(zhuǎn)瓶細胞培養(yǎng)技術(shù)制造豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗，可解決生產(chǎn)效率低、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、病毒效價低的問題，通過生產(chǎn)技術(shù)和生產(chǎn)工藝的改變，全面提升疫苗質(zhì)量和產(chǎn)量，提高疫苗的安全性。
[0034](2)本發(fā)明可以大量降低生產(chǎn)成本，而且生產(chǎn)周期短，每個生產(chǎn)周期僅需5-6天，相比現(xiàn)有轉(zhuǎn)瓶細胞培養(yǎng)法的18-30天以上明顯縮短。
[0035]( 3 )應用生物反應器進行疫苗生產(chǎn)，具有自動化程度高，用人少，生產(chǎn)工藝簡單穩(wěn)定。易操作、產(chǎn)量大占用場地小，易于快速擴大生產(chǎn)規(guī)模。質(zhì)量易于實現(xiàn)均衡穩(wěn)定。
[0036](4)應用本方法生產(chǎn)疫苗，產(chǎn)品病毒效價比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶細胞培養(yǎng)法提高10-20倍，成本降低3-4倍。產(chǎn)品質(zhì)量均一，易于規(guī)?；a(chǎn)，整個生產(chǎn)工藝過程不涉及傳統(tǒng)生產(chǎn)方法所具有的其他生物安全和公共衛(wèi)生問題。【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為本發(fā)明的制備流程圖。
【具體實施方式】
[0038]以下結(jié)合說明書附圖及具體實施例來對本發(fā)明作進一步的描述。
[0039](I)選擇生物反應器作為培養(yǎng)的手段:3L-3000L生物反應器。
[0040](2)選擇微載體作為細胞貼附生長的載體
[0041]微載體的清洗、滅菌方法:
[0042]I)稱量Cytodex微載體3_5g/L、使用適量PBS液浸泡三小時。
[0043]2 )每次用適量PBS液清洗3遍。
[0044]3)加入適量PBS液浸泡微載體，121°C蒸汽滅菌三十分鐘。
[0045](3)選擇pK-15Al#細胞作為制苗用細胞:
[0046](4)制苗用細胞的傳代與培養(yǎng):
[0047]上述細胞經(jīng)胰酶消化液(含0.25%胰酶(1:250))消化傳代，以生長液繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37.0 ( ±0.2) ° C。形成50-60%單層時，用于繼續(xù)傳代或接種于生物反應器中進行微載體培養(yǎng)。
[0048](5)細胞毒種的繁殖:
[0049]用細胞維持液，將豬圓環(huán)病毒2型種毒按1-5%比例接種生長良好的上述細胞單層，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為33-38°C。至培養(yǎng)50h左右時收獲病毒液；進行無菌檢驗和效力檢驗，合格后將該病毒作為生產(chǎn)用種毒。
[0050](6) PK-15A1#克隆細胞在生物反應器中的微載體培養(yǎng):
[0051]取轉(zhuǎn)瓶上生長良好的PK-15A1#克隆細胞，經(jīng)胰酶消化液消化制備為細胞懸液，細胞計數(shù)后接種反應器中。生物反應器設定如下參數(shù)溫度37°C、pH7.2-7.4、攪拌速度40-80rpm、溶氧含量40-80%進行反應器自動控制培養(yǎng)。
[0052](7)制苗毒液的繁殖:
[0053]培養(yǎng)后第三日待觀察微載體上細胞長滿60%后更換為含1%D_氨基葡萄糖的維持液進行接毒操作。設定溫度33-38°C、pH7.2-7.6、攪拌速度40_80rpm、溶氧含量30-60%等培養(yǎng)參數(shù)，進行反應器自動控制培養(yǎng)。接毒后大約50h左右密切關(guān)注DO值，待DO值呈明顯上升趨勢，停止反應器攪拌，待微載體全部沉到反應器底部后，分別收獲上清液和微載體。
[0054](8)收獲病毒液的處理:
[0055]經(jīng)次反復凍融后離心或過濾去除細胞碎片后-20°C冷凍保存作為半成品。
[0056]1、收獲病毒液毒價的測定:
[0057]將以上收獲的細胞病毒液混合后取樣，測定毒價。病毒含量應≥105_5TCID5ciAil。
[0058]2、半成品檢驗
[0059]無菌檢驗:按《中華人民共和國獸用生物制品質(zhì)量標準》附錄301頁進行，無菌生長。
[0060]3、成品檢驗
[0061]疫苗制造和成品檢驗按《豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗(DBN-SX07株)制造及檢驗規(guī)程》要求進行，應符合要求。`
【權(quán)利要求】
1.一種豬圓環(huán)病毒2型的生產(chǎn)方法，其特征在于: 選擇生物反應器作為培養(yǎng)工具；選擇微載體作為細胞貼附的生長載體；選擇PK-15A1#細胞作為制苗用細胞； (1)、制苗用細胞的傳代與接種 將致密單層的PK-15A1#細胞經(jīng)消化液消化分散后取樣計數(shù)，用含10%NBCS的MEM生長液將PK-15A1#細胞調(diào)整為2-3X IO5個/ml，再接種到生物反應器上進行培養(yǎng)；所述培養(yǎng)條件為:溫度為 37.0°C ±0.2°C，pH 值為 7.40，DO 為 40%_80%，轉(zhuǎn)速為 40rpm-80rpm ； (2)、制苗用細胞的接毒 將在生物反應器中培養(yǎng)的PK-15A1#細胞按照體積比1%_5%接種PCV2病毒，接毒后按照所述培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)； (3)、接毒后的培養(yǎng) 接毒后在細胞培養(yǎng)12h時補加200 μ mo I/L的必需氨基酸；在細胞培養(yǎng)約24h時更換含10%NBCS的MEM生長液一次；在細胞培養(yǎng)48h時，細胞長滿微載體50%_60%，吸出MEM生長液后，用預熱的無菌PBS洗滌兩次，再加入含2%NBCS和1%D-氨基葡萄糖的MEM維持液繼續(xù)培養(yǎng); (4 )、病毒的收獲與效價檢測 維持液培養(yǎng)后約54h后停止攪拌，靜置5min后吸出上清作為一收，此后加入MEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)48h，靜置后吸出上清，收獲為二收，此后加入MEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)48h，此時將微載體和培養(yǎng)液一起全部收獲，凍融三次后作為抗原保存。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒2型的生產(chǎn)方法，其特征在于:所述的生物反應器容積為3L-3000L，所采用的微載體為Cytodex系列，微載體的使用濃度為3_5g/L，生物反應器在使用前需要進行電極校正，滅菌，平衡，方法如下； (1)生物反應器的準備: 根據(jù)培養(yǎng)的體積選擇合適的生物反應器，連接好各種管道和補料，換液的接口，接上T，pH, DO電極，參照使用說明書上的方法進行電極的校正； (2)微載體的準備: 根據(jù)培養(yǎng)的體積和選定的微載體濃度稱取適量的Cytodex-1微載體于已娃化處理的玻璃瓶中或不銹鋼容器中，加入約50倍微載體質(zhì)量的PBS緩沖液浸泡(如IOg微載體加入500ml的PBS) 30min，此后更換新鮮的PBS繼續(xù)浸泡2h ;更換10倍體積的PBS于待滅菌的生物反應器中準備滅菌； (3)滅菌: 滅菌前認真檢查各管道和接頭確保連接完好后進行氣密性測試，測試合格后方可準備進行滅菌；根據(jù)生物反應器的規(guī)模，5L及5L以下一般采用離線滅菌，在高壓鍋中121°C高壓30min，滅菌結(jié)束后取出自然冷卻；10L及IOL以上的生物反應器通常采用在位滅菌的方式滅菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的豬圓環(huán)病毒2型的生產(chǎn)方法，其特征在于:制苗用細胞的接毒采用細胞同步接毒工藝。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的豬圓環(huán)病毒2型的生產(chǎn)方法，其特征在于:細胞同步接毒工藝為:(1)采用無支原體和PCV2/PCV1污染的PK-15A1#細胞作為制苗用細胞； (2)細胞接種到微載體上的密度為2-3XIO5個/ml ； (3)細胞在生物反應器上培養(yǎng)的條件為:溫度:37.(TC (±0.2°C)，pH值:7.40，DO:40%-80%，轉(zhuǎn)速為 40rpm-80rpm ； (4)細胞接毒按照1%-5%(體積比)接種PCV2種毒，接毒后按照之前既定的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)； (5)在細胞培養(yǎng)12h時應酌情補加200μ mo I/L的必須氨基酸；在細胞培養(yǎng)約24h時應換細胞培養(yǎng)用生長液一次； (6)在細胞培養(yǎng)至約48h時取樣觀察細胞應該長滿微載體約60%-70%，此時應該吸出生長液，加入適量預熱的無菌PBS洗滌兩次并抽出PBS，加入含2%NBCS和1%D_氨基葡萄糖的MEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)； (7)維持液培養(yǎng)后約54h后停止攪拌，靜置5min后吸出上清作為一收； (8)此后加入適量的MEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)48h，靜置后吸出上清，收獲為二收； 此后加入適量的MEM維持液繼續(xù)培養(yǎng)48h，此時將微載體和培養(yǎng)液一起全部收獲，凍融三次后作為抗原保存為三收。`
【文檔編號】A61K39/12GK103550769SQ201310529147
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月30日
【發(fā)明者】徐宏軍, 丁光星, 任麗, 趙英杰, 胡來根, 劉玉才 申請人:成都天邦生物制品有限公司