一種含有未甲基化CpG的DNA序列（CpG-DNA）及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種在牙鲆中具有免疫刺激效應(yīng)的含有未甲基化CpG的DNA序列及其在抗病毒中的應(yīng)用。含有未甲基化CpG的DNA序列（CpG-DNA）為牙鲆中具有免疫刺激效應(yīng)的CpG-DNA序列，由序列表SEQ?ID?No.1中的堿基序列所示。本發(fā)明的CpG－DNA能夠使魚類抵御腫大細胞病毒的侵染。本發(fā)明的CpG－DNA可以作為疫苗佐劑使用，能夠增強疫苗的特異性免疫效應(yīng)。
【專利說明】—種含有未甲基化CpG的DNA序列(CpG-DNA)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種在牙鲆中具有免疫刺激效應(yīng)的含有未甲基化CpG的DNA序列及其在抗病毒中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]CpG-DNA是含有未甲基化CpG的DNA序列，是原核生物DNA序列的一種特征。在進化過程中，脊椎動物獲得了針對CpG — DNA的免疫識別系統(tǒng)，以此對微生物病原入侵做出保護性免疫反應(yīng)，包括通過與Toll樣受體家族成員9作用，激活Thl誘導(dǎo)的細胞免疫和體液免疫等。已有研究表明，CpG — DNA具有種屬特異性，不同物種中有效的CpG — DNA序列不同，并且不同CpG — DNA在同一物種中誘發(fā)的免疫應(yīng)答亦不同。牙鲆是我國重要的養(yǎng)殖海水魚類，近年來其養(yǎng)殖業(yè)不斷受到微生物病害影響。雖然現(xiàn)階段發(fā)現(xiàn)了能在牙鲆中誘發(fā)抗細菌感染的CpG — DNA。但對于能在牙鲆中誘發(fā)顯著抗病毒感染的CpG — DNA并沒有相關(guān)的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明目的在于提供一種在牙鲆中具有免疫刺激效應(yīng)的含有未甲基化CpG的DNA 序列及其在抗病毒中的應(yīng)用。
[0004]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0005]一種含有未甲基化CpG的DNA序列，含有未甲基化CpG的DNA序列(CpG-DNA)為牙鲆中具有免疫刺激效應(yīng)的CpG-DNA序列，由序列表SEQ ID N0.1中的堿基序列所示。
[0006]含有未甲基化CpG的DNA序列的應(yīng)用，所述CpG-DNA序列可制備成抗病毒因子的藥物。所述CpG-DNA序列可制備成抗腫大細胞的病毒因子的藥物。
[0007]含有未甲基化CpG的DNA序列的應(yīng)用，其特征在于:所述CpG-DNA序列作為疫苗佐劑。
[0008]本發(fā)明具有如下優(yōu)點:
[0009]1.能夠抑制病毒侵染。本發(fā)明的CpG — DNA能夠使魚類抵御腫大細胞病毒的侵染。
[0010]2.具有疫苗佐劑效應(yīng)。本發(fā)明的CpG - DNA可以作為疫苗佐劑使用，能夠增強疫苗的特異性免疫效應(yīng)。
【具體實施方式】
[0011]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進行舉例描述，而非以任何形式對本發(fā)明進行限制。
[0012]在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法:
[0013]1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收、細菌基因組DNA提取皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應(yīng)試劑盒。[0014]2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press2001)；
[0015]3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于“紐英倫生物技術(shù)有限公司”，北京。
[0016]4.所有寡核苷酸合成皆由“上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司”合成。
[0017]實施例1
[0018]牙鲆特異性CpG - DNA序列具序列表SEQ ID N0.1中的堿基序列。
[0019]序列表SEQ ID N0.1 為:
[0020]GGCGCGCGTCGCGCGCTA
[0021](a)序列特征:
[0022]?長度:18
[0023]?類型:核苷酸序列
[0024]籲鏈型:單鏈
[0025]?拓撲結(jié)構(gòu):線性
[0026](b)分子類型:DNA
[0027](C)假設(shè):否`
[0028](d)反義:否
[0029](e)最初來源:人工設(shè)計
[0030]實施例1
[0031]CpG - DNA作為抗病毒因子的應(yīng)用
[0032]I)病毒懸液的制備。將腫大細胞病毒RBIV-Cl (具體制備方法見Zhang M, Xiao Z, Hu Y, Sun L.Characterization of a megalocytivirus from cultured rock bream, Oplegnathus fasciatus(Temminck&Schlege), in China.Aquae Res.2012;43:556 - 64)于 PBS中稀釋至5xl06copies/ml,即為病毒懸液。
[0033]所述PBS 組成成分按重量百分比計:0.8%NaCl,0.02%KC1,0.358%Na2HP04.12H20, 0.024%NaH2P04,98.798% 蒸餾水。
[0034]2)將10條牙鲆(每條重約Sg)隨機分為2組，每組5條。將這2組分別命名為A 和B組。將A組的每條魚肌肉注射IOOul含有IOug CpG - DNA的PBS，將B組(對照組) 的每條魚注射IOOul PBS0 I天后將A和B組魚每條腹腔注射IOOul上述步驟I)的病毒懸液。在感染后第3d和5d，取魚脾臟組織，提取DNA，用絕對定量PCR法檢測組織中病毒含量 (具體方法見上述參考文獻)。結(jié)果表明A組魚在感染后3d和5d的病毒數(shù)(分別為1.1xlO3/ mg 和 3.8xl03/mg)皆顯著(P〈0.01)低于 B 組魚的病毒數(shù)(1.8xl04/mg 和 4.3xl04/mg)。因此，CpG — DNA具有明顯的抗病毒效應(yīng)。
[0035]實施例2
[0036]CpG - DNA作為疫苗佐劑的應(yīng)用
[0037]步驟I)疫苗免疫注射
[0038]將DNA 疫苗質(zhì)粒 pCN86 (其構(gòu)建過程見 Zhang M, Hu Y，Xiao Z, Sun Y， Sun L.Construction and analysis of experimental DNA vaccines against megalocyti virus.Fish Shellfish Immunol.2012; 33:1192 - 8.)在 PBS 中稀釋至 200ug/ml。將CpG - DNA在PBS中稀釋至200ug/ml。將pCN86與CpG — DNA稀釋液等體積混合， 即為pCN86+CpG - DNA混合液。將pCN86與PBS等體積混合，即為pCN86疫苗液。將15條牙鲆(同上)隨機分為3組，每組5條。將這3組分別命名為A、B和C。將A組的每條魚肌肉注射0.lmlpCN86疫苗液，將B組的每條魚肌肉注射0.1ml pCN86+CpG 一 DNA混合液，將 C組(對照組)的每條魚肌肉注射0.1ml PBS。
[0039]步驟2)病毒懸液的制備，參見實施例1中相應(yīng)的記載。
[0040]步驟3)攻毒感染和免疫保護效應(yīng)檢測
[0041]在上述步驟I)免疫后第30天，將3組的每條魚腹腔注射IOOul上述步驟2)的病毒懸液。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組魚的總死亡數(shù)目:A組，20條；B組，11條；C組，28條。利用下列公式計算相對免疫保護效率(RPS):
[0042]RPS=100x(l 一免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)
[0043]由此得出免疫pCN86和pCN86+CpG — DNA混合液組魚的RPS分別為29%和61%，其中免疫pCN86+CpG - DNA混合液組魚的RPS顯著(P〈0.01)高于免疫pCN86組。因此，CpG — DNA顯著提高了疫苗pCN86的免疫保護效應(yīng)。
[0044]結(jié)論:本發(fā)明的CpG - DNA既具有抗病毒效應(yīng)也具有疫苗佐劑效應(yīng)。
【權(quán)利要求】
1.一種含有未甲基化CpG的DNA序列，其特征在于:含有未甲基化CpG的DNA序列 (CpG-DNA)為牙鲆中具有免疫刺激效應(yīng)的CpG-DNA序列，由序列表SEQ ID N0.1中的堿基序列所示。
2.—種權(quán)利要求1所述的含有未甲基化CpG的DNA序列的應(yīng)用，其特征在于:所述 CpG-DNA序列可制備成抗病毒因子的藥物。
3.按權(quán)利要求2所述的含有未甲基化CpG的DNA序列，其特征在于:所述CpG-DNA序列可制備成抗腫大細胞的病毒因子的藥物。
4.一種權(quán)利要求1所述的含有未甲基化CpG的DNA序列的應(yīng)用，其特征在于:所述 CpG-DNA序列作為疫苗佐劑 。
【文檔編號】A61P31/20GK103555726SQ201310479972
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月14日
【發(fā)明者】孫黎, 周志俠, 孫鉑光 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所