蜈蚣的活性多肽及其在制藥中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蜈蚣活性多肽的提取、分離、純化和鑒定及其在制藥中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。該發(fā)明提供了一種節(jié)肢動(dòng)物門蜈蚣科動(dòng)物少棘巨蜈蚣活性多肽的提取、分離、純化和鑒定的方法，具體來說，該方法通過使用乙醇加熱回流方法提取，以鎮(zhèn)痛活性為指標(biāo)，運(yùn)用鹽析、葡聚糖層析柱等方法分離、純化而獲得，并經(jīng)過質(zhì)譜確認(rèn)。本發(fā)明方法提取、分離、純化獲得的蜈蚣多肽藥理活性高。本發(fā)明同時(shí)公開了蜈蚣活性多肽在制備心腦血管和鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】蜈蚣的活性多肽及其在制藥中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于天然高分子領(lǐng)域，也屬于生化制藥領(lǐng)域，涉及一種從動(dòng)物中藥體內(nèi)獲得活性物質(zhì)，更具體涉及一種從蜈蚣中提取、分離、純化和鑒定活性多肽的方法，同時(shí)還涉及一種蜈蚣活性多肽在制備鎮(zhèn)痛、心腦血管藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]蜈蚣始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為節(jié)肢動(dòng)物門蜈蚣科動(dòng)物少棘巨蜈蚣Scolopendrasubspinipes mutilans L.Koch的干燥體,具有辛溫走竄、通經(jīng)逐邪、調(diào)達(dá)肝經(jīng)之功效,是祛風(fēng)鎮(zhèn)痛、攻毒散結(jié)之要藥。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中蜈蚣常用于小兒驚風(fēng)，抽搐痙攣，中風(fēng)，半身不遂，毒蛇咬傷等。在近代醫(yī)學(xué)中，應(yīng)用蜈蚣治療腫瘤、結(jié)核病、神經(jīng)性頭疼、糖尿病等療效顯著。
[0003]目前，在臨床應(yīng)用中，蜈蚣通常是采用干燥全蟲入藥，也有采用干燥全蟲經(jīng)水提液或醇提取后入藥的，無論采取哪種方法，其所用的實(shí)際是蜈蚣所有化學(xué)成分的混合物?，F(xiàn)代藥學(xué)研究表明，蜈蚣中含有蛋白質(zhì)86.25%、水不溶性物質(zhì)0.24%、還原糖0.23%等多種成分，但蜈蚣中已經(jīng)報(bào)導(dǎo)的具有活性作用的成分不多。在蜈蚣眾多的化學(xué)成分中，如何篩選、分離、提取出最具有藥理活性的有效成分已成為人們研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。曾紅等人曾將蜈蟲公脫脂處理后，經(jīng)sephadex G_25、sephadex G-150兩次柱層析,分離出8種具有抗癌活性的組分，并經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)表明其中的El、E6兩組抗癌活性最強(qiáng)。(沈陽藥科大學(xué)制藥工程學(xué)院.曾紅.蜈蚣中抗癌活性成分的提取.湖南中醫(yī)雜志，2004.20(5).57)。許鳴鏑等人則采取不同的方法提取到了對(duì)人口腔上皮細(xì)胞鱗癌和人結(jié)腸癌細(xì)胞有明顯抑制作用的堿性蛋白。(許鳴鏑.柳雪枚.蜈蚣?jí)A性蛋白SSmp-d的分離純化及其部分理化性質(zhì)的鑒定.生物化學(xué)雜質(zhì).1997.13(5):586)。由此可見，采用不同的提取方法可以從蜈蚣中提取出具有不同藥理活性的有效成分。
[0004]本發(fā)明采用活性跟蹤的辦法，從蜈蚣體內(nèi)提取、分離、純化并鑒定出兩個(gè)活性多肽，以及該活性多肽在制備鎮(zhèn)痛、心腦血管藥物中應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明公開了具有鎮(zhèn)痛、抗凝和溶栓活性作用的蜈蚣活性多肽的提取、分離、純化和鑒定方法，以及該活性多肽在制備鎮(zhèn)痛、心腦血管藥物中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0007]本發(fā)明方法包括有一下步驟:
[0008]a、取蜈蚣細(xì)粉，加一定量一定濃度的乙醇回流提取兩次，過濾，合并濾液；
[0009]b、所得濾液在水浴下?lián)]干乙醇，適量蒸餾水溶解，離心，取上清液用石油醚萃取，待分層后，取水層濃縮至一定量，得墨綠色的蜈蚣粗提液；
[0010]C、取所述蜈蚣粗提液，加入適量海藻酸，攪拌，過濾，所得濾渣用稀鹽酸少量多次洗脫海藻酸，得綠色的洗脫液；
[0011]d、向所述洗脫液中加入氯化鈉至飽和，攪拌，置冰箱4°C靜置過夜至完全析出并分層，收集懸浮于液面的蛋白類物質(zhì)，冷凍干燥，得多肽粗品；
[0012]e、取多肽粗品用蒸餾水溶解成一定的濃度，上樣，用蒸餾水做洗脫劑，sephadex凝膠柱分離，收集峰I和峰2，冷凍干燥，其核酸蛋白儀的波譜圖見附圖1，液相色譜圖見附圖2。
[0013]f、取峰I和峰2的冷凍樣品，進(jìn)行液相色譜分離，得到純度更高的兩個(gè)多肽樣品I和2，其中活性最強(qiáng)的蜈蚣多肽分子量介于13000~14000，其中多肽樣品峰I的液相色譜圖見附圖3。
[0014]進(jìn)一步的，a步驟中所說乙醇的濃度優(yōu)選30%~85%,更進(jìn)一步優(yōu)選65%;優(yōu)選乙醇用量為藥材的2~6倍量，更進(jìn)一步優(yōu)選第一次提取用量為4倍量，第二次提取用量為3倍量；提取時(shí)間優(yōu)選為0.5小時(shí)~4小時(shí)，更進(jìn)一步優(yōu)選第一次提取時(shí)間為1.0小時(shí)，第二次提取時(shí)間為0.5小時(shí)。
[0015]進(jìn)一步的，b步驟中所說的水浴溫度優(yōu)選40~9(TC,更進(jìn)一步優(yōu)選75? ;離心機(jī)轉(zhuǎn)速優(yōu)選4000轉(zhuǎn)/分鐘；離心時(shí)間，優(yōu)選5~30分鐘，更進(jìn)一步優(yōu)選15分鐘。
[0016]進(jìn)一步的，c步驟中以苦味酸作為檢查多肽指示劑，攪拌時(shí)間優(yōu)選0.5~3小時(shí)；洗脫海藻酸所用的稀鹽酸，優(yōu)選濃度為0.05~0.5mol/L，更進(jìn)一步有選為0.2mol/L。
[0017]進(jìn)一步的，e步驟中所說核酸蛋白檢測(cè)儀的檢測(cè)波長(zhǎng)優(yōu)選280nm。
[0018]進(jìn)一步的，f步驟中所說液相色譜分離純化，優(yōu)選反相液相色譜，流動(dòng)相優(yōu)選乙腈、水和三氟醋酸的組成，鎮(zhèn)痛活性最強(qiáng)多肽分子量為13616.796。
[0019]本發(fā)明方法可有效·提取、分離和純化蜈蚣中所含的鎮(zhèn)痛、降低血粘、促進(jìn)微循環(huán)等的活性多肽，且用該方法所得的蜈蚣活性多肽雜質(zhì)少、純度高。
[0020]本發(fā)明方法提取的蜈蚣活性多肽，可用于制備各種劑型的鎮(zhèn)痛、心腦血管藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0021]圖1為鹽析后樣品經(jīng)過sephadex凝膠柱分離后的波峰圖
[0022]圖2為粗品多肽樣品2的高效液相色譜圖
[0023]圖3為粗品多肽樣品I的高效液相色譜圖
[0024]圖4為純化后多肽樣品I的基質(zhì)輔助激光飛行質(zhì)譜圖
具體實(shí)施例:
[0025]下列實(shí)施例說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但并非用以限制本發(fā)明。
[0026]實(shí)施例1
[0027]準(zhǔn)確稱取蜈蚣粉末100g，乙醇溶解，加熱回流提取兩次，合并兩次的濾液。75°C水浴揮干濾液中，得殘?jiān)?，蒸餾水溶解殘?jiān)?，離心(轉(zhuǎn)速4000轉(zhuǎn)/分鐘)15min，石油醚萃取上清液，分層后，取水層濃縮，得到墨綠色的蜈蚣粗提液；量取500ml上述蜈蚣粗提液，加入海藻酸，攪拌0.5小時(shí)，待吸附完全后過濾，得濾渣，以0.2mol/L的弱鹽酸少量多次洗脫海藻酸，收集得到綠色的洗脫液。向洗脫液中加入氯化鈉至飽和，攪勻，4°C靜置過夜，收集懸浮于液面的蛋白類物質(zhì)，冷凍干燥得粗多肽樣品。將上述粗多肽樣品配成lg/ml, sephadexG-25凝膠柱(2.6cmX 60cm)分離,得到峰I和峰2兩個(gè)冷凍干燥品。峰I樣品經(jīng)過sephadexG-50凝膠色譜柱分離為2個(gè)峰即峰1-1和峰1-2。峰1-1和峰1_2樣品經(jīng)RP-HPLC分離，色譜條件為:安捷倫C18反相柱(4.6_^150111111，54)，柱溫2()1:，流速1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250~280nm，進(jìn)樣量20 μ 1，流動(dòng)相A為超蒸水，B為100%乙腈含0.1%三氟醋酸，30min內(nèi)從5%~50%，根據(jù)色譜峰收集流分。得到兩個(gè)純度較高的活性多肽樣品I和2。
[0028]實(shí)施例2
[0029]昆明種小鼠每種8只，雌雄各半，體重18_22g，隨機(jī)分為5組:陰性對(duì)照組(蒸餾7jC, 2g/10g小鼠體重)、陽性對(duì)照組(阿司匹林，1.5mg/10g小鼠體重)、樣品I組(蜈蚣活性多肽2,0.05mg/10g小鼠體重)、樣品2組(蜈蚣活性多肽1+活性多肽2,0.05mg/10g小鼠體重)、樣品3組(蜈蚣活性多肽l，0.015mg/10g小鼠體重)，皮下注射受試藥物。于5min后對(duì)每只小鼠腹腔注射新鮮配制的0.6%的醋酸溶液0.2ml,5min后觀察小鼠的扭體反應(yīng)(即腹部?jī)?nèi)凹、軀干與后肢伸張、臀部高起)，記錄20min內(nèi)扭體次數(shù)，以扭體抑制率作為活性指標(biāo)。
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種蜈蚣活性多肽，其特征在于所述提取、分離、純化和鑒定的方法包括以下步驟: a、取蜈蚣細(xì)粉，加一定量一定濃度的乙醇回流提取兩次，過濾，合并濾液； b、所得濾液在水浴下?lián)]干乙醇，適量蒸餾水溶解，離心，取上清液用石油醚萃取，待分層后，取水層濃縮至一定量，得墨綠色的蜈蚣粗提液； C、取所述蜈蚣粗提液，加入適量海藻酸，攪拌，過濾，所得濾渣用稀鹽酸少量多次洗脫海藻酸，得綠色的洗脫液； d、向所述洗脫液中加入氯化鈉至飽和，攪拌，置冰箱4°C靜置過夜至完全析出并分層，收集懸浮于液面的蛋白類物質(zhì)，冷凍干燥，得多肽粗品； e、取多肽粗品用蒸懼水溶解成一定的濃度，上樣，用蒸懼水做洗脫劑，sephadex凝膠柱分離，收集峰I和峰2，冷凍干燥。 f、取峰I和峰2的冷凍樣品，進(jìn)行液相色譜分離，得到純度更高的兩個(gè)多肽樣品I和2，經(jīng)質(zhì)譜鑒定，蜈蚣活性多肽分子量介于13000~14000。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述活性多肽提取，其特征在于a步驟中所說乙醇的濃度優(yōu)選30%~85%，更進(jìn)一步優(yōu)選65%;優(yōu)選乙醇用量為藥材的2~6倍量，更進(jìn)一步優(yōu)選第一次提取用量為4倍量，第二次提取用量為3倍量；提取時(shí)間優(yōu)選為0.5小時(shí)~4小時(shí)，更進(jìn)一步優(yōu)選第一次提取時(shí)間為1.0小時(shí)，第二次提取時(shí)間為0.5小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述活性多肽分離，其特征在于b步驟中所說的水浴溫度優(yōu)選40~90°C，更進(jìn)一步優(yōu)選75°C;離心機(jī)轉(zhuǎn)速優(yōu)選4000轉(zhuǎn)/分鐘；離心時(shí)間，優(yōu)選5~30分鐘，更進(jìn)一步優(yōu)選15分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述活性多肽分離，其特征在于c步驟中以苦味酸作為檢查多肽指示劑，攪拌時(shí)間優(yōu)選0.5~3小時(shí)；洗脫海藻酸所用的稀鹽酸，優(yōu)選濃度為0.05~0.5mol/L，更進(jìn)一步有選為0.2mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述活性多肽，其特征在于e步驟中所說核酸蛋白檢測(cè)儀的檢測(cè)波長(zhǎng)優(yōu)選280nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述活性多肽，其特征在于f步驟中所說液相色譜分離純化，優(yōu)選反相液相色譜，流動(dòng)相優(yōu)選乙腈、水和三氟醋酸的組成。
7.具有活性作用的蜈蚣多肽，其特征在于多肽分子量介于13000-14000之間，其鎮(zhèn)痛活性最強(qiáng)的多肽分子量在質(zhì)譜圖中更明確標(biāo)示為13616.796道爾頓。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述活性多肽，在鎮(zhèn)痛和心腦血管藥物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7和8所述的應(yīng)用，其特征在于其中所述的藥物劑型為膠囊劑、片劑、顆粒劑、散劑、注射劑、口服液或丸劑。
【文檔編號(hào)】A61P29/00GK103588859SQ201310272557
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年7月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月2日
【發(fā)明者】李振國(guó), 萬玲, 陳艷明 申請(qǐng)人:牡丹江友搏藥業(yè)股份有限公司