專利名稱：葉酸修飾的多功能靶向造影劑磁性氧化鐵/金納米顆粒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于造影劑材料的制備領(lǐng)域，特別涉及一種葉酸修飾的多功能靶向造影劑磁性氧化鐵/金納米顆粒的制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，納米醫(yī)學(xué)(Nanomedicine)這一新興領(lǐng)域得到了人們廣泛的重視和極大的研究興趣，例如細(xì)胞分離、藥物傳遞、腫瘤的靶向診斷和治療、分子手術(shù)、醫(yī)學(xué)成像和納米機(jī)器人等。而腫瘤的早期診斷和治療是當(dāng)前世界各國著重研究的一個重要課題。應(yīng)用納米科學(xué)與技術(shù)發(fā)展高準(zhǔn)確率的腫瘤早期診斷分子影像活體成像技術(shù)顯得越來越重要。常見的分子影像學(xué)手段包括X/射線斷層攝影術(shù)(X-ray computedtomography imaging, CT)和磁共振成像術(shù)(Magnetic Resonance Imaging, MRI)。這些醫(yī)學(xué)成像技術(shù)通常需要適當(dāng)?shù)募{米顆粒作為造影劑輔助腫瘤的早期診斷。為達(dá)到和體內(nèi)組織反襯的效果，納米顆粒造影劑通常由無機(jī)化合物、金屬或氧化物組成。由于納米金和納米氧化鐵顆粒具有非常好的生物相容性，已有 較多的文獻(xiàn)報道了它們成功地應(yīng)用于腫瘤早期CT和MRI診斷。研究證實(shí)，基于納米金顆粒的CT造影劑能夠有效地延長成像時間，減弱對腎臟的毒副作用，并具備較好的造影效果，其尺寸和形貌容易控制，且其表面化學(xué)修飾已得到了較多的研究。所以，納米金顆粒用于CT造影劑的研究引起了很大的興趣。MRI是上世紀(jì)七十年代發(fā)展起來的一項(xiàng)先進(jìn)醫(yī)學(xué)成像診斷技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于人體多種疾病的檢測與診斷。超順磁性氧化鐵(Fe3O4)納米顆?？商岣叱上駥Ρ榷群颓逦龋且环N很好的T2MRI造影劑。在腫瘤早期臨床診斷研究中，人們希望通過多模態(tài)成像對病灶組織進(jìn)行確認(rèn)，提高腫瘤診斷準(zhǔn)確度。因此，發(fā)展新型的的多模態(tài)造影劑成為當(dāng)前納米醫(yī)學(xué)和影像診斷學(xué)的發(fā)展趨勢。目前，雙功能納米Au和Fe3O4復(fù)合材料得到了廣泛的研究，其納米結(jié)構(gòu)主要有:I)金包覆Fe3O4的核/殼納米顆粒(Au作為保護(hù)層并與巰基化的有機(jī)分子反應(yīng)可進(jìn)一步多功能化);2)三組分磁納米復(fù)合材料Fe304/3rd component/Au ；3)啞鈴狀的Fe304/Au納米顆粒；4) Fe3O4OAu納米雜化材料。這些雙功能或后續(xù)的多功能化結(jié)構(gòu)的納米顆粒綜合具有磁和光性能，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)，如分子影像和藥物輸送等。然而，還沒有通過調(diào)節(jié)多功能化的納米Au和Fe3O4復(fù)合材料的Au/Fe304的摩爾比例，優(yōu)化其MRI/CT雙模態(tài)成像效果，使其能更好地對腫瘤進(jìn)行靶向診斷的相關(guān)文獻(xiàn)報道。樹狀大分子是一種高度支化的、合成性的、高度單分散的大分子。它具有非常精確的核、內(nèi)部空間和表面功能基團(tuán)。樹狀大分子經(jīng)表面修飾后具有較好的生物相容性，沒有免疫原性，因而可以應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。樹狀大分子特定的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)使其已被用作模板或穩(wěn)定化試劑合成各種不同的金屬納米粒子。之前用樹狀大分子包裹合成納米金顆粒，以超順磁性Fe3O4納米顆粒為核，通過靜電自組裝在Fe3O4納米顆粒表面形成生物相容性好的高分子多層膜，并在最外層組裝修飾樹狀大分子包裹的納米金顆粒(Dendrimer-entrappedgold nanoparticles, Au DENPs),最后進(jìn)行殼層交聯(lián),并將Au DENPs表面氨基通過乙?；?，得到膠體穩(wěn)定性良好的、具備生物相容性的納米顆粒材料Fe304@Au。但此法合成的Fe3O4OAu中Au/Fe304的摩爾比(0.152)較小，且不可控，不利于同時進(jìn)行高靈敏MRI/CT雙模態(tài)成像(Cai, H.; Li, K.; Shen, M.;ffen, S.; Luo, Y.; Peng, C.; Zhang, G.; Shi, X.Facile assembly ofFe3O4OAu nanocomposite particles for dual mode magnetic resonance and computedtomography imaging applications.Journal of Materials Chemistry, 2012，22，15110)。因此我們在此基礎(chǔ)上，先合成Fe3O4OAu-FA靶向納米雜化材料，然后通過控制逐層金種還原反應(yīng)的次數(shù)來調(diào)節(jié)Fe3O4OAu-FA納米材料的Au/Fe304摩爾比，優(yōu)化雙模態(tài)成像效果，最后將表面氨基進(jìn)行乙?；磻?yīng)，得到具有最好MRI/CT雙模態(tài)成像效果的Fe3O4Au-FA納米材料。檢索國內(nèi)外有關(guān)MRI/CT靶向雙模態(tài)造影劑Fe3O4Au-FA納米顆粒的文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明，通過調(diào)節(jié)多功能靶向Fe3O4Au-FA納米顆粒的Au/Fe304的摩爾比例，優(yōu)化其MRI/CT雙模態(tài)成像效果的研究還未見相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種葉酸修飾的多功能靶向造影劑磁性氧化鐵/金復(fù)合納米顆粒的制備方法，該方法工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作分離；制備的Fe3O4Au-FA納米顆粒不僅可以調(diào)節(jié)Au/Fe304摩爾比,優(yōu)化雙模態(tài)成像效果,而且能夠長時間地分散在水基溶液中，具有良好的生物相容性，可應(yīng)用于MRI/CT雙模態(tài)靶向成像診斷。本發(fā)明的一種葉酸修飾的多功能靶向造影劑磁性氧化鐵/金納米顆粒的制備方法，包括:(I)配制NaOH溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，提前預(yù)熱到80° C，然后將Fe源溶解于鹽酸中，排除空氣，再加入到提前預(yù)熱好的NaOH溶液中，并于氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)2小時；反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，將黑色沉淀洗滌分離后，得到Fe3O4納米顆粒；(2)將葉酸和1- (3-二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽EDC分別溶于溶劑中，混合，攪拌活化2-3 h，然后滴加到末端為氨基的第5代聚酰胺/胺樹狀大分子G5.NH2溶液中，攪拌反應(yīng)2-3d，透析除掉過量的反應(yīng)物，冷凍干燥，得到G5.NH2-FA ;其中G5.NH2的表面氨基、葉酸、EDC的摩爾比為22:1:10 ；(3)將HAuCl4.4H20水溶液加入G5.NH2-FA溶液中，攪拌10_30min，然后加入硼氫化鈉NaBH4溶液，攪拌反應(yīng)l_2h，透析，冷凍干燥，得到{(Au0) 50-G5.NH2-FAj DENPs納米顆粒；其中 G5.NH2-FA 和 HAuCl4.4H20 摩爾比為 1:50 ;(4)通過靜電層層自組裝的方法，在Fe3O4納米顆粒表面一次組裝聚谷氨酸PGA、聚賴氨酸PLL和聚谷氨酸PGA三層膜，然后進(jìn)一步組裝末端為氨基的{(Au0) 50-G5.NH2-FAjDENPs,組裝結(jié)束后，進(jìn)行EDC交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)時間為15-20h，離心，洗滌，得到Fe304/PGA/PLL/PGA/ {(Au0) 50-G5.NH2-FAj DENPs ;其中每次組裝吸附時間為15_20min，F(xiàn)e3O4納米顆粒溶液、PGA溶液、PLL溶液、PGA溶液的體積比為0.5:1:1:1 ;(5)可以通過控制逐層金種還原反應(yīng)的次數(shù)來調(diào)節(jié)Fe3O4OAu-FA納米材料的Au/Fe3O4 摩爾比，將 HAuCl4.4Η20 溶液加入上述合成的 Fe304/PGA/PLL/PGA/ {(Au0) 50-G5.NH2-FAjDENPs溶液中，超聲反應(yīng)5-8min，再加入水合肼N2H4.H2O超聲反應(yīng)5_8min，重復(fù)還原反應(yīng)6-7次，離心，洗漆，得到Fe3O4Au-FA納米材料，將Fe304/Au_FA納米材料分散在水中，然后加入三乙胺，振蕩混合，再滴加入乙酸酐，振蕩反應(yīng)18-20h，離心，洗滌，再分散在水中，即得表面乙酰化的Fe3O4Au-FA納米顆粒，其中HAuCl4.4H20溶液、Fe304/PGA/PLL/PGA/{(Au0) 50-G5.NH2-FA} DENPs 溶液、水合肼 N2H4.H2O 溶液的體積比為 40 μ L:2mL:40 μ L ;三乙胺、乙酸酐與樹狀大分子中的表面NH2摩爾比為11:5:1。所述步驟(I)中NaOH溶液的濃度1Μ，體積為250mL ;鹽酸的濃度為0.4M，體積為25mL。所述步驟(I)中Fe源為摩爾比為2:1的FeCl3.6H20和FeCl2.4H20。所述步驟(2)中溶劑為二甲基亞砜DMS0。所述步驟(3)中HAuCl4.4H20水溶液的濃度為6.00mg/mL, G5.NH2-FA溶液的濃度為2mg/ml,硼氫化鈉溶液濃度為6.91mg/ml。所述步驟(3 )中NaBH4溶液的溶劑為體積比為1:2的甲醇和超純水混合液，NaBH4溶液為冰浴處理。所述步驟(2) (3)中透析為對水透析3天。所述步驟(4)中Fe3O4納米顆粒溶液濃度為10mg/mL，聚谷氨酸溶液的濃度為Img/mL，聚賴氨酸溶液濃度為lmg/mL，{(Au°) 5(1-G5.NH2_FA} DENPs溶液的濃度為lmg/mL。所述步驟(4)中PGA、PLL、和{(Au0) 50-G5.NH2-FAj DENPs 溶液的溶劑都是 pH 為 7.4的 PBS。所述步驟(4)中ED C交聯(lián)反應(yīng)條件為在pH5.5的2_ (N-嗎啉)乙磺酸MES緩沖液條件下進(jìn)行的，MES緩沖液的濃度為50mM。所述步驟(4)中離心轉(zhuǎn)速為8000rpm，離心時間為8-lOmin純化，離心水洗3-5次。所述步驟(5)中HAuCl4.4H20 溶液濃度為 31.74mg/mL ；Fe304/PGA/PLL/PGA/{(Au。)5(1-G5.NH2-FA} DENPs 溶液中[Fe] =0.97mg/mL，[Au] =0.32mg/mL ；所述步驟(5)中三乙胺的密度為0.726 0.729g/mL,體積百分濃度為99.0% ;乙酸酐的密度為1.08g/mL，體積百分濃度為98.5%。所述步驟(5)中為在TS-2型搖床上，振蕩反應(yīng)；離心轉(zhuǎn)速為lOOOOrpm，離心時間為5_10mino本發(fā)明通過修飾靶向分子FA的G5PAMAM樹狀大分子包裹合成納米金顆粒，以超順磁性Fe3O4納米顆粒為核，通過靜電自組裝在Fe3O4納米顆粒表面形成生物相容性好的高分子多層膜，并在最外層組裝修飾{(Au°)5C1-G5.NH2-FAjDENPs納米材料，然后進(jìn)行殼層交聯(lián)，得到具有良好膠體穩(wěn)定性和生物相容性的納米顆粒Fe304/PGA/PLL/PGA/ {(Au0) 50-G5.NH2-FA} DENPs (Fe3O4OAu-FA)。并進(jìn)一步通過控制逐層金種還原反應(yīng)的次數(shù)來調(diào)節(jié)Fe3O4OAu-FA納米材料的Au/Fe304摩爾比，優(yōu)化雙模態(tài)成像效果，最后將表面氨基進(jìn)行乙?；磻?yīng)，得到具有最好雙模態(tài)成像效果的Fe3O4Au-FA納米材料。該方法制備的多功能靶向Fe3O4Au-FA納米材料具有良好的生物相容性，可成功用于MRI/CT雙模態(tài)靶向成像診斷。本發(fā)明使用透射電子顯微鏡(TEM)、能量分散譜(EDS)、紫外-可見光分光光度計(UV-Vis)、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)以及水動力學(xué)粒徑(DLS)等方法表征本發(fā)明制備的多功能祀向造影劑Fe304/Au-FA納米顆粒和對比例中的對照材料Fe304/Au納米顆粒，同時利用MTT法和溶血試驗(yàn)來分別檢驗(yàn)納米顆粒的細(xì)胞相容性和血液相容性，最后通過CT和磁共振成像儀檢測納米顆粒體外X-射線衰減特性和T2弛豫性能，以及對體外癌細(xì)胞和體內(nèi)腫瘤模型的雙模態(tài)造影性能。具體測試結(jié)果如下:(I)紫外-可見光分光光度計(UV-Vis)和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜(ICP-AES)的測試結(jié)果通過靜電層層自組裝的方法，在Fe3O4納米顆粒表面組裝PGA/PLL/PGA多層膜，在形成的PGA/PLL/PGA多層膜修飾的Fe3O4納米顆粒表面進(jìn)一步組裝端基為氨基的{(Au0) 50-G5.NH2-FAj納米顆粒，然后通過EDC化學(xué)鍵合法將Fe3O4納米顆粒表面的羥基、PGA的羧基、PLL的氨基和{(Au°)5C1-G5.NH2-FA}的氨基進(jìn)行交聯(lián)，接著通過控制逐層金種還原反應(yīng)的次數(shù)來調(diào)節(jié)Fe304/Au-FA納米材料的Au/Fe304摩爾比；納米顆粒外圍的氨基則通過進(jìn)一步完全乙酰化，使整體納米顆粒電荷接近中性(見反應(yīng)示意圖，圖14)。通過UV-Vis和ICP-AES測試來鑒定對比例中的對照材料Fe3O4Au和本發(fā)明制備的Fe304/Au_FA納米顆粒的Au/Fe304摩爾比(圖1和圖2)。其中圖1代表乙?；安煌珹u/Fe304摩爾比的Fe304/Au的UV-Vis圖譜，圖2代表乙?；蟮腇e3O4Au和Fe304/Au_FA納米顆粒的UV-Vis圖譜，從圖1和圖2中可以看出，與沒有吸收峰的Fe3O4納米顆粒相比，F(xiàn)e3O4Au和Fe304/Au_FA納米顆粒在520nm處顯示出一個吸收峰，證實(shí)了 Au元素的存在；隨著金種還原反應(yīng)的次數(shù)的增力口,在520nm處的吸收峰越來越明顯,且ICP結(jié)果也證實(shí)了 Fe304/Au納米顆粒的Au/Fe304摩爾比從0.20:1增加到1.59:1，參考附圖1和2 ;(2)透射電子顯微鏡(TEM)和能量分散譜(EDS)的測試結(jié)果TEM測試結(jié)果(圖3a)顯示Fe304/Au_FA納米顆粒的形貌，黑色的小圓點(diǎn)代表Au顆粒，淺色顆粒為Fe3O4顆粒,其中Au顆粒圍繞在Fe3O4核心顆粒表面,但總體結(jié)構(gòu)則顯示合成的Fe3O4Au-FA納米顆粒為雜化結(jié)構(gòu)。能量分散譜(EDS)也更進(jìn)一步地證實(shí)了 Fe304/Au_FA雜化顆粒中元素Au和F e的共同存在，參考附圖3b。(3) T2弛豫率測試結(jié)果為了研究Fe304/Au納米顆粒中Au摩爾量的增加對雜化納米顆粒的弛豫率的影響，我們測定了對比例中不同Au/Fe304摩爾比的Fe304/Au納米顆粒的弛豫率(圖4)。從圖4中可以看出，F(xiàn)e3O4Au材料的弛豫率隨著鐵濃度的增加(在0-0.2mM濃度范圍內(nèi))具有很好的線性關(guān)系。從線性關(guān)系圖可知，Au/Fe304摩爾比為0.2的Fe304/Au的納米顆粒R2弛豫率為127.86ι Μ ，而Au/Fe304摩爾比為0.66、1.06及1.59的Fe3O4Au的納米顆粒R2弛豫率分別降為99.52,97.59和112.，這些結(jié)果表明Au摩爾量的增加沒有阻擋其與質(zhì)子的接觸率，對雜化納米顆粒的弛豫率影響不大，這些雜化納米顆粒都具有良好的弛豫率。我們也測量了本發(fā)明制備的Au/Fe304摩爾比為2.02的靶向材料Fe304/Au_FA的弛豫率為92.66ι Μ (圖 5)。(4) X-射線衰減測試結(jié)果金納米顆粒由于有很高的原子序數(shù)和電子密度，因而具有很好的X-射線衰減性質(zhì)，可用作CT造影劑。圖6顯示了對比例中不同Au/Fe304摩爾比的Fe304/Au和本發(fā)明制備的Au/Fe304摩爾比為2.02的靶向材料Fe304/Au_FA隨金濃度(圖6a)或鐵濃度(圖6b)變化的X-射線衰減效應(yīng)關(guān)系。在圖6b中，在同樣的鐵濃度下，跟對比例中具有不同Au/Fe304摩爾比的Fe3O4Au(摩爾比為0.2至1.59)相比較，Au/Fe304摩爾比為2.02的靶向材料Fe3O4/Au-FA具有最高的金濃度，從而顯示了最好的X-射線衰減特性。因此，當(dāng)用于材料雙模態(tài)成像時，在同樣的鐵濃度下，Au/Fe304摩爾比為2.02的靶向材料Fe304/Au_FA材料既可達(dá)到良好的MRI成像效果，又由于具有最高的金濃度，因而具備最好的CT成像效果。而在圖6a中，在同樣的金濃度下，由于Au/Fe304摩爾比最低0.2的Fe304/Au材料具有最高的鐵濃度，因而其具有最好的X-射線衰減效應(yīng)，這表明Fe3O4納米顆粒也能增強(qiáng)金納米顆粒的X-射線衰減效應(yīng)。因此，本發(fā)明所合成的靶向材料Fe3O4Au-FA以及對比例中的對照材料不僅具有可調(diào)控的Au/Fe304摩爾比和良好的弛豫率，而且Au摩爾量的增加并沒有阻擋其質(zhì)子與Fe3O4內(nèi)核的接觸效率，對其T2弛豫率沒有太大影響。Au摩爾量越高其X-射線衰減效應(yīng)越強(qiáng)。這些結(jié)果表明靶向材料Fe3O4Au-FA可作為一種很有潛力的多功能造影劑，有望應(yīng)用于MRI/CT雙模態(tài)醫(yī)學(xué)成像診斷。(5)水動力學(xué)粒徑分布為了分析對比例中Fe304/Au和本發(fā)明制備的Fe304/Au_FA納米材料在水相中的穩(wěn)定性，我們測定了其水動力學(xué)粒徑(如圖7所示)。對比例中的Fe3O4Au和本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA納米材料在水相中分散穩(wěn)定，其水動力學(xué)粒徑大小分別是418.3nm和532.5nm,跟以前合成的 Fe3O4OAu (200nm, Cai, H.; Li, K.; Shen, Μ.; Wen, S.; Luo, Y.; Peng, C.; Zhang, G.;Shi,X.Facile assembly of Fe3O4OAu nanocomposite particles for dual modemagnetic resonance and computed tomography imaging applications.Journal ofMaterials Chemistry, 2012, 22, 15110)的水動力學(xué)粒徑相比較，明顯大些,可能是由于金殼厚度的增加，導(dǎo)致其水動力學(xué)粒徑增加，但其在水相中還是具有很好的穩(wěn)定性。(6) MTT細(xì)胞活力測試和血液相容性通過MTT比色法測定KB細(xì)胞(一種人類上皮癌的細(xì)胞株)的活力檢測所合成材料的細(xì)胞毒性。KB細(xì)胞分別與對比例中Fe3O4Au和本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA (質(zhì)量濃度為
10、25、50和100μ g/mL)在37°C下共培養(yǎng)24小時。然后，經(jīng)MTT處理后在570nm處測量吸光值，并根據(jù)此值計算細(xì)胞的增殖及活力。不同濃度下材料對細(xì)胞增殖的影響與對照組(緩沖液PBS，pH7.4)的統(tǒng)計比較 ，通過單因素方差分析方法實(shí)施。與對照組相比，F(xiàn)e3O4Au和Fe3O4Au-FA在從O到100 μ g/ml實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對KB細(xì)胞的存活率沒有顯著性差異，沒顯示細(xì)胞毒性，這表明它們在此濃度范圍內(nèi)具有良好的生物相容性，參考附圖8。為了便于材料能更好地用于體內(nèi)生物成像，本試驗(yàn)又測定了對比例中的Fe3O4Au和本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA納米材料的血液相容性。圖9中顯示了 Fe304/Au(a)和Fe3O4/八11- 4納米顆粒(13)在不同濃度(50、100、200、40(^8/1^)下的溶血性測試結(jié)果。通過對上層清液的吸光度進(jìn)行測量來定量評價樣品的溶血性。如圖9右上角紫外圖譜顯示，在濃度達(dá)到400 μ g/mL條件下，F(xiàn)e304/Au和Fe304/Au_FA納米顆粒的溶血率分別為5.05%和3.14%，低的溶血率表明材料具有良好的血液相容性。這些結(jié)果表明Fe304/Au-FA納米材料具有良好的生物相容性和血液相容性,可用于體內(nèi)各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。(7) KB細(xì)胞內(nèi)吞結(jié)果為了測定靶向材料的靶向性，我們選用表達(dá)葉酸受體的KB細(xì)胞作為模型，把KB細(xì)胞分別與對比例中Fe3O4Au和本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA (Au濃度為4和20 μ M)在37°C下共培養(yǎng)4小時。用ICP-AES測定相同數(shù)量細(xì)胞的Au內(nèi)吞量。如圖10結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4Au和Fe304/Au-FA兩種材料內(nèi)吞量都為濃度依賴型，隨著Au濃度增加，內(nèi)吞量也越高，表明對比例中非靶向材料能通過內(nèi)吞作用或自由擴(kuò)散而進(jìn)入細(xì)胞。但在同樣的Au濃度下，與對比例Fe304/Au相比較，本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA靶向材料共培養(yǎng)的KB細(xì)胞的內(nèi)吞量更高，表明材料除通過內(nèi)吞作用或自由擴(kuò)散而進(jìn)入細(xì)胞外，具有靶向分子的Fe3O4Au-FA能通過葉酸受體介導(dǎo)而進(jìn)入KB細(xì)胞。(8)體內(nèi)CT成像結(jié)果為了研究材料的體內(nèi)靶向CT成像，我們選用4到6周的BALB/c裸鼠(上海動物實(shí)驗(yàn)中心)作為動物模型。腋下注射IX IO6表達(dá)葉酸受體的KB細(xì)胞于裸鼠體內(nèi)，注射約3周后，腫瘤體積即可達(dá)到0.1-lcm3。將腫瘤裸鼠麻醉后，隨機(jī)抽取作為對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組老鼠通過尾靜脈注射189 μ L對比例材料Fe3O4Au (Au/Fe304摩爾比為1.59)或本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA (Au/Fe304摩爾比為2.02)靶向納米材料的PBS溶液(Au質(zhì)量為0.2mg)，然后在不同時間點(diǎn)(2h，6h，24h )進(jìn)行Mi cro-CT掃描。圖11 a和b分別代表了靶向材料和非靶向材料的Micro-CT圖片，跟對照組比較，我們能夠看出，注射2h后，兩種材料的CT信號強(qiáng)度都加強(qiáng)了，沒有明顯區(qū)別，但是從6h到24h靶向材料Fe3O4Au-FA主要集中在腫瘤部位，而非靶向材料則慢慢被代謝掉。CT信號強(qiáng)度變化圖(圖lie)進(jìn)一步定量驗(yàn)證了 Micro-CT圖片的結(jié)果，跟非靶向材料比較，在24h，注射靶向材料Fe3O4Au-FA的腫瘤的CT信號強(qiáng)度增加到200.16%，而非靶向材料Fe3O4Au的腫瘤的CT信號強(qiáng)度只有109.31%，這些結(jié)果表明本發(fā)明制備的Fe304/Au-FA納米材料能對腫瘤實(shí)施祀向CT成像。(9)體內(nèi)MRI結(jié)果對于MRI，首先通過尾靜脈注射189μ L對比例材料Fe3O4Au或本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA納米材料的PBS溶液(Fe質(zhì)量為0.9mg)，然后在不同時間點(diǎn)(2h，6h，24h)進(jìn)行MRI掃描。從圖12a和b可以看出，注射靶向材料Fe3O4Au-FA的裸鼠肝臟處的MRI信號強(qiáng)度明顯比注射非靶向材料Fe3O4Au的裸鼠肝臟處的MRI信號強(qiáng)度低得多。跟對照組相比，注射靶向材料Fe3O4Au-FA的裸鼠腫瘤部位的信號逐漸從亮白色變到灰色，表明靶向材料降低了腫瘤部位的MRI信號強(qiáng)度；而注射非靶向材料Fe3O4Au的裸鼠腫瘤部位的信號沒發(fā)生太大變化，這些結(jié)果表明靶向材料Fe3O4Au-FA能特異性靶向裸鼠腫瘤部位用于靶向MRI成像。MRI信號強(qiáng)度變化圖(圖12c)進(jìn)一步定量驗(yàn)證了 MRI圖片的結(jié)果，跟對照組比較，注射靶向材料Fe3O4Au-FA的裸鼠腫瘤部位的信號強(qiáng)度從2h (79.38%)到24h (56.24%)逐次降低，而注射非靶向材料Fe3O4Au的裸鼠腫瘤部位的信號強(qiáng)度從2h(82.71%)到24h(93.43%)逐次升高，信號慢慢恢復(fù)到初始強(qiáng)度。這些結(jié)果也表明靶向材料Fe3O4Au-FA能特異性靶向表達(dá)葉酸受體的裸鼠腫瘤部位用于MRI/CT雙模態(tài)成像。( 10)體內(nèi)組織分布結(jié)果為了研究靶向材料Fe304/Au-FA在體內(nèi)生物組織分布情況，首先通過尾靜脈注射納米材料的PBS溶液(Au質(zhì)量為0.2mg)，然后用ICP-AES測量Au元素在注射后不同時間點(diǎn)(12或36h)在各個重要器官中的含量(圖13)。從圖中可看出，跟對照組(注射前)相比，Au兀素主要分布在肝(在注射12和36h后,每克器官含Au量分別為19.5 μ g和56.1yg)和脾臟(在注射12和36h后，每克器官含Au量分別為59.0 μ g和190.6 μ g)處，并且隨著時間的增長，聚集 量越多；而對于這兩個時間點(diǎn)，在其他的器官，比如:肺、腎和腫瘤，金的聚集明顯少得多。這些結(jié)果表明，靶向材料Fe3O4Au-FA能被巨噬細(xì)胞吞噬掉，并在小鼠體內(nèi)正常的代謝清除。同時需要指出的是，跟對照組腫瘤部位(每克腫瘤含金量為0.1 μ g)比較，靶向材料能特異性靶向腫瘤部位，在注射24h后，腫瘤部位含金量最多，達(dá)到1.Ομ g，在注射36h后，腫瘤部位含金量降低到0.6。這些結(jié)果不僅表明靶向材料Fe3O4Au-FA對腫瘤部位具有很好的靶向性，可用于腫瘤靶向成像，而且表明材料能在小鼠體內(nèi)能慢慢的正常的代謝清除，且不顯示毒性。有益.效果(I)本發(fā)明利用靜電層層自組裝方法和樹狀大分子獨(dú)特性質(zhì)來合成水溶性良好的Fe3O4OAu-FA納米顆粒,然后通過控制逐層金種還原反應(yīng)的次數(shù)來調(diào)節(jié)Fe3O4OAu-FA納米材料的Au/Fe304摩爾比，優(yōu)化雙模態(tài)成像效果，最后將表面氨基進(jìn)行乙酰化反應(yīng)，得到具有最好成像效果的雙模態(tài)的Fe3O4Au-FA靶向納米材料。本發(fā)明工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作分離；(2)本發(fā)明制備的Fe304/Au_FA納米顆粒不僅可以調(diào)節(jié)Au/Fe304摩爾比,優(yōu)化雙模態(tài)成像效果，而且能夠長時間地分散在水基溶液中，具有良好的生物相容性和靶向成像效應(yīng)，可應(yīng)用于MRI/CT雙模態(tài)成像靶向診斷。


圖1為對比例中具有不同Au/Fe304摩爾比的Fe304/Au和Fe3O4納米顆粒的紫外吸收光譜圖；圖2為本發(fā)明制備的乙?；腇e304/Au-FA和對比例中Fe304/Au納米顆粒的紫外吸收光譜圖；圖3為本發(fā)明制備Fe3CVAu-FA納米顆粒的透射電子顯微鏡圖片(a)和能量分散圖譜(b)；

圖4為對比例中具有不同Au/Fe304摩爾比的Fe304/Au雜化納米顆粒的T2弛豫時間倒數(shù)隨鐵濃度變化的線性關(guān) 系圖；圖5為本發(fā)明制備的Fe304/Au-FA納米顆粒的的T2弛豫時間倒數(shù)隨鐵濃度變化的線性關(guān)系圖；圖6為本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA和對比例中具有不同Au/Fe304摩爾比的Fe3O4/Au納米顆粒的X-射線衰減隨金濃度變化(a)或隨鐵濃度變化(b)的線性關(guān)系圖；圖7為本發(fā)明制備的Fe304/Au-FA和對比例中Fe304/Au納米顆粒的水動力學(xué)粒徑分布； 圖8為MTT法測試的KB細(xì)胞經(jīng)過PBS緩沖液(對照)、對比例中Fe304/Au和本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA納米顆粒(濃度范圍在0-100 μ g/ml)處理24小時后的細(xì)胞活力；圖9為對比例中Fe304/Au (a)和本發(fā)明制備的Fe304/Au_FA納米顆粒(b)(濃度范圍50-400 μ g/mL)的溶血實(shí)驗(yàn)紫外圖譜，右上角插圖顯示的是圖中放大的紫外吸收圖譜；圖10為經(jīng)PBS緩沖液(對照)和對比例中Fe304/Au和本發(fā)明制備的Fe304/Au_FA(在Au濃度為4和20 μ Μ)納米顆粒處理4小時后的KB細(xì)胞的內(nèi)吞結(jié)果；圖11為尾靜脈注射189 μ L本發(fā)明制備的Fe304/Au-FA (a)和對比例中Fe304/Au (Au質(zhì)量為0.2mg) (b)入腫瘤裸鼠(4-6周大小)后，于不同時間拍的CT圖片和CT值隨時間的變化圖(c)。(C)。圖12為尾靜脈注射189 μ L本發(fā)明制備的Fe304/Au-FA(a)和對比例中Fe304/Au (Fe質(zhì)量為0.9mg) (b)進(jìn)入腫瘤裸鼠(4-6周)后，于不同時間拍的MRI圖片和MRI信噪比隨時間的變化圖(c)；圖13為尾靜脈注射本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA納米顆粒(Au質(zhì)量為0.2mg)后，Au元素在不同時間點(diǎn)(12或36h)在小鼠主要器官(肝、脾、肺、腎、和腫瘤)的組織分布；圖14為本發(fā)明的反應(yīng)示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1(I)首先用共沉淀法合成Fe3O4納米顆粒,配制IM氫氧化鈉250mL,氮?dú)獗Ｗo(hù)下,提前預(yù)熱到80。，然后將FeCl2.4Η20和FeCl3.6Η20以摩爾比2:1溶解于0.4Μ稀鹽酸(25mL)中，排除空氣，再加入提前預(yù)熱好的NaOH溶液中，并于氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)2小時；反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，將黑色沉淀洗滌分離后，即得Fe3O4納米顆粒；(2)用末端為氨基的第5代聚酰胺/胺樹狀大分子(G5.NH2)為初始材料，首先將
1.87mg葉酸和8.1lmgl- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)分別溶于2mL 二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)中，混合攪拌活化3h后，再逐滴加入G5.NH2溶液(22.0Omg溶于8mL DMS0)中，攪拌反應(yīng)3天，產(chǎn)物對水透析三天除掉過量的反應(yīng)物，冷凍干燥得到產(chǎn)品G5.NH2-FA。

(3)將 2.0mL HAuCl4 水溶液(6.00mg/mL)加入上述合成的 G5.NH2-FA 溶液(20mg溶解于IOmL超純水中)中，攪拌半小時。然后向其中加入冰浴處理的硼氫化鈉溶液(6.9Img溶于ImL超純水/甲醇(v/v=2:1)中)還原反應(yīng)2小時，對水透析三天，冷凍干燥得到產(chǎn)品{(Au0) 50-G5.NH2-FA} DENPs 納米顆粒。(4)通過靜電層層自組裝的方法,在0.5mL Fe3O4 (10mg/mL水溶液)納米顆粒表面依次組裝聚谷氨酸(PGA，lmg/mL溶于ρΗ7.4的PBS緩沖液，lmL)、聚賴氨酸(PLL，lmg/mL溶于ρΗ7.4的PBS緩沖液，ImL)和聚谷氨酸(PGA，lmg/mL溶于ρΗ7.4的PBS緩沖液，ImL)三層膜，在形成的PGA/PLL/PGA多層膜修飾的Fe3O4納米顆粒表面進(jìn)一步組裝過量的端基為氨基的{(Au0) 50-G5.NH2-FAj DENPs溶液(lmg/mL溶于ρΗ7.4的PBS緩沖液)。每次組裝吸附持續(xù)20min,8000rpm離心IOmin除掉過量的反應(yīng)物,離心洗漆3次,再重新分散于水中。組裝結(jié)束后，在PH5.5的2- (N-嗎啉)乙磺酸(MES，50mM)緩沖液條件下，進(jìn)行EDC交聯(lián)反應(yīng)20 小時后，用水離心洗滌 3 次得到 Fe304/PGA/PLL/PGA/{(Au°) 5(1-G5.NH2-FAj DENPs (Fe3O4OAu-FA )納米材料。(5)可以通過改變逐層金種還原反應(yīng)的次數(shù)來調(diào)節(jié)Fe3O4OAu-FA納米材料的Au/Fe3O4摩爾比。首先將40 μ L HAuCl4.4Η20溶液(31.74mg/mL)加入上述合成的Fe3O4OAu-FA ([Fe] =0.97mg/mL, [Au] =0.32mg/mL, 2mL)溶液中，超聲反應(yīng) 8min，再加入 40 μ L 水合肼(N2H4.Η20)超聲反應(yīng)8min，重復(fù)還原反應(yīng)6-7次。最后將上述制備的材料離心(lOOOOrpm，8min.)洗滌4次，再均勻分散在5mL超純水中，加入50 μ L三乙胺。振蕩30分鐘充分混合后，逐滴加入15 μ L乙酸酐(三乙胺、乙酸酐與樹狀大分子中的-NH2摩爾比=5:5:1)，將玻璃瓶放置在搖床上，振蕩反應(yīng)20小時，離心(lOOOOrpm, 8min)洗滌4次，再均勻分散在2mL超純水中，制得表面乙?；腇e304/Au-FA納米顆粒。通過UV-Vis和ICP-AES測試來鑒定本發(fā)明制備的Fe304/Au_FA納米顆粒的Au/Fe3O4摩爾比(參考附圖2)。圖2代表乙酰化后的對比例中Fe3O4Au和本發(fā)明制備的Fe3O4/Au-FA納米顆粒的UV-Vis圖譜,從圖中可以看出，F(xiàn)e3O4Au和Fe304/Au_FA納米顆粒在520nm處顯示出一個吸收峰，證實(shí)了 Au元素的存在；且通過ICP測定了對比例中Fe3O4Au和本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA納米顆粒的Au/Fe304摩爾比分別為1.59:1和2.02:1?？赏ㄟ^TEM測試和EDS能譜等測試方法表征Fe304/Au_FA納米顆粒,結(jié)果顯示了 Fe304/Au_FA納米顆粒的形貌大部分為雜化顆粒，黑色的小圓點(diǎn)代表Au顆粒，少部分為核殼結(jié)構(gòu)，其中Au顆粒圍繞修飾在Fe3O4核心顆粒表面；能量分布圖譜(EDS)更進(jìn)一步地證實(shí)了 Fe3O4Au-FA雜化顆粒中元素Au和Fe的存在(參考附圖3)。實(shí)施例2將對比例中Fe3O4Au和本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA納米材料分散在水溶液中，并通過ICP-AES測試法測得溶液中Fe和Au元素的含量，再用EP管配制Fe濃度依次為0.002、
0.005,0.01,0.02,0.05,0.1以及0.2mM的水溶液2mL，通過T2磁共振成像和CT成像研究不同Au/Fe304摩爾比的Fe3O4Au和Fe304/Au_FA的T2弛豫和CT效應(yīng)。結(jié)果表明Fe304/Au和Fe304/Au-FA的弛豫率在鐵濃度0-0.2mM濃度范圍內(nèi)隨著鐵濃度的增加具有很好的線性關(guān)系。參考附圖4和5,從線性關(guān)系圖可知，Au/Fe304摩爾比為0.2的Fe3O4/Au的納米顆粒R2弛豫率為127.86ι Μ ，而Au/Fe304摩爾比為0.66、1.06及1.59的Fe3O4Au的納米顆粒R2弛豫率分別降為99.52,97.59和112.這些結(jié)果表明Au摩爾量的增加沒有阻擋Fe3O4內(nèi)核與質(zhì)子的接觸率，對雜化納米顆粒的弛豫率影響不大，都具有良好的弛豫率。我們也測量了 Au/Fe304摩爾比為2.02的靶向材料Fe304/Au_FA的弛豫率為92.66mM^s^0附圖6顯示了不同Au/Fe304摩爾比的Fe3O4Au和靶向材料Fe304/Au_FA隨金濃度(圖6a)或鐵濃度(圖6b)變化的X-射線衰減效應(yīng)。在圖6b中，在同樣的鐵濃度下，跟對比例中具有不同Au/Fe304摩爾比的Fe3O4Au (摩爾比為0.2至1.59)相比較，Au/Fe304摩爾比為2.02的靶向材料Fe3O4Au-FA具有最高的金濃度，從而顯示了最好的X-射線衰減特性。在同樣的鐵濃度下，Au/Fe304摩爾比為2.02的靶向材料Fe304/Au_FA材料既可達(dá)到良好的MRI成像效果，又由于具有最高的金濃度，因而具備最好的CT成像效果。而在圖6a中，在同樣的金濃度下，由于Au/Fe304摩爾比最低0.2的Fe304/Au材料具有最高的鐵濃度，因而其具有最好的X-射線衰減效應(yīng)，這表明Fe3O4納米顆粒也能增強(qiáng)金納米顆粒的X-射線衰減效應(yīng)。因此，本發(fā)明所合成的靶向材料Fe3O4Au-FA以及對比例中的對照材料不僅具有可調(diào)控的Au/Fe3O4摩爾比和良好的弛豫率，而且Au摩爾量的增加并沒有阻擋Fe3O4與質(zhì)子的接觸效率，對其弛豫率沒有太大影響，Au摩爾量越高其X-射線衰減效應(yīng)越強(qiáng)。這些結(jié)果表明靶向材料Fe304/Au-FA可作為一種很有潛力的多功能造影劑，有望應(yīng)用于MRI/CT雙模態(tài)醫(yī)學(xué)成像診斷。因此，對比例中Fe3O4Au和本發(fā)明所合成的靶向材料Fe304/Au_FA不僅具有可調(diào)制的Au/Fe304摩爾比和良好的弛豫率，而且Au摩爾量的增加并沒有阻擋Fe3O4與質(zhì)子的接觸效率，對其弛豫率沒有太大影響。Au摩爾 量越高其X-射線衰減效應(yīng)越強(qiáng)。靶向材料Fe3O4/Au-FA可作為一種很有潛力的多功能造影劑，有望應(yīng)用于MRI/CT雙模態(tài)醫(yī)學(xué)診斷，參考附圖 4-6。實(shí)施例3分別取0.1mL 對比例 Fe3O4Au ([Fe]=0.054mol/L, [Au]=0.029mol/L)和 0.08mL本發(fā)明制備的Fe304/Au-FA ([Fe]=0.061mol/L, [Au] =0.041mol/L)納米顆粒用超純水配制成1.5mL的水溶液，然后用于測水動力學(xué)粒徑。如圖7水動力學(xué)粒徑分布表明，對比例中的Fe3O4Au和本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA納米材料在水相中分散穩(wěn)定，其水動力學(xué)粒徑大小分別是418.3nm和532.5nm,跟以前合成的Fe3O4OAu納米顆粒的水動力學(xué)粒徑(200nm,Cai, H.; Li, K.; Shen, M.;ffen, S.; Luo, Y.; Peng, C.; Zhang, G.; Shi, X.Facile assembly ofFe3O4OAu nanocomposite particles for dual mode magnetic resonance and computedtomography imaging applications.Journal of Materials Chemistry, 2012, 22, 15110)相比較，明顯大些，可能是由于金殼厚度的增加，導(dǎo)致其水動力學(xué)粒徑增加，但其在水相中還是具有很好的穩(wěn)定性，參考附圖7。實(shí)施例4以KB細(xì)胞為模型細(xì)胞，通過MTT比色法測定KB細(xì)胞的活力檢測所合成材料的細(xì)胞毒性。KB細(xì)胞分別與不同質(zhì)量濃度的對比例Fe3O4Au和本發(fā)明制備的靶向材料Fe3O4/Au-FA (10、25、50和100μ g/mL)納米材料，在37°C下與KB細(xì)胞(96孔，10000萬細(xì)胞/每孔)共培養(yǎng)24小時，然后，經(jīng)MTT處理后在570nm處測量吸光值，并根據(jù)此值計算細(xì)胞的增殖及活力檢測所合成材料的細(xì)胞毒性。與對照組相比，F(xiàn)e3O4Au和Fe3O4Au-FA在從O到100 μ g/ml實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對KB細(xì)胞的存活率沒有顯著性差異，沒顯示細(xì)胞毒性，這表明它們在此濃度時范圍內(nèi)具有良好的生物相容性，參考附圖8。實(shí)施例5為了便于材料能 更好地用于體內(nèi)生物成像，本試驗(yàn)進(jìn)一步測定了對比例中的Fe3O4Au和本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA材料的血液相容性。取人血，首先離心(2000rpm/min，IOmin)去上清液，并用PBS洗滌5次，收集健康的紅細(xì)胞，然后用PBS將紅細(xì)胞稀釋10倍備用。再將Fe3O4Au或Fe3O4Au-FA材料(50-400 μ g/mL)與稀釋后的紅細(xì)胞混合靜置2小時后，10000rpm/min離心Imin后，并測上清液的紫外吸光度。圖9 中顯示了 Fe304/Au Ca)和 Fe304/Au_FA 納米顆粒(b)在不同濃度 50、100、200和400 μ g/mL下的溶血性測試結(jié)果。通過對上層清液的吸光度進(jìn)行測量來定量評價樣品的溶血性。如圖9右上角紫外圖譜顯示，在達(dá)到400 μ g/mL條件下，F(xiàn)e3O4Au和Fe304/Au_FA納米顆粒的溶血率分別為5.05%和3.14%，低的溶血率表明材料具有良好的血液相容性，參考附圖9。這些結(jié)果表明Fe304/Au-FA納米材料具有良好的生物相容性和血液相容性,可用于體內(nèi)各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。實(shí)施例6為了測定靶向材料Fe3O4Au-FA的靶向性，我們選用表達(dá)葉酸受體的KB細(xì)胞作為模型，首先5 X IO5KB被種在24孔培養(yǎng)板上，過夜培養(yǎng)后，換上含有Fe3O4Au (Au/Fe304摩爾比1.59)或Fe3O4Au-FA納米顆粒(Au/Fe304摩爾比2.02)的新鮮培養(yǎng)基(Au濃度為4和20 μ Μ)，在37°C以及5%C02下共培養(yǎng)4小時，之后細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌三次，然后細(xì)胞用胰酶消化下來，再懸浮在ImL包含10%FBS的RPM1-1640培養(yǎng)基中，計算細(xì)胞數(shù)目后，1000轉(zhuǎn)離心5分鐘收集細(xì)胞，再用0.2mL王水消化I小時后，加入1.8mL PBS緩沖液至2mL，最后用ICP-AES測定細(xì)胞的Au內(nèi)吞量。通過ICP-AES測試測定細(xì)胞的Au內(nèi)吞量(參考附圖10)，結(jié)果表明，F(xiàn)e304/Au和Fe3O4Au-FA兩種材料內(nèi)吞量都為濃度依賴型，隨著Au濃度增加，內(nèi)吞量也越高，表明對比例中非靶向材料能通過內(nèi)吞作用或自由擴(kuò)散而進(jìn)入細(xì)胞。但在同樣的Au濃度下，與對比例Fe3O4Au相比較，本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA靶向材料共培養(yǎng)的KB細(xì)胞的內(nèi)吞量更高，表明材料除通過內(nèi)吞作用或自由擴(kuò)散而進(jìn)入細(xì)胞外，具有靶向分子的Fe3O4Au-FA能通過葉酸受體介導(dǎo)而進(jìn)入KB細(xì)胞。實(shí)施例7為了研究材料的體內(nèi)靶向CT/MRI成像，我們購買4至6周的裸鼠作為動物模型(上海動物實(shí)驗(yàn)中心)。腋下注射IX IO6表達(dá)葉酸受體的KB細(xì)胞入裸鼠體內(nèi)，注射約3周左右，腫瘤長到0.1-lcm3。將腫瘤裸鼠麻醉后，隨機(jī)抽取作為對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組老鼠通過尾靜脈注射1891^對比例材料？％04/^11(411八^304摩爾比為1.59)或本發(fā)明制備的Fe3O4Au-FA (Au/Fe304摩爾比為2.02)靶向納米材料的PBS溶液(Au總質(zhì)量為0.2mg)，然后在不同時間點(diǎn)(2h，6h，24h)進(jìn)行Micro-CT掃描。對于MRI靶向成像，首先通過尾靜脈注射189 μ L對比例材料Fe3O4Au或本發(fā)明制備的Fe304/Au_FA納米材料的PBS溶液(Fe總質(zhì)量為0.911^)，然后在不同時間點(diǎn)(211，611，2411)進(jìn)行1 1掃描。通過Micro-CT掃描，參考附圖11，a和b分別代表了靶向材料和非靶向材料的Micro-CT圖片，跟對照組比較，我們能夠看出，注射2h后，兩種材料的CT信號強(qiáng)度都加強(qiáng)了，沒有明顯區(qū)別，但是從6h到24h靶向材料Fe3O4Au-FA主要集中在腫瘤部位，而非靶向材料則慢慢被代謝掉。CT信號強(qiáng)度變化圖(圖lie)進(jìn)一步定量驗(yàn)證了 Micro-CT圖片的結(jié)果，跟非靶向材料比較，在 24h，注射靶向材料Fe3O4Au-FA的腫瘤的CT信號強(qiáng)度增加到200.16%，而非靶向材料Fe3O4Au的腫瘤的CT信號強(qiáng)度只有109.31%。對于MR成像，參考附圖12，注射靶向材料Fe304/Au-FA (圖12a)的裸鼠肝臟處的MRI信號強(qiáng)度明顯比注射非靶向材料Fe3O4Au的裸鼠肝臟處的MRI信號強(qiáng)度低得多。跟對照組相比，注射靶向材料Fe3O4Au-FA的裸鼠腫瘤部位的信號逐漸從亮白色變到灰色，表明靶向材料降低了腫瘤部位的MRI信號強(qiáng)度；而注射非靶向材料Fe3O4Au的裸鼠腫瘤部位的信號沒發(fā)生太大變化，這些結(jié)果表明靶向材料Fe3O4Au-FA能特異性靶向裸鼠腫瘤部位用于靶向MRI成像。MRI信號強(qiáng)度變化圖(圖12c)進(jìn)一步定量驗(yàn)證了 MRI圖片的結(jié)果，跟對照組比較，注射靶向材料Fe3O4Au-FA的裸鼠腫瘤部位的信號強(qiáng)度從2h (79.38%)到24h(56.24%)逐次降低，而注射非靶向材料Fe3O4Au的裸鼠腫瘤部位的信號強(qiáng)度從2h(82.71%)到24h (93.43%)逐次升高，信號慢慢恢復(fù)到初始強(qiáng)度。這些結(jié)果也表明祀向材料Fe304/Au-FA能特異性祀向表達(dá)葉酸受體的裸鼠腫瘤部位用于MRI/CT雙模態(tài)成像。實(shí)施例8為了研究靶向材料Fe304/Au-FA在體內(nèi)生物組織分布情況，首先通過尾靜脈注射納米材料的PBS溶液(Au質(zhì)量為0.2mg)入腫瘤裸鼠體內(nèi)，然后用ICP-AES測量Au元素在注射后不同時間點(diǎn)(12或36h)在各個重要器官中的含量。
從圖13中可看出，跟對照組(注射前)相比，Au元素主要分布在肝(在注射12和36h后，每克器官含Au量分別為19.5yg和56.1 μ g)和脾臟(在注射12和36h后，每克器官含Au量分別為59.0 μ g和190.6 μ g)處，并且隨著時間的增長，聚集量越多；而對于這兩個時間點(diǎn)，在其他的器官，比如:肺、腎和腫瘤，金的聚集明顯少得多。這些結(jié)果表明，靶向材料Fe3O4Au-FA能被巨噬細(xì)胞吞噬掉，并在小鼠體內(nèi)正常的代謝清除。同時需要指出的是,跟對照組腫瘤部位(每克腫瘤含金量為0.1 μ g)比較，靶向材料能特異性靶向腫瘤部位，在注射24h后，腫瘤部位含金量最多，達(dá)到1.0 μ g，在注射36h后，腫瘤部位含金量降低到
0.6。這些結(jié)果不僅表明靶向材料Fe3O4Au-FA對腫瘤部位具有很好的靶向性，可用于腫瘤靶向成像，而且表明材料能在小鼠體內(nèi)能慢慢的正常的代謝清除，且不顯示毒性。參考附圖13。對比例(I)將 2.375mL HAuCl4.4H20 水溶液(31.75mg/mL)加入到 G5.NH2 溶液(IOOmg 溶解于IOmL超純水中)中，攪拌半小時。然后向其中加入冰浴處理的硼氫化鈉溶液(40.50mg溶于2mL超純水/甲醇體積比為2:1的混合液)，攪拌還原反應(yīng)2小時，對水透析三天，冷凍干燥得到產(chǎn)品{(Au0) 50-G5 .NHJ DENPs納米顆粒。(2)通過靜電層層自組裝的方法,在0.5mL Fe3O4 (10mg/mL水溶液)納米顆粒表面依次組裝聚谷氨酸(PGA，lmg/mL溶于ρΗ7.4的PBS緩沖液，lmL)、聚賴氨酸(PLL，lmg/mL溶于ρΗ7.4的PBS緩沖液，ImL)和聚谷氨酸(PGA，lmg/mL溶于ρΗ7.4的PBS緩沖液，ImL)三層膜，在形成的PGA/PLL/PGA多層膜修飾的Fe3O4納米顆粒表面進(jìn)一步組裝過量的端基為氨基的{(Au0) 50-G5.NHJ DENPs溶液(lmg/mL溶于pH7.4的PBS緩沖液)。每次組裝吸附持續(xù)20min,8000rpm離心IOmin除掉過量的反應(yīng)物,離心洗漆3次,再重新分散于水中。組裝結(jié)束后，在 ρΗ5.5 的 2- (N-嗎琳)乙橫酸(2_(N-morpholino) ethane sulphonic acid, MES)(50mM)緩沖液條件下，進(jìn)行EDC交聯(lián)反應(yīng)20小時后，離心水洗3次得到Fe304/PGA/PLL/PGA/{(Au0) 50-G5.NHJ DENPs (Fe3O4OAu)納米材料。(3)可以通過改變控制逐層金種還原反應(yīng)的次數(shù)來調(diào)節(jié)Fe3O4OAu納米材料的Au/Fe3O4摩爾比。首先將40 μ L HAuCl4.4Η20溶液(31.74mg/mL)加入到上述合成的Fe3O4OAu ([Fe]=l.22mg/mL, [Au]=0.28mg/mL, 2mL)溶液中，超聲反應(yīng) 8min,再加入 40 μ L 水合肼(N2H4.Η20)超聲反應(yīng)8min，重復(fù)還原反應(yīng)6_7次。最后將上述制備的材料離心(lOOOOrpm,8min.)水洗4次，再均勻分散在5mL超純水中。向上述制備的5mL Fe3O4OAu水溶液中加入50 μ L三乙胺。振蕩30分鐘充分混合后，再逐滴加入15 μ L乙酸酐，將玻璃瓶放置在搖床上，振蕩反應(yīng)20小時，離心(lOOOOrpm，8min.)水洗4次，再均勻分散在2mL超純水中，制得表面乙?；膶φ詹牧螰e304/Au納米顆粒。通過UV-Vis和ICP-AES測試來鑒定對比例中的Fe304/Au的Au/Fe304摩爾比(參考附圖1和2)。其中圖1代表乙?；安煌珹u/Fe304摩爾比的Fe3O4Au的UV-Vis圖譜，圖2代表乙?；蟮腇e3O4Au和Fe3O4Au-FA納米顆粒的UV-Vis圖譜，從圖1和圖2中可以看出，跟沒有吸收峰的Fe3O4納米顆粒相比,Fe304/Au和Fe304/Au_FA納米顆粒在520nm處顯示出一個吸收峰，證實(shí)了 Au元素的存在；隨著金種還原反應(yīng)的次數(shù)的增加，在520nm處的吸收峰越來越明顯，且ICP結(jié)果也表明Fe3O4Au納米顆粒的Au/Fe304摩爾比從0.20:1增加到
1.59:1。
權(quán)利要求
1.一種葉酸修飾的多功能靶向造影劑磁性氧化鐵/金納米顆粒的制備方法，包括: (1)配制NaOH溶液，氮?dú)獗Ｗo(hù)下，提前預(yù)熱到80°C，然后將Fe源溶解于鹽酸中，排除空氣，再加入到提前預(yù)熱好的NaOH溶液中，并于氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)2小時；反應(yīng)結(jié)束后，自然冷卻至室溫，將沉淀洗滌分離后，得到Fe3O4納米顆粒； (2)將葉酸和1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基-碳二亞胺鹽酸鹽EDC分別溶于溶劑中，混合，攪拌活化2-3h，然后滴加到第5代聚酰胺/胺樹狀大分子G5.NH2溶液中，攪拌反應(yīng)2-3d，透析，冷凍干燥，得到G5.NH2-FA ;其中G5.NH2的表面氨基、葉酸、EDC的摩爾比為22:1:10 ； (3)將HAuCl4.4H20水溶液加入G5.NH2-FA溶液中，攪拌10_30min，然后加入硼氫化鈉NaBH4溶液，攪拌反應(yīng)l_2h，透析，冷凍干燥，得到{(Au0) 50-G5.NH2-FAj DENPs納米顆粒；其中G5.NH2-FA 和 HAuCl4.4H20 摩爾比為 1:50 ; (4)通過靜電層層自組裝的方法，在Fe3O4納米顆粒表面一次組裝聚谷氨酸PGA、聚賴氨酸PLL和聚谷氨酸PGA三層膜，然后進(jìn)一步組裝{(Au0) 50-G5.NH2-FAj DENPs，組裝結(jié)束后，進(jìn)行EDC交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)時間為15-20h，離心，洗滌，得到Fe304/PGA/PLL/PGA/ {(Au0) 50-G5.NH2-FAj DENPs ;其中每次組裝吸附時間為15_20min，F(xiàn)e3O4納米顆粒溶液、PGA溶液、PLL溶液、PGA溶液的體積比為0.5:1:1:1 ;(5 )將 HAuCl4.4H20 溶液加入 上述合成的 Fe304/PGA/PLL/PGA/ {(Au0) 50-G5.NH2-FAjDENPs溶液中，超聲反應(yīng)5-8min，再加入水合肼N2H4.H2O超聲反應(yīng)5_8min，重復(fù)6_7次，離心，洗漆，得到Fe3O4Au-FA納米材料，將Fe3O4Au-FA納米材料分散在水中，然后加入三乙胺，振蕩混合，再滴加入乙酸酐，振蕩反應(yīng)18-20h，離心，洗滌，再分散在水中，即得表面乙?；?Fe3O4Au-FA 納米顆粒，其中 HAuCl4.4H20 溶液、Fe304/PGA/PLL/PGA/{(Au°) 5(1-G5.NH2-FAj DENPs溶液、水合肼N2H4 -H2O溶液的體積比為40 μ L:2mL:40 μ L ;三乙胺、乙酸酐與樹狀大分子中的表面NH2摩爾比為11:5:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的多功能靶向造影劑磁性氧化鐵/金納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(I)中NaOH溶液的濃度1Μ，體積為250mL ;鹽酸的濃度為0.4M,體積為25mL ；Fe源為摩爾比為2:1的FeCl3.6H20和FeCl2.4H20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的多功能靶向造影劑磁性氧化鐵/金納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(2)中溶劑為二甲基亞砜DMS0。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的多功能靶向造影劑磁性氧化鐵/金納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中HAuCl4.4H20水溶液的濃度為6.00mg/mL,G5.NH2-FA溶液的濃度為2mg/ml，硼氫化鈉溶液濃度為6.91mg/ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的多功能靶向造影劑磁性氧化鐵/金納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)中NaBH4溶液的溶劑為體積比為1:2的甲醇和超純水混合液，NaBH4溶液為冰浴處理。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的多功能靶向造影劑磁性氧化鐵/金納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中Fe3O4納米顆粒溶液濃度為10mg/mL,聚谷氨酸溶液的濃度為lmg/mL，聚賴氨酸溶液濃度為lmg/mL，{(Au°)50-G5.NH2_FA} DENPs溶液的濃度為lmg/mL0
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的多功能靶向造影劑磁性氧化鐵/金納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中PGA、PLL、和{(Au°)5C1-G5.NH2-FAjDENPs溶液的溶劑都是pH為7.4的PBS。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的多功能靶向造影劑磁性氧化鐵/金納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(4)中EDC交聯(lián)反應(yīng)條件為在pH5.5的2- (N-嗎啉)乙磺酸MES緩沖液條件下進(jìn)行的，MES緩沖液的濃度為50mM。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的多功能靶向造影劑磁性氧化鐵/金納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(5)中HAuCl4.4H20溶液濃度為31.74mg/mL ；Fe304/PGA/PLL/PGA/{(Au。)5(1-G5.NH2-FAj DENPs 溶液中[Fe]=0.97mg/mL, [Au] =0.32mg/mL。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種葉酸修飾的多功能靶向造影劑磁性氧化鐵/金納米顆粒的制備方法，其特征在于:所述步驟(5)中三乙胺的密度為0.726 0.729g/mL，體積百分濃度為99.0% ;乙酸酐的密度 為1.08g/mL，體積百分濃度為98.5%。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種葉酸修飾的多功能靶向造影劑磁性氧化鐵/金復(fù)合納米顆粒的制備方法，包括合成Fe3O4納米顆粒，將納米金顆粒包裹在修飾了靶向分子葉酸的樹狀大分子內(nèi)部，得到{(Au0)50-G5.NH2-FA}DENPs納米顆粒；然后在Fe3O4納米顆粒表面形成高分子多層膜，并在最外層組裝修飾{(Au0)50-G5.NH2-FA}DENPs；進(jìn)行殼層交聯(lián)，得到復(fù)合納米顆Fe3O4/Au-FA；調(diào)節(jié)Fe3O4/Au-FA納米材料的Au/Fe3O4摩爾比，優(yōu)化雙模態(tài)成像效果，最后進(jìn)行乙?；揎?，得到具有最好雙模態(tài)成像效果的Fe3O4/Au-FA納米材料。本發(fā)明工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作分離。
文檔編號A61K49/12GK103223178SQ20131017026
公開日2013年7月31日 申請日期2013年5月9日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月9日
發(fā)明者史向陽, 蔡紅東, 李靜超, 沈明武 申請人:東華大學(xué)