氨柔比星脂質(zhì)體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及氨柔比星脂質(zhì)體及其制備工藝。該脂質(zhì)體包含治療劑量的氨柔比星，以及適量的磷脂、膽固醇等。同時本發(fā)明提供了該脂質(zhì)體可制備的劑型—凍干制劑的制備方法。該劑型適用于惡性腫瘤的治療，在一定程度上降低了抗癌藥物氨柔比星的毒副作用。
【專利說明】氨柔比星脂質(zhì)體及其制備方法
【技術領域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種氨柔比星脂質(zhì)體凍干制劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002]氨柔比星(amrubicin)，化學名為(7S，9S)-9_乙?；?9-氨基_7-[ (2_脫氧-B-D-赤型-吡喃戊糖基)氧基]-7，8，9，10-四氫-6，11-二羥基_5，12-并四苯二酮，本品為日本住友制藥株式會社開發(fā)的全合成第三代蒽環(huán)類抗生素和強有力的DNA拓撲異構(gòu)酶II抑制劑，用于非小細胞肺癌和小細胞肺癌的治療，于2002年在日本注冊并上市。臨床劑量以鹽酸氨柔比星計，成人I日I次，每次45mg/m2 (體表面積)，溶于20ml生理鹽水或5%葡萄糖注射液中，連續(xù)3日靜脈推注，然后停藥3~4周，再進行下一療程的治療(袁永榮，常萍.肺癌用藥鹽酸氨柔比星[J].齊魯藥事，2004，23: 61)。
[0003]氨柔比星及其活性代謝物氨柔比星醇，主要通過抑制拓撲異構(gòu)酶II的活性，最終導致DNA的斷裂而抑制腫瘤細胞增殖。第1-1I期臨床試驗確定本品的最大耐受劑量(MTD)為50mg/m2/d。第II期臨床試驗數(shù)據(jù)表明，本品對非小細胞肺癌的有效率達到27.9%(其中完全緩解率為1.6%)，對小細胞肺癌的有效率達到了 75.8% (其中完全緩解率為9.1%)(袁永榮，常萍.肺癌用藥鹽酸氨柔比星[J].齊魯藥事，2004，23: 61)。美國臨床腫瘤學會2011報道Jotte等的一項研究報告表明，氨柔比星(AMR)治療小細胞肺癌(SCLC)與托泊替康(Topo)相比，可顯著改善緩解率。AMR組生存期較長[危險比(HR)為0.88]，難治性患者亞組更是如此(HR為0.77)。
[0004]氨柔比星給藥后，原型藥物濃度迅速降低，其代謝物氨柔比星醇的濃度基本保持平穩(wěn)。全身臟器均有藥物分布，在骨髓、消化道壁細胞、皮膚、腎、腎上腺、肝臟、脾臟、肺中的藥物濃度較高，心臟細胞藥物濃度較低。其主要代謝器官為肝臟，代謝酶主要是羰基還原酶、NADPH-P450還原酶、NADPH氫-醌還原酶。膽汁、尿和糞便為其主要排泄渠道。(盧紅陽，陳莉莉等.氨柔比星治療小細胞肺癌研究進展[J].中國肺癌雜質(zhì)，2010，13: 544-549)。
[0005]在臨床試驗和應用中，發(fā)現(xiàn)本品的毒副作用主要是骨髓機能抑制。其中白細胞減少和嗜中性粒細胞減少發(fā)生率都在90%以上，貧血發(fā)生率在80%以上。(袁永榮，常萍.肺癌用藥鹽酸氨柔比星[J].齊魯藥事，2004，23:61)因此，通過藥物制劑技術以達到改善氨柔比星的毒副作用，增加患者的順應性，方便臨床用藥已成為亟待解決的課題。
[0006]目前氨柔比星制劑方面的相關專利已有:中國專利[200610200279.3] 一種痛載氨柔比星及其增效劑的抗癌藥物緩釋劑。研究了氨柔比星的微球制劑，該專利實施例1中指出用聚苯丙生制備的含藥10%氨柔比星微球制劑體外釋放可持續(xù)10~15天，小鼠皮下注射后維持釋放20~30天左右。但微球制劑由于在制備過程中大量使用有機溶劑無疑造成制劑中的有機殘留，可能進一步降低患者的順應性。中國專利[201010272910.7]報道了氨柔比星凍干制劑及其制備方法等。該專利中提出影響氨柔比星穩(wěn)定性的因素，主要為pH值、溫度和水分，該專利將氨柔比星制備成凍干制劑并嚴格控制水分在O~3.5%，制備溫度控制在15°C以下，pH值調(diào)節(jié)在2~5。[0007]但是目前針對氨柔比星服藥后不良反應較多，患者順應性差而進行的研究報道較少，本發(fā)明通過改變氨柔比星給藥的常規(guī)劑型，以目前在國內(nèi)外尚未見報道的氨柔比星脂質(zhì)體為研究對象，結(jié)合溶出度試驗和毒性試驗，初步顯示了脂質(zhì)體凍干制劑在一定程度上可以在保證藥物較高體外溶出度的前提下，降低藥物的毒性。
[0008]眾所周知，脂質(zhì)體具有低毒和良好的生物相容性，近年來，屢見文獻和專利中報道以脂質(zhì)體為載體的抗癌制劑，并已有產(chǎn)品成功上市，例如阿霉素脂質(zhì)體和順鉬脂質(zhì)體已在國外上市。近期，石藥集團有限公司自主開發(fā)的抗腫瘤藥物鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液(商品名多美素)也已在國內(nèi)成功上市，該產(chǎn)品的研發(fā)得到了 863計劃的鼎力支持。在此鼓舞下，本課題組研究開發(fā)了一種氨柔比星脂質(zhì)體凍干制劑及其制備工藝，該工藝可以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。體外溶出度試驗試驗表明4小時溶出度可達到70%以上。在給以較高劑量的藥物氨柔比星之后，氨柔比星脂質(zhì)體凍干制劑組較對照組可有效提高大鼠存活率I倍以上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明中所述的藥物氨柔比星，包含氨柔比星、鹽酸氨柔比星或氨柔比星的其它成鹽形式，如甲磺酸氨柔比星、醋酸氨柔比星等。
[0010]本發(fā)明中所提供的一種氨柔比星脂質(zhì)體凍干制劑，包含了給藥劑量的藥物氨柔比星、磷脂、膽固醇，同時包含了表面活性劑和糖。
[0011]目前，可用作脂質(zhì)體制備的磷脂分為天然磷脂和合成磷脂兩大類，天然磷脂主要以卵磷脂(磷脂酰膽堿)為主，合成磷脂主要為氫化磷脂類。本發(fā)明所涉及的氨柔比星脂質(zhì)體，其磷脂包括以下 一種或幾種:DPPC (二棕櫚酰磷脂酰膽堿)、DSPC (二硬脂酰磷脂酰膽堿)、DDPG (二棕櫚酰磷脂酰二甘油)。
[0012]發(fā)明中所述的表面活性劑為聚乙二醇化酯類，包括以下一種或幾種:甲氧基PEG2000- 二硬酯酰磷脂酰乙醇銨、膽固醇-PEG、甘油二酯_PEG、DSPE多臂PEG或DSPE樹狀PEG。
[0013]由于脂質(zhì)體凍干制劑的制備過程中，不可避免需進行冷凍干燥，而低溫環(huán)境對脂質(zhì)體的穩(wěn)定性造成了不利的影響。文獻報道(唐文雅，鄧意輝等.脂質(zhì)體凍干保護劑種類及其作用機制研究進展[J].沈陽藥科大學學報，2012，29: 560-569)，脂質(zhì)體凍干制劑水化后，可能會引起粒徑的增大以及單室脂質(zhì)體向多室脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)變。在一定程度上表明凍干過程中會引起雙層膜的融合、聚集，造成內(nèi)容物的滲漏。解決這一問題的有效途徑是，凍干保護劑的應用。目前可作為凍干保護劑的輔料有葡萄糖、甘露醇、麥芽糖、海藻糖、蔗糖、乳糖、果聚糖、氨基酸等。本專利中優(yōu)選但不限于將海藻糖作為凍干保護劑，并進行工藝優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)當糖脂比的比例為3.0~5.0時，其保護效果最佳，可有效的提高凍干后脂質(zhì)體內(nèi)容物的保留率，防止復溶后脂質(zhì)體粒徑的顯著增大以及單室脂質(zhì)體向多室脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)變。
[0014]本發(fā)明還包含了以下的內(nèi)容:
(I)所述的氨柔比星脂質(zhì)體，其中氨柔比星占該藥物組合物重量的0.01%~1.2%，優(yōu)選
0.05% ~1%。
[0015](2)所述的氨柔比星脂質(zhì)體，其中磷脂占該藥物組合物重量的1%~10%，優(yōu)選2%~
8% ο
[0016](3)所述的氨柔比星脂質(zhì)體，其中膽固醇占該藥物組合物重量的0.001%~5%，優(yōu)選 0.01% ~3%O
[0017](4)所述的氨柔比星脂質(zhì)體，其中表面活性劑占該藥物組合物重量的0.001%~2%，優(yōu)選 0.01% ~1%。
[0018](5)所述的氨柔比星脂質(zhì)體，其中糖占該藥物組合物重量的8%~40%，優(yōu)選15%~30%。
[0019](6)所述的氨柔比星脂質(zhì)體，其中硫酸銨占該藥物組合物重量的0.003%~3%，優(yōu)選 0.005% ~2%ο
[0020]本發(fā)明包含了一種氨柔比星脂質(zhì)體凍干制劑制備工藝如下:
(I)將二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰二甘油中的一種或幾種與聚乙二醇化脂類表面活性劑和膽固醇溶于乙醇和異丙醇或叔丁醇的混和溶劑中，冷凍干燥，制備得脂相混合物。
[0021](2)用pH 2~4的磷酸鹽緩沖液配制0.05、.5M.L-1硫酸銨水溶液，加到脂相混合物中，在40~70°C的溫度下攪拌0.5~4h，制備得空白脂質(zhì)體中間體I。 [0022](3)將步驟(2)得到的空白脂質(zhì)體中間體I經(jīng)微射流整粒數(shù)次，壓力設定為8000~18000psi，得到粒徑均勻的空白脂質(zhì)體中間體II。
[0023](4)將步驟(3)得到的空白脂質(zhì)體中間體II進行柱層析，采用糖濃度為0.5~IM.ΙΛ pH為2~4的磷酸鹽糖溶液進行洗脫，用于置換脂質(zhì)體外相中的硫酸銨，得空白脂質(zhì)體溶液。
[0024](5)按照權利要求7或8所述的藥物濃度，制備得20~100mg/ml的氨柔比星或鹽酸氨柔比星注射用水溶液。于空白脂質(zhì)體溶液中20~40°C下孵化0.5~lh，得氨柔比星脂質(zhì)體溶液。
[0025](6)將步驟(5)得到的氨柔比星脂質(zhì)體溶液經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾除菌，按適當規(guī)格進行灌裝。
[0026](7)將步驟(6)所得灌裝好的脂質(zhì)體溶液進行冷凍干燥，加塞、密封得氨柔比星脂質(zhì)體凍干粉針。
[0027]步驟(1)中所述的乙醇和異丙醇或叔丁醇的混合溶劑，其特征在于:乙醇與異丙醇或叔丁醇的的比例范圍為10:90~90:10。步驟(4)中所述的糖溶液優(yōu)選但不限于海藻糖。步驟(7)中所述的冷凍干燥條件為預凍溫度為-30~_40°C,預凍時間為I~4h。冷凍干燥時，真空泵壓力為10~20pa，冷凍溫度為-20~_30°C，冷凍時間為7~15h。步驟
(2),(4)中所述的PH值調(diào)節(jié)劑優(yōu)選但不限于磷酸鹽緩沖溶液，還可選擇醋酸鹽緩沖液等。
[0028]下面的實施例和試驗例均為對本發(fā)明進行的說明，但本發(fā)明并不限于以下例子 實施例1
將二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC):膽固醇:DSPE-PEG2000以1: 0.05:0.01比例溶于1000mL乙醇和異丙醇混和溶劑(1:6)中，冷凍干燥，得到脂相混合物。將硫酸銨溶解于pH為3磷酸鹽緩沖液中，得濃度為0.05M -L-1的硫酸銨溶液，加入至上述冷凍干燥后的脂相混合物中，在55°C下水浴加熱、攪拌1.5小時，得到空白脂質(zhì)體中間體I?？瞻字|(zhì)體中間體I經(jīng)微射流整粒三次，壓力設定為I1000psi，得到粒徑均勻的空白脂質(zhì)體中間體II。采用柱層析法，將空白脂質(zhì)體中間體II用pH為3的0.5M.L-1海藻糖磷酸鹽溶液置換外相中的硫酸銨，得空白脂質(zhì)體溶液。用注射用水制備濃度為5%的鹽酸氨柔比星溶液，鹽酸氨柔比星加入量占制劑的0.1%。將上述藥物溶液倒入空白脂質(zhì)體溶液中，緩慢攪拌混合后，至35°C水浴中恒溫孵化I小時，得鹽酸氨柔比星脂質(zhì)體溶液。上述產(chǎn)物經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾、除菌，得無菌鹽酸氨柔比星脂質(zhì)體溶液。對其灌裝后進行冷凍干燥(預凍溫度:-30~-40°C，預凍時間為I~4h。冷凍干燥時，真空泵壓力:10pa，冷凍溫度:-20~_30°C，冷凍時間為7~15h。)，之后將溫度由-20~_30°C升溫至0°C，升溫時間4h~6h，再將溫度由0°C升溫至25~30°C，升溫時間為6h~8h，在此溫度范圍內(nèi)恒溫干燥8h左右。干燥后制劑加蓋密封，制備得氨柔比星脂質(zhì)體凍干制劑。
[0029]實施例2
將二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC):二硬酯酰磷脂酰膽堿(DSPC):膽固醇:DSPE-PEG2000以0.7:0.3:0.5:0.2的比例溶于1000mL乙醇和叔丁醇混和溶劑(1:6)中，冷凍干燥，得到脂相混合物。將硫酸銨溶解于PH為3磷酸鹽緩沖液中，得濃度為0.5M -L-1的硫酸銨溶液，加入至上述冷凍干燥后的脂質(zhì)混合物中，在55°C下水浴加熱、攪拌1.5小時，得到空白脂質(zhì)體中間體I?？瞻字|(zhì)體中間體I經(jīng)微射流整粒三次，壓力設定為llOOOpsi，得到粒徑均勻的空白脂質(zhì)體中間體II。采用柱層析法，將空白脂質(zhì)體中間體II用PH為3的IM.L-1海藻糖磷酸鹽溶液置換外相中的硫酸銨，得空白脂質(zhì)體溶液。用注射用水制備濃度為5%的鹽酸氨柔比星溶液，鹽酸氨柔比星加入量占制劑的1.0%。將上述藥物溶液倒入空白脂質(zhì)體溶液中，緩慢攪拌混合后，至35°C水浴中恒溫孵化I小時，得鹽酸氨柔比星脂質(zhì)體溶液。上述產(chǎn)物經(jīng)0.22μπι濾膜過濾、除菌，得無菌鹽酸氨柔比星脂質(zhì)體溶液。對其灌裝后進行冷凍干燥(預凍溫度:-30~_40°C,預凍時間為I~4h。冷凍干燥時,真空泵壓力:15pa,冷凍溫度:-20~_30°C，冷凍時間為7~15h。)，之后將溫度由-20~_30°C升溫至(TC，升溫時間4h~6h，再將溫度由0°C升溫至25~30°C，升溫時間為6h~8h，在此溫度范圍內(nèi)恒溫干燥8h左右。干燥后制劑加蓋密封，制備得到氨柔比星脂質(zhì)體凍干制劑。 [0030]試驗例I
分別將按照實施例1，2的方法制備的樣品1、樣品2取適量溶解于5%的葡萄糖溶液中，精密移取上述樣品溶液5ml于透析膜中，將此透析膜置于100mL的pH7.4的磷酸鹽緩沖液釋放介質(zhì)中。設定氣浴恒溫振蕩器溫度37°C，轉(zhuǎn)數(shù)60rpm。分別于0，15，30，60，120，240min定時取樣ImL,同時補充釋放介質(zhì)ImL,樣品經(jīng)0.22Mm微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液用HPLC法測定不同時間點藥物的含量。計算累計溶出度，結(jié)果如圖1所示。由圖1可見，本發(fā)明樣品皆達到70%的溶出度，具有較好的溶出效果。
[0031]試驗例2
將實施例2的方法制備的氨柔比星凍干脂質(zhì)體凍干制劑，取適量溶解于5%葡萄糖水溶液中，作為供試樣品。制備藥物濃度為0.5%的氨柔比星5%葡萄糖水溶液作為對照樣品。將體重200±20g的wista大鼠隨機分為2組，每組6只，一組對照組，一組樣品組。尾靜脈給藥，給藥劑量為50mg/m2，給藥后觀察實驗鼠的毒性反應，觀察周期為一周。計算大鼠的存活率，并采用統(tǒng)計學計算其顯著性差異，結(jié)果如表1所示:
【權利要求】
1.一種氨柔比星脂質(zhì)體，其包含氨柔比星、磷脂、膽固醇，同時包含糖和表面活性劑，所述氨柔比星脂質(zhì)體為凍干制劑。
2.根據(jù)權利要求1所述的氨柔比星脂質(zhì)體，其特征在于所述氨柔比星可以為氨柔比星、鹽酸氨柔比星或氨柔比星的其它成鹽形式。
3.根據(jù)權利要求1所述的氨柔比星脂質(zhì)體，其特征在于所述磷脂包括以下一種或幾種:二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰二甘油。
4.根據(jù)權利要求1所述的氨柔比星脂質(zhì)體，其特征在于所述表面活性劑為聚乙二醇化酯類。
5.根據(jù)權利要求1所述的氨柔比星脂質(zhì)體，其特征在于所述糖選自下述一種或多種:海藻糖、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖，優(yōu)選海藻糖。
6.根據(jù)權利要求1所述的 氨柔比星脂質(zhì)體，其特征在于所述的磷脂:膽固醇:聚乙二醇化酯的比例為:1:0.05~0.5:0.01~0.2。
7.根據(jù)權利要求1所述氨柔比星脂質(zhì)體，其特征在于，各組分的重量比為:氨柔比星0.01%~1.2%、磷脂1%~10%、膽固醇0.001%~5%,表面活性劑0.001%~2%、糖8%~40%、硫酸銨0.003%~3%，其余為注射用水。
8.根據(jù)權利要求1所述氨柔比星脂質(zhì)體，其特征在于，各組分的重量比優(yōu)選為:氨柔比星0.05%~1%、磷脂2%~8%、膽固醇0.01%~3%,表面活性劑0.01%~1%、糖15%~30%、硫酸銨0.005%~2%，其余為注射用水。
9.一種制備權利要求1所述氨柔比星脂質(zhì)體的方法: (1)將二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰二甘油中的一種或幾種與聚乙二醇化脂類表面活性劑和膽固醇溶于乙醇和異丙醇或叔丁醇的混和溶劑中，冷凍干燥，制備得脂相混合物； (2)用pH2~4的磷酸鹽緩沖液配制0.05~0.5M.L-1硫酸銨水溶液，加到脂相混合物中，在40~70°C的溫度下攪拌0.5~4h，制備得空白脂質(zhì)體中間體I ; (3)將步驟(2)得到的空白脂質(zhì)體中間體I經(jīng)微射流整粒數(shù)次，壓力設定為8000~18000psi，得到粒徑均勻的空白脂質(zhì)體中間體II ； (4)將步驟(3)得到的空白脂質(zhì)體中間體II進行柱層析，采用糖濃度為0.5~IM.Ι^，pH為2~4的磷酸鹽糖溶液進行洗脫，用于置換脂質(zhì)體外相中的硫酸銨，得空白脂質(zhì)體溶液； (5)按照權利要求7或8所述的藥物濃度，制備得20~100mg/ml的氨柔比星或鹽酸氨柔比星注射用水溶液，于空白脂質(zhì)體溶液中20~40°C下孵化0.5~lh，得氨柔比星脂質(zhì)體溶液； (6)將步驟(5)得到的氨柔比星脂質(zhì)體溶液經(jīng)0.22 μ m濾膜過濾除菌，按適當規(guī)格進行灌裝； (7)將步驟(6)所得灌裝好的脂質(zhì)體溶液進行冷凍干燥，加塞、密封得氨柔比星脂質(zhì)體凍干粉針。
10.權利要求9所述的制備方法，其中步驟(1)中所述的乙醇和異丙醇或叔丁醇的混合溶劑，其特征在于:乙醇與異丙醇或叔丁醇的比例范圍為10:90~90:10。
11.權利要求9所述的制備方法，步驟(4)中所述的糖溶液如權利要求5所述，優(yōu)選海藻糖溶液。
12.權利要求9所述的制備方法，步驟(7)中所述的冷凍干燥條件為預凍溫度為-30~-40°C，預凍時間為1~4h，冷凍干燥時，真空泵壓力為10~20pa，冷凍溫度為-20~-30°C，冷凍時間為7~15h。
13.權利要求9所述的制備方法，步驟(2)、(4)中所述的pH調(diào)節(jié)劑優(yōu)選但不限于磷酸鹽緩沖液。
【文檔編號】A61P35/00GK104000781SQ201310056867
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月23日 優(yōu)先權日:2013年2月23日
【發(fā)明者】胡潔, 何亮, 賈春榮 申請人:重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司, 重慶匯智藥物研究院有限公司