專利名稱：一種rna及其在心血管系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種RNA及其在心血管系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
HIP-55(hematopoietic progenitor kinase I[HPK1]-1nteracting protein of55 kDa ;也稱為drebrin-like protein、mAbpl或SH3P7)是一個(gè)包含多功能域的蛋白質(zhì)。其結(jié)構(gòu)主要包含著N端的F-actin蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端SH3結(jié)構(gòu)域。HIP-55參與突觸發(fā)生、受體內(nèi)吞、骨架重排及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。目前對(duì)HIP-55功能了解較少尚無(wú)對(duì)HIP-55在心血管系統(tǒng)方面的研究報(bào)道。心血管疾病是中國(guó)居民健康的“頭號(hào)殺手”，每年主要用于心血管病的直接醫(yī)療費(fèi)用已達(dá)1300億元人民幣。心肌纖維化是心臟重塑的重要病理改變，是指在心肌的正常組織結(jié)構(gòu)中心肌成纖維細(xì)胞過(guò)度分裂，膠原纖維過(guò)量積聚、心臟組織中膠原濃度顯著升高或膠原成分發(fā)生改變，引起心肌僵硬度增加、舒縮功能受限，嚴(yán)重影響心臟的功能。這種病理變化在多種心血管疾病中存在，與心律失常、心功能障礙甚至心臟性猝死密切相關(guān)。心肌纖維化是心功能由代償期向失代償期轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵，其嚴(yán)重程度和疾病的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。因此，預(yù)防和逆轉(zhuǎn)心肌纖維化具有重要的意義。大量研究表明兒茶酚胺-腎上腺素系統(tǒng)過(guò)度激活是促心肌纖維化的重要因素，兒茶酚胺(如異丙腎上腺素isoproteixmol，Iso)通過(guò)β -ARs促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成增加，從而導(dǎo)致心肌纖維化、心臟功能的惡化和心衰的形成。同時(shí)β-ARs阻滯劑能夠顯著改善患者的預(yù)后。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種RNA及其在心血管系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的RNA，其核苷酸序列為序列表中序列3。編碼上述RNA的基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述RNA的基因的核苷酸序列為序列表中序列4。含有上述基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組腺病毒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述重組載體為重組腺病毒載體；所述重組腺病毒載體具體為將上述的基因?qū)胂俨《据d體中，得到表達(dá)RNA的重組腺病毒載體。上述腺病毒載體為pAd/PL-Dest，上述重組腺病毒載體具體為將編碼上述RNA的基因(序列4)插入pAd/PL-Dest中得到的載體，將該質(zhì)粒命名為shpAd_HIP-55HIP-55蛋白抑制劑在制備具有如下I)和/或2)功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍:1)促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞增殖；2 )提高P38MAPK激酶活性；所述HIP-55蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。上述促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞增殖具體通過(guò)如下I)或2)體現(xiàn):
I)在ISO誘導(dǎo)下增加心臟成纖維細(xì)胞Brdu參入量；2)在ISO誘導(dǎo)增加心臟成纖維細(xì)胞CCK8吸光值。上述提高P38MAPK激酶(為兩種亞型，其氨基酸序列為序列表中的序列8或序列9)活性通過(guò)提高P38MAPK激酶底物ATF-2的磷酸化水平。上述應(yīng)用中，所述HIP-55蛋白抑制劑為上述RNA、上述基因或上述重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組腺病毒。上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品為藥物。 上述應(yīng)用中，所述心臟成纖維細(xì)胞為離體心臟成纖維細(xì)胞。HIP-55蛋白在篩選、開發(fā)和/或設(shè)計(jì)具有如下I)和/或2)功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍:1)抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖；2)抑制P38MAPK激酶活性；所述HIP-55蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)經(jīng)異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)，在乳大鼠心肌成纖維細(xì)胞中過(guò)表達(dá)HIP-55明顯抑制心臟成纖維細(xì)胞增殖，與之相反，應(yīng)用RNAi方法knock downHIP-55明顯促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞增殖；在過(guò)表達(dá)HIP-55心臟成纖維細(xì)胞中能夠抑制ISO誘導(dǎo)的P38MAPK的激活以及激酶活性，而在Knock-down HIP-55心肌成纖維細(xì)胞中能夠增強(qiáng)ISO誘導(dǎo)的P38MAPK的激活以及激酶活性；發(fā)現(xiàn)HIP-55是一種新的對(duì)心臟纖維化具有保護(hù)作用的蛋白質(zhì)，為臨床診斷、治療及新藥開發(fā)提供了新的靶點(diǎn)。


圖1為過(guò)表達(dá)HIP-55蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)A為攜帶Dserd-HIP-55基因腺病毒及攜帶Dserd基因的對(duì)照腺病毒轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)；B為過(guò)表達(dá)HIP-55蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)圖2為HIP_55shRNA敲減HIP-55蛋白質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)圖3為HIP-55抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖(Brdu法)A為過(guò)表達(dá)HIP-55抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖；B為敲減HIP-55促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖圖4為HIP-55抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖(CCK8法)A為過(guò)表達(dá)HIP-55抑制心肌成纖維細(xì)胞增殖；B為敲減HIP-55促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖圖5為ISO通過(guò)p38MAPK誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞增殖圖6為HIP-55抑制心臟成纖維細(xì)胞P38MAPK激酶活性A和B為過(guò)表達(dá)HIP-55抑制心肌成纖維細(xì)胞P38MAPK激酶活性；C和D為敲減HIP-55增強(qiáng)心肌成纖維細(xì)胞P38MAPK激酶活性。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中定量試驗(yàn)均重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。鼠HIP-55蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2，編碼該蛋白的基因的核苷酸序列為序列表中的序列I。下述實(shí)施例采用的離體乳大鼠心臟成纖維細(xì)胞通過(guò)如下方法獲得:實(shí)驗(yàn)用SD乳大鼠購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，完全遵照北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)；采用酶消化和差速貼壁方法進(jìn)行分離培養(yǎng)；細(xì)胞在含有10%胎牛血清(Biochrom AG, Berlin, Germany)的高糖 DMEM (Hyclone, Logan, UT)培養(yǎng)基里,其中添加ΙΟΟμ g/ml鏈霉素及100U/ml青霉素，置于37°C的5%C02孵箱里培養(yǎng)，具體如下:出生1-3天內(nèi)的SD乳大鼠，浸沒于75%酒精；眼科剪開胸取心臟；置于冰冷的Hank’s緩沖液中剪除心房部分并洗滌兩次。轉(zhuǎn)移到IOml血清瓶中，剪碎組織后Hank’s緩沖液再洗滌兩次。棄去上清；加入4mL0.1%胰蛋白酶置于37°C水浴中平緩攪動(dòng)消化，每次4min,棄去前兩次細(xì)胞懸液。繼續(xù)進(jìn)行6-8次消化，收集細(xì)胞懸液，加入含4mLDMEM完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)的離心管中， IOOOrpmX 5min離心，取4mL DMEM完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞沉淀，再次重懸離心。最后合并收集細(xì)胞，接種于IOcm培養(yǎng)皿，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)2小時(shí)。吸取未貼壁的心肌細(xì)胞懸液，已貼壁的成纖維細(xì)胞用DMEM洗滌后，加入DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。長(zhǎng)滿后傳代，實(shí)驗(yàn)選用第二代離體心臟成纖維細(xì)胞。下面實(shí)施例采用的抗體如下:Anti_EIF5 (Santa cruz公司；貨號(hào):c_282)、Ant1-P38MAPK (santa cruz 公司；貨號(hào):sc-7194)、Ant1-phospho_P38MAPK (cellsignaling ;貨號(hào):#9211s)。實(shí)施例1、HIP-55shRNA、過(guò)表達(dá)HIP-55的重組腺病毒和RNA干擾HIP-55表達(dá)的重組腺病毒的獲得一、HIP_55shRNA 的獲得針對(duì)鼠HIP-55蛋白編碼基因設(shè)計(jì)并合成如下HIP_55shRNA和對(duì)照Control shRNA如表I所示:HIP_55shRNA，其核苷酸序列為序列表中序列3，其編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列4 ；設(shè)計(jì)Control shRNA:其核苷酸序列為序列表中序列5，其編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列6 ；表I為shRNA及其對(duì)照序列
權(quán)利要求
1.一種RNA，其核苷酸序列為序列表中序列3。
2.編碼權(quán)利要求1所述RNA的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述RNA的基因的核苷酸序列為序列表中序列4。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組腺病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的載體，其特征在于: 所述重組載體為重組腺病毒載體；所述重組腺病毒載體具體為將權(quán)利要求2或3所示的基因?qū)胂俨《据d體中，得到表達(dá)RNA的重組腺病毒載體。
6.HIP-55蛋白抑制劑在制備具有如下I)和/或2)功能的產(chǎn)品中的應(yīng)用: 1)促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞增殖； 2)提高P38MAPK激酶活性； 所述HIP-55蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列2。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于:所述HIP-55蛋白抑制劑為權(quán)利要求1所述RNA、權(quán)利要求2或3所述基因或權(quán)利要求4或5重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組腺病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述產(chǎn)品為藥物。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的應(yīng)用，其特征在于: 所述心臟成纖維細(xì)胞為離體心臟成纖維細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種RNA及其在心血管系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的一種RNA，一種RNA，其核苷酸序列為序列表中序列3。還提供了編碼上述RNA的基因。所述RNA的基因的核苷酸序列為序列表中序列4。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)經(jīng)異丙腎上腺素(ISO)誘導(dǎo)，在乳大鼠心肌成纖維細(xì)胞中應(yīng)用RNAi方法knock down HIP-55明顯促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞增殖；而在Knock-down HIP-55心肌成纖維細(xì)胞中能夠增強(qiáng)ISO誘導(dǎo)的P38MAPK的激活以及激酶活性；發(fā)現(xiàn)HIP-55是一種新的對(duì)心臟纖維化具有保護(hù)作用的蛋白質(zhì)，為臨床診斷、治療及新藥開發(fā)提供了新的靶點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P9/00GK103114087SQ20131002778
公開日2013年5月22日 申請(qǐng)日期2013年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月24日
發(fā)明者李子健, 張幼怡, 邢瑞, 楊承志, 呂志珍 申請(qǐng)人:北京大學(xué)第三醫(yī)院