豬圓環(huán)病毒Ⅱ型與豬偽狂犬病二聯(lián)疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬圓環(huán)病毒Ⅱ型與豬偽狂犬病二聯(lián)疫苗，其特征在于，包含至少一種豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗原和至少一種豬偽狂犬病毒抗原。本發(fā)明還涉及該二聯(lián)疫苗的兩種制備方法：其一是將豬圓環(huán)病毒Ⅱ型進行滅活，制成豬圓環(huán)病毒Ⅱ型滅活苗；將豬偽狂犬病毒抗原與凍干保護劑混合，制成豬偽狂犬凍干活疫苗，然后將所述滅活苗作為稀釋液溶解所述豬偽狂犬凍干活疫苗制備成豬圓環(huán)Ⅱ型、豬偽狂犬二聯(lián)疫苗組合物；其二是將豬圓環(huán)病毒Ⅱ型抗原和豬偽狂犬病毒抗原按比例混合，然后與凍干保護劑混合制備成二聯(lián)凍干疫苗。使用本發(fā)明的二聯(lián)疫苗，可以大大降低冷鏈運作的費用，聯(lián)合用疫苗對豬偽狂犬病抗原免疫效果有協(xié)同作用，且不影響豬圓環(huán)病毒抗原的免疫效果。
【專利說明】豬圓環(huán)病毒II型與豬偽狂犬病二聯(lián)疫苗及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于疫苗【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒II型與豬偽狂犬病二聯(lián)疫苗及其制備方法和應(yīng)用?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus, PCV)是迄今發(fā)現(xiàn)的一種最小的動物病毒。現(xiàn)已知PCV有兩個血清型，即PCVl和PCV2。PCVl為非致病性的病毒，而PCV2為致病性的病毒，與通常不具有毒力的PCVl形成對比，豬的PCV2感染與多種疾病綜合癥有關(guān)，這些疾病綜合癥共同稱為豬圓環(huán)病毒性疾病，亦被稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病。
[0003]豬圓環(huán)病毒性疾病侵襲5-22周齡的豬，臨床特征在于消瘦、皮膚蒼白、生長遲滯、呼吸窘迫、腹瀉、黃疸及黃疸病。在一些受侵襲的豬中，會明顯出現(xiàn)所有癥狀的組合，而也有一些受侵襲的豬僅具有一種或兩種上述癥狀。感染PCV2的豬的死亡率接近50%，在尸體剖檢中，顯微鏡可見及肉眼可見多個組織及器官損傷，其中淋巴器官是最常見的損傷部位。已經(jīng)觀察到PCV2核酸或抗原的量與顯微鏡可見的淋巴損傷程度強烈相關(guān)。此外，亦已發(fā)現(xiàn)血液中核酸或抗原的量與臨床癥狀的嚴重程度相關(guān)，在患有豬圓環(huán)病毒性疾病的豬具有高于IO6基因組當(dāng)量數(shù)/毫升的病毒含量。
[0004]豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是多種動物共患的傳染病，引起家畜和野生動物急性致死性的傳染病，以發(fā)熱、奇癢和腦脊髓炎為主要癥狀，豬是其自然易感宿主，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎，仔豬感染主要是神經(jīng)癥狀，成年豬則以隱性感染為主，該病已成為種豬繁殖障礙綜合癥的主要病因。近年來研究發(fā)現(xiàn)，PCV2和PRV混合感染時具有協(xié)同作用，導(dǎo)致斷奶后仔豬病情加重，損失更為嚴重。
[0005]與PCV2感染的臨床明顯疾病表現(xiàn)相比，亞臨床PCV2感染被認為存在于那些感染了 PCV2但無臨床癥狀的動物中。一般而言，PCV2感染的這些形式間存在相關(guān)性，因為亞臨床的感染可以轉(zhuǎn)變成豬圓環(huán)病毒性疾病，而恢復(fù)期的動物可能保持持久感染狀態(tài)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本 申請人:在重復(fù)亞臨床PCV2感染向豬圓環(huán)病毒性疾病轉(zhuǎn)變的試驗中，意外的發(fā)現(xiàn)豬偽狂犬病毒可導(dǎo)致該轉(zhuǎn)變的發(fā)生。
[0007]因此，本發(fā)明的目的在于給豬接種豬圓環(huán)病毒疫苗，并聯(lián)合接種豬偽狂犬病毒疫苗，可以理解為給豬接種二聯(lián)疫苗或同時使用豬圓環(huán)病毒疫苗和豬偽狂犬病毒疫苗，聯(lián)合用豬圓環(huán)病毒II型與豬偽狂犬病疫苗不僅方便、多效、低成本，與單一疫苗相比，還可以減少疫苗接種次數(shù)，避免因漏種而不能得到全程免疫，可以大大降低冷鏈運作的費用。特別地，本 申請人:意外地發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用疫苗對豬偽狂犬病抗原免疫效果有協(xié)同作用，且不影響豬圓環(huán)病毒抗原的免疫效果。
[0008]本發(fā)明提供一種豬圓環(huán)病毒II型與豬偽狂犬病二聯(lián)疫苗，其包含至少一種豬圓環(huán)病毒II型抗原和至少一種豬偽狂犬病毒抗原。
[0009]本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒II型抗原含有至少一種PCV2抗原，所述抗原接種豬可誘導(dǎo)、刺激或增強抵抗PCV2感染的免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，所述PCV2抗原是PCV2全病毒、含有PCV2免疫原性氨基酸序列(如0RF2蛋白)的嵌合病毒，任何其它至少含PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位或其他成分。PCV2抗原還可以包含以下任一種抗原:如
梅里亞公司(Merial)的Circovac?;輝瑞公司(Pfizer)的Suvaxyn?: PCV2 ;哈爾濱維科生
物技術(shù)開發(fā)公司的豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗(LG株)；福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司的豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗(DBN-SX07株)和基因工程亞單位疫苗(如勃林格殷格翰公司(Boehringer-1ngelheim)的 Ingelvac CircoFLEX?)。 [0010]優(yōu)選地，本發(fā)明中豬圓環(huán)病毒II型抗原為滅活的PCV2全病毒抗原，其中優(yōu)選使用PCV2SH株，保藏號為CGMCC N0.23890，公開于專利文獻CN101240264A。PCV2不同毒株之間核苷酸序列同源性較高，均在90%以上，因此PCV2SH株(GenBank登錄號AY686763)、PCV2LG株(GenBank 登錄號 HM038034)、PCV2DBN-SX07-2 (GenBank 登錄號 HM641752)的抗原組合物或疫苗組合物均在本發(fā)明保護范圍之內(nèi)。
[0011]優(yōu)選地，本發(fā)明中豬圓環(huán)病毒II型抗原為含有PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位或其他成份，更優(yōu)選地，豬圓環(huán)病毒II型抗原為PCV2亞單位抗原，最優(yōu)選地，豬圓環(huán)病毒II型抗原為PCV20RF2蛋白。其中，本發(fā)明PCV20RF2蛋白，優(yōu)選序列表SEQN01.DNA序列編碼的蛋白或序列表SEQ N02.氨基酸序列的蛋白或與其同源性在75%以上的、優(yōu)選80%以上的、更優(yōu)選90%以上的氨基酸序列的蛋白，為能達到本發(fā)明目的的蛋白序列。本發(fā)明對PCV20RF2蛋白沒有特別的限制，只要其具有保留對PCV2的免疫原性，任何PCV20RF2蛋白都可用作本文所述PCV20RF2DNA和/或多肽的來源。
[0012]優(yōu)選地，本發(fā)明的二聯(lián)疫苗中所述的豬偽狂犬病毒抗原為豬偽狂犬活病毒、改良/嵌合的豬偽狂犬活病毒，豬偽狂犬病毒基因缺失病毒或弱毒病毒的一種或任意幾種的組合。優(yōu)選地，所述的豬偽狂犬病毒抗原為偽狂犬病病毒基因缺失SA215株(CCTCC，保藏編號 ￥200002)33株(06110:，保藏編號 N0.0907)、WKQ-001 株(CCTCC，保藏號 V200511)或偽狂犬病病毒弱毒株Bartha株、Bartha-K61株、Bucharest株、BUK株、H株(GCMCC，保藏號為N0.5013)和C株(CCTCC，保藏編號V201114)的一種或任意幾種的組合。
[0013]優(yōu)選地，本發(fā)明的二聯(lián)疫苗中所述PCV2病毒含量為IO3~IO7TCID5tl/頭份；更優(yōu)地，所述PCV2病毒含量為IO4~IO6TCID5tl/頭份。所述PCV20RF2蛋白生物的含量為0.5~50 μ g/頭份，更優(yōu)選5~30 μ g/頭份，更優(yōu)選10~20 μ g/頭份。所述的豬偽狂犬病毒抗原含量為IO5~IO7TCID5tl/頭份，優(yōu)選地為IO6TCID5tl/頭份。優(yōu)選地，所述的豬偽狂犬病毒抗原為豬偽狂犬病毒基因缺失株(SA215株)，含量為IO5~IO7TCID5tl/頭份，優(yōu)選地為IO6TCID5tl/頭份。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)選方式涉及二聯(lián)疫苗的佐劑，優(yōu)選為頂S1313N VG、MS2215VG、Gel01、卡波姆、蜂膠、ISA206、ISA15A的一種或幾種的組合物。
[0015]更優(yōu)選地，本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒II型與豬偽狂犬病二聯(lián)疫苗中，還包括凍干保護劑。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的凍干保護劑，可以是乳糖、脫脂牛奶、明膠、海藻糖、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、山梨醇、谷氨酸鈉中一種或幾種。[0016]優(yōu)選的，本發(fā)明所述的凍干保護劑優(yōu)選12wt%_30wt%的乳糖、lwt%_5wt%的明膠，更優(yōu)選為2wt%明膠與15wt%乳糖的1:1 (v/v)的混合物。
[0017]本發(fā)明的另一目的在于提供上述二聯(lián)疫苗的制備方法，本發(fā)明是通過兩種技術(shù)方案來實現(xiàn)的，方案一是將豬圓環(huán)病毒II型進行滅活，制成豬圓環(huán)病毒II型滅活苗；將豬偽狂犬病毒抗原與凍干保護劑混合，制成豬偽狂犬凍干活疫苗，然后將所述滅活苗作為稀釋液溶解所述豬偽狂犬凍干活疫苗制備成豬圓環(huán)II型、豬偽狂犬二聯(lián)疫苗組合物。方案二是將豬圓環(huán)病毒II型抗原和豬偽狂犬病毒抗原按比例混合，然后與凍干保護劑混合制備成二聯(lián)凍干疫苗。
[0018]本發(fā)明的另一目的在于提供一種所述二聯(lián)疫苗在制備預(yù)防和/或控制豬圓環(huán)病毒II型病和豬偽狂犬病藥物中的應(yīng)用，特別是，所述二聯(lián)疫苗在制備預(yù)防和/或控制PCV2臨床發(fā)病的藥物中在應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明技術(shù)方案帶來的有益效果至少包括:
[0020]I)含有兩種或兩種以上抗原、可以預(yù)防兩種或兩種以上疾病的聯(lián)合疫苗以其方便、多效、低成本成為新一代疫苗研究的特點。與單一疫苗相比，聯(lián)合疫苗可以減少疫苗的接種次數(shù)，避免因漏種而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐熱，其生產(chǎn)、運輸、儲存乃至全部使用過程均需在較低溫度下進行，即所謂的“冷鏈”，這種環(huán)環(huán)相扣的冷鏈運作，費用極高，使疫苗成本居高不下，而使用聯(lián)合疫苗，則可以大大降低冷鏈運作的費用，因此具有顯著的優(yōu)越性。
[0021]2)本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒II型和豬偽狂犬病毒抗原組合物及使用該組合物制備的預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒II型和豬偽狂犬病毒感染的二聯(lián)疫苗，不僅不會產(chǎn)生兩種抗原成份的相互免疫干擾或影響，而且意外發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒II型和豬偽狂犬病毒的抗原混合后，豬圓環(huán)病毒II型和豬偽狂犬病毒的抗原組合物不僅能產(chǎn)生的保護性免疫應(yīng)答的同時，還意外發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒II型和豬偽狂犬病毒抗原有相互增強免疫效果的作用，而且如本發(fā)明后續(xù)實施例所證明的，特別是存在其中一種抗原的情況下，另一種抗原量減半仍能維持本抗原的免疫效果，而這出乎本領(lǐng)域普通技術(shù)人員預(yù)料的。
[0022]3)解決了現(xiàn)有技術(shù)的困難，改變了人們對豬圓環(huán)病毒II型和豬偽狂犬病毒同時感染時的認識偏見，首次將豬圓環(huán)病毒II型和豬偽狂犬病毒抗原按照合適的比例聯(lián)合使用，而在本發(fā)明之前，一直沒有人認為兩種病可以同時進行預(yù)防進而這兩種疫苗可以聯(lián)合使用；
[0023]4)本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒II型和豬偽狂犬病毒抗原組合物及使用該組合物制備的預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒II型和豬偽狂犬病毒感染的二聯(lián)疫苗，在預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒II型疾病及豬圓環(huán)病毒II型亞臨床感染的應(yīng)用，可以有效的防止豬圓環(huán)病毒II型亞臨床感染向豬圓環(huán)病毒II型臨床感染的轉(zhuǎn)變，遏制病情的蔓延。
[0024]5)此外，本發(fā)明預(yù)防和治療豬圓環(huán)病毒II型相關(guān)疾病和豬偽狂犬病毒相關(guān)疾病的二聯(lián)疫苗，制備方法簡單，疫苗的效價含量高，免疫方便快捷，與現(xiàn)有技術(shù)中的多次免疫，至少需要打2針或3針才能防治以上二種疾病的疫苗及其免疫方法相比，本發(fā)明僅免疫I次就能夠預(yù)防豬圓環(huán)病毒II型和豬偽狂犬病毒兩種病原感染，降低了免疫成本，節(jié)約了免疫程序，更加經(jīng)濟可靠。【具體實施方式】
[0025]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合實施例來詳細說明本發(fā)明，這些實施例僅起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍，下列實施例中未提及的具體實驗方法，通常按照常規(guī)實驗方法進行。
[0026]本發(fā)明所述“每頭份”或“/頭份”是指每頭豬每次用疫苗量。未作特別說明之處，在本發(fā)明的實施方式中所述“每頭份”或“/頭份”為2ml。本發(fā)明所述疫苗佐劑包括但不限于:Gel01 (法國SEPPIC)、氫氧化招膠、卡波姆(Carbomer)(商品名Carbopol)、蜂膠、ISA206 (法國SEPPIC)或ISA760VG (法國SEPPIC)，優(yōu)選水溶性疫苗佐劑，例如GelOl (法國 SEPPIC)。
[0027]本發(fā)明所述凍干保護劑的例子，包括但不限于:明膠水溶液、乳糖水溶液及其混合物，優(yōu)選2wt%明膠水溶液與15wt%乳糖水溶液以1:1 (v/v)比例混合所得的混合物。
[0028]實施例[0029]實施例1豬圓環(huán)病毒II型抗原的制備
[0030]I豬圓環(huán)病毒II型亞單位抗原的制備
[0031](I)將豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因引入蜂毒素信號肽基因序列，轉(zhuǎn)入pMD-18T載體，獲得包含豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因的重組載體:首先設(shè)計引物Spe_ATG(5’ -cgactagtatgacgtatccaaggaggcgt-3') ?口弓L Hind-TAA(5' _gcaagctttattcattaagggttaagttggg_3，)，以保藏號為CGMCC N0.2389的PCV2-SH株的基因組DNA為模板，擴增PCV2-0RF2基因，并將擴增的0RF2基因克隆入pMD-18T載體中，獲得重組載體pT_0RF2。PCR產(chǎn)物大小約730bp。將PCR產(chǎn)物進行測序，由電泳及測序結(jié)果可知，重組載體pT-0RF2含序列表中的SEQ ID NOl序列。具體序列詳見專利CN101884787A。
[0032]設(shè)計4條引物，以pT-0RF2為模板，通過融合PCR方法在0RF2基因序列5'端引入蜂毒素信號肽核昔酸序列和限制性酶SpeI和Hind III酶切位點，引物如下:
[0033]HBM-F15' _tttcttacatctatgcgacgtatccaaggaggcgt_3’
[0034]HBM-Rl5' -ggcaacgttgactaagaatttcatactagtatcgtccac-3’
[0035]HBM-F25’ _ttatggtcgtatacatttcttacatctatgcg_3’
[0036]HBM-R25’ _aaacaagggcaacgttgactaagaatttc_3’
[0037]通過SpeI和Hind III雙酶切帶有蜂毒素信號膚核昔酸序列的0RF2序列，并將其克隆入轉(zhuǎn)移載體pFastBacTMl (Invitrogen)，構(gòu)成包含豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因的載體pFastBacP2。用PCR擴增并測序，由測序結(jié)果可知,重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacP2含蜂毒素信號膚核昔酸序列，即含序列表中的SEQ ID N02序列。具體序列詳見專利CN101884787A。
[0038](2)包含豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因的轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化入含有穿梭載體的大腸桿菌感受態(tài)細胞中，獲得包含豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因的穿梭載體，再將該穿梭載體轉(zhuǎn)染入昆蟲細胞中，獲得重組桿狀病毒vBac_P2;將PFastBacP2轉(zhuǎn)化含有病毒穿梭質(zhì)粒Bacmid的大腸桿菌DHlOBac (購自Invitrogen公司),獲得重組質(zhì)粒Bacmid_P2;經(jīng)PCR篩選，提取陽性質(zhì)粒，制備陽性重組質(zhì)粒Bacmid-P2DNA。采用Cellfectins RReagent轉(zhuǎn)染Sf9細胞(購自Invitrogen公司)，待細胞出現(xiàn)病變后，進行重組病毒噬斑純化和病毒擴增，然后通過通用引物Ml3F和Ml3R進行PCR驗證目的重組0RF2基因。純化獲得重組桿狀病毒，命名為vBac_P2。擴增重組桿狀病毒vBac_P2作為種毒,通過噬斑法進行效價滴定后于4° C保存?zhèn)溆谩?br> [0039](3)重組桿狀病毒vBac_P2感染昆蟲細胞及昆蟲細胞的培養(yǎng)，將vBac_P2重組桿狀病毒感染懸浮培養(yǎng)的昆蟲細胞High Five?(購自Invitrogen公司)。在含有200_350ml的EXPRESS FIVE SFM培養(yǎng)基的500ml轉(zhuǎn)瓶中無菌懸浮培養(yǎng)High Five?細胞，接種細胞密度為0.3-0.6 X IO6個細胞/mL當(dāng)細胞密度達到I X IO6個細胞/ml時，用重組病毒vBac_P2接種各轉(zhuǎn)瓶，接種到各轉(zhuǎn)瓶中的重組桿狀病毒具有不同的感染復(fù)數(shù)(M.0.1.)分別是0.01、
0.1、10接種重組桿狀病毒后，以26-28°C培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為lOOrpm，培養(yǎng)4天。
[0040](4)重組桿狀病毒的豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2基因表達豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白，收獲和純化豬圓環(huán)病毒2型重組0RF2蛋白。具體表達條件及鑒定方法參照專利CN101884787A。
[0041](5)將培養(yǎng)物經(jīng)1000Og離心20分鐘，分離沉淀和上清液，上清液通過I μ m的濾膜進行過濾，然后通過超濾濃縮純化，超濾膜孔徑為10000 (切割分子量)，純化后的樣品溶液經(jīng)7mM 二乙烯亞胺(BEl)滅活重組桿狀病毒載體，36-48小時，加入等量的硫代硫酸納中和。然后通過紫外分光光度計進行蛋白抗原含量測定，測定結(jié)果為500μg/ml。4°C保存。
[0042]2豬圓環(huán)病毒II型 全病毒滅活抗原的制備
[0043]豬圓環(huán)病毒II型(SH株)病毒液的制備:將長滿單層的PK15細胞(購自ATCOJgJ去細胞培養(yǎng)液，將PCV2毒種按0.1~0.2TCID50的接種量接種于PK15細胞上，37°C吸附30分鐘，加入細胞維持液，置37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。每日觀察I~2次，細胞生長良好，36~37°C培養(yǎng)4~7日后收獲細胞培養(yǎng)物，凍融2-3次后，測定毒價結(jié)果為106 5TCID5(l/ml，將抗原液置于-20°C以下保存。
[0044]將病毒液用中空纖維(0.5 μ m~2 μ m)濾柱過濾，除去細胞碎片，經(jīng)濃縮后，測定毒價結(jié)果為107.tlTCID5tZml再加入0.1%~0.2%的甲醛溶液37°C滅活24h，加入0.1%~0.2%中和劑來中和甲醛的毒性。
[0045]實施例2豬偽狂犬病毒抗原的制備
[0046]將豬偽狂犬病毒基因缺失株(SA215株，為TK7gE7gf三基因缺失，公開于中國專利CNlOl 186902，該毒株以保藏編號V200002保藏于CCTCC)用病毒稀釋液(無血清的DMEM培養(yǎng)基)作適當(dāng)稀釋，按感染復(fù)數(shù)(M.0.1)為0.1接種于ST細胞(購自CCTCC，編號⑶C0060)培養(yǎng)，37°C吸附30min，加入含3% (v/v)犢牛血清的DMEM細胞維持液，37°C培養(yǎng)2~4日，凍融2~3次，收獲病毒，病毒效價為108_ 7TCID5tZml。
[0047]實施例3豬圓環(huán)病毒II型抗原與豬偽狂犬病毒抗原二聯(lián)疫苗的制備
[0048]1.豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗稀釋豬偽狂犬病凍干活疫苗
[0049]將豬圓環(huán)病毒II型全病毒滅活抗原與水質(zhì)佐劑MS1313N VG以1:1比例混合，用IKA攪拌器以350rpm)攪拌混勻5min制成乳劑。按照國家標(biāo)準(zhǔn)對其進行檢驗,均符合規(guī)定。具體疫苗配比參照表1進行，共設(shè)A~G7種，其中A、B、C、D、E、F組中豬圓環(huán)病毒II型部分采用PCV2全病毒滅活抗原，每頭份(2ml)中含量分別為103_°TCID5(1、104_°TCID5(1、106_°TCID5Q、106.0TCID50, 107.0TCID50 和 106.0TCID500
[0050]A、B、C、D、E、G組豬偽狂犬病毒部分將豬偽狂犬病毒抗原與凍干保護劑(2wt%明膠水溶液與15wt%乳糖水溶液以1:1 (v/v)比例配制)以1:1 (v/v)比例混合,攪拌混勻30~60min，無菌分裝進行凍干，按照表1中含量配比制成豬偽狂犬凍干活疫苗。[0051]使用時，將A、B、C、D、E組中以豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗作為稀釋液溶解豬偽狂犬凍干活疫苗，按表1所示各組分別加至凍干的豬偽狂犬活疫苗，溶解混勻。共制成5種不同配比的疫苗組合物。F組為單獨的豬圓環(huán)病毒II型滅活疫苗，G組為單獨的豬偽狂犬病毒凍干活疫苗。
[0052]表1豬圓環(huán)病毒II型全病毒抗原與豬偽狂犬抗原具體配比
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種豬圓環(huán)病毒II型與豬偽狂犬病二聯(lián)疫苗，其特征在于，包含至少一種豬圓環(huán)病毒II型抗原和至少一種豬偽狂犬病毒抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的二聯(lián)疫苗，其特征在于，所述豬圓環(huán)病毒II型抗原為PCV2全病毒和/或含PCV2免疫原性氨基酸序列的多肽或亞單位。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的二聯(lián)疫苗，其特征在于，所述豬偽狂犬病毒抗原為豬偽狂犬活病毒、改良/嵌合的豬偽狂犬活病毒，豬偽狂犬病毒基因缺失病毒或弱毒病毒的一種或任意幾種的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的二聯(lián)疫苗，其特征在于，所述豬偽狂犬病毒抗原的含量為IO5~IO7TCID5tl/頭份，所述豬圓環(huán)病毒II型抗原的含量為IO3~IO7TCID5tl/頭份。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項所述的二聯(lián)疫苗，其特征在于，還包括疫苗佐劑，所述佐劑為頂S1313N VG、IMS2215VG, GelOl、卡波姆、蜂膠、ISA206或ISA15A的一種或幾種的組合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項所述的二聯(lián)疫苗，其特征在于，還包括凍干保護劑，所述凍干保護劑為2wt%明膠與15wt%乳糖的1:1 (v/v)的混合物。
7.一種制備豬圓環(huán)病毒II型與豬偽狂犬病二聯(lián)疫苗的方法，其特征在于，包括如下步驟:將豬圓環(huán)病毒II型進行滅活，制成豬圓環(huán)病毒II型滅活苗；將豬偽狂犬病毒抗原與凍干保護劑混合，制成豬偽狂犬凍干活疫苗，然后將所述滅活苗作為稀釋液溶解所述豬偽狂犬凍干活疫苗。
8.一種制備豬圓環(huán) 病毒II型與豬偽狂犬病二聯(lián)疫苗的方法，其特征在于，包括如下步驟:將豬圓環(huán)病毒II型抗原和豬偽狂犬病毒抗原按比例混合，然后與凍干保護劑混合進行凍干。
9.權(quán)利要求1~6中任一項所述的二聯(lián)疫苗在制備預(yù)防和/或控制豬圓環(huán)病毒II型病和豬偽狂犬病藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1~6中任一項所述的二聯(lián)疫苗在制備預(yù)防和/或控制PCV2臨床發(fā)病的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/22GK103920146SQ201310012804
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月14日
【發(fā)明者】張許科, 孫進忠, 白朝勇 申請人:普萊柯生物工程股份有限公司