專利名稱：葉下珠多糖在制備抗乙肝病毒的藥物中的應用的制作方法
葉下珠多糖在制備抗乙肝病毒的藥物中的應用技術領域
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，具體涉及一種葉下珠多糖PUIP III在制備抗乙肝病毒的藥物中的應用。
背景技術：
乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus, HBV)從發(fā)現(xiàn)至今已有四十余年。1963年， Blumberg等發(fā)現(xiàn)澳大利亞血友病患者血清中含有一種能與美國血友病患者血清起反應的抗原，稱其為澳大利亞抗原(即乙型肝炎病毒表面抗原，Hepatitis B Virus Surface Antigen,HBsAg)。1970年Dane等在乙肝病人血清中發(fā)現(xiàn)了 42nm大小的HBV顆粒,其外膜成分中含有HBsAg，1986年國際病毒命名委員會正式將HBV歸為嗜肝DNA病毒科。
乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個世界性的健康問題，呈世界性分布，它不僅可以導致急、慢性HBV感染與75% — 90%的原發(fā)性肝癌相關。全球慢性HBV感染約有3. 5億人，我國屬HBV感染的高流行區(qū)。據(jù)我國傳染病報告和疾病監(jiān)測統(tǒng)計，乙肝占急性肝炎病例的25% 左右，與HBV感染有關的肝病死亡率約23/10萬，其中肝癌死亡率約13/10萬，乙肝對人類健康危害最為嚴重，是我國最重要的公共衛(wèi)生問題之一。由一些數(shù)據(jù)估計，我國慢性無癥狀 HBV攜帶者(AsC)超過1. 2億，占全世界HBV感染的1/3，其中慢性乙型肝炎有3000萬人， 先、現(xiàn)患率約為2770/10萬，這些患者10% — 30%可發(fā)展為肝硬化，一部分可進一步發(fā)展為肝癌，累計現(xiàn)行的和既往的，我國已有一半以上人口經(jīng)受HBV感染，所以慢性乙肝的治療是亟待解決的問題。
目前臨床上用于治療HBV感染的藥物除干擾素(Interfeixm，IFN)外，還有少數(shù)天然藥物及眾多化學合成藥物如核苷類似物阿糖腺苷(adenine arabinside, Ara_A)、拉米夫定(Iamivudine)、泛昔洛韋(famciclovir)、阿地福韋(adefovir)、恩他卡韋(ontacavir) 等。這些藥物已在實驗室和臨床應用中證實能顯著抑制HBV DNA的復制或抑制HBsAg、 HBeAg的表達與分泌。然而這些藥物卻存在一定的不足，干擾素的缺點主要表現(xiàn)在①價格昂貴；②注射制劑；③對患者的選擇有嚴格的限制性；④明顯的不良反應，如發(fā)熱、血小板減少、暫時性脫發(fā)等；⑤在失代償性肝病患者中應用有一定的風險。核苷類藥物的不足表現(xiàn)在①需要長期治療耐藥性病毒變異的發(fā)生率高；③停藥后發(fā)生ALT反跳，甚至發(fā)生重癥肝炎。上述的種種不足都使得臨床應用受到了極大的限制。因此，尋找和開發(fā)無污染、低毒副作用、價格低廉、安全有效的新型抗HBV藥物具有十分重要的理論、經(jīng)濟和社會意義。
隨著天然植物及其提取物或有效成分抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)，天然藥物具有對人體低毒副作用，不易產(chǎn)生耐藥性等顯著特點。針對目前病毒性肝炎治療中的困難，尋找與證實有效天然藥物已經(jīng)成為臨床治療病毒性肝炎的希望與重要手段。傳統(tǒng)中草 藥品種繁多，已廣泛應用于臨床治療慢性乙型肝炎并取得一定療效，積累了豐富的臨床經(jīng)驗，但中草藥抗HBV的作用機理還有待于深入研究，所以篩選中草藥抗 HBV這方面的工作尚有很大的潛力；而且傳統(tǒng)中草藥不良反應少，價格低，日益受到國內(nèi)外研究者的普遍重視，尋求有抗病毒作用的天然藥物是當前研究的熱點。目前國內(nèi)外對天然藥物生物活性與功能的研究已發(fā)展為研究與分析天然藥物的活性部位、活性成分及至活性成分的結(jié)構(gòu)或構(gòu)型，以進一步明確藥物的作用機理，真正實現(xiàn)“天然藥物現(xiàn)代化”這一目標。 如美國Holk等在天然植物茜草抗HBV作用的深入研究中，發(fā)現(xiàn)其抑制HBsAg、HBeAg表達的具體有效成分為三種奈-氫醌化合物。日本學者Nin等研究證明治療肝炎的傳統(tǒng)藥物甘草中起免疫調(diào)節(jié)作用的成分為一種糖類(甘草甜素)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種葉下珠多糖TOIP III在制備抗乙肝病毒的藥物中的應用，PUIP III是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖4個單糖組成，鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖的摩爾比為O. 27:0. 28:0. 1:0. 35，分子量為418793. 5。由藥用植物葉下珠經(jīng)人工提取、分離純化而成。體外生物活性實驗表明，PUIP III具有抑制IfepG2. 2. 2. 15細胞培養(yǎng)中HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA的復制，具有一定的體外抗HBV活性作用；體內(nèi)活性實驗表明，PUIP III在鴨體內(nèi)對DHBV DNA有明顯抑制作用，且反彈較小，可用于制備抗乙肝病毒的藥物和保肝護肝保健品。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案一種葉下珠多糖PUIPIII在制備抗乙肝病毒的藥物和保肝護肝保健品中的應用。
本發(fā)明所述的葉下珠多糖TOIP III的提取分離方法，包括如下步驟I)葉下珠全草蒸餾水洗滌去土，干燥后，粉碎，用石油醚浸沒藥材且液面高出藥材 O. 5 1cm，在80°C和常壓力回流提取3次，每次2小時，棄去回流液。藥渣繼續(xù)用50 100% 乙醇按同樣方法在80°C °C下回流提取3次，每次2小時，棄去回流液。藥渣再用90 °〇水浸提3次，每次2小時，合并3次浸提液進行離心分離，離心速度4000r/min，取濾液濃縮至原體積1/4，加入4倍體積的95%乙醇，靜置24h，離心，取醇沉物即為粗總多糖；粗總多糖經(jīng) 2)除蛋白，即用Sevag法脫蛋白將步驟I)得到的醇沉物用蒸餾水復溶得粗多糖溶液，在粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇混合液的優(yōu)選體系是粗多糖溶液氯仿和正丁醇混合液以體積比計量是3:1，混合液=氯仿正丁醇=4:1 (體積比計量)，磁力攪拌30min，充分靜置分層，棄去沉淀。重復7 8次后直至界面無白色沉淀。3)洗滌，除雜在除蛋白后的多糖溶液中加入4倍體積的95%乙醇沉淀24h，離心，棄濾液，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚清洗、重復3次。4)透析，干燥即醇沉洗滌后濾渣加適量蒸餾水，充分復溶后透析，透析在磁力攪拌下進行，樣品液與透析液(蒸餾水)體積比優(yōu)選條件為1:20，8h換一次水，透析72h。 透析完畢后將糖溶液放入冷凍干燥機中干燥得葉下珠總多糖(PULP)，經(jīng)測定本發(fā)明總多糖 (PULP)含量在95%以上。5)總多糖各組分分離純化經(jīng)過脫蛋白，透析處理后的葉下珠精總多糖(PULP)溶于適量的重蒸水中(8 mg/mL)，過DEAE-52陰離 子交換柱分離。使用前將 DEAE-52纖維素填料用蒸餾水浸泡48h，期間3h換一次水，并用傾瀉法除去懸浮雜質(zhì)，然后進行堿一酸一堿處理。先用O. 5 mo I/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸餾水洗至中性，再用 O. 5 mo I/L的HCl溶液浸泡30 min后蒸餾水洗至中性，最后用O. 5 mo I/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸餾水洗至中性，得到0H_型纖維素。濕法裝柱(柱尺寸為500 X 50mm)，蒸餾水平衡48h，裝柱過程中避免氣泡及斷層現(xiàn)象。將葉下珠精總多糖樣液，過O. 45 μ m濾膜后上樣。依次用 0、0. 1,0. 25,0. 5,0. 75mol/L NaCl 梯度洗脫，每 IOmin 收集一管，流速 4mL/min， 苯酚一硫酸法跟蹤檢測。以收集的管序(管數(shù))為橫坐標，溶液的光吸收度為縱坐標繪圖得洗脫曲線，從曲線上能夠明顯宣示出四個峰形對稱的洗脫峰，分別代表四個組分，按照出峰的順序分別記為PULP1、PULP I1、PULP III和PULP IV。其中第2個、第3個兩個洗脫峰較大，收集第3主峰組分，濃縮，重蒸水透析48h，冷凍干燥得葉下珠多糖I3ULPIII純組分。純度在98%以上，符合生物活性試驗要求，可直接用于下述的抗病毒活性試驗，樣品也可干燥后密封保存?zhèn)溆谩?br> 本發(fā)明的有益效果1、葉下珠多糖PULP III目前未有報道具有抗乙肝病毒作用， 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)葉下珠多糖PULP III能作為抗乙肝病毒藥物，此藥物其最大優(yōu)點是天然產(chǎn)物，與現(xiàn)有抗病毒藥相比，毒副小，無不良反應，且還有抗氧化、提高機體免疫力等作用，可長期使用；2、與直接使用中草藥相比，葉下珠多糖I3ULP III作為具體化學組分的物質(zhì)直接作為抗病毒的藥效成分，用藥量少，無其它非藥用組分，因而能減少其它成分可能對肌體的傷害(副作用)，臨床用藥簡單；3、葉下珠中草藥原料易得，價廉，提取分離工藝簡單，生產(chǎn)方便，開發(fā)價值高。


圖1是葡萄糖標準曲線。
圖2是多糖梯度洗脫曲線。
圖3是H印G2. 2. 2. 15細胞分泌HBsAg、HBeAg的規(guī)律。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細說明葉下珠多糖的提取葉下珠全草蒸餾水洗滌去土，50°C低溫干燥后，粉碎，密封備用。其粉末為黃綠色。
石油醚80 1回流脫脂一95%乙醇80 1回流脫小分子糖一90 °C水回流提取3 次，合并3次濾液4000r/min離心，濃縮至1/4體積一加入4倍體積的95%乙醇，靜置24h， 離心，蒸懼水復溶一sevag法除蛋白(氯仿正丁醇=4:1,多糖溶液混合液=3:1),磁力攪拌30min，充分靜置分層，重復7 8次操作即可除去游離蛋白質(zhì)一除蛋白后的多糖溶液加入4倍體積的95%乙醇沉淀24h —依次用無水乙醇、丙酮、乙醚清洗、重復三次一透析72h — 冷凍干燥得葉下珠總多糖(PULP)。
葡萄糖標準液和樣品供試液的制備精密稱取葡萄糖標準品(在105°C下干燥到重量不再發(fā)生變化)10mg，用蒸餾水溶解后， 置于IOOmL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，制成O. lmg/mL的葡萄糖標準液，備用。
精密稱取干燥至恒重的葉下珠多糖10mg，用蒸餾水溶解后，置于IOOmL容量瓶中加蒸懼水定容至刻度，搖勻，制成O. lmg/mL的樣品供試液備用。
吸收波長的確定取葡萄糖標準液和樣品溶液各I mL,分別加入ImL 5%苯酹溶液(取5g重蒸苯酹于 IOOmL棕色容量瓶中加蒸餾水定容)，搖勻后，懸空垂直加入5mL濃 硫 酸，置沸水浴中加熱 15min，然后置冷水浴中冷卻，在400 600 nm范圍內(nèi)全波長掃描，確定吸收波長。
葡萄糖標準曲線制作精密吸取葡萄糖標準液O. 2,0. 4,0. 6,0. 8、ImL于IOmL具塞刻度試管中，依次添加水使終體積為ImL,空白對照為ImL水,然后加入ImL 5%苯酹溶液搖勻,迅速加入5mL濃硫酸(懸空垂直加入)，置沸水浴中加熱15min,然后置冷水浴中冷卻，于490nm處測定吸光度。以吸光度為Y軸，葡萄糖質(zhì)量為X軸，繪制標準曲線，并計算回歸方程。
糖含量的計算精密吸取供試液lmL，于490nm處測定吸光度。
按照公式計算糖含量糖含量=C / (C0X V) X 100%C :由標準曲線查得的葡萄糖微克數(shù) C0 :樣品溶液的濃度(O.1 mg/mL)V:測定時用的樣品溶液體積(1. OmL)多糖的提取率多糖的提取率=多糖的質(zhì)量/原材料的質(zhì)量X 100 %樣品溶液和葡萄糖標準液的最大吸收峰波長都在490 nm左右處，所以選取490 nm作為多糖含量的測定波長。
以吸光度為Y軸，葡萄糖微克數(shù)Ug)為X軸，繪制標準曲線，如圖1，可以看出在 20 100 μ g范圍內(nèi)，葡萄糖量與吸光度有良好的線性關 系。
測得樣品液的吸光度A為O. 388，根據(jù)回歸方程計算其相應葡萄糖的微克數(shù)為 28. 27 μ g。根據(jù)公式得糖含量糖含量=C / (C0X V) X 100%=28. 27/(0. 1X1) X 100%=28. 27%多糖的提取率==1. 5/100X 100 %=1. 5%本實驗通過石油醚脫脂，再以95%的乙醇脫去低聚糖等小分子物質(zhì)，然后以水提醇沉法從葉下珠中分離出多糖，并采用sevag法脫蛋白，苯酚一硫酸法測定其含量，其最大吸收波長為490nm，多糖提取率為1. 5%，糖含量為28. 27%。
葉下珠多糖的分離純化柱分離DEAE-52填料預處理DEAE-52纖維素填料用蒸餾水浸泡48h，期間4 5h換一次水，并用傾瀉法除去懸浮雜質(zhì)，然后進行堿-酸-堿處理。先用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸懼水洗至中性，再用O. 5 mol/L的HCl溶液浸泡30 min后蒸餾水洗至中性，最后用O. 5 mol/L的NaOH 溶液浸泡30 min后蒸餾水洗至中性，得到MT型纖維素。濕法裝柱(柱尺寸為500 X 50mm)， 蒸餾水平衡48h，裝柱過程中避免氣泡及斷層現(xiàn)象。
過DEAE-52層析柱分離純化稱取640mg葉下珠總多糖溶于80mL重蒸水中(8 mg/mL),過O. 45 μ m濾膜后上樣。依次用 0、0. 1,0. 25,0. 5,0. 75mol/L NaCl 梯度洗脫，每 IOmin 收集一管，流速 4mL/min ;苯酚-硫酸法跟蹤檢測，收集各主峰組分，濃縮，重蒸水透析48h，冷凍干燥得葉下珠多糖各組分。
SephadexG-200葡聚糖凝膠過濾法的預處理SephadexG-200填料加適量蒸懼水浸泡24h,期間4 5h換一次水，并用傾瀉法除去懸浮雜質(zhì)，然后超聲脫氣直到凝膠液中沒有氣泡出現(xiàn)為止。濕法裝柱(柱尺寸為 500X25mm)，用O. 05 mol/L的NaCl溶液平衡48 h后備用。
柱層析將上面收集的各組分配制成25mg/mL的樣品液，上樣2mL，用O. 05 mol/L 的NaCl洗脫。自動部分收集器收集，每管5 mL,每30 min收集一管，苯酚-硫酸法跟蹤檢測。
HPLC高效液相色譜法將純化后的各組分多糖配制成lmg/mL的樣品液,過O. 45 μ m的濾膜后進樣。
高效液相色譜條件色譜柱PolySep-SEC 4000 Part No: 00H-3144-K0 Column Size :300 X 7. 8mm ；檢測器示差檢測器；柱溫30°C;流動相雙蒸水；流速0. 8 mL/min ;進樣量20 μ L。
柱層析分離結(jié)果經(jīng)過脫蛋白，透析處理后的葉下珠精多糖(PULP)，過DEAE - 52離子交換柱，依次用O、 O. U0. 25,0. 5,0. 75mol/L NaCl溶液梯度洗脫，苯酚一硫酸法跟蹤檢測，得如圖2所示中洗脫曲線。由圖2可以看出，TOLP經(jīng)DEAE-52柱層析分離后，能夠明顯分離出四個峰形對稱的洗脫峰，分別代表四個組分，記為I3ULP1、PULP I1、PULP III和I3ULP IV。收集含量較大的組分PULP III做進一步分析。
柱和HPLC純度鑒定 SephadexG-200 柱結(jié)果取葉下珠多糖組分I3ULP III過S印hadexG-200凝膠柱，NaCl洗脫，苯酚一硫酸法跟蹤檢測，用吸光度值與洗脫管數(shù)作洗脫曲線，PULP III在Sephadex G-200柱上的洗脫曲線是對稱的單一峰，說明TOLP III組分是分子量相對均一的多糖組分。
HPLC法純度鑒定利用HPLC法檢測葉下珠多糖組分TOLP III的純度時，結(jié)果顯示，經(jīng)DEAE-52纖維素柱分離純化后的多糖組分PULP III，在高效液相圖譜上峰型比較對稱 ，且經(jīng)過面積歸一法計算其純度達到95%以上，與S印hadex G-200凝膠色譜圖結(jié)果相吻合，說明純度比較高，可以用來做結(jié)構(gòu)鑒定。
水提醇沉脫蛋白后的葉下珠多糖經(jīng)過DEAE-52纖維素柱分離純化后得到四個組分，分別記為PULP1、PULP I1、PULP III和PULP IV。收集含量較大的組分PULP III，用 SephadexG-200凝膠柱層析法和高效液相色譜法(HPLC)兩種方法進行純度鑒定，證明其組分相對均一，可以進一步做結(jié)構(gòu)分析。
III的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析狀態(tài)、溶解性試驗稱取適量分離純化后的多糖組分PULP III溶解于純水、無水乙醇、丙酮、乙醚和乙酸乙酯等溶劑，觀察其溶解性。
卻三酮反應取1. Omg/mL樣品溶液1. OmL于試管中，加入1. OmL O. 5%茚三酮試劑，沸水浴5min，冷卻后觀察顏色變化，若出現(xiàn)紫紅色，則證明有蛋白質(zhì)，反之則無。以蒸餾水和小牛血清溶液作為對照。
Molish 反應取1. Omg/mL樣品溶液1. OmL于試管中，滴加兩滴Molish試劑,搖勻。傾斜試管,沿管壁加入約ImL濃硫酸，小心豎直后，2 3min后仔細觀察兩層液面交界處的顏色變化，若有紫紅色出現(xiàn)，則證明有糖類物質(zhì)。以蒸餾水和淀粉溶液作為對照。
苯酚一硫酸反應取1. Omg/mL樣品溶液1. OmL于試管中，加入ImL 5%的苯酹,再加入5mL濃硫酸,振蕩， 若呈橙黃色，說明含糖。以蒸餾水為對照。
碘-碘化鉀反應取1. OmL1. Omg/mL的樣品溶液，滴加250 μ L碘-碘化鉀溶液后，若不顯藍色，說明此多糖為非淀粉類。以蒸餾水為陰性對照，O. 5%的淀粉指示液為陽性對照。
硫酸一咔唑反應取1. Omg/mL樣品溶液1. OmL于試管中，在冰水浴中向管中加入6mL濃硫酸，搖勻后置于85°C水浴中20min，取出冷卻至室溫，加入O. 2mL 0.1%的咔唑液，室溫下保持2h，若有紫紅色物質(zhì)出現(xiàn)，說明含有糖醛酸，是酸性糖，以蒸餾水為陰性對照。
斐林反應取1. Omg/mL樣品溶液1. OmL于試管中,加入過量的斐林試劑,煮沸2 min,若產(chǎn)生紅色的氧化亞酮沉淀，則證明含還原糖。
三氯化鐵試驗取1. Omg/mL樣品溶液1. OmL于試管中，調(diào)節(jié)pH值為4 5，加入1%的三氯化鐵水溶液，若出現(xiàn)藍、墨綠或藍紫色，則證明含有鞣質(zhì)類或酚類。
硫酸基定性試驗取2mg多糖樣品，加入1. OmL lmol/L HCl, 110°C密閉水解3h，然后滴加0. 5mL的氯化鋇-明膠試劑，若有白色沉淀生成，說明含有硫酸基。
法測定分子量高效液相色譜條件色譜柱PolySep-SEC 4000 Part No: 00H-3144-K0 Column Size :300 X 7. 8mm ；檢測器示差檢測器；柱溫30°C;流動相雙蒸水；流速0. 8 mL/min ;進樣量20 μ L。
樣品溶液的制備將多糖組分PULP III配制成濃度為lmg/mL的溶液，以10000r/min離心10 min后,過 0.45 μ m濾膜，備用。
標準對照溶液將各種已知分子量的葡聚糖標準品系列(T-10、T-20、T-110、T-500、T-2000)配制成濃度為lmg/mL的溶液，處理方法同樣品溶液，備用。
標準曲線的繪制 將各種已知分子量的葡聚糖標準品由小分子到大分子依次平均進樣3次，記錄相應的保留時間tK和色譜圖，以保留時間tK為橫坐標，分子量的對數(shù)值為縱坐標繪制標準曲線。
I3ULP III相對分子質(zhì)量的測定將上面配制好的樣品溶液各進樣三次，HPLC色譜條件同標準品一樣，記錄相應的保留時間tK和色譜圖，根據(jù)標準曲線得到的回歸方程計算分子量。
標準曲線的繪制采用硫酸咔唑法測定糖醛酸含量。配制0. 2mg/mL的葡萄糖醛酸溶液25mL，依次量取 0. 25,0. 5,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5mL 上述溶液，定容于 IOmL 容量瓶中，制成 5、10、20、30、40、50 μ g/mL的標準溶液置4°C冰箱中備用。
量取5mL硼砂硫酸溶液(O. 025 mol/L)于具塞試管中，冰浴，然后將ImL葡萄糖醛酸標準溶液小心加入酸液層上方，以蒸餾水作為空白對照，邊搖勻(先輕輕搖勻，后劇烈搖晃)邊冰浴冷卻。然后將試管在沸水浴中加熱lOmin，冷卻至室溫后加入O. 2mL咔唑溶液 (O. 125%的無水乙醇溶液)，搖勻，沸水加熱15min，冷卻至室溫，測定530nm處的吸光值，以葡萄糖醛酸的濃度為橫坐標，吸光值縱坐標繪制標準曲線。
樣品中糖醛酸含量的測定將多糖組分PULP III配成5 μ g/mL的溶液，操作同上，測定其在530nm處的吸光值。
蛋白質(zhì)和核酸測定將純化后的多糖組分PULP III配制成lmg/mL的多糖水溶液，用UV紫外分光光度計在 200 400nm范圍內(nèi)掃描看其在260nm(核酸)，280nm (Pr)處是否有吸收峰，以判定有無蛋白質(zhì)和核酸的存在。
、H、N元素分析分別稱取兩份完全干燥的PULP III樣品2. 5mg,采用Elementar Vario EL III元素分析儀測定C、H、N的含量。
IR)的檢測取2mg多糖樣品，用溴化鉀(KBr)壓片后在400 4000CHT1波長范圍內(nèi)做紅外光譜分析。
采用糖腈乙酸酯衍生物的氣相色譜法進行單糖組成測定。根據(jù)出峰時間可以確定樣品的單糖組成成分，根據(jù)出峰面積可以確定單糖的組成比例。
單糖糖腈乙酸酯衍生化分別稱取鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖(Ara)，甘露糖(Man)各10 mg，分別加入IOmg鹽酸輕胺，O. 5 mL卩比唳振蕩后，90 °C水浴30 min，并不時振蕩，取出冷卻至室溫后，加入O. 5 mL乙酸酐，于90 °〇水浴中?；?0 mim，得到的產(chǎn)物即是糖腈乙酸酯衍生物，直接注入GC分析。
多糖糖腈乙酸酯衍生化稱取多糖10mg，加入2mol/L三氟乙酸5mL，110°C真空封管水解4h后，在40°C下減壓濃縮至干，然后加入4mL甲醇，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，重復3 4 次，以除去三氟乙酸。然后加入10 mg鹽酸羥胺和O. 5 mL吡啶，放入90°C水浴加熱反應 30 min，并不時振蕩取出后冷至室溫，加入0.5 mL醋酸酐，在90°C水浴中繼續(xù)反應30 min進行乙?；?，反應產(chǎn)物可直接進行氣相色譜分析色譜條件`色譜柱0V1701 (30. O mXO. 32 ymXO. 25 μ m)毛細管柱；進樣口溫度250 V ；(FID )檢測器溫度240 V ；載氣壓力0.4 MPa;程序升溫150 °C下保持4 min，然后以10 °C /min升至200 °C， 保持 8 min,再以 15 °C/min 升至 280min。
取20mg PULP III多糖組分，用2mL O. 05mol/L三氟乙酸進行部分酸水解，水解16h 后離心，沉淀進行GC分析。上清液中加入甲醇旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，重復3 4次除去三氟乙酸，然后用水復溶后，透析袋(分子截留量3500)透析。透析結(jié)束后，袋外部分真空干燥后進行GC 分析；袋內(nèi)部分加入4倍體積的乙醇醇析，上清部分和醇沉部分分別真空干燥后進行GC分析。
smith 降解高碘酸鈉標準曲線的制作取6支干燥試管，按下表操作制作標準曲線
權利要求
1.一種葉下珠多糖PUIP III在制備抗乙肝病毒的藥物中的應用。
2.—種葉下珠多糖TOIP III在制備保肝護肝保健品中的應用。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的葉下珠多糖TOIPIII的應用，其特征在于所述的葉下珠多糖PUIPIII是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖4個單糖組成，鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖的摩爾比為0. 27 :0. 28 :0.1 :0. 35，分子量為418793. 5 ;由藥用植物葉下珠經(jīng)人工提取、分離純化而成。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種葉下珠多糖PUIPⅢ在制備抗乙肝病毒的藥物中的應用，PUIPⅢ是由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖4個單糖組成，鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖和葡萄糖的摩爾比為0.27:0.28:0.1:0.35，分子量為418793.5。由藥用植物葉下珠經(jīng)人工提取、分離純化而成。體外生物活性實驗表明，PUIPⅢ具有抑制HepG2.2.2.15細胞培養(yǎng)中HBsAg、HBeAg的分泌和HBV-DNA的復制，具有一定的體外抗HBV活性作用；體內(nèi)活性實驗表明，PUIPⅢ在鴨體內(nèi)對DHBVDNA有明顯抑制作用，且反彈較小，可用于制備抗乙肝病毒的藥物和保肝護肝保健品。
文檔編號A61K31/715GK103054894SQ201310005909
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月8日 優(yōu)先權日2013年1月8日
發(fā)明者李清祿, 李凌峰, 李宇翔, 張麗麗, 謝勇平, 王玉林, 黃志堅 申請人:福建農(nóng)林大學