神經(jīng)生長因子在制備用于治療中老年男性性功能低下綜合征的藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及神經(jīng)生長因子在制備用于治療中老年男性性腺功能低下綜合征的藥物中的用途，主要是用于制備治療因垂體增加促黃體生成激素分泌降低或睪丸間質(zhì)細(xì)胞衰老而導(dǎo)致的人體睪酮含量下降的藥物，其中所用的神經(jīng)生長因子來源于人、小鼠及大鼠，優(yōu)選來源于人。所述神經(jīng)生長因子的氨基酸序列如SEQ?ID?No：1-3所示。
【專利說明】神經(jīng)生長因子在制備用于治療中老年男性性功能低下綜合征的藥物中的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及神經(jīng)生長因子的第二醫(yī)學(xué)用途。具體而言，本發(fā)明涉及人神經(jīng)細(xì)胞生長因子在制備用于治療中老年男性性功能低下綜合征的藥物中的用途?？梢酝ㄟ^鼻腔給藥或睪丸靜脈注射的途徑施用人、大鼠和小鼠來源的神經(jīng)細(xì)胞生長因子來治療人類中老年男性遲發(fā)性性腺功能低下綜合征。
【背景技術(shù)】[0002]人類遲發(fā)性性腺功能低下綜合征(late onset hypogonadism in males, LOH)為中老年男性多發(fā)的一種與老齡相關(guān)的睪丸機(jī)能減退，其主要特征包括性欲和勃起質(zhì)量(特別是夜間勃起)減退、情緒改變伴有腦力和空間定向能力下降、瘦體量(Lean body mass,LBM)減少伴肌肉容積和肌力下降、體毛減少和皮膚改變、骨密度下降以及內(nèi)臟脂肪增加等(王璽坤，等，中華男科學(xué)雜志，2012，18 (5) =475-477 ;郭應(yīng)祿和李宏軍，中華男科學(xué)雜志，2004,10(8) =563-566) 0遲發(fā)性性腺功能低下綜合征一般好發(fā)于45-55歲，也可以早至40歲或延遲到65歲，而發(fā)病原因與下丘腦-垂體-睪丸軸系的功能減退和睪丸間質(zhì)細(xì)胞衰退有關(guān)(Wang 等，J.Androl., 2009, 32 (I): 1-10 ；Chen 等，Endocrindogy, 2002,143 (5):1637-1642)。
[0003]睪丸間質(zhì)細(xì)胞(leydig cell，LC)是一種具有合成和分泌睪酮功能的細(xì)胞，是雄性體內(nèi)雄激素的最主要來源。人體血清中的睪酮是間質(zhì)細(xì)胞受腦垂體分泌的促黃體生成激素(Luteinizing hormone, LH)刺激而產(chǎn)生的,并受一系列負(fù)反饋機(jī)制調(diào)節(jié)。臨床研究表明，男性下丘腦-垂體軸功能隨著年齡增長而逐漸下降，從而導(dǎo)致促黃體生成激素脈沖釋放的幅度減弱，最終影響睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成和分泌雄性激素(陳為想等，內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2012，31(5):117-118.)。此外，睪丸間質(zhì)細(xì)胞在分化發(fā)育過程中分為四個顯著不同的階段:間質(zhì)干細(xì)胞(Stem leydig cell, SLC)、間質(zhì)祖細(xì)胞(Progenitor leydig cell, PLC)、幼稚型間質(zhì)細(xì)胞(Immature leydig cell, ILC)和成年型間質(zhì)細(xì)胞(Adult leydig cell, ALC)。而這些發(fā)育過程中由于增殖分化異常、數(shù)量減少及激素合成分泌功能減退也會導(dǎo)致體內(nèi)雄激素缺乏(Ge 等，Biol.R印rod.，2005，72 (6):1405-1415 ;5.Ge 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,2006，103:2719-2724)。
[0004]現(xiàn)時，臨床上治療中老年遲發(fā)性性腺功能低下綜合征主要通過睪酮補(bǔ)充療法，然而，該療法除了需要定期注射睪酮以外，還存在顯著的安全性問題。首先，長期定量補(bǔ)充睪酮會使患者易生痤瘡并患紅細(xì)胞增多癥；其次，容易造成血清睪酮濃度的大幅度波動，進(jìn)而引起患者情緒和遲發(fā)性性腺功能低下綜合征癥狀的明顯起伏；再次，患者容易出現(xiàn)水、鈉潴留及陰莖異常勃起、排尿困難等不良反應(yīng)，甚至肝腎功能受損及引發(fā)前列腺癌等疾病(史虹莉，中國臨床保健雜志，2009，12 (4) =386-388 ;范曉博等，中華男科學(xué)雜志，2010，16 (I):68-71)。
[0005]神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)是哺乳動物中最重要的生物活性分子之一，分布在大腦、頜下腺、心臟、虹膜、皮膚及睪丸等組織中。對于神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)生長因子具有促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育、軸突生長、遞質(zhì)合成及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等功能；而對于心血管、免疫、生殖等其它系統(tǒng)，神經(jīng)生長因子主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抑制部分腫瘤細(xì)胞的有絲分裂以及促進(jìn)創(chuàng)口愈合等(Tuszynski 等，2005, Nature Medicine 11:551-555)。
[0006]天然的神經(jīng)生長因子由α、β、Y三個亞單位組成，其主要活性位點為β亞單位。在神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)生長因子與受體(nerve growth factor receptor, NGFR)結(jié)合后,通過神經(jīng)生長因子受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制內(nèi)在化，形成軸膜包繞小泡，經(jīng)軸突沿微管逆行轉(zhuǎn)運至胞體。最后，經(jīng)酪氨酸蛋白激酶、脂酰肌醇鈣、內(nèi)源性環(huán)腺苷酸等第二信使體系的轉(zhuǎn)導(dǎo)，啟動一系列級聯(lián)反應(yīng)而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)(Ribatti等，Int.J.Exp.Pathol., 2009,90 (6):615-620)。目前，小鼠來源的神經(jīng)生長因子已經(jīng)被開發(fā)為人注射用神經(jīng)保護(hù)類藥物，藥物品牌包括恩經(jīng)復(fù)(廈門北大之路生物工程有限公司)、金路捷(武漢海特生物制藥股份有限公司)和蘇肽生(北京舒泰神藥業(yè)有限公司)。而大鼠來源的神經(jīng)生長因子及通過基因工程方式獲得的人神經(jīng)生長因子亦已證明具有相同的生物學(xué)功能(Lou et al.，2012，Neuroscience, 223:225-237)。
[0007]除了在神經(jīng)系統(tǒng)分布較多以外，神經(jīng)生長因子和神經(jīng)生長因子受體也廣泛存在于睪丸組織中。近年來研究證實，神經(jīng)生長因子可以通過自分泌或者旁分泌的方式作用于生精細(xì)胞(Spermatogenic Cell)、支持細(xì)胞(Sertoli Cell)和睪丸間質(zhì)細(xì)胞(LC),促進(jìn)精子的形成和成熟、睪酮的合成和分泌以及睪丸組織的發(fā)育(郝玉娟和張映，國外畜牧學(xué)，2011，31 (2):89-90)。而前人亦已利用眼鏡蛇毒神經(jīng)生長因子治療男性生殖缺陷及降低棉酚對雄性生精功能影響(ZL 00116192.X)，但對神經(jīng)生長因子能否用于治療遲發(fā)性性腺功能低下綜合征尚未有報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的主要目的在于提供神經(jīng)生長因子在制備用于治療中老年男性性腺功能低下綜合征的藥物中的用途。在該應(yīng)用中，可以通過鼻腔給藥或者睪丸靜脈注射的方式將神經(jīng)生長因子或其與其他 相關(guān)治療劑的組合物送入患者體內(nèi)，用以促進(jìn)垂體增加促黃體生成激素分泌及誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的增殖分化，從而增加睪丸和血清中睪酮含量，最終改善或者治愈中老年男性性功能低下綜合征。
[0009]由于神經(jīng)生長因子已經(jīng)成為商品化的藥物，其組成，結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都是已知，不同藥物劑型的制備也是本領(lǐng)域的常規(guī)知識，因此，在神經(jīng)生長因子的新用途已經(jīng)能夠確認(rèn)的前提下，由神經(jīng)生長因子和相應(yīng)載體制備的不同藥物劑型也能被本領(lǐng)域技術(shù)人員容易實現(xiàn)。
[0010]用于本發(fā)明的神經(jīng)生長因子可以包括，但不限于，人神經(jīng)生長因子，小鼠神經(jīng)生長因子和大鼠神經(jīng)生長因子。優(yōu)選地，本發(fā)明所用的神經(jīng)生長因子為其β亞基氨基酸序列，更優(yōu)選地，所述神經(jīng)生長因子的氨基酸序列如SEQ ID No:1-3所示。
[0011]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，用于本發(fā)明的神經(jīng)生長因子可以從相應(yīng)地動物體或組織中提取(主要是小鼠神經(jīng)生長因子和大鼠神經(jīng)生長因子)，或者通過基因工程方法在適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主中表達(dá)獲得相應(yīng)的重組神經(jīng)生長因子。
[0012]本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，以神經(jīng)生長因子為主要有效成分制備的治療中老年男性性腺功能低下綜合征藥物的作用如下:[0013]1.所述藥物對快速老化鼠血清和睪丸中睪酮偏低的治療作用
[0014]以雄性快速老化小鼠(Senescence-accelerated mouse prone-8, SAM P8, 32周齡，26±2克/只)作為研究對象，并選用同源正常小鼠(Senescence-acceleratedresistant mouse prone_l，SAM Rl，32周齡，26±2克/只)作為正常對照組。將小鼠神經(jīng)生長因子用0.9%的生理鹽水稀釋至I毫克/毫升(mg/mL)，然后按照250微克/公斤體重(V- g/kg)通過滴鼻方式給藥，每2天給藥一次,連續(xù)給藥5周。模型組則以雄性快速老化小鼠(Senescence-accelerated mouse prone-8, SAM P8, 32 周齡，26±2 克 / 只)作為研究對象，與正常對照組一樣，用0.9%生理鹽水進(jìn)行滴鼻，溶液量及給藥時間與實驗組相同。實驗結(jié)束后，收集血清和睪丸。然后利用放射性免疫檢測方法檢測血清以及睪丸內(nèi)睪酮的含量，熒光定量鏈?zhǔn)骄酆厦阜椒ê偷鞍纂s交方法檢測睪酮合成和分泌過程中幾個限速酶的表達(dá)情況。在血清睪酮含量分析方面，神經(jīng)生長因子治療組小鼠的血清中，其睪酮的平均含量為18.09納克/毫升(ng/ml)，為正常組的12.3倍，而僅以生理鹽水作為安慰劑的模型組，其血清中的睪酮含量僅為正常對照組的5.1%。而在睪丸內(nèi)睪酮含量分析方面，小鼠神經(jīng)生長因子治療組小鼠睪丸內(nèi)睪酮含量與正常對照組的相當(dāng)，兩者間沒有顯著差異，但均比模型組的高2.5倍。這個實驗結(jié)果表明，神經(jīng)生長因子能夠極顯著地改善快速老化鼠血清和睪丸中睪酮的含量。由于睪酮的合成和分泌是睪丸間質(zhì)細(xì)胞受腦垂體分泌的促黃體生成激素(Luteinizing hormone, LH)刺激而產(chǎn)生的，因此,用滴鼻方式進(jìn)入腦部的小鼠神經(jīng)生長因子可以作用于下丘腦和垂體，從而改善和增加睪丸分泌睪酮的功能。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究表明，相對于生理鹽水處理的模型組，小鼠神經(jīng)生長因子處理組小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的急性激素調(diào)控蛋白(Steroidogenic acute regulatory protein, Star)的表達(dá)量顯著上升2倍以上，這個結(jié)果說明，小鼠神經(jīng)生長因子處理組小鼠的血液中促黃體生成激素增多并調(diào)控睪丸間質(zhì)細(xì)胞合成更多的睪酮。 [0015]2.所述藥物促進(jìn)快速老化鼠睪丸間質(zhì)干細(xì)胞的增殖和分化
[0016]睪丸間質(zhì)細(xì)胞在分化發(fā)育過程中分為四個顯著不同的階段:間質(zhì)干細(xì)胞(Stemleydig cell, SLC)、間質(zhì)祖細(xì)胞(Progenitor leydig cell, PLC)、幼稚型間質(zhì)細(xì)胞(Immature leydig cell, ILC)和成年型間質(zhì)細(xì)胞(Adult leydig cell, ALC)。而這些發(fā)育過程中由于增殖分化異常、數(shù)量減少及激素合成分泌功能減退也會導(dǎo)致體內(nèi)雄激素缺乏。睪丸間質(zhì)細(xì)胞發(fā)育分化一般只限于胚胎發(fā)生和青春期初期，而成年型間質(zhì)細(xì)胞一旦形成，即使在雄性進(jìn)入衰老狀態(tài)，其數(shù)量也不會發(fā)生顯著變化。然而，近年來有研究表明，間質(zhì)干細(xì)胞可以重新增殖并分化成新的年型間質(zhì)細(xì)胞。而間質(zhì)細(xì)胞的再生過程也是經(jīng)歷了間質(zhì)祖細(xì)胞、幼稚型間質(zhì)細(xì)胞和成年型間質(zhì)細(xì)胞階段，且所有的雄激素合成酶的信使核糖核酸(mRNA)表達(dá)及其生理功能都與正常的睪丸間質(zhì)細(xì)胞沒有顯著性差異。這個結(jié)果有力地說明，睪丸中存在“沉默”狀態(tài)的間質(zhì)干細(xì)胞，這些細(xì)胞可以再次增殖和分化發(fā)育到具有睪酮合成能力的成年型間質(zhì)細(xì)胞，而這種再生能力與雄性年齡無關(guān)(Stanley et al., 2012,Endocrinology,153(10):5002-5010)。
[0017]將雄性Sprague-Dawley大鼠(12-16周齡，250±20克/只，購自中山大學(xué)實驗動物中心，許可證號:SCXK2011-0029)于實驗前7天腹腔注射乙烷二甲烷硫砜(Ethanedimethane sulfonate,EDS) (90毫克/公斤體重,mg/kg), 二氧化碳窒息處死后,取出睪丸，然后分離曲細(xì)精管，于DMEM/F-12培養(yǎng)基中(含0.1 %小牛血清白蛋白)，34°C培養(yǎng)16小時。然后，將曲細(xì)精管分至24孔板，加入不同濃度的大鼠神經(jīng)生長因子及促黃體生成激素處理24小時。用熒光染色劑對細(xì)胞核進(jìn)行染色，激光共聚焦及熒光顯微鏡觀察，結(jié)果表明，單獨使用促黃體生成激素(LH)并不能“激活” SLC，而大鼠神經(jīng)生長因子則可以促進(jìn)SLC的顯著增殖并開始分化，且該增殖效果與大鼠神經(jīng)生長因子呈濃度依賴效應(yīng)(圖4)。此外，SLC是分布在曲細(xì)精管表面，且神經(jīng)生長因子和神經(jīng)生長因子受體也廣泛存在于睪丸組織中，因此，含大鼠神經(jīng)生長因子的藥物可通過睪丸靜脈注射誘導(dǎo)SLC進(jìn)行增殖分化。
[0018]進(jìn)一步的研究表明，利用含100納克/毫升(ng/ml)人神經(jīng)生長因子、0.1 %小牛血清白蛋白及I納克/毫升(ng/ml)促黃體生成激素的培養(yǎng)基(Dulbeccc^ sModification of Eagle' s Medium/Ham' s F-12,DMEM/F_12)連續(xù)培養(yǎng)曲細(xì)精管8 周后，培養(yǎng)液中的睪酮已經(jīng)可以檢測到，最高達(dá)到5.4納克/孔(ng/well，圖5)。這個結(jié)果可以說明，促黃體生成激素及人神經(jīng)生長因子可以促進(jìn)睪丸間質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化發(fā)育至成體間質(zhì)細(xì)胞，并能合成和分泌睪酮。
[0019]上述研究結(jié)果充分證明小鼠、大鼠以及人源的神經(jīng)生長因子可以單獨或以與其他相關(guān)藥劑組合成藥物組合物的形式用于治療中老年男性性腺功能低下綜合征，其中所述的藥物組合物形式，包括滴鼻劑、針劑或者針粉劑。此外，藥物組合物可以含有其他的相關(guān)活性成分，還可以含有穩(wěn)定劑、改變滲透壓的鹽、緩沖液、或抗氧化劑。
[0020]因此，在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供一種治療中老年男性遲發(fā)性性腺功能低下綜合征的方法，所述方法包括:將大鼠神經(jīng)生長因子、小鼠神經(jīng)生長因子或者通過基因工程方法獲得人源神經(jīng)生長因子，以40微克/公斤體重(μ g/kg)的劑量通過滴鼻給藥方式施用至受試者(主要是患有遲發(fā)性性腺功能低下綜合征的中老年男性)，隔天一次，一共給藥10次作為一個療程，每個療程結(jié)束后檢測血液中睪酮的含量，依據(jù)血液中睪酮的含量判斷是否還需要進(jìn)行下一療程的治療，直至血液中睪酮的含量達(dá)到正常水平；或者，也可以將大鼠神經(jīng)生長因子、小鼠神經(jīng)生長因子或者通過基因工程方法獲得人源神經(jīng)生長因子，以1-3微克/公斤體重(μ g/kg)的劑量通過睪丸靜脈給藥方式施用至受試者(主要是患有遲發(fā)性性腺功能低下綜合征的中老年男性)，每周一次，一共給藥4次作為一個療程，每個療程結(jié)束后檢測血液 中睪酮的含量，依據(jù)血液中睪酮的含量判斷是否還需要進(jìn)行下一療程的治療，直至血液中睪酮的含量達(dá)到正常水平。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點將更明顯，其中:
[0022]圖1:曲細(xì)精管表面睪丸間質(zhì)干細(xì)胞增殖和分布(綠色熒光部分顯示正在進(jìn)行核酸復(fù)制活動的細(xì)胞核)，LH =促黃體生成激素(LH，280ng/ml) +胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基添加劑(Insulin-Transferrin-Sodium Selenite, ITS), PDGF AA 膜島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基添加劑(ITS) +血小板衍生生長因子AA (PDGF AA)，NGF 200 =胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基添加劑(ITS) +大鼠神經(jīng)生長因子(200ng/ml) ；NGF100 =胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基添加劑(ITS) +大鼠神經(jīng)生長因子(100ng/ml) ；NGF10=胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基添加劑(ITS) +大鼠神經(jīng)生長因子10(10ng/ml);血小板衍生生長因子AA(PDGF AA)的濃度為10納克/毫升(ng/ml)，促黃體生成激素(LH)濃度為280納克/毫升(ng/ml)，處理24小時后，Click-1T? EdU HCS Assays試劑盒(貨號:C10352,購自Invitrogen公司)進(jìn)行核染色,奧林巴斯(Olympus)突光顯微鏡(IOOX)拍照；
[0023]圖2:大鼠神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)干細(xì)胞增殖分析；
[0024]圖3:睪酮合成通路上關(guān)鍵酶基因表達(dá)的定量分析，大鼠神經(jīng)生長因子的工作濃度為200納克/毫升(ng/ml), 100納克/毫升(ng/ml), 10納克/毫升(ng/ml),血小板衍生生長因子AA(PDGF AA)的濃度為10納克/毫升(ng/ml)，促黃體生成激素(LH)濃度為280納克/毫升(ng/ml)，處理時間為72小時，而后分別將含有上述各種細(xì)胞因子的培養(yǎng)基更換為胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基添加劑(ITS) +促黃體生成激素(LH)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至第21天，每3.5天更換一次培養(yǎng)基，收集第14天和第21天樣品提取核糖核酸(RNA)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自Invitrogen公司，貨號:11753500)反轉(zhuǎn)錄I微克(Ug)RNA，熒光定量鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)檢測各個基因的表達(dá)情況。胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基添加劑(ITS)組作為對照組，內(nèi)參為核糖體蛋白S16基因(RPS16，其引物序列由深圳華大基因研究院合成)，*#p < 0.001，#p < 0.01，*p < 0.05，vs ITS.η = 5 ;a***P < 0.001，b**P < 0.01 和 c*P < 0.05, vs 促黃體生成激素(LH)，η =50
[0025]圖4:放射性免疫方法分析培養(yǎng)基中睪酮含量，人神經(jīng)生長因子的濃度為200納克/毫升(ng/ml)，100納克/毫升(ng/ml)，10納克/毫升(ng/ml),血小板衍生生長因子AA(PDGFAA)的濃度為10納克/毫升(ng/ml)，促黃體生成激素(LH)濃度為280納克/毫升(ng/ml)，處理時間為72小時，而后將含有分別將含有上述各種細(xì)胞因子的培養(yǎng)基更換為胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基添加劑(ITS) +促黃體生成激素(LH)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至第21天，每3.5天更換一次培養(yǎng)基，收集第14天和第21天的培養(yǎng)基上清，放射性免疫試劑盒(購自北京北方生物技術(shù)研究所，貨號:B10TFB)檢測上清睪酮。胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉培養(yǎng)基添加劑(ITS)組作為對照組，內(nèi)參為40S核糖體蛋白S16基因(RPS16，其引物序列由華大基因研究院合成)，*P < 0.05，#P < 0.01和< 0.0Olvs對照組a_P < 0.001，b**P < 0.01和c*P < 0.05, vs促黃體生成激素(LH), vs促黃體生成激素(LH) η = 5。
[0026]圖5:快速老化鼠血清睪酮含量分析，正常小鼠為同系的SAM Rl系列，模型組小鼠為SAM Ρ8小鼠(購自天津中醫(yī)藥大學(xué)，合格證號:W-J津?qū)崉淤|(zhì)M準(zhǔn)字第006號，26±2克/只)，小鼠神經(jīng)生長因子組小鼠的給藥劑量為250微克/公斤體重(μ g/kg)，隔天鼻腔給藥，連續(xù)給藥5周，眼球取血，收集血清，放射性免疫方法檢測體內(nèi)睪酮，***P < 0.0Olvs正常 η = 6。
[0027]圖6:快速老化鼠睪丸內(nèi)睪酮含量分析，將睪丸去除被膜后，放入勻漿器，按1: 5 (質(zhì)量:體積)的比例加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液，4°C搖床過夜，次日以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘后取上清，-20°C保存，放射性免疫法檢測睪酮，**P < 0.01vs對照，η = 4。
[0028]圖7:快速老化鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)合成和分泌睪酮的關(guān)鍵酶基因定量PCR檢測分析，小鼠神經(jīng)生長因子組小鼠的給藥劑量為250微克/公斤體重(P g/kg)，鼻腔隔天給藥，連續(xù)給藥5周,睪丸樣品提取核糖核酸(RNA),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自Invitrogen公司，貨號:11753500)反轉(zhuǎn)錄I微克(μ g)核糖核酸(RNA)，42°C逆轉(zhuǎn)錄30分鐘后，85°C處理5分鐘終止反應(yīng)。40S核糖體蛋白S16基因(RPS16，其引物序列由華大基因研究院合成)作為內(nèi)參，熒光定量鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)檢測睪酮合成通路上相關(guān)酶的表達(dá)情況，*P < 0.05，**P
<0.01 和 ***P < 0.001, VS 對照 η = 4。
[0029]圖8:快速老化鼠曲細(xì)精管內(nèi)支持細(xì)胞睪酮轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)分析情況，小鼠神經(jīng)生長因子組小鼠的給藥劑量為250微克/公斤體重(μ g/kg)，鼻腔隔天給藥，連續(xù)給藥5周，睪丸樣品提取核糖核酸(RNA)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)I微克(μ g)核糖核酸(RNA)，42°C逆轉(zhuǎn)錄30分鐘后，85°C處理5分鐘終止反應(yīng)。40S核糖體蛋白S16基因(RPS16，其引物序列由華大基因研究院合成)作為內(nèi)參，熒光定量鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)檢測睪酮合成通路上相關(guān)酶的表達(dá)情況，*P < 0.05, #P < 0.01和< 0.001, vs對照η = 4。
[0030]圖9:快速老化鼠睪丸總蛋白雜交檢測結(jié)果分析，小鼠神經(jīng)生長因子組小鼠的給藥劑量為250微克/公斤體重(μ g/kg)，鼻腔隔天給藥，連續(xù)給藥5周，睪丸樣品提取蛋白，蛋白雜交方法檢測蛋白表達(dá)情況。熒光定量鏈?zhǔn)骄酆厦阜磻?yīng)(PCR)檢測睪酮結(jié)合蛋白(Androgen Bingding Protein, ABP)基因的表達(dá)情況，*P < 0.05,林P < 0.01 和 ***P
<0.001, vs 對照 η = 4。
[0031]序列表說明
[0032]
【權(quán)利要求】
1.神經(jīng)生長因子在制備用于治療中老年男性性功能低下綜合征的藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1所述的用途，其中所述神經(jīng)生長因子來源于人、小鼠或大鼠。
3.權(quán)利要求1所述的用途，其中所述神經(jīng)生長因子的氨基酸序列如SEQID No:1-3所/Jn ο
4.權(quán)利要求1所述的用途，其中所述藥物除了包含有效量的神經(jīng)生長因子外還包含一種或多種其他有效用于治療老年男性性功能低下綜合征的藥物活性成分，例如促黃體生成激素、血小板衍生生長因子AA。
5.權(quán)利要求1所述的用途，其中所述藥物的劑型包括滴鼻劑、針劑或針粉劑。
6.一種治療中老年男性性功能低下綜合征的藥物，所述藥物包含治療有效量的神經(jīng)生長因子作為主要活性成分以及藥學(xué)上可接受的載體。
7.權(quán)利要求6所述的藥物，其中所述神經(jīng)生長因子來源于人、小鼠或大鼠。
8.權(quán)利要求6所述的藥物，其中所述神經(jīng)生長因子的氨基酸序列如SEQID No:1-3所/Jn ο
9.權(quán)利要求6所述的藥物，其中所述藥物還包含一種或多種其他有效用于治療老年男性性功能低下綜合征的藥物活性成分，例如促黃體生成激素、血小板衍生生長因子AA。
10.權(quán)利要求6所述的藥物,其中`所述藥物的劑型包括滴鼻劑、針劑或針粉劑。
【文檔編號】A61K38/18GK103861087SQ201310004439
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2013年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月14日
【發(fā)明者】黃亞東, 蘇志堅, 葛仁山, 陳潔, 項琪, 蘇澤軒, 張齊好, 張磊 申請人:廣州暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心