用于生物產(chǎn)品特別是疫苗的真空輔助保存的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一般性地涉及免疫學(xué)和疫苗【技術(shù)領(lǐng)域】。更特別是，本發(fā)明涉及用于使生物制劑包括肽、抗原、抗體、細胞等玻璃化的方法。
【專利說明】用于生物產(chǎn)品特別是疫苗的真空輔助保存
[0001]通過引用并入
[0002]本申請要求2011年5月27日提交的臨時申請USSN61/490，987 (通過引用整體并入本文)的優(yōu)先權(quán)。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明一般性地涉及免疫學(xué)和疫苗技術(shù)的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及用于冷凍干燥的活減毒免疫原性和/或疫苗組合物的穩(wěn)定劑，所述組合物可特別包含犬副粘病毒。本發(fā)明還涉及穩(wěn)定化的冷凍干燥的活減毒免疫原性和/或疫苗組合物(例如犬副粘病毒的所述組合物)，所述組合物可包含這些穩(wěn)定劑。本發(fā)明的其它方面被描述于下列公開內(nèi)容中或由下列公開內(nèi)容是顯然的，并且在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0004]發(fā)明背景
[0005]包含生物學(xué)成分例如病毒、細菌、寄生蟲、真菌、蛋白質(zhì)、多肽、糖蛋白以及特別是減毒的活微生物的免疫原性組合物和疫苗組合物對籍以制備、配制和儲存它們的條件顯著敏感。
[0006]可通過化學(xué)反應(yīng)(例如水解、脫氨基作用、Maillard’ s反應(yīng))修飾和降解這樣的生物學(xué)成分，所述反應(yīng)中的許多都是通過水介導(dǎo)的。液態(tài)水允許分子運動并且可引起包含生物學(xué)成分的組合物中的蛋白質(zhì)構(gòu)象的修飾。通過限制對水的接觸或通過除去水，修飾和降解的主要因素被減少。賦予生物學(xué)成分穩(wěn)定性的先前方法主要涉及冷凍水或通過冷凍干燥除去水。
[0007]冷凍干燥或冷凍干燥的過程是在脫水產(chǎn)品的制備中用來除去水的常用技術(shù)。一般地，“冷凍干燥”含水組合物包括3個步驟。第一，在低溫條件下冷凍含水組合物。第二，通過在降低的壓力和低溫條件下升華來除去冷凍的水。在該階段，組合物通常包含約15%的水。第三，通過在降低的壓力和更高的溫度條件下解吸來進一步除去殘余的水。在冷凍干燥過程的最后，產(chǎn)生冷凍干燥產(chǎn)品，也稱為“錠劑”或“餅狀物”。凍干的產(chǎn)品包含極低的殘余水(約0.5%至約5%重量/重量)和以無定形形式存在的干物質(zhì)。該特定狀態(tài)適格為“玻璃態(tài)的”。
[0008]然而，在制備階段(例如在冷凍干燥之前和冷凍干燥期間)，以及還有在免疫原性組合物和疫苗組合物的保存過程中觀察到生物學(xué)成分的免疫原性活性的實質(zhì)性喪失。必須保障生物學(xué)成分的完整性以確保保持免疫原性組合物和疫苗組合物的免疫效率。生物學(xué)成分的免疫原性活性通過當(dāng)給宿主或受試者施用時誘導(dǎo)和刺激免疫反應(yīng)的能力來測量。
[0009]為了限制受試者的操作和施用次數(shù)，在本領(lǐng)域中有對提供多價免疫原性組合物或疫苗組合物的強烈需求。按照定義，多價免疫原性組合物或疫苗組合物包含超過一種源自或衍生自至少兩種不同的病原體的活性免疫原性組分。來自不同屬的病毒在冷凍干燥步驟過程中和隨后的保存期間在穩(wěn)定性上可變化，這導(dǎo)致活力或感染性的喪失。在病毒(例如犬副粘病毒)的情況下，通常施用的活性免疫原性組分是活減毒病毒。為了高效地刺激免疫系統(tǒng)，活減毒病毒必須在經(jīng)免疫接種的受試者中復(fù)制?；盍蚋腥拘缘膯适Э稍诶鋬龈稍锒鄡r免疫原性組合物或疫苗組合物的過程之中、在組合物的保存期間或在重構(gòu)之后施用組合物之前發(fā)生。因此，已將穩(wěn)定劑添加至這樣的冷凍干燥組合物中。然而，為了獲得保留它們的感染性和/或活力的多價免疫原性組合物或疫苗組合物，能夠保持不同活減毒病原體的活力和感染性的常用穩(wěn)定劑將是特別有利的。
[0010]干燥形式的生物學(xué)成分的穩(wěn)定化通常包括保存抗毒素、抗原和細菌(Flosodort等人(1935) J.1mmunol.29，389)。然而，當(dāng)在環(huán)境溫度由含水狀態(tài)干燥時，該過程的限制包括蛋白質(zhì)的部分變性。從冷凍狀態(tài)干燥幫助減少變性并且引起更好(盡管不完全)地保存生物學(xué)成分(包括細菌和病毒)(Stamp等人(1947) J.Gen.Microbiol.1, 251 ;Rightsel等人(1967) Cryobiology3, 423 ；Rowe 等人(1971) Cryobiology8, 251)。
[0011]最近，在病毒的冷凍干燥之前以各種組合添加了糖例如蔗糖、棉子糖和海藻糖作為穩(wěn)定劑。已測試了許多化合物穩(wěn)定不同的包含活減毒生物學(xué)成分(特別是病毒)的疫苗的能力。此類化合物包括SPGA(鹿糖、磷酸鹽、谷氨酸鹽和白蛋白；Bovarnick等人(1950)J.Bacteriol.59，509-522 ；美國專利N0.4，000，256)、牛或人血清白蛋白、谷氨酸的堿金屬鹽、鋁鹽、蔗糖、明膠、淀粉、乳糖、山梨醇、Tris-EDTA、酪蛋白水解物、乳糖酸鈉和鉀以及單金屬或二原子金屬堿性金屬磷酸鹽。其它化合物包括例如SPG-NZ胺(例如美國專利N0.3，783，098)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)混合物(例如美國專利N0.3，915，794)。最近，已使用多種化合物的復(fù)雜混合物來穩(wěn)定活減毒黃病毒，所述多種化合物包括山梨醇、蔗糖，任選地海藻糖和/或其它二糖或三糖、尿素以及氨基酸的特定組合(屬于Sanofi Pasteur的US2010/0015180A1)。
[0012]疫苗和免疫原性組合物通過減小多種強毒性病原體的發(fā)病率和死亡率對公共健康有巨大影響。然而，從免疫原性組合物和疫苗組合物的添加劑產(chǎn)生的不欲的副作用繼續(xù)產(chǎn)生可勝過免疫原性組合物和疫苗組合物的任何保護和治療性特性的潛在風(fēng)險。
[0013]在美國在通常用于疫苗的形式中，明膠可在約200萬劑的I劑中引發(fā)嚴重的過敏反應(yīng)。先前被認為由白蛋白(卵蛋白)引起的過敏反應(yīng)更可能是由相同疫苗中的明膠引起的。在人血清白蛋白的情況下，雖然沒有疾病與疫苗中的人血清白蛋白相關(guān)，但仍然有可能通過該蛋白傳播源自人血液的病毒。
[0014]源自牛的產(chǎn)品(例如牛血清白蛋白和明膠)具有通過用于疫苗制造的牛血和結(jié)締組織產(chǎn)品傳播CJD(庫杰二氏病，也稱為“瘋牛病”)的風(fēng)險。然而，未曾報導(dǎo)其中CJD通過血液或結(jié)締組織產(chǎn)品傳播的病例，未曾在血液或結(jié)締組織中發(fā)現(xiàn)引起CJD的朊病毒，使用來自從有已知的瘋牛病病例的國家進口的牛的源自牛的產(chǎn)品被禁止。然而，鑒于這些風(fēng)險，進行了努力來消除在已被觀察到引起不欲的免疫作用的免疫原性組合物中使用此類產(chǎn)品。
[0015]De Rizzo(de Rizzo 等人(1989)Bull.Pan.Am.Health Organ.23(3), 299-305)報導(dǎo)了包含山梨醇-明膠或谷氨酸-乳糖溶液的凍干的麻疹病毒制劑。這些制劑被保存在-20°C，并且在21個月的保存期中測定了它們的病毒滴度。所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)表明不具有穩(wěn)定劑的凍干病毒當(dāng)在_20°C保存21個月的時期時是穩(wěn)定的。此外，眾所周知當(dāng)在-20°C保存時，凍干的麻疹病毒是穩(wěn)定的，并且可很多年實際上無損失地保持效力(Gray A.，(1978)Dev.Biol.Stand.41，265-266)。然而，這些結(jié)果是在-20°C獲得的，此時凍干的麻疹病毒是穩(wěn)定的并且未顯示額外的穩(wěn)定化效應(yīng)。這些結(jié)果僅顯示出山梨醇-明膠和谷氨酸-乳糖溶液對以凍干形式在-20°C保存的麻疹病毒的穩(wěn)定性沒有負面影響。[0016]Precausta (Precausta 等人(1980) J.Clin.Microbiol.12 (4), 483-489)檢查了殘余水分和封閉氣氛對冷凍干燥后犬瘟熱病毒(CDV)和傳染性支氣管炎病毒(IBV)的感染性滴度的作用。將乳糖溶液添加至⑶V的制劑至75mg/ml的終濃度，而IBV疫苗包含40mg的甘露醇/ml。當(dāng)將冷凍干燥前的CDV滴度與冷凍干燥后并且在6°C保存12個月后的滴度相比較時，⑶V滴度從IO16降至102_°CCID5(l/ml，這反映了⑶V滴度的非常顯著的減少。
[0017]本領(lǐng)域中已知幾種用于除去水份以保存生物制劑的方法。術(shù)語“噴霧冷凍干燥”被理解為表示在低溫環(huán)境中用液體噴霧，隨后冷凍干燥獲得的冷凍顆粒?！芭菽稍铩北焕斫鉃楸硎就ㄟ^蒸發(fā)水、以玻璃狀泡沫的形式干燥濃縮的溶液?！袄鋬雠菽稍铩币庥竿ㄟ^在低于玻璃轉(zhuǎn)化溫度和基質(zhì)崩解溫度(matrix collapse temperature)的溫度下升華冰、以玻璃狀泡沫的形式干燥預(yù)冷凍的溶液。
[0018]因此，存在對用于以冷凍干燥形式保存生物學(xué)成分的活力和感染性的新型穩(wěn)定劑和方法的需要，所述生物學(xué)成分是安全的并且適合用于給受試者注射，且具有良好的方面。
[0019]本申請中的任何文獻的引用或鑒別不是承認這樣的文獻可獲得作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
[0020]發(fā)明概述
[0021]本發(fā)明特別通過提供用于產(chǎn)生生物品(包括蛋白質(zhì)、肽、抗體、細菌、病毒、單細胞寄生蟲或任何人或非人動物組織)的玻璃化制劑的新方法，解決了本領(lǐng)域的需要。病毒可包括活減毒犬瘟熱病毒(CDV)、犬副流感2型(cPi2)、犬腺病毒、馬立克氏(Marek’s)病、傳染性法氏囊病或新城疫疾病。細菌可包括巴斯德菌屬的種(Pasteurella spp.)或禽桿菌屬的種(Avibacteriu m spp.),并且生物品可包括利什曼原蟲(Leishmania)的KSAC多肽。
[0022]在實施方案中，經(jīng)概括的玻璃化方法包括下列步驟:
[0023](I)配制生物制劑，包括如下步驟:添加活性生物品成分，添加穩(wěn)定劑(其減少或消除由使生物品成分經(jīng)受低溫保存手段(包括造粒、玻璃化和冷凍干燥)而誘導(dǎo)的損害)，和任選地添加一種或多種佐劑，其在免疫制劑的情況下增強生物品的免疫原性；
[0024](2)給小瓶填充步驟(1)的生物制劑；
[0025](3)將小瓶加載至溫控容器中，其中溫度為_15°C至10°C，特別是-10°C至5°C，更特別是約5°C ；
[0026](4)降低溫控容器的氣壓直至獲得15-30mbar范圍內(nèi)的壓力；
[0027](5)維持步驟⑷過程中獲得的壓力5至20分鐘，特別是10至15分鐘，以允許產(chǎn)品的溫度穩(wěn)定并且允許揮發(fā)性氣體(包括碳酸鹽類)從生物制劑釋放，其中容器溫度在該步驟中保持在約4°C至約6°C，或約5°C ；
[0028](6)將容器氣壓降至約4至約7mbar或約5mbar,進行約5至約20分鐘；
[0029](7)維持步驟(6)的壓力約30至約60分鐘，這允許生物制劑變得更為濃縮；
[0030](8)在45至85分鐘，或約60分鐘的過程中將容器的溫度從負溫度升高至正溫度(約30°C至約50°C )，并保持壓力恒定直至達到約10°C至約20°C，或約15°C ；
[0031](9)將容器氣壓降至約1.5至約4mbar,或約3mbar,以加速濃縮,并且直至容器溫度達到約30°C，并且維持約30°C約30分鐘至約90分鐘，或60分鐘；
[0032](10)進一步將壓力降至約0.5至約4.0mbar,或約Imbar,并且維持恒定壓力直至發(fā)泡完成；[0033](11)將壓力進一步降至約5 μ bar至約100 μ bar,或約25 μ bar,同時將溫度維持在約30°C，進行約400至約2400或更多分鐘，直至獲得約0.5%至約15%，或約1%至約4%的所需水份；
[0034](12)在冷凍干燥器容器中給小瓶塞塞子，從而完成玻璃化法。
[0035]本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用任何已知或有待制造的適當(dāng)干燥裝置進行本發(fā)明的方法。適當(dāng)?shù)母稍镅b置的非限定性實例包括:1)小型干燥器(一個架子，200X3CC小瓶容量)；2)試驗(pilot)干燥器(2個架子，3000X3cc小瓶容量)或大型BERLIN干燥器(3個架子，10000X3cc)?？蛇M行對干燥裝置壓力調(diào)節(jié)回路的常規(guī)修飾，從而與其常規(guī)范圍相比，冷凍干燥器可在更寬的范圍內(nèi)操作。
[0036]這些和其它實施方案被公開了，或根據(jù)下列詳細描述將是明顯的且被涵蓋在下列詳細描述中。
[0037]附圖簡述
[0038]通過舉例方式給出、但不意在將本發(fā)明限定于所描述的特定實施方案的下列詳細描述可與附圖(通過引用并入)結(jié)合起來理解，其中:
[0039]圖1顯示具有棉花糖外觀的玻璃化團塊的照片。
[0040]發(fā)明詳述
[0041]在本公開中，“包含”、“包括”、“含有”和“具有”等可具有在美國專利法中歸屬于它們的含義，并且可表示“包括”、“包含”等；“基本上由……組成”或“基本上組成”類似地具有在美國專利法中被歸有的含義，并且該術(shù)語是開放式的(open-ended)，允許超出被引述的內(nèi)容存在，只要被引述的內(nèi)容的基本或新型特征不因超出被引述的內(nèi)容的存在而改變，但不包括現(xiàn)有技術(shù)實施方案。
[0042]本發(fā)明情境中的“受試者”可以是脊椎動物例如哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物或魚；更有利地為人、伴侶動物或家養(yǎng)動物；產(chǎn)生食物或產(chǎn)生飼料的動物；家畜、狩獵動物、競賽動物或運動動物例如但不限于牛、犬、貓科動物、山羊、綿羊、豬、馬和禽類。優(yōu)選地，脊椎動物是犬。
[0043]如本文中所使用的，“重組”是指合成的或以其它方式經(jīng)體外操作的核酸(例如，“重組核酸”)，指使用重組核酸在細胞中、受試者中或其它生物學(xué)系統(tǒng)中產(chǎn)生基因產(chǎn)物的方法，或指由重組核酸編碼的多肽(“重組蛋白”)?！爸亟M方法”還包括切除具有來自不同來源的不同編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)域或啟動子序列的核酸并且將其連接入表達盒或載體，以進行例如核酸編碼序列的可誘導(dǎo)的或組成型表達。
[0044]如本文中所用，術(shù)語“可操作連接的”意指所述組分處于允許它們以其所需的方式起作用的關(guān)系中。
[0045]術(shù)語“異源的”，當(dāng)用于指核酸時，表示核酸存在于自然中其不是被通常發(fā)現(xiàn)的細胞、病毒、受試者或細菌中；或包括兩個或更多個核酸亞序列，所述亞序列不以在自然中通常發(fā)現(xiàn)的相同的相互間關(guān)系被發(fā)現(xiàn)，或者被重組工程化從而在細胞、受試者或結(jié)構(gòu)中其表達水平或者其與其它核酸或其它分子的物理關(guān)系不是自然中通常所發(fā)現(xiàn)的。例如，可重組產(chǎn)生異源核酸，其具有以非天然發(fā)現(xiàn)的形式排列的兩個或更多個來自不相關(guān)基因的序列；例如插入例如痘病毒或腺病毒載體中的可操作連接至啟動子序列的犬基因。作為實例，目標異源核酸可編碼免疫原性基因產(chǎn)物，其中將載體中包含的目標異源核酸作為免疫原性組合物或疫苗組合物治療性或預(yù)防性地施用。異源序列可包括啟動子和序列的各種組合，其許多實例于本文中被詳細地描述。
[0046]如本文中所用，“載體”是允許或促進實體從一個環(huán)境轉(zhuǎn)移至另一個環(huán)境的工具。例如，重組核酸技術(shù)中使用的一些載體允許實體例如核酸區(qū)段(例如異源核酸區(qū)段，例如異源cDNA區(qū)段)轉(zhuǎn)移進入靶細胞。本文中還使用的是術(shù)語“表達載體”。本發(fā)明包括重組載體，其可包括但不限于病毒載體、細菌載體、真菌載體、原生動物載體、質(zhì)粒載體或其組合。
[0047]關(guān)于用于在載體中表達的異源核酸(例如，其編碼目標表位和/或抗原和/或免疫原和/或治療劑)和提供此種異源核酸的文獻，以及關(guān)于用于增強核酸分子的表達的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯因子的表達，以及關(guān)于術(shù)語例如特別是“目標表位”、“治療劑”、“免疫反應(yīng)”、“免疫學(xué)反應(yīng)”、“保護性免疫反應(yīng)”、“免疫組合物”、“免疫原性組合物”和“疫苗組合物”，參考1999年11月23日發(fā)布的美國專利N0.5, 990, 091以及W098/00166和W099/60164，和其中引用的文獻以及該專利和那些PCT申請的進行中記錄的文獻；將其全部通過引用并入本文。因此，可在本發(fā)明的實施中參考美國專利N0.5，990，091以及W098/00166和W099/60164,以及其中引用的文獻和該專利及那些PCT申請的進行中的文獻或記錄，和本文中引用的或以其它方式通過引用并入本文中的其它文獻；并且本文中引用的所有異源核酸分子、啟動子和載體可被用于本發(fā)明的實施。在這方面，還提及美國專利N0.6，706，693 ；6，716，823 ;6，348，450 ;美國專利申請系列 N0.10/424，409 ; 10/052，323 ; 10/116，963 ；10/346，021 ;和 1999 年 2 月 25 日公布的來自 PCT/US98/16739 的 W099/08713。
[0048]“抗原”是被免疫系統(tǒng)識別且誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的物質(zhì)?？乖砂?被殺死的、減毒的或活的完整生物體；生物體的亞單位或部分；包含具有免疫原性性質(zhì)的插入物的重組載體；能夠在呈遞給宿主動物后誘發(fā)免疫反應(yīng)的核酸塊或片段；蛋白質(zhì)、多肽、肽、糖蛋白、表位、半抗原、碳水化合物、糖或其任意組合。備選地，抗原可包含毒素或抗毒素。在本說明書中可互換使用的相似術(shù)語是“免疫原”?！安≡w”是指疾病的特定致病劑，例如細菌、真菌、原生動物、寄生蟲或病毒。
[0049]如本文中所用，術(shù)語“玻璃化”意在指使用在特定的溫度范圍中進行特定時間長度的一系列受控壓力減少而使液體生物制劑干燥至低水份(例如少于約4%)、“棉花糖樣外觀?？稍谌魏问?chamber)或容器(包括冷凍干燥器)中進行玻璃化，其中可調(diào)節(jié)氣壓和溫度以適應(yīng)本公開中所呈現(xiàn)的范圍。術(shù)語“玻璃化組合物”和“玻璃化制劑”可互換使用，并且在本文中意指已經(jīng)受本文中公開的玻璃化法的任何組合物、制劑或配制劑。
[0050]如本文中所用，術(shù)語“免疫原性組合物”和“免疫組合物”以及“免疫原性或免疫組合物”涵蓋了引發(fā)抗從載體表達的目標抗原或免疫原的免疫反應(yīng)的任何組合物；例如，在施用至受試者中后，引發(fā)抗所靶向的目標免疫原或抗原的免疫反應(yīng)。術(shù)語“疫苗的組合物”和“疫苗”及“疫苗組合物”涵蓋誘導(dǎo)抗目標抗原的保護性免疫反應(yīng)的任何組合物，或其有效地保護抵抗抗原；例如，在施用或注射入受試者后，引發(fā)抗所靶向的抗原或免疫原的保護性免疫反應(yīng)或提供有效的抗從載體表達的抗原或免疫原的保護。
[0051]如本文中所用，術(shù)語“多價”意指包含超過一種抗原(不論來自相同物種還是來自不同物種)的免疫原性組合物或疫苗組合物，或包含來自不同屬的抗原的組合的免疫原性組合物或疫苗組合物。
[0052]在本發(fā)明的情境中，“活性免疫原性組分”包括活減毒病原體例如活減毒病毒、活減毒細菌、真菌或寄生蟲。當(dāng)活免疫原性組分為本發(fā)明的多價活減毒CDV和cPi2免疫原性組合物、懸液或溶液的一部分時，活免疫原性組分可有利地源自除副粘病毒外的病原體。本發(fā)明還涵蓋的是衍生自或來源于本文中描述的一種或多種病原體的重組異源免疫原或抗原，其可被包含及表達在特別是病毒載體、細菌載體、真菌載體和質(zhì)粒載體中。本發(fā)明還包括來源于一種或多種病原體的異源免疫原或抗原的表位、免疫調(diào)節(jié)劑例如細胞因子、治療劑、毒素、抗體、抗體的抗原結(jié)合片段、佐劑，或其它種類例如反義RNA、催化RNA、小干擾RNA
坐坐寸寸ο
[0053]術(shù)語“獸醫(yī)用組合物”意指包含用于獸醫(yī)用途的載體的組合物，所述載體表達治療性蛋白例如紅細胞生成素(EPO)或免疫調(diào)節(jié)性蛋白例如干擾素(IFN)。類似地，術(shù)語“藥物組合物”意指包含用于表達治療性蛋白的載體的任何組合物。
[0054]本發(fā)明的組合物和方法可被適當(dāng)?shù)赜糜谌魏紊飳W(xué)物質(zhì)/試劑或組合生物品物質(zhì)/試劑+藥物/獸醫(yī)用試劑的穩(wěn)定化和玻璃化?！吧锲贰卑ǖ幌抻诿庖哒{(diào)節(jié)劑例如細胞因子、治療劑、毒素、抗體、抗體的抗原結(jié)合片段、佐劑或其它種類例如反義1^、催化RNA、小干擾RNA等等。在玻璃化材料/物質(zhì)重構(gòu)后，這些化合物可作為預(yù)防性免疫來用于預(yù)防疾病，或作為治療性免疫來緩解疾病的癥狀。
[0055]本發(fā)明涵蓋用于活減毒免疫原性組合物的玻璃化的方法，其可包括至少一種穩(wěn)定齊?，例如非還原糖或抗氧化化合物。在一些實施方案中，玻璃化穩(wěn)定劑可任選地包含至少一種非還源寡糖和/或至少一種填充劑(bulking agent)和/或至少一種糖醇。這些穩(wěn)定劑可保持或幫助保持生物學(xué)成分(包括但不限于病毒、細菌、真菌、寄生蟲、蛋白質(zhì)、多肽等)的免疫原性、感染性和活力。本發(fā)明的玻璃化法中使用的穩(wěn)定劑可具有良好的方面，包括例如一致的形狀和顏色，并且對于施用至受試者是安全的。
[0056]“還原性單糖”是能夠貢獻電子、從而能夠在氧化-還原反應(yīng)過程中減少另一種化合物的糖。一般而言，還原性單糖在其`結(jié)構(gòu)中具有醛基或酮基。可用比色測試來鑒定還原性糖，例如Fehling’ s試劑測試，當(dāng)銅離子試劑在還原性糖的存在下被還原成銅金屬時其產(chǎn)生從深藍至紅色的顏色變化。在本發(fā)明中，還原性單糖優(yōu)選包括葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖、山梨糖或其組合。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了至少兩種還原性單糖的組合。還原性單糖在冷凍干燥過程(特別是升華步驟(即，第一和第二干燥步驟))中，對于組合物(特別是蛋白質(zhì)和活減毒病原體)的保護是重要的，其中還原性單糖代替升華的水并且維持生物結(jié)構(gòu)的內(nèi)聚力(cohesion)。
[0057]任選地，糖醇和/或非還原性寡糖可被添加來穩(wěn)定根據(jù)本發(fā)明玻璃化的制劑。本公開包括還原性單糖和糖醇的組合、還原性單糖和非還原性寡糖的組合以及還原性單糖、糖醇和非還原性寡糖的組合。糖醇可以是例如山梨醇、甘露醇、木糖醇或麥芽糖醇。
[0058]本發(fā)明的情境中的“非還原性寡糖”是包含2至10個糖單元并且在氧化還原反應(yīng)中不能還原另一種化合物的糖。在本發(fā)明中，非還原性寡糖可以是非還原性二糖或非還原性三糖，有利地包括海藻糖、蔗糖或棉子糖。本發(fā)明的穩(wěn)定劑還可包括至少兩種非還原性寡糖的混合物。
[0059]“酸性抗氧化劑”化合物被定義為與氧化劑、自由基(即具有未配對電子的分子)或釋放自由基的化學(xué)品反應(yīng)并且中和其的化合物。在本發(fā)明的情境中，抗氧化化合物可以為酸的形式。酸性抗氧化劑包括但不限于抗壞血酸和/或酸性氨基酸例如天冬氨酸和谷氨酸。超過一種酸性抗氧化劑化合物的組合是根據(jù)本公開的方法玻璃化的制劑的適當(dāng)組分。
[0060]填充劑也是根據(jù)本公開的內(nèi)容玻璃化的組合物的適當(dāng)組分。填充劑可以是藥學(xué)上或獸醫(yī)上可接受的聚合物，例如但不限于葡聚糖、麥芽糖糊精、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、交聚維酮和羥乙基淀粉。淀粉衍生物的其它非限制性實例包括微晶纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥乙基甲基纖維素和羥丙基甲基纖維素。填充劑增加生物組合物的T’ g值，從而允許在冷凍過程中使用更高的溫度?！癟’ g值”被定義為玻璃轉(zhuǎn)化溫度，其對應(yīng)于低于其冷凍的組合物變成玻璃態(tài)的溫度。填充劑可幫助提供在本公開的玻璃化團塊中觀察到的良好方面，該團塊具有輕的、蓬松的、棉花糖的一般外觀。
[0061 ] 如果將葡聚糖用作填充劑，其分子量可為約5000Da至約70000Da，優(yōu)選約10，OOODa至約40，OOODa0如果將PVP用作填充劑，其分子量可以為約8，OOODa至約360，OOODa，特別是約 10，OOODa 至約 60，OOODa0
[0062]如果麥芽糖糊精被用作填充劑，其葡萄糖當(dāng)量值(DE，其為淀粉聚合物水解的程度的定量量度)可為約3至約20，優(yōu)選約5至約18，更優(yōu)選約10至約15。如果羥乙基淀粉被用作填充劑，則其分子量可為約70，OOODa至約450，OOODa，優(yōu)選約130，OOODa至約200，OOODa0羥乙基淀粉的取代的程度可以為約0.4至約0.7，特別是約0.4至約0.6。取代的程度被定義為羥乙基的數(shù)目/葡萄糖單元。
[0063]生物學(xué)制劑的一些組分(包括穩(wěn)定劑)可能不是容易溶解的。然而，替代適當(dāng)?shù)念愃平M分(例如通過選擇更加可溶的組分)和/或調(diào)節(jié)穩(wěn)定劑中存在的不可溶組分的量或數(shù)量以獲得可溶的穩(wěn)定劑完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員所及的范圍內(nèi)。組分的溶解度可通過視覺溶解度測試容易地檢測。溶解度測試包括在約55°C的溫度下添加穩(wěn)定劑的所有組分，以及混合約30分鐘的步驟。在室溫下且無任何攪動下進行約24小時后，可就沉淀物的外觀而言視覺檢查穩(wěn)定劑。如果穩(wěn)定劑是透明的或清澈的，則穩(wěn)定劑的所有成分都是可溶的。
[0064]根據(jù)本公開的內(nèi)容玻璃化的生物學(xué)制劑可包含任何數(shù)目的穩(wěn)定劑。表I提供了數(shù)個實例?！捌暇厶恰卑哂?0，OOODa的分子量的葡聚糖-40，000。
[0065]表1:穩(wěn)定劑的組成
[0066]
【權(quán)利要求】
1.一種用于使生物材料玻璃化的方法，包括如下步驟:配制生物液體制劑，將所述制劑在壓力和溫度下經(jīng)歷受控改變，以使所述制劑的水分含量降至按重量計少于約5%，從而使所述生物材料玻璃化。
2.權(quán)利要求1的方法，其還包括下述步驟: (a)向所述液體制劑中添加活性生物品成分、穩(wěn)定劑和任選地添加一種或多種佐劑，所述穩(wěn)定劑減少或消除由使生物品成分經(jīng)受低溫保存手段誘導(dǎo)的損害，所述低溫保存手段包括造粒、玻璃化和冷凍干燥； (b)給小瓶填充步驟(a)的生物制劑； (c)將小瓶加載至溫控容器中，其中溫度為-15°C至10°C，特別是-10°C至5°C，更特別為約5°C ； (d)降低溫控容器的氣壓直至獲得15-30mbar范圍內(nèi)的壓力； (e)維持步驟(4)過程中獲得的壓力5至20分鐘，特別是10至15分鐘，以允許產(chǎn)品的溫度穩(wěn)定并且允許揮發(fā)性氣體包括碳酸鹽類從所述生物制劑釋放，其中容器溫度在該步驟中保持在約4°C至約6°C，或約5°C ； (f)將容器氣壓降至約4至約7mbar或約5mbar,進行約5至約20分鐘； (g)保持步驟出)的壓力約30至約60分鐘，這允許生物制劑變得更為濃縮； (h)在45至85分鐘、或約60分鐘的過程中將容器的溫度從負溫度升高至正溫度(約30°C至約50°C )，并保持壓力恒定直至達到約10°C至約20°C或約15°C ； (i)將容器氣壓降至約1.5至約4mbar，或約3mbar，以加速濃縮，并且直至容器溫度達到約30°C，并且維持在約30°C約30分鐘至約90分鐘，或60分鐘； (j)進一步將壓力降至約0.5至約4.0mbar,或約lmbar，并且維持恒定壓力直至發(fā)泡完成； (k)將壓力進一步降至約5 μ bar至約100 μ bar,或約25 μ bar,同時將溫度維持在約30°C，進行約400至約2400或更多分鐘，直至獲得約0.5%至約15%，或約1%至約4%的所需水份； (I)在冷凍干燥器容器中時給小瓶塞塞子，從而完成玻璃化法。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述活性生物品是免疫原、多肽、核苷酸、活病毒、活細菌、活原生生物或來源于引起疾病或病癥的病原體的亞單位。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述活性生物品是活減毒病毒。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述病毒是犬瘟熱病毒(CDV)、犬副流感病毒2型(PI2)或其組合。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述減毒病毒是金絲雀痘、馬立克氏病病毒、傳染性法氏囊病病毒、西尼羅病毒(WNV)或貓白血病病毒(FeLV)。
7.權(quán)利要求3的方法，其中所述細菌是禽桿菌。
8.前述權(quán)利要求的任一項的方法，其中所述制劑包含至少一種佐劑。
9.前述權(quán)利要求的任一項的方法，其中所述玻璃化生物材料在4°C穩(wěn)定至少I年。
10.前述權(quán)利要求的任一項的方法，其中所述玻璃化生物材料在_20°C和_80°C穩(wěn)定至少I年。
11.一種組合物，其包含使用前述權(quán)利要求的任一項的方法產(chǎn)生的玻璃化生物材料。
【文檔編號】A61K9/19GK103841963SQ201280046735
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月12日
【發(fā)明者】N·Y·H·J·熱南 申請人:梅里亞有限公司