從藻類中生產(chǎn)4-氨基丁酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)4-氨基丁酸-也稱作γ-氨基丁酸-簡稱GABA的方法，涉及一種生產(chǎn)包含4-氨基丁酸的提取物的方法，涉及包含4-氨基丁酸的化妝品配制品的制備方法，及涉及Cyanidium?caldarium細胞或細胞成分在化妝品中的應用。
【專利說明】從藻類中生產(chǎn)4-氨基丁酸的方法
發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)4-氨基丁酸-也稱作Y -氨基丁酸-簡稱GABA的方法，涉及一種生產(chǎn)包含4-氨基丁酸的提取物的方法，涉及包含4-氨基丁酸的化妝品配制品的制備方法，及涉及Cyanidium caldarium細胞或細胞成分在化妝品中的應用。
現(xiàn)有技術
[0002]GABA對皮膚的積極作用首先由Ito等在Biochim BiophysActa.2007Feb; 1770 (2): 291-6中描述，其證實GAD67在人皮膚成纖維細胞中表達，而此前GAD67僅被描述為定位于神經(jīng)兀并且催化GABA合成。
[0003]已經(jīng)證實GABA能上調(diào)成纖維細胞中的透明質(zhì)酸合成，并且GAD67對膠原蛋白合成具有積極作用。
[0004]包含GABA(INC1:氨基丁酸)的化妝品見于裝飾性化妝品、除臭劑、濕巾、皮膚護理和淋浴用品。在此，GABA被描述為是皮膚中恒定的物質(zhì)，具有松弛肌肉活性、提亮皮膚活性、保濕活性，并且是對膠原蛋白和Matrikin合成具有刺激活性的物質(zhì)。應用領域是例如抗衰老、抗皺、緊致和平滑唇線、減少表情紋，減少細紋和魚尾紋的應用。使用的GABA的來源是植物的微生物發(fā)酵。在此，例如將水稻胚芽在37°C發(fā)酵幾年。
[0005]迄今為止，已經(jīng)描述的GABA的合成幾乎毫無例外地僅在高等生物體中發(fā)生。
[0006]在藻類中，迄今為止僅僅是由Morse and Morse在Hydrobiologia, 116-117(1): 155-158 描述了在例如 Porphyra 中的 GABA 模擬物。
[0007]本發(fā)明的一個目的是提供一種包含GABA的化妝品配制品，其中所述GABA的來源基于可易于培養(yǎng)的快速生長的微生物。
[0008]發(fā)明描述
[0009]令人驚奇地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)藻類Cyanidium caldarium包含大量GABA,其可出色地用于產(chǎn)生GABA以及用于生產(chǎn)化妝品。
[0010]特別驚奇的是因為先前被認為不可能發(fā)現(xiàn)能合成GABA的藻類。
[0011]本發(fā)明的目的因此是使用Cyanidium caldarium細胞生產(chǎn)GABA及生產(chǎn)含有GABA的化妝品的方法。
[0012]本發(fā)明另一目的是通過所述方法可獲得的化妝品,及Cyanidium caldarium細胞或細胞成分在化妝品配制品中的應用。
[0013]本發(fā)明的一個優(yōu)勢是由于使用可再生原材料的可持續(xù)性。
[0014]另一優(yōu)勢是由于Cyanidium caldarium細胞可易于加工的事實而便于提供GABA。
[0015]本發(fā)明的再一優(yōu)勢是Cyanidium caldarium細胞不包含干擾化妝品的任何二級成分。
[0016]本發(fā)明的另一優(yōu)勢是Cyanidium caldarium細胞包含對化妝品有利的進一步的二級成分，例如營養(yǎng)素、礦物質(zhì)、非必需氨基酸和必需氨基酸、鳥氨酸和多酚。
[0017] 本發(fā)明的再一優(yōu)勢是本發(fā)明的化妝品能上調(diào)細胞外基質(zhì)的標記基因。[0018]特別是，彈性纖維的最重要結構成分原纖維蛋白和彈性蛋白，以均一的方式被有利地上調(diào)。
[0019]再一優(yōu)勢是本發(fā)明的化妝品具有抗氧化活性及對皮膚有營養(yǎng)作用。
[0020]另一優(yōu)勢是本發(fā)明的化妝品證實對各種皮膚類型、特別是對衰老皮膚有效，并且具有抗炎和舒緩皮膚的活性。
[0021]本發(fā)明的目的因此是生產(chǎn)4-氨基丁酸的方法，包括如下步驟:
[0022]A)在水性培養(yǎng)基中培養(yǎng)Cyanidium caldarium細胞，
[0023]B)如果需要，破壞 Cyanidium caldarium 細胞，
[0024]C)除去固體細胞成分以獲得提取物，及如果需要，
[0025]D)進一步純化4-氨基丁酸。
[0026]在本發(fā)明中，用語“Cyanidium caldarium”應理解為是指在Cyanidiaceae科中分類為 Cyanidium caldarium (Ti lden) Geitler 的藻類。
[0027]用語“水性 ”應理解為是指水含量基于總組合物重量為至少50%，在本發(fā)明中“水性”特別用于描述培養(yǎng)基。
[0028]用語“破壞細胞”應理解為是指破壞細胞膜，特別是外部細胞膜。
[0029]用語“提取物”應理解為是指各種成分的液體混合組合物，其可以是分離自Cyanidium caldarium細胞的這些混合組合物。
[0030]用語“細胞成分”應理解為是指各種成分的混合組合物，其可分離自Cyanidiumcaldarium 細胞。
[0031]除非特別指出，則所有標示的百分比(%)均是重量百分比。
[0032]本發(fā)明優(yōu)選的Cyanidium caldarium細胞是株系SAG16.91的細胞。
[0033]根據(jù)本發(fā)明,優(yōu)選Cyanidium caldarium細胞在步驟A)中在升高的溫度下培養(yǎng)，因此優(yōu)選的溫度范圍是20°C _60°C，特別是35°C _45°C。優(yōu)選在升高溫度下培養(yǎng)是在7-192天期間進行，特別是28-56天。這樣使得可以提供這樣的提取物或化妝品，其除了 GABA之外還包含多胺，如精胺、亞精胺和去甲精胺。
[0034]步驟A)中的水性培養(yǎng)基優(yōu)選在25°C的pH為1.5_6，優(yōu)選2_3。
[0035]在步驟B)中，破壞細胞可以通過超聲處理藻類培養(yǎng)物的懸浮液，通過應用滲透壓休克，通過高壓均質(zhì)化(例如French press,Manton-Gaulin均質(zhì)器)，通過熱水提取,通過應用高剪切力(例如Ultra-Turrax, Potter-Elvehjem方法)，通過在攪拌式球磨機中濕磨，通過減壓(letting down)，借助于酶例如多糖酶如葡聚糖酶、半纖維素酶、纖維素酶或者商購的酶如SP-311 (novo)，或者通過這些上述方法的任意希望的組合方式進行。
[0036]在步驟B)中，細胞優(yōu)選在水性培養(yǎng)基中被破壞，以更好地獲得水性提取物。特別優(yōu)選步驟B)的水性培養(yǎng)基相應于步驟A)中的培養(yǎng)基，特別是采取相同培養(yǎng)基形式。
[0037]在步驟B)中特別優(yōu)選通過熱水組合酶促細胞破壞進行細胞破壞。
[0038]在步驟C)中除去固體細胞成分可以例如通過離心、沉降或者過濾進行。
[0039]GABA 的進一步純化可例如 Carmona et al., Acta Pharmacol Toxicol(Copenh).1980Mar; 46 (3): 235-40 所述進行。
[0040]本發(fā)明另一目的是提供生產(chǎn)包含4-氨基丁酸的提取物的方法，包括如下步驟:
[0041]A)在水性培養(yǎng)基中培養(yǎng)Cyanidium caldarium細胞，[0042]B)如果需要，破壞 Cyanidium caldarium 細胞，
[0043]C)除去固體細胞成分以獲得提取物，
[0044]步驟A)_C)相應于本發(fā)明第一個提及的方法及相應優(yōu)選的實施方案也類似地是優(yōu)選的。
[0045]優(yōu)選地，本發(fā)明的生產(chǎn)提取物的方法由步驟A)、B)和C)組成。
[0046]因此，通過上述方法可獲得的提取物也是本發(fā)明的一部分。
[0047]所述提取物優(yōu)選是水性提取物。
[0048]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的提取物特征在于其包含另外的成分-多胺，如精胺、亞精胺和去甲精胺。[0049]由于所述提取物可有利地用于制備化妝品配制品，因此優(yōu)選提供具有防腐劑的提取物。在這方面，優(yōu)選的防腐劑選自安息香酸鹽和山梨酸鹽。
[0050]本發(fā)明優(yōu)選的一種提取物特征在于其包含0.01%-10%重量、優(yōu)選0.5%-5%及特別優(yōu)選1%_3%重量的Cyanidium caldarium細胞成分干物質(zhì),其中重量百分比是基于總提取
物重量。
[0051]本發(fā)明優(yōu)選的一種提取物特征在于其包含0.01%-7%重量、優(yōu)選0.25%-3%重量及特別優(yōu)選0.5%-1.5%重量的防腐劑，其中重量百分比是基于總提取物重量。
[0052]本發(fā)明另一目的是提供一種制備包含4-氨基丁酸的化妝品配制品的方法，包括如下步驟:
[0053]A)在水性培養(yǎng)基中培養(yǎng)Cyanidium caldarium細胞，
[0054]B)如果需要，破壞 Cyanidium caldarium 細胞，
[0055]C)除去固體細胞成分以獲得提取物，及
[0056]E)將來自步驟B)的破壞的Cyanidium caldarium細胞和/或來自步驟C)的提取物摻入化妝品配制品中，
[0057]步驟A)_C)相應于本發(fā)明第一個提及的方法，且相應優(yōu)選的實施方案也類似地是優(yōu)選的。優(yōu)選地，本發(fā)明的制備化妝品配制品的方法由步驟A)、B)、C)和E)組成。
[0058]優(yōu)選地，僅將步驟C)的提取物摻入步驟E)中。
[0059]本發(fā)明的再一目的是提供包含可通過本發(fā)明方法獲得的GABA的化妝品配制品，包含GABA及Cyanidium caldarium細胞和/或細胞成分的化妝品配制品，以及包含本發(fā)明的提取物的化妝品配制品。
[0060]本發(fā)明的配制品可可以是任何化妝品配制品形式，特別是皮膚配制品、指甲配制品和毛發(fā)配制品，特別優(yōu)選皮膚配制品。
[0061]Cyanidium caldarium細胞和/或細胞成分的特征性質(zhì)如在皮膚和/或毛發(fā)之上和之內(nèi)形成殘余物的適度傾向具有對皮膚和/或毛發(fā)的結構的促進作用，因此增強，特別是增強毛發(fā)的穩(wěn)定性、抗性、色度和強度，特別是抗張強度。
[0062]本發(fā)明的毛發(fā)配制品不限于免洗(leave-on)應用(護發(fā)素，毛發(fā)護理)。本發(fā)明的毛發(fā)配制品也有利地是漂洗產(chǎn)品形式(例如香波，皮膚清潔產(chǎn)品)。
[0063]適用于皮膚及根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的配制品特別包含:須后乳液，男人護膚品，防曬霜，曬后修復產(chǎn)品，護唇產(chǎn)品，抗皺護理產(chǎn)品，增強皮膚屏障的產(chǎn)品，抗衰老產(chǎn)品，頸部去皺產(chǎn)品，抗皮下脂肪團產(chǎn)品，塑形產(chǎn)品，保濕產(chǎn)品，防止有害環(huán)境影響的產(chǎn)品，皮膚舒緩產(chǎn)品和降低皮膚刺激產(chǎn)品。
[0064]本發(fā)明的配制品可以如乳液、懸浮液、溶液、乳霜、軟膏、膏劑、凝膠、油劑、粉末、噴霧劑、條狀物(stick)、噴霧或泡沫形式應用。
[0065]本發(fā)明的化妝品配制品可包含例如選自如下一組的至少一種其它成分:
[0066]潤膚劑，
[0067]乳化劑，
[0068]增稠劑/粘性調(diào)節(jié)劑/穩(wěn)定劑，
[0069]抗氧化劑，
[0070]增溶劑(或者多元醇)，
[0071]固體和充填劑，
[0072]珠光光澤彩料添加劑，
[0073]除臭劑和止汗活性物質(zhì)
[0074]驅(qū)蟲劑，
[0075]自曬黑劑(self-tanningagents),
[0076]防腐劑，
[0077]柔順劑，
[0078]香料，
[0079]著色劑，
[0080]化妝活性物質(zhì)，
[0081]護理添加劑，
[0082]超脂劑(superfattingagents),
[0083]溶劑，
[0084]UV 防護劑(filter)。
[0085]可被采用為各種代表性物質(zhì)為本領域技術人員已知，可見例如德國專利申請DE102008001788.4中所述。這個專利申請并入本文并因此組成本發(fā)明的一部分。
[0086] 關于應用這些成分中的進一步的任意成分和量，可以參考本領域技術人員已知的專業(yè)手冊，例如 K.Schrader, 〃Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika〃，2ndEdition,page329to341, Hiithig Buch Verlag Heidelberg。
[0087]各添加劑的量根據(jù)具體應用確定。
[0088]針對各種應用的典型構架配方本領域已知，可例如見于各個賦形劑和活性物質(zhì)的廠商的指導手冊。因此，可以使用這些現(xiàn)有的配制品而不用修改。然而，如果需要，可以無問題的方式進行希望的修改，通過簡便的實驗以調(diào)整及優(yōu)化配制品。
[0089]根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的化妝品配制品特征在于其包含另外的成分-多胺，例如精胺、亞精胺和去甲精胺和/或防腐劑。在這方面，優(yōu)選的防腐劑選自安息香酸鹽和山梨酸鹽。
[0090]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選化妝品配制品特征在于其包含0.00125-1.5%重量、優(yōu)選0.0025-0.625% 重量及特別優(yōu)選 0.0125-0.0625% 重量的 Cyanidium caldarium細胞和 / 或細胞成分干物質(zhì)，其中重量百分比是針對總配制品重量的百分比。
[0091]本發(fā)明的化妝品配制品具有高抗炎活性，因此本發(fā)明的另一目的是抗炎癥的化妝品配制品，特別是對抗皮膚炎癥如痤瘡。[0092]本發(fā)明的再一目的是Cyanidium caldarium細胞或細胞成分及根據(jù)本發(fā)明的提取物在化妝品配制品中的應用。
[0093]本發(fā)明的化妝品配制品證實了對于非常廣泛的皮膚類型、特別是衰老皮膚(年齡相關的衰老皮膚，光老化皮膚，松垂的皮膚，松弛的皮膚)的效力。
[0094]本發(fā)明的化妝品配制品通常導致改良的皮膚結構，從而本發(fā)明的化妝品配制品可有效作為通用的抗衰老活性物質(zhì)。特別地，本發(fā)明的化妝品配制品可用于塑形治療，例如對下頜、胸部、臀部和腹部塑形。
[0095]本發(fā)明的化妝品配制品的另一積極作用包括降低皮膚粗糙性，減少皮膚鱗屑，減輕皺紋深度，及增加皮膚彈性、皮膚緊實性和皮膚厚度。
[0096]本發(fā)明的化妝品配制品在皮膚上的局部應用導致受刺激的、發(fā)癢的、發(fā)紅和發(fā)炎的皮膚跡象減輕。這樣使得本發(fā)明的化妝品配制品特別適于鎮(zhèn)靜發(fā)癢的皮膚、敏感性皮膚的化妝品。本發(fā)明的化妝品配制品的抗炎和舒緩皮膚的活性也有利地用于舒緩皮膚的須后乳液。
[0097]本發(fā)明的化妝品配制品具有保護活性，免于有害的內(nèi)部和外部因素(環(huán)境的不利影響)的侵犯，從而可以防止對細胞大分子及表皮脂質(zhì)屏障的破壞。
[0098]本發(fā)明化妝品配制品的舒緩皮膚的活性也可以在發(fā)紅的皮膚上觀測到，發(fā)紅的皮膚示出由于日光照射引起的曬傷或紅斑癥狀。在這方面，本發(fā)明的化妝品配制品也可以用作防曬及曬后修復的活性物質(zhì)。
[0099]此外，本發(fā)明的化妝品配制品適于皮膚的護理和防護，特別是其表皮屏障功能由于某些皮膚疾病的結果而被降低及因此的經(jīng)皮水丟失增加和/或其皮膚水合作用降低的皮膚。這種皮膚疾病包括干燥癥、特應性皮炎、接觸性皮炎、銀屑病、魚鱗癬、棘皮癥、頭屑、光照性皮炎、紅斑，及角化損害和/或缺失。本發(fā)明的化妝品配制品也適用于皮膚以減輕某些作用，如干燥、發(fā)癢和脫屑皮膚，例如由于自身免疫疾病引起(例如銀屑病)。
[0100]在下文提及的實施例中，本發(fā)明通過實施例形式描述；然而，所述實施例不限制本發(fā)明范圍于實施例中提及的實施方案，其范圍從所有描述和權利要求書中可見。
[0101]下圖是實施例的一部分。
[0102]圖1:在應用 IOOppm (=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium 提取物(基于提取物干重的濃度)或者純培養(yǎng)基(運載體)之后24小時，相對于GAPDH基因表達的COLlAl基因在人皮膚成纖維細胞中的表達。
[0103]圖2:在應用純培養(yǎng)基(運載體)、TGF-β (10ng/ml,陽性對照)或者IOOppm (=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium提取物(基于提取物干重的濃度)之后24小時，相對于GAPDH基因表達的各個基因在人皮膚成纖維細胞中的表達。
[0104]圖3:在應用純培養(yǎng)基(運載體)、IOOppm (=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium 提取物(基于提取物干重的濃度)或者TGF-β (10ng/ml,陽性對照)之后24小時，相對于總細胞蛋白質(zhì)含量的彈性蛋白在人皮膚成纖維細胞中的含量。
[0105]圖4:在應用純培養(yǎng)基(運載體)、IOOppm (=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium 提取物(基于提取物干重的濃度)或者TGF-β (10ng/ml,陽性對照)之后24小時，相對于總細胞蛋白質(zhì)含量的基膜聚糖(Lumican)蛋白在人皮膚成纖維細胞中的含量。[0106]圖5:在應用純培養(yǎng)基(運載體)或者 IOOppm(=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium提取物(基于提取物干重的濃度)之后24小時，相對于總細胞蛋白質(zhì)含量的前膠原蛋白在人皮膚成纖維細胞中的含量。
[0107]圖6:在UVA照射及在應用 750ρρηι(=750μ g/ml) Cyanidium caldarium提取物(基于提取物干重的濃度)或者水(運載體)之后24小時，相對于GAPDH基因表達的ILl-α在SkinEthic皮膚模型中的基因表達。
[0108]圖7:在 UVA 照射及在應用 750ppm (=750 μ g/ml) Cyanidium caldarium提取物(基于提取物干重的濃度)或者水(運載體)之后24小時，相對于GAPDH基因表達的TNF- α在SkinEthic皮膚模型中的基因表達。
[0109]圖8:在UVA照射及在應用 750ρρηι(=750μ g/ml) Cyanidium caldarium提取物(基于提取物干重的濃度)或者水(運載體)之后24小時，相對于GAPDH基因表達的NF- κ B在SkinEthic皮膚模型中的基因表達。[0110]圖9:在UVA照射及在應用 750ρρηι(=750μ g/ml) Cyanidium caldarium提取物(基于提取物干重的濃度)或者水(運載體)之后24小時，相對于總細胞蛋白質(zhì)含量的白細胞介素l-α蛋白在SkinEthic皮膚模型中的含量。
[0111]圖10:Cyanidium caldarium提取物對于表皮祖細胞的集落形成的作用。在應用IOOppm (=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium提取物(基于提取物干重的濃度)或者純培養(yǎng)基(運載體)之后的CFE。
[0112]圖11:在應用 IOOppm (=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium 提取物(基于提取物干
重的濃度)或者純培養(yǎng)基(運載體)之后，相對于B2M基因表達的各個基因在表皮祖細胞中的基因表達。
[0113]圖12:在用免洗(leave-on)護發(fā)素處理毛發(fā)之前和之后參數(shù)E模塊的平均值。
[0114]圖13:皮膚彈性參數(shù)R1。在用1%和5%Cyanidium caldarium提取物處理之后8周基于運載體配制品的相對改變。
[0115]圖14:皮膚彈性參數(shù)R4。在用1%和5%Cyanidium caldarium提取物處理之后8周基于運載體配制品的相對改變。
[0116]圖15:皮膚結構參數(shù)。在用1%和5%Cyanidium caldarium提取物處理之后8周基于運載體配制品的相對改變。
[0117]圖16:皮膚表面和體積參數(shù)。在用1%和5%Cyanidium caldarium提取物處理之后8周基于運載體配制品的相對改變。
實施例
[0118]實施例1:培養(yǎng) Cyanidium caldarium
[0119]如DE4411486、DE29607285、TO9105849、W02010/149154 或者 DE102009028474A1 (W02011/018082A2)詳細描述，在密閉的光生物反應器中進行制備性Cyanidium caldarium生物量生產(chǎn)以獲得提取物。調(diào)整培養(yǎng)方法以適合紅藻Cyanidium caldarium(SAG16.91)的特定生長條件。通過選擇合適的泵結構使剪切力最小化，在培養(yǎng)期間通過可變的光照設計方案調(diào)試持續(xù)光照，從50至2000 μ ΕΦπι?并將pH調(diào)節(jié)為〈3，使得實現(xiàn)較高的生長速度及較高的可再生生物量質(zhì)量。
[0120]使用的培養(yǎng)基由如下成分組成(/L蒸餾水):[0121]4.5g (NH4)2SO4,0.6g MgS04x7H20,0.6g KH2PO4,0.03g CaCl2x2H20, 0.01g FeSO4,0.018g 乙二胺四乙酸二鈉二水合物，0.005g H3BO3,0.004MnCl2，0.00068g ZnS04x7H20,0.00052g Na2Mo04x2H20，0.00008g CuS04x5H20,0.00008g NaV03x4H20,0.00064g CoC12x6H20。培養(yǎng)基的pH通過加入IN H2SO4和/或通過調(diào)整CO2濃度而保持在pH2-3。
[0122]對于預培養(yǎng)，在5L Erlenmeyer培養(yǎng)瓶中充填IL培養(yǎng)基，并用Cyanidiumcaldarium(SAG16.91)原種培養(yǎng)物接種。將該培養(yǎng)物在30°C在熒光管下以140 μ E*m_2s_1輕輕搖動保溫。通過在550nm吸光度監(jiān)測該藻類培養(yǎng)物的生長狀況。一旦生長達到指數(shù)生長期(0D1.0)，通過在5000rpm離心10分鐘收獲細胞，用蒸餾水洗滌細胞沉淀。將凈生物量貯存在_20°C直至進一步使用。
[0123]實施例2:Cyanidium caldarium 的水性提取
[0124]如在DE10136645(EP 1277831)或W09105849中所述從光生物反應器中進行收獲。
[0125]使用超聲破壞微藻類細胞的方法已經(jīng)描述并可再現(xiàn)，參見例如US2009069213的實施例3及US2008299147的實施例3所述。不溶的成分通過用200 μ m袋式過濾器過濾而分離。在水性提取物中加入1.0%的Rokonsal BS以防腐。通過Sartorius MA30濕度分析儀確定的水性Cyanidium caldarium提取物的干物質(zhì)重(105°C )為2.5%。
[0126]實施例3:檢測 Cyanidium caldarium 中 GABA
[0127]通過高效液相層析(HPLC)及隨后的鄰苯二甲醛(OPA)衍生化檢測GABA。所述 HPLC 儀器由 Jasco PU2080Plus 泵、JascoAS2055Plus 自動取樣器、JascoFP-2020Plus 突光檢測儀和 Jasco ChromPassl.8.6.1integrator(Jasco GermanyGmbH, Gross-Umstadt, Germany)組成。使用的固定相是 Zorbax Eclipse XDB-C18,4.6 X 150mm, 3.5 μ m 柱(Agilent Technologies, Inc.),溫度為 40。。。如下梯度用作流動相(A:2%乙腈，2%四氫呋喃，96%50mM磷酸，用NaOH將pH調(diào)節(jié)為pH7.5) ；B:65%乙腈，35%水):0-2分鐘20%B恒定，2-8分鐘20-40%B線性，8_11分鐘40_100%B線性，11-38分鐘100%B恒定。流速為1.5ml/分鐘。注射5 μ L的分析物及15 μ L的OPA試劑(ImL鄰苯二醛試劑，Solution Complete, Sigma-Aldrich P0532 及 0.5 μ L 疏基乙醇)。吸收波長為 340nm,發(fā)射波長為455nm。使用的內(nèi)部標準是1，6-二氨基己烷。分析物是通過用水將Iml的水性Cyanidium caldarium提取物稀釋為100mL而制備。
[0128]Cyanidium caldarium提取物中GABA的典型值為0.090%。這個值相應于基于Cyanidium caldarium 干物質(zhì)的 3.3% 的 GABA。
[0129]實施例4:通過基因芯片研究Cyanidium caldarium提取物在人皮膚成纖維細胞上的基因表達分析
[0130]方法:
[0131]在本實施例中,研究了 Cyanidium caldarium提取物對成纖維細胞(正常人皮膚成纖維細胞，NHDF)中基因表達的作用。
[0132]為此，將原代人皮膚成纖維細胞(衍生自新生兒皮膚的人皮膚成纖維細胞(HDF)，
低溫保存， Lifeline Cell Technology,得自 CeIISystems^ Biotechnologie Vertrieb
GmbH, St.Katharinenj Germany)首先在最低必需培養(yǎng)基(MEM)中在37i5C和條件下生長，所述培養(yǎng)基中補加了 Earle’s 鹽(EMEM) (PAA Laboratories GmbH, Paschingj Austria)并且加入了 10%胎牛血清(FBS-胎牛血清(InvitiOgen Ltd, UK)、1%非必需氨基酸(NEAA (IOOx)-非必需氨基酸，PAA, Pasching, Austria)、1%L-谷氨酸胺(IOOx) (InvitrogenLtd, UK)和1%青霉素/鏈霉素(5000U/ml青霉素和5000 μ g/ml鏈霉素，InvitrogenLtd，UK)。對于基因表達研究，將細胞接種在6-孔平板中并生長至亞鋪滿(最大60%)。
[0133]之后，從細胞中抽出培養(yǎng)基,用具有Cyanidium caldarium提取物的新鮮培養(yǎng)基置換。培養(yǎng)基中Cyanidium caldarium提取物的終濃度為IOOppm(=100 μ g/ml,基于Cyanidium caldarium提取物干物質(zhì)重)。作為對照,將培養(yǎng)物在無活性物質(zhì)的僅具有培養(yǎng)基(運載體)的條件下生長。所有培養(yǎng)均一式三份進行(3個生物學復制樣品)。
[0134]在細胞已經(jīng)培養(yǎng)24小時后，抽出培養(yǎng)基，通過加入RNeasy裂解緩沖液(Qiagen, Hilden, Germany)使細胞裂解。根據(jù)廠商指導分離總RNA。簡而言之,利用RNeasyMini試劑盒(Qiagen, Hilden, Germany)分離總RNA。所述RNA質(zhì)量通過Agilent2100生物分析儀和Agilent RNA6000Nano試劑盒(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA)確定。集合三個生物學復制樣品，集合的樣品的濃度通過在260/280nm的光度測量確定。
[0135]基因表達通過利用Affymetrix GeneChip表達分析包括標準數(shù)據(jù)評估，根據(jù)廠商指導進行分析(Human Genel.0ST Array, Expression ConsoleSoftware, AFFYMETRIX, INC.，Santa Clara, CA, USA)。
[0136]結果示于表1。
[0137]表1:在應用 IOOppm (=100 μ g/ml) Cyanidium caldarium 提取物(基于提取物干
物質(zhì)重的濃度)之后24小時在人皮膚成纖維細胞中至少2倍上調(diào)或下調(diào)的基因概述
[0138]
【權利要求】
1.生產(chǎn)4-氨基丁酸的方法，包括如下步驟: A)在水性培養(yǎng)基中培養(yǎng)Cyanidiumcaldarium細胞， B)如果需要,破壞Cyanidiumcaldarium細胞， C)除去固體細胞成分以獲得提取物，及如果需要， D)進一步純化所述4-氨基丁酸。
2.生產(chǎn)包含4-氨基丁酸的提取物的方法，包括如下步驟: A)在水性培養(yǎng)基中培養(yǎng)Cyanidiumcaldarium細胞， B)如果需要,破壞Cyanidiumcaldarium細胞， C)除去固體細胞成分，以獲得提取物。
3.制備包含4-氨基丁酸的化妝品配制品的方法，包括如下步驟: A)在水性培養(yǎng)基中培養(yǎng)Cyanidiumcaldarium細胞， B)如果需要,破壞Cyanidiumcaldarium細胞， C)除去固體細胞成分，以獲得提取物，及 E)將破壞的Cyanidiumcaldarium細胞和/或提取物摻入化妝品配制品中。
4.前述權利要求中至少一項的方法，特征在于步驟C)中的提取物是水性提取物。
5.前述權利要求中至少一項的方法,特征在于步驟A)中的Cyanidiumcaldarium細胞在升高的溫度下培養(yǎng)。
6.前述權利要求中至少一項的方法，特征在于步驟A)中的水性培養(yǎng)基在25°C的pH為1.5-6ο
7.前述權利要求中至少一項的方法，特征在于步驟B)中的細胞破壞是在水性培養(yǎng)基中進行的。
8.前述權利要求中至少一項的方法，特征在于步驟B)中的細胞破壞是熱水破壞組合酶促細胞破壞。
9.前述權利要求中至少一項的方法，特征在于在步驟C)中除去固體細胞成分是通過離心、沉降或過濾方法進行的。
10.通過權利要求2及4-9中至少一項的方法可獲得的提取物，特別是水性提取物。
11.權利要求10的提取物，特征在于其包含0.01%-10%重量的Cyanidium caldarium細胞成分干物質(zhì)，及如果需要則包含0.01%-7%重量的防腐劑。
12.包含GABA的化妝品配制品， 其可通過權利要求3-9的至少一項的方法獲得， 其包含權利要求10或11的提取物，或者 其包含 Cyanidium caldarium 細胞和 / 或 Cyanidium caldarium 細胞成分。
13.權利要求12的化妝品配制品，其具有抗炎作用。
14.Cyanidium caldarium細胞或Cyanidium caldarium細胞成分或者權利要求10或11的提取物在制備化妝品配制品中的應用。
15.Cyanidium caldarium細胞或Cyanidium caldarium細胞成分或者權利要求10或11的提取物在用于敏感性、干性、發(fā)癢和/或脫屑皮膚的化妝品配制品中的化妝應用。
16.Cyanidium caldarium細胞或Cyanidium caldarium細胞成分或者權利要求10或11的提取物在減輕皮膚粗糙、 減少皮膚鱗屑、減少深皺紋及增強皮膚彈性、皮膚緊實性及皮膚厚度的化妝品配制品中的化妝應用。
17.Cyanidium caldarium細胞或Cyanidium caldarium細胞成分或者權利要求10或11的提取物在用于對下頜、胸部、臀部和腹部的修型化妝處理的化妝品配制品中的化妝應用。
18.Cyanidium caldarium細胞或Cyanidium caldarium細胞成分或者權利要求10或11的提取物在用于增加毛發(fā)穩(wěn)定性、強度、色度和抗性的化妝品配制品中的化妝應用。
19.Cyanidium caldarium細胞或Cyanidium caldarium細胞成分或者權利要求10或11的提取物在 用于維持皮膚干細胞功能的化妝品配制品中的化妝應用。
【文檔編號】A61K8/97GK103930560SQ201280040256
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2012年7月20日 優(yōu)先權日:2011年8月18日
【發(fā)明者】T·克勒, J·席爾德, M·門特爾, P·萊爾施, M·法爾維克, C·魏特邁爾 申請人:贏創(chuàng)德固賽有限公司