對具有改變的血管屏障功能的病癥的治療的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供使用RASIP1激動(dòng)劑和拮抗劑調(diào)整血管屏障功能并且調(diào)節(jié)新血管形成以及治療相關(guān)病癥的方法。
【專利說明】對具有改變的血管屏障功能的病癥的治療
[0001]相關(guān)申請
[0002]本申請要求2011年3月10提交的美國臨時(shí)申請系列號61/451，540的權(quán)益，上述臨時(shí)申請通過引用完全并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0003]本發(fā)明一般涉及可用于治療與改變的血管屏障功能相關(guān)的病況和病癥的組合物和方法。具體地，本發(fā)明涉及Ras-相互作用蛋白I(Rasipl)的調(diào)節(jié)劑和它們的使用方法。
[0004]發(fā)明背景
[0005]在鼠胚胎中，循環(huán)的發(fā)生(Ji等，Circ.Res.(循環(huán)研究)92:133-35，(2003))與諸如背主動(dòng)脈的主血管的活性生長同時(shí)發(fā)生(Walls等，PLoS 0ne3:e2853, (2008) ; Strilic等，Dev.Cell (細(xì)胞發(fā)育)17:505-15，(2009))。隨后，活躍的循環(huán)保證通過血管發(fā)生、血管形成和重塑的快速血管擴(kuò)張過程(涉及大量細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞間的位置交換的動(dòng)態(tài)過程)(Carmel iet, Nat.Med.(自然醫(yī)學(xué))6:389-95，(2000) ; Coultas 等，Nature(自然)438:937-45, (2005) ; Jakobsson 等，Nat.Cell.Biol.(自然細(xì)胞生物學(xué))12:943-53, (2010))。這些同時(shí)發(fā)生的事件形成對發(fā)育中的脈管系統(tǒng)的特有的挑戰(zhàn):新生內(nèi)皮的細(xì)胞-細(xì)胞連接必須足夠穩(wěn)定以允許腔形成、循環(huán)并且經(jīng)受增加的剪切力，但是要足夠柔韌以允許在動(dòng)態(tài)生長和重塑過程中的細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。另外，由于增加的通透性有助于包括出血、水腫、缺血性卒中、炎癥和膿毒癥的病理狀況，因此緊密調(diào)節(jié)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞連接的血管的通透性(Dejana等，Dev.Cell (細(xì)胞發(fā)育)16:209-21，(2009) ; Spindler等，Cardiovascular Research (心血管研究)87:243-53，(2010))。盡管已經(jīng)表明內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞緊密和粘附連接的關(guān)鍵成分決定性地影響血管發(fā)育和腔穩(wěn)定(Dejana，Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.(自然分子細(xì)胞生物學(xué)綜述)5:261-70，(2004) ; Crosby 等，Blood (血液)105:2771-76 (2005) ;Dejana等(2009;同上))，但是關(guān)于在發(fā)育中調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞-細(xì)胞連接的分子系綜還有許多需要了解。
[0006]表皮和內(nèi)皮細(xì)胞中的細(xì)胞-細(xì)胞連接形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑是小G蛋白Rapl (Kooistra 等，J.Cell Science (細(xì)胞科學(xué)雜志)120:17-22，(2007))。在多種情形中，在細(xì)胞膜處的蛋白激酶A(PKA)的激活促使環(huán)AMP(cAMP)形成，環(huán)AMP與鳥嘌呤交換因子(GEF)Epacl結(jié)合并且在Rapl上引發(fā)⑶P與GTP的交換，這激活該蛋白并且引發(fā)分子相互作用的級聯(lián)，導(dǎo)致穩(wěn)定化和皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白與粘附蛋白和緊密連接復(fù)合物的連接(Kooistra 等，F(xiàn)EBS Letters579:4966-72，(2005))。Rapl 活性的調(diào)整影響內(nèi)皮屏障功能(Spindler等(2010;同上))。在這一網(wǎng)絡(luò)中，小G蛋白的調(diào)節(jié)劑，如EPAC1,也起著關(guān)鍵的作用(Pannekoek 等,Biochim.Biophys.Actal788:790-96，(2009))。在過去的幾年里，已經(jīng)鑒定了 Ras和RAPl的效應(yīng)子，如MLLT4/AFADIN-6、RADIL和KRIT1，并且表明其在介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞粘附和遷移中起重要作用(Boettner等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào))97:9064-69，(2000) ;Glading 等，J.Cell Biol.(細(xì)胞生物學(xué)雜志)161:1163-77，(2007) ;Mitin等，J.Biol.Chem.(生物化學(xué)雜志)279:22353-61，(2004) ; Smolen 等，Genes Dev.(基因發(fā)育)21:2131-36，(2007) ; Xu 等，Dev.Biol.(發(fā)育生物學(xué))329:269-79, (2009))。另外，已經(jīng)表明Rasipl結(jié)合過量表達(dá)的Ras和Rapl(Mitin等，(2004;同上))，并且在光滑爪蟾(Xenopus Iaevis)中Rasipl的敲減消除血管形成(Mitin等，(2004;同上))；Xu等，(2009;同上))。
[0007] 盡管我們對正常和病理性脈管系統(tǒng)的發(fā)育和維持的理解有許多進(jìn)步，但是仍然需要鑒定靶標(biāo)并且開發(fā)可以補(bǔ)充或提高本領(lǐng)域中現(xiàn)有治療的功效的方式。
[0008]發(fā)明概述
[0009]本發(fā)明至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)，Ras-相互作用蛋白I(Rasipl)是維持內(nèi)皮連接穩(wěn)定性所必需的。因此，用激活Rasipl或激活Rasipl位于其中的信號傳導(dǎo)級聯(lián)的試劑靶向Rasipl可用于治療具有降低的血管屏障功能的病癥，包括膿毒癥(sepsis)、年齡相關(guān)的黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)、水腫(edema)和出血(hemorrhage)。因此，本發(fā)明提供使用激活Rasipl活性的試劑治療所述病癥的新方法。另外，本發(fā)明至少部分基于這樣的發(fā)現(xiàn):形成穩(wěn)定的血管需要Rasipl。因此，用抑制Rasipl的試劑或抑制Rasipl存在于其中的信號傳導(dǎo)級聯(lián)的試劑靶向Rasipl可用于治療需要新血管形成的病癥，包括癌癥和增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病(proliferative diabetic retinopathy)。因此，本發(fā)明提供使用抑制Rasipl活性的試劑治療所述病癥的新方法。
[0010]一方面，本發(fā)明提供治療受試者中與改變的血管屏障功能相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括給所述受試者施用RASIPl調(diào)節(jié)劑。在一些實(shí)施方案中，所述病癥與降低的血管屏障功能相關(guān)，并且其中RASIPl調(diào)節(jié)劑是RASIPl激動(dòng)劑，包括所述病癥例如為膿毒癥、年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)、水腫、缺血性卒中或出血的情形。在一些實(shí)施方案中，所述病癥與增加的血管屏障功能相關(guān)，并且其中所述RASIPl調(diào)節(jié)劑是RASIPl拮抗劑，包括所述病癥例如為高血壓的情形。
[0011]另一方面，本發(fā)明提供降低或抑制需要其的受試者中的血管屏障功能的方法，所述方法包括給所述受試者施用RASIPl激動(dòng)劑。
[0012]另一方面，本發(fā)明提供增加或增強(qiáng)需要其的受試者中的血管屏障功能的方法，所述方法包括給所述受試者施用RASIPl拮抗劑。
[0013]另一方面，本發(fā)明提供治療受試者中需要新血管形成的病癥的方法，所述方法包括給所述受試者施用RASIPl抑制劑，包括所述病癥例如為癌癥或增生性視網(wǎng)膜病(proliferative retinopathy)(包括糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy))的情形。
[0014]在一些實(shí)施方案中，所述RASIPl調(diào)節(jié)劑是小分子。在一些實(shí)施方案中，其中當(dāng)所述RASIPl調(diào)節(jié)劑是拮抗劑時(shí)，其為反義RNA、RNAi或核酶。
[0015]附圖簡述
[0016]圖1:Rasipl敲除的小鼠在孕中期死于血管缺陷
[0017](A)在E9.0的雜合子對照(+/ —)胚胎的亮視野圖片。(B)在E9.0的Rasipl - / -胚胎的亮視野圖片，顯示較小的尺寸、心包水腫和出血。(C，D)在Rasipl+/- (C)和-/-(D)E8.5胚胎中的整體⑶31加⑶105免疫熒光(紅色)。腹面視圖，喙在左側(cè)。(E，F(xiàn))Rasipl+/ - (E)和-/_ (F)E9.0胚胎的軀干血管的整體免疫熒光。側(cè)視圖，喙在左側(cè)。紅色:⑶31+⑶105，綠色:RBC自發(fā)熒光；藍(lán)色:DAPI。箭頭:背側(cè)主動(dòng)脈。星號:月牙形心臟。So:體節(jié)。
[0018]圖2 =Rasipl敲除小鼠中的軸血管缺陷
[0019]Rasipl+/ - (A-D)和_ / _ (E-H)胚胎的尾側(cè)背主動(dòng)脈的橫切面切片，1-2體節(jié)期(ss) (A，E)，3-6ss(B，F(xiàn))和 7-lOss (C，D，G，H)。注意:(C)和(D)以及(G)和(H)中的切片來自相鄰的切片，表示Rasipl-/_胚胎在7-lOss的主動(dòng)脈的局部塌陷。(I)Rasipl+/-(n=5)和-/_ (n=5)胚胎在7-lOss的背主動(dòng)脈腔面積的散點(diǎn)圖。20 μ m2的截止線(紅色)表示有功能的毛細(xì)管直徑。Rasipl-/-主動(dòng)脈顯示腔面積的較寬的變化。每個(gè)點(diǎn)表示單獨(dú)的主動(dòng)脈面積測量。
[0020]圖3:在斑馬魚中破壞rasipl和rafadil表達(dá)引起異常的EC-EC締合和血管滲漏
[0021](A)在受精后26小時(shí)(hpf)的對照嗎啉代寡核苷酸(對照(Ctrl))注射的Tg(kdrl:EGFP) s843斑馬魚胚胎的側(cè)視圖。_在左側(cè)。(B)在26hpf的rasipl和rafadil嗎啉代寡核苷酸(MO)注射的胚胎。肌節(jié)間的血管(ISVs)有發(fā)育障礙，并且軸血管形態(tài)異常。(C) 27hpf胚胎的側(cè)視圖，顯示背主動(dòng)脈(小括號)和向腹側(cè)遷移形成后主靜脈的細(xì)胞(大括號)。(D) 27hpf雙重變異體(double morphant)的側(cè)視圖。成血管細(xì)胞的軸向定位是正常的(括號)但是血管合生是異常的并且出現(xiàn)多個(gè)縫隙(箭頭)。(E)對照54hpf胚胎的熒光血管造影術(shù)，顯不在血管(綠色)內(nèi)的突光微球(microbead)(紅色)。(F) rasipl和rafadilMO胚胎的血管造影術(shù)，顯示滲漏的血管外微球。
[0022]圖4:失去RASIPl改變細(xì)胞-細(xì)胞連接性
[0023](A)在24小時(shí)的對照(Ctrl)HUVEC血管形成生芽。(B)由穩(wěn)定表達(dá)RASIPl短發(fā)夾RNA的HUVEC形成的出芽。注意在RASIPl敲減(KD)樣品中分離的(detached)細(xì)胞/出芽的增加。(C)在24和48小時(shí)在對照和KD樣品中分離的出芽的量化。來自兩次實(shí)驗(yàn)每種病況總共量化40個(gè)球，表示為平均值+/-SEM。(*表示P〈0.0001，通過不配對的Welch-校正的t檢驗(yàn)確定)。(D)在二維(2D)傷口愈合測定中對照和RASIP1KD HUVEC的遷移速率(μ m/min)。(E)在2D遷移測定中由波前瞬時(shí)分離的細(xì)胞的量化。每種病況量化21-23次運(yùn)動(dòng)(movies)。誤差棒為SEM。(F)在RASIP1KDHUVEC中通透性增加，如針對對照標(biāo)準(zhǔn)化。使用40kDa FITC-葡聚糖測量細(xì)胞旁流量。數(shù)值為4次獨(dú)立的重復(fù)對的平均值。誤差棒為SD0 O*表示Ρ〈0.02,通過配對t-檢驗(yàn)確定)。
[0024]圖5 =RASIPl通過RAPl的GTP負(fù)載而控制接合的精細(xì)化
[0025]對照(A-C)或RASIP1KD (D-F)HUVECs用EGTA處理，接著用cBiMPS處理，并且用鬼筆環(huán)肽(A，D;在C，F(xiàn)中為綠色)和VE-鈣粘著蛋白(B，E;在E，F(xiàn)中為紅色)染色。E和F中的藍(lán)色表示細(xì)胞核(DAPI)。(G)對對照HUVEC用RASIPl抗體染色。觀察到彌散的細(xì)胞質(zhì)/核周以及接合染色(箭頭)。(H)在RASIP1KD HUVEC中，來自RasIPlpAb染色的細(xì)胞質(zhì)和接合信號顯著減少。(I)對照和KD HUVEC中的RAPl的GTP負(fù)載。與對照相比，在KDHUVEC中結(jié)合GTP的RAPl減少。
[0026]優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述
[0027]定義
[0028]除非另有定義，本文使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。參見例如Singleton等人，Dictionary of Microbiologyand Molecular Biology (微牛.物學(xué)和分子牛.物學(xué)詞典)第二版，J.ffiley&Sons (紐約，NY1994): Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (分子克降，實(shí)驗(yàn)室指南).Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, NY1989)。為本發(fā)明的目的，對某些術(shù)語定義如下。
[0029]當(dāng)用于本文時(shí)，術(shù)語“RASIP1”或“RASIP1多肽”是指具有從自然界獲得的RASIPl多肽的氨基酸序列的多肽，而不論其制備方式或物種。因此，此類多肽可以具有來自于人、小鼠或任何其它物種的天然存在的RASIPl的氨基酸序列。全長人RASIPl氨基酸序列是:
[0030]
【權(quán)利要求】
1.一種用于治療受試者中與改變的血管屏障功能相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括給所述受試者施用RASIPl調(diào)節(jié)劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥與降低的血管屏障功能相關(guān)，并且其中所述RASIPl調(diào)節(jié)劑是RASIPl激動(dòng)劑。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述病癥選自由膿毒癥、年齡相關(guān)的黃斑變性(AMD)、水腫、缺血性卒中和出血組成的組。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述病癥與增加的血管屏障功能相關(guān)，并且其中所述RASIPl調(diào)節(jié)劑是RASIPl拮抗劑。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述病癥是高血壓。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述RASIPl調(diào)節(jié)劑是小分子。
7.一種在需要其的受試者中降低或抑制血管屏障功能的方法，所述方法包括給所述受試者施用RASIPl激動(dòng)劑。
8.一種在需要其的受試者中增加或增強(qiáng)血管屏障功能的方法，所述方法包括給所述受試者施用RASIPl拮抗劑。
9.一種治療受試者中需要新血管形成的病癥的方法，所述方法包括給所述受試者施用RASIPl抑制劑。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述病癥是癌癥或增生性視網(wǎng)膜病。
【文檔編號】A61K31/00GK103533928SQ201280012337
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月10日
【發(fā)明者】葉蔚藍(lán), 利昂·H·帕克四世, 克里斯托弗·威爾遜 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司