一種新型手足口病疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明一種手足口病疫苗及其制備方法，屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過構(gòu)建一種重組病毒表達(dá)載體—pIRES-VP1-dhfr，高效表達(dá)手足口病主要抗原蛋白基因EV71VP1。免疫接種EV71動物模型，檢測免疫效果，獲得候選疫苗。相比于傳統(tǒng)的手足口病疫苗生產(chǎn)具有安全性好、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高、易于操作、適用于大規(guī)模生產(chǎn)的特點(diǎn)。
【專利說明】一種新型手足口病疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種手足口病疫苗及其制備方法，尤其涉及手足口病疫苗制備中的重組質(zhì)粒和重組病毒的制備，屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]腸道病毒71型(enterovirus 71, EV71)微小核糖核酸病毒科腸道病毒屬，分為A、B、C三種基因型。EV71極其渺小，為正2 O面體、直徑27nm、內(nèi)含一條單股RNA。同時(shí)該病毒還具有以下特性:不耐強(qiáng)堿、56°C以上高溫失去活性；紫外線可降低其活性；甲醛、含氯漂白水等化學(xué)物質(zhì)可抑制其活性；沒有脂質(zhì)胞膜，故親脂性消毒劑如酒精對其無用。
[0003]EV71和柯薩奇病毒A16 (CA16)是手足口病(HFMD)重癥病例的主要病原體，且能引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹等多種與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病，致殘及病死率很高，備受人們關(guān)注。
[0004]1974年Schmidt等人首次報(bào)道從美國加利福尼亞患者中分離到EV71，隨后世界上許多國家相繼報(bào)道了 EV71在不同地區(qū)的流行情況。近年來，EV71感染引起的手足口病在亞太地區(qū)，尤其在我國北京、安徽、河南、山東等地較為嚴(yán)重。當(dāng)前，我國流行的手足口病主要是由腸道病毒71型(EV71)引起的急性傳染病，多發(fā)生于學(xué)齡前兒童。病人和隱性感染者均為傳染源，主要通過消化道、呼吸道和密切接觸等途徑傳播。致死原因主要為腦干腦炎及神經(jīng)源性肺水腫。
[0005]目前，EV71疫苗的研究己取得一定的進(jìn)展，正在研發(fā)的疫苗包括滅活全病毒疫苗、減毒活疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、重組蛋白亞單位疫苗、病毒樣顆粒疫苗和轉(zhuǎn)基因口服疫苗。如C Chung等構(gòu)建并純化了 EV71病毒樣顆粒(VLP)，應(yīng)用純化的VLP、變性的VLP和熱滅活的EV71病毒，分別對小鼠的進(jìn)行了免疫。Wu CN等用VPl DNA疫苗、福爾馬林滅活疫苗和VPl原核表達(dá)亞單位疫苗等三種EV71疫苗對實(shí)驗(yàn)?zāi)甘筮M(jìn)行免疫接種，比較了新生小鼠對野生型EV71產(chǎn)生的免疫保護(hù)效果。結(jié)果表明，三種疫苗都有一定的免疫保護(hù)效果。HF Chen等培育了能表達(dá)EV71蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄，新鮮番茄中的表達(dá)量達(dá)到了 27 mg/ g。用該轉(zhuǎn)基因番茄喂養(yǎng)小鼠，能刺激小鼠產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫，促進(jìn)脾細(xì)胞增殖。在糞便和血清中，能夠分別檢測到針對VPl特異性的IgA抗體和IgG抗體。
[0006]雖然各種疫苗均具有一定的免疫原性和免疫效果，但最適疫苗的確認(rèn)還需要對各種疫苗進(jìn)行安全性和有效性的評價(jià)。
[0007]基因工程重組亞單位疫苗是指利用重組DNA技術(shù)，將病原的保護(hù)性抗原基因在不同的表達(dá)系統(tǒng)中體外表達(dá)，生產(chǎn)能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)的病原蛋白質(zhì)，再經(jīng)分離純化而制備的疫苗?；蚬こ虂唵挝灰呙绯藖唵挝灰呙绲膬?yōu)點(diǎn)外，還有制備簡單，成本較低等傳統(tǒng)亞單位疫苗無法比擬的優(yōu)越性。目前疫苗市場仍以常規(guī)傳統(tǒng)疫苗為主，從生物疫苗的研究開發(fā)角度出發(fā)，利用先進(jìn)的基因工程技術(shù)不僅可開發(fā)新型疫苗，還可用于改進(jìn)現(xiàn)有疫苗。一些重組疫苗已商品化成品問世應(yīng)用于臨床，例如我國自行研制開發(fā)的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)表達(dá)的乙肝基因重組疫苗已在衛(wèi)生部長春生物制品研究所投人生產(chǎn)，還有重組甲肝及戊肝疫苗，故手足口病基因工程重組疫苗是該疾病疫苗開發(fā)的方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明通過重組DNA技術(shù)，將病原的保護(hù)性抗原基因EV71 VPl在表達(dá)載體一pIRES-VPl-dhfr，轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，獲得能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)的病原蛋白質(zhì)，再經(jīng)分離純化而制備的疫苗。相比于傳統(tǒng)手足口病疫苗生產(chǎn)具有安全性好、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)量高、易于操作、適用于大規(guī)模生產(chǎn)的特點(diǎn)。
[0009]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
上述病毒表達(dá)載體一pIRES-VPl-dhfr的制備方法包括以下步驟:
(1)由PCR擴(kuò)增的方法獲得病毒囊膜蛋白信號肽基因序列和桿狀病毒囊膜蛋白跨膜域基因序列，通過BamHI EcoRI和XhoI Hindlll雙酶切插入載體多克隆位點(diǎn)上下游兩端構(gòu)建的病毒表面；
(2)由PCR擴(kuò)增的方法獲得手足口病主要抗原蛋白基因EV71VPl序列，其5’和3’端分別引入EcoR I和Xba I酶切位點(diǎn)后構(gòu)建成重組病毒表達(dá)載體pIRES-VPl-dhfr ；
(3)取步驟(2)所得的重組病毒載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，篩選高表達(dá)單克隆細(xì)胞系；
(4)取步驟(3)所鑒定成功的重組病毒基因組轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，獲得含重組病毒，提取病毒基因組用M13引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得所述重組病毒載體。
[0010]本發(fā)明進(jìn)一步提供上述家蠶重組桿狀病毒Bmgp64VPl在手足口病疫苗制備中的應(yīng)用。
[0011 ] 本發(fā)明還提供上述蛋白在手足口病疫苗制備中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)效果如下:
利用重組DNA技術(shù)高效表達(dá)有極高臨床應(yīng)用價(jià)值手足口病疫苗的方法，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，降低了成本，且產(chǎn)量高，所生產(chǎn)的手足口病疫苗應(yīng)用價(jià)值大。EV71 VPl蛋白直接決定EV71病毒的抗原性，是疫苗設(shè)計(jì)的主要靶蛋白，利用真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)具備良好的免疫原性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1:pIRES-VPl_DHFR表達(dá)載體示意圖【具體實(shí)施方式】
[0014]應(yīng)該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對本發(fā)明提供進(jìn)一步的發(fā)明。除非另有說明，本文使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】人員通常理解的相同含義。
本發(fā)明所述的應(yīng)用DNA重組技術(shù)，備手足口病疫苗的方法，是通過PCR的方法獲得EV71 VPl基因，并在其5’和3’端分別引入EcoR I和Xba I酶切位點(diǎn)，與病毒表達(dá)載體pIRES-dhfr相連構(gòu)建成重組病毒載體pIRES-VPl-dhfr (見圖1);鑒定成功的重組病毒基因組轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，獲得含重組病毒，提取重組載體pIRES-VPl-dhfr表達(dá)的抗原蛋白，免疫接種EV71動物模型，檢測免疫效果，篩選出最佳的候選疫苗和佐劑。
[0015]下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)闡述本發(fā)明的具體內(nèi)容。[0016]實(shí)施例1: PCR擴(kuò)增EV71 VPl基因
以含有EV71 VPl基因的pMAL-p7b為模板，P1P2上下游引物，進(jìn)行PCR特異性片段擴(kuò)增。[0017]Pl:5-CAACTTCCCCGGTGGGTGTGTTTTCCTACATGCGCTTTGATGCA-3
P2: 5-TATGTTTGTGCCACCTGGAGCCTTTTGGGGTTAGTGGCGGTTTG-3
PCR反應(yīng)體系為:
ddH2074 ul
10XPCR buffer10 ul
2 mM dNTP10 ul
P52 ul
P62 ul
酶I ul
質(zhì)粒I ul
Total100 ul
【權(quán)利要求】
1.一種用于預(yù)防或治療手足口病的疫苗或藥劑，其包含一種重組病毒表達(dá)載體一pIRES-VPl-dhfr 的病毒株。
2.—種權(quán)利要求1所述病毒表達(dá)載體一pIRES-VPl-dhfr的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)由PCR擴(kuò)增的方法獲得病毒囊膜蛋白信號肽基因序列和桿狀病毒囊膜蛋白跨膜域基因序列，通過BamHI EcoRI和XhoI Hindlll雙酶切插入載體多克隆位點(diǎn)上下游兩端構(gòu)建的病毒表面； (2)由PCR擴(kuò)增的方法獲得手足口病主要抗原蛋白基因EV71VPl序列，其5’和3’端分別引入EcoR I和Xba I酶切位點(diǎn)后構(gòu)建成重組病毒表達(dá)載體pIRES-VPl-dhfr ； (3)取步驟(2)所得的重組病毒載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，篩選高表達(dá)單克隆細(xì)胞系； (4)取步驟(3)所鑒定成功的重組病毒基因組轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，獲得含重組病毒，提取病毒基因組用M13引物進(jìn)行PCR鑒定，獲得所述重組病毒載體。
3.一種權(quán)利要求2所述的重組載體pIRES-VPl-dhfr表達(dá)的抗原蛋白，免疫接種EV71動物模型，檢測免疫效果，篩選出最佳的候選疫苗和佐劑。
4.一種 權(quán)利要求3所述的疫苗在手足口病中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K49/00GK103893748SQ201210577794
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月27日
【發(fā)明者】馬境, 李昂 申請人:上海吉美生物工程有限公司