Dna-殼聚糖復(fù)合納米顆粒、其制備及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種DNA-殼聚糖復(fù)合納米顆粒，為殼聚糖增溶衍生物包裹的含有AS5短發(fā)夾序列的重組質(zhì)粒，所述AS5短發(fā)夾序列為通過環(huán)狀序列連接的、與IL-10基因的siRNA對應(yīng)的DNA序列。本發(fā)明還公開了該納米顆粒的制備方法，以及其作為免疫佐劑的應(yīng)用。本發(fā)明的納米顆粒免疫佐劑顆粒均勻性好；可引發(fā)細(xì)胞免疫刺激；細(xì)胞毒性?。豢煽焖儆行У匾种艻L-10抑炎因子的表達(dá)，進(jìn)而實現(xiàn)輔助增強疫苗效力的佐劑作用；而且由于使用殼聚糖納米包裹技術(shù)，在細(xì)胞中具有緩釋效應(yīng)，并能組織細(xì)胞內(nèi)的核酸內(nèi)切酶降解DNA。
【專利說明】DNA-殼聚糖復(fù)合納米顆粒、其制備及應(yīng)用
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及新型免疫佐劑，具體涉及一種DNA-殼聚糖復(fù)合納米顆粒、其制備方法，及作為免疫佐劑應(yīng)用。
【【背景技術(shù)】】
[0002]目前不斷開發(fā)出的新型疫苗具有良好的抗原特異性和低毒性，但疫苗免疫原性較差。盡管已成功制備得到很有希望的抗原，卻并不能誘導(dǎo)出足夠強的預(yù)防作用。例如，可溶性純化蛋白質(zhì)疫苗或蛋白質(zhì)亞單位疫苗的免疫激活作用通常較弱，不足以刺激機體產(chǎn)生足夠抗體；單獨應(yīng)用時所需抗原量較多，機體產(chǎn)生的抗體量較少；且還易引起免疫耐受。但這些疫苗在與較匹配佐劑連用時，以上缺點就會有所改善。因此開發(fā)安全有效的免疫佐劑來輔助增強疫苗效力，對于更多新型疫苗在臨床上的成功應(yīng)用具有重要意義。
[0003]佐劑的作用方式多種多樣，人們對其與免疫系統(tǒng)間相互作用的知識也正在逐漸豐富，并已經(jīng)成為現(xiàn)代免疫學(xué)的重要組成部分。分別從事佐劑研究，對于深入理解佐劑作用機理和機體免疫調(diào)節(jié)方式很有意義。
[0004]免疫佐劑可輔佐免疫原刺激機體產(chǎn)生較早、較強、持久的免疫應(yīng)答。理想的免疫佐劑應(yīng)該能滿足以下條件:(1)在有效劑量內(nèi)無毒或毒性極??；(2)能刺激機體產(chǎn)生強大的體液免疫和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答；(3)具有持久的免疫力；(4)不誘導(dǎo)自身免疫；(5)無致突變、致癌、致畸形作用等。雖然現(xiàn)在已有許多佐劑應(yīng)用于動物，但還沒有哪一種佐劑能完全滿足以上要求。
[0005]近年來，隨著第2、3代疫苗的迅速發(fā)展，特別是多肽疫苗呈現(xiàn)出的極大發(fā)展空間，促使免疫佐劑也有了長足的進(jìn)步。
[0006]目前通過FDA批準(zhǔn)的能用于人的佐劑鋁膠佐劑存在兩方面主要缺點:其一，只能激發(fā)機體產(chǎn)生體液免疫,不能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫。而細(xì)胞免疫對機體細(xì)胞內(nèi)寄生病原體(病毒、原蟲等)及腫瘤免疫力的產(chǎn)生尤為必要。其二，鋁膠佐劑對人免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、單純皰疹病毒(HSV)、流感病毒，以及血吸蟲病、百日咳和傷寒等抗原沒有免疫佐劑性效果。因此已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足新型疫苗發(fā)展的要求。
[0007]納米技術(shù)是一門具有廣闊前景的新興技術(shù)，納米技術(shù)與免疫技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物-納米佐劑已成為了當(dāng)前疫苗研究的熱點。從免疫學(xué)觀點來看，納米佐劑均勻性好，包裹或吸附的抗原顆粒正是巨噬細(xì)胞(M5)和樹突狀細(xì)胞(DC)的首選吞噬目標(biāo)，這為實現(xiàn)機體有效的免疫反應(yīng)完成了重要的一步。而且納米佐劑與多肽抗原或DNA疫苗連接后，可以避免常規(guī)佐劑載體效應(yīng)的發(fā)生，起到保護(hù)抗原的作用。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0008]本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷，提供新型DNA-殼聚糖復(fù)合納米顆粒的免疫佐劑。
[0009]具體地，本發(fā)明一方面提供一種DNA-殼聚糖復(fù)合納米顆粒，為殼聚糖增溶衍生物包裹的含有AS5短發(fā)夾序列的重組質(zhì)粒，所述AS5短發(fā)夾序列為通過環(huán)狀序列連接的SEQN0.1所示序列與其互補序列。
[0010]所述殼聚糖增溶衍生物可以為殼聚糖-聚乙烯亞胺-聚乙二醇聚合物。
[0011 ] 所述環(huán)狀序列可以為TCAAGAG序列。
[0012]所述重組質(zhì)粒的大小可以為4610bp。
[0013]所述納米顆粒的粒徑可以為35_50nm。
[0014]所述殼聚糖增溶衍生物與所述重組質(zhì)粒的的包被比例為摩爾比20:1。
[0015]本發(fā)明另一方面提供用于制備該納米顆粒的方法，包括以下步驟:
[0016]S1合成AS短發(fā)夾序列，并退火；
[0017]S2將經(jīng)退火的AS短發(fā)夾序列與雙酶切線性質(zhì)粒、DNA連接酶在連接緩沖液中混合，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，接種于含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，做抗性篩查，選取抗性菌落，得到重組質(zhì)粒溶液；以及
[0018]S3將殼聚糖增溶衍生物溶液與重組質(zhì)粒溶液混合，得到DNA-殼聚糖復(fù)合納米顆粒溶液。
[0019]步驟S3中殼聚糖增溶衍生物溶液的pH可以為5.5。
[0020]步驟S3中殼聚糖增溶衍生物溶液與重組質(zhì)粒溶液在混合前，可以分別于65°C恒溫5分鐘。
[0021]本發(fā)明再一方面提供該納米顆粒作為免疫佐劑的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明的納米顆粒免疫佐劑均勻性好；可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫；細(xì)胞毒性小；可快速有效地降低抑炎因子IL-10的表達(dá)；通過納米顆粒包括技術(shù)，在細(xì)胞中具有緩釋效應(yīng)，且能保護(hù)DNA免于被細(xì)胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶降解。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0023]圖1示出根據(jù)本發(fā)明實施例的重組質(zhì)粒的凝膠電泳檢測結(jié)果。
[0024]圖2為根據(jù)本發(fā)明實施例的納米顆粒的掃描電鏡圖像。
[0025]圖3示出根據(jù)本發(fā)明實施例的納米顆粒的凝膠阻滯電泳檢測結(jié)果。
[0026]圖4示出本發(fā)明的納米顆粒在降低抑炎因子IL-10表達(dá)上的作用。
【【具體實施方式】】
[0027]IL-10最初發(fā)現(xiàn)是鼠的Th2細(xì)胞分泌的一種獨特的細(xì)胞因子，后來發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞、角化細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞以及人的Thl細(xì)胞均可分泌IL-10。
[0028]IL-10具有很強的抗炎及免疫抑制活性，它能抑制IL-2、IFN-C及促炎因子的產(chǎn)生和釋放；可減少免疫受體MFK:1 0的表面表達(dá)；能抑制人的Th2細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞增生和細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少。
[0029]IL-10具有多種抑制功能，例如抑制單核細(xì)胞依賴性Th細(xì)胞增生；抑制Thl類淋巴因子的合成及其活性；抑制單核細(xì)胞表面MHC O類分子表達(dá)，降低單核細(xì)胞的抗原提呈能力，阻斷抗原特異性單核/巨噬細(xì)胞因子的產(chǎn)生；抑制NK細(xì)胞的活性，IL-10并不直接作用于NK細(xì)胞，而是通過抑制IFN-C的產(chǎn)生間接發(fā)揮作用。IFN-C對NK細(xì)胞增殖活化具有正向調(diào)節(jié)作用。1/4抑制T細(xì)胞的凋亡，從外周血單核細(xì)胞中分離出的T細(xì)胞，如在培養(yǎng)液中加入IL-1O可減少T細(xì)胞的凋亡。抑制反應(yīng)性氮氧化物的產(chǎn)生，反應(yīng)性氮氧化物對細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物及細(xì)胞內(nèi)外寄生物的清除有重要意義。
[0030]IL-10具有很強的免疫刺激作用，包括:促進(jìn)非單核細(xì)胞依賴性T細(xì)胞的增殖、成熟。在IL-3、IL-4存在的條件下，刺激肥大細(xì)胞及其祖細(xì)胞的增殖，增強肥大細(xì)胞的活力。刺激抗原特異性B細(xì)胞增殖，并分化為漿細(xì)胞。
[0031] 基于此，本發(fā)明人設(shè)計了一種包含有AS5短發(fā)夾序列的重組質(zhì)粒，該AS5短發(fā)夾序列為通過環(huán)狀序列連接的SEQ N0.1所示序列與其互補序列。
[0032]AS5短發(fā)夾序列的設(shè)計
[0033]通過GeneBank獲得人IL-10基因序列，針對其3’ UTR區(qū)設(shè)計了一個RNAi靶位。在互補的siRNA之間引入一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)序列，該環(huán)狀序列可以為，例如TCAAGAG。在shRNA5’端和3’端分別引入BamH I和Hind III酶切位點，反義片段以后接終止信號TTTTT，以終止轉(zhuǎn)錄。如此，形成了 BamH I+正義鏈+環(huán)鏈+反義鏈+終止信號+Hind III的結(jié)構(gòu)。
[0034]化學(xué)合成所設(shè)計的ShRNA的反義DNA序列，即本發(fā)明的AS5序列。作為對照，本發(fā)明人還使用相同的環(huán)狀序列TCAAGAG，連接SEQ N0.2所示序列，合成了對照序列(對照)。
[0035]為了形成穩(wěn)定的DNA雙鏈，將合成得到的DNA序列進(jìn)行退火。用滅菌三蒸水分別溶解合成AS5片段(正義鏈與反義鏈)溶解，終濃度為lOumol/L。并按以下條件完成退火:正義鏈2uL、反義鏈2uL、10x退火緩沖液2ul，加三蒸水到總體積為20uL，于80°C水浴2分鐘，緩慢冷卻至室溫(16°C )，完成退火。
[0036]重鉬質(zhì)粒
[0037]制各:
[0038]為獲得重組質(zhì)粒，本發(fā)明人使用了 pSilencer3.1-Hlhygro載體來構(gòu)建PS-AS5-1L10表達(dá)載體。
[0039]首先，利用pSilencer3.1-Hlhygro,獲得線形質(zhì)粒:按照 pSilencer3.1-Hlhygro載體說明書，制備質(zhì)粒溶液lug/uL ;轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α ;接種于氨節(jié)青霉素(ampcillin)的LB固體培養(yǎng)基；抗性篩選提取質(zhì)粒pSilencer3.1-Hl ;通過BamH I和HindIII雙酶切；膠回收酶切產(chǎn)物，獲得線性目的質(zhì)粒20uL (16ug/uL)。
[0040]之后，連接線性目的質(zhì)粒與經(jīng)退火的DNA片段。雙酶切線性質(zhì)粒pSilencer3.l-H14uL、經(jīng)退火 AS5 序列 luL、T4DNA 連接酶 2uL、10 倍連接緩沖液(ligationbuffer) 2uL，加滅菌三蒸水至總體積為20uL，于16°C水浴12小時，之后置于65°C水浴10分鐘。轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，接種于含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，做抗性篩選，選取抗性菌落。獲得重組質(zhì)粒(PS-AS5)。
[0041]使用對照DNA序列，以相同的方法，指標(biāo)得到對照質(zhì)粒(pS-對照)。
[0042]表征:
[0043]抗性篩選后取抗性菌落，在重組質(zhì)粒的插入位點上下游設(shè)計引物菌落做菌落PCR鑒定擴增片段長度是否為插入片段長度，引物為:3.lsq-F:TCTTTGGATTTGGGAATCTTAT, 3.1sq-R: ACACAGGAAACAGCTATGA。將PCR產(chǎn)物片段大小合適的菌落送Invitrogen公司測序，進(jìn)一步鑒定重組質(zhì)量的正確性。
[0044]菌落PCR產(chǎn)物電泳檢測后條帶大小為插入片段大小，Invitrogen公司測序結(jié)果顯示shRNA表達(dá)片段正確的插入到pSilencer3.1-Hl載體中。[0045]圖1示出該重組質(zhì)粒的凝膠電泳(1%瓊脂糖凝膠)檢測結(jié)果。重組質(zhì)粒制備后電泳條帶顯示片段大小大約為5000bp，條帶亮度較高，符合預(yù)期。
[0046]納米顆粒
[0047]進(jìn)一步，本發(fā)明人將該重組質(zhì)粒與納米技術(shù)相結(jié)合，利用殼聚糖增溶衍生物包裹重組質(zhì)粒，以形成納米顆粒。
[0048]殼聚糖是自然界中迄今發(fā)現(xiàn)的唯--種陽離子多糖，在水溶液中電離為陽離子。
如此形成的帶極性陽離子納米顆粒，便于吸附到帶有負(fù)電荷的細(xì)胞膜上，促進(jìn)細(xì)胞的胞吞作用。這樣就可以使殼聚糖納米顆粒包裝的分子藥物便于被細(xì)胞吸收。且殼聚糖的生物相容性非常好，用其制備的納米顆粒對細(xì)胞毒性非常低，其本身就可以作為一種免疫增強劑使用，故用其包裝可抑制IL-10表達(dá)的DNA分子藥物將是一種非常好的免疫增強劑，即疫苗佐劑。
[0049]然而，殼聚糖因水溶性較差，在生物體中的使用也有一定的局限性。本發(fā)明使用經(jīng)改性的殼聚糖增溶衍生物，例如殼聚糖-聚乙烯亞胺-聚乙二醇聚合物(CS-N-PE1-PEG)，大大提高了殼聚糖的水溶性。其帶有的陽離子電荷增加，使其轉(zhuǎn)染效率大大提高。
[0050]此外，由于這樣的殼聚糖衍生物的分子構(gòu)象更加復(fù)雜，用其制備得到的納米顆粒在包裝DNA后會使包裝后的納米顆粒分子組裝更加緊密，在細(xì)胞中能夠更加有效地抵御細(xì)胞DNA酶對外來DNA的剪切，起到對IL-10干擾分子的緩釋作用。
[0051]制各:
[0052]本發(fā)明中，使用離子交聯(lián)法來制備殼聚糖增溶衍生物包裹的重組質(zhì)粒。將殼聚糖增溶衍生物CS-N-PE1-PEG (殼聚糖-聚乙烯亞胺-聚乙二醇聚合物，參考《聚乙二醇-殼聚糖-聚乙烯亞胺共聚物的制備及其基因傳遞系統(tǒng)性能的研究》一中山大學(xué)博士學(xué)位論文張未，潘仕榮等，20080420，制備得到)的溶液(pH5.5)，重組質(zhì)粒溶液，分別于65°C水浴恒溫5分鐘。然后將二者均勻混合10分鐘，得到殼聚糖增溶衍生物包裹重組質(zhì)粒的納米顆粒，即本發(fā)明的DNA-殼聚糖復(fù)合納米顆粒(CNP-pS-AS5)。
[0053]使用對照DNA序列，以相同的方法，獲得對照納米顆粒(CNP-pS-對照)。
[0054]表征:
[0055]1.納米顆粒的形態(tài)、粒徑及Zeta電位測定
[0056]取少量質(zhì)粒殼聚糖納米樣品液于透射電子顯微鏡下觀察納米顆粒形態(tài)并拍照。另取納米顆粒樣品液適量，加雙蒸水稀釋后用ZetasizerfOOOHS/IHPL納米粒度分析儀測定粒徑、分散度及Zeta電位。
[0057]電鏡照片示于圖2中，圖中的電鏡觀察結(jié)果表明殼聚糖納米顆粒多呈球形，且均勻性較好。
[0058]納米粒度分析儀測定結(jié)果如下表1所示:
[0059]表1納米顆粒的粒徑和Zeta電位
[0060]
【權(quán)利要求】
1.一種DNA-殼聚糖復(fù)合納米顆粒，為殼聚糖增溶衍生物包裹的含有AS5短發(fā)夾序列的重組質(zhì)粒，所述AS5短發(fā)夾序列為通過環(huán)狀序列連接的SEQ N0.1所示序列與其互補序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述殼聚糖增溶衍生物為殼聚糖-聚乙烯亞胺-聚乙二醇聚合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述環(huán)狀序列為TCAAGAG序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述重組質(zhì)粒的大小為4610bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述納米顆粒的粒徑為35-50nm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其特征在于，所述殼聚糖增溶衍生物與所述重組質(zhì)粒的包被比例為摩爾比20:1。
7.用于制備權(quán)利要求1-6中任一項所述的納米顆粒的方法，包括以下步驟: S1合成AS5短發(fā)夾序列，并退火； S2將經(jīng)退火的AS5短發(fā)夾序列與雙酶切線性質(zhì)粒、DNA連接酶在連接緩沖液中混合，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，接種于含氨芐抗性的LB培養(yǎng)基，做抗性篩查，選取抗性菌落，得到重組質(zhì)粒溶液；以及 S3將殼聚糖增溶衍生物溶液與重組質(zhì)粒溶液混合，得到DNA-殼聚糖復(fù)合納米顆粒溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟S3中殼聚糖增溶衍生物溶液的pH為5.5o
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟S3中殼聚糖增溶衍生物溶液與重組質(zhì)粒溶液在混合前，分別于65°C恒溫5分鐘。
10.權(quán)利要求1-6中任一項所述的納米顆粒作為免疫佐劑的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K39/39GK103893753SQ201210574988
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月26日
【發(fā)明者】萬曉春, 田永帥, 馬軼凡, 蔡林濤 申請人:深圳先進(jìn)技術(shù)研究院