專利名稱：一種人凝血因子Ⅷ的干熱處理穩(wěn)定劑及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及血漿制品領(lǐng)域，具體涉及一種人凝血因子VDI的干熱處理穩(wěn)定劑及其用途。
背景技術(shù)：
人凝血因子VDI是凝血因子的一種，是一種復(fù)合因子，由兩部分組成，其中小分子量(約260KD)部分珊C，具有促凝血活性，在血液凝固的瀑布反應(yīng)過(guò)程中，作為FIXa的輔助因子，使FX激活成FXa，可糾正甲型血友病的凝血異常。以血漿為原料制備人凝血因子VDI是目前市場(chǎng)上的主要人凝血因子VDI產(chǎn)品。人凝血因子VDI制備的常用方法有沉淀法和層析法，沉淀法包括等電點(diǎn)沉淀，鹽析沉淀，醚沉淀，酸沉淀和PEG沉淀等,層析法包括離子交換層析,親和層析等。由于人凝血因子VDI來(lái)源于血漿，有傳播病毒的危險(xiǎn)，因此，在制備過(guò)程中需采用有效的病毒滅活和去除措施。常用的病毒滅活方式有巴氏法，有機(jī)溶劑/去污劑，納米過(guò)濾，光照法和干熱法等。人凝血因子VDI穩(wěn)定性差，不耐熱處理，其穩(wěn)定性受血漿蛋白、抗體、蛋白水解、自身降解等多種因素的影響，凝血酶對(duì)其有雙重作用。因人凝血因子VDI的不穩(wěn)定性，分離純化時(shí)，需在最終配制時(shí)加入保護(hù)劑，使產(chǎn)品能耐受凍干及干熱處理，又不影響干熱處理的病毒滅活效果。申請(qǐng)?zhí)?01110240278. 2，發(fā)明名稱“用于人凝血因子VDI制劑的干熱處理方法及其穩(wěn)定劑”的專利申請(qǐng)文件公開(kāi)了一種人凝血因子VDI的干熱處理穩(wěn)定劑，該穩(wěn)定劑包括人血白蛋白、Ca2+可溶解鹽、氨基酸、檸檬酸三鈉和氯化鈉，其中，人血白蛋白濃度百分比為2%時(shí)，制備的人凝血因子珊的外觀和可見(jiàn)異物才符合規(guī)定，效價(jià)回收率最高約94. 6%。該穩(wěn)定劑由5種成分組成，其中的人血白蛋白濃度高，使用量大，成本極高。申請(qǐng)?zhí)?01210060299.0，發(fā)明名稱“人凝血因子VDI與vW復(fù)合物或人凝血因子VDI的干熱處理穩(wěn)定劑”的專利申請(qǐng)文件公開(kāi)了一種人凝血因子VDI的穩(wěn)定劑，包括氨基酸和/或糖醇，所述糖醇為甘露醇，所述的氨基酸為組氨酸或其鹽，精氨酸或其鹽，賴氨酸或其鹽，糖醇含量為O. 1-10%，氨基酸或其鹽含量O. 1-10%，將該保護(hù)劑加入用層析法制備得到的人凝血因子VDI中，80°C干熱滅活72h，人凝血因子VDI的活性回收率最高僅33. 28%。該穩(wěn)定劑組成成分僅為2種，不需要使用大量人血白蛋白，成本低，但是人凝血因子珊的活性回收率最太低，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新的人凝血因子VDI的干熱處理穩(wěn)定劑以及新的人凝血因子VDI制劑及其制備方法。本發(fā)明人凝血因子珊的干熱處理穩(wěn)定劑，它包括如下配比的成分枸櫞酸鈉O. 005M O. 015M，氯化鈣O. OOlM O. 002M，鹽酸精氨酸O. 15M O. 25M，人血白蛋白6 10g/L(濃度百分比為O. 6 1.0%)。優(yōu)選地，它由如下配比的成分組成枸櫞酸鈉O. 005M^0. 015Μ，氯化鈣O. OOlM O. 002M，鹽酸精氨酸O. 15M O. 25M，人血白蛋白6 10g/L濃度百分比為O. 6 I. 0%)。進(jìn)一步優(yōu)選地，它由如下配比的成分組成枸櫞酸鈉O. 01M，氯化鈣O. 001M，鹽酸精氨酸O. 19M，人血白蛋白8g/L (濃度百分比為0.8%)。前述干熱穩(wěn)定劑在制備人凝血因子VDI的制劑中用途。本發(fā)明人凝血因子珊制劑，它包括前述的干熱穩(wěn)定劑和人凝血因子珊，其中，人凝血因子VDI的濃度為16-28IU/ml。本發(fā)明人凝血因子珊制劑的方法，它包括如下步驟( I)取新鮮冰凍血漿，融化，離心制備冷沉淀，溶解，用聚乙二醇沉淀法沉淀，離心，得上清，SD法病毒滅活，離子交換層析法純化，得到含人凝血因子珊的洗脫液；(2)取含有枸櫞酸鈉、氯化鈣和鹽酸精氨酸的緩沖液，對(duì)步驟(I)所得洗脫液進(jìn)行超濾透析，后加入人血白蛋白；(3)取步驟(2)處理后的洗脫液，除菌、分裝、凍干，干熱處理，即得。其中，步驟(I)所述聚乙二醇沉淀法采用30%聚乙二醇沉淀。其中，步驟(I)所述離子交換層析采用的凝膠為Toyopearl DEAE650M，緩沖液為O. OOIM^O. 05M的枸櫞酸鈉緩沖液。其中，步驟(3)所述干熱處理的溫度為80°C，時(shí)間為72小時(shí)。本發(fā)明人凝血因子珊的干熱處理穩(wěn)定劑既可有效維持人凝血因子珊的活性，又不影響干熱處理的病毒滅活效果，并且成分的種類少，含有的人血白蛋白少，成本低廉。本發(fā)明人凝血因子珊制劑的穩(wěn)定性好，活性高，安全有效，成本低廉，具有良好的臨床應(yīng)用前景。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過(guò)實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)材料枸櫞酸鈉、氯化鈣、鹽酸精氨酸、人血白蛋白、聚乙二醇、氫氧化鋁、Toyopearl DEAE 650M凝膠均為市售品。實(shí)施例I本發(fā)明人凝血因子VDI制劑的制備I、制備方法I、分離純化(I)以新鮮冰凍血漿為原料，經(jīng)血漿融化，離心制備冷沉淀，O. 02MTris緩沖液溶解
冷沉淀，后經(jīng)30%聚乙二醇沉淀，氫氧化鋁吸附后離心，得上清；(2)上清合并澄清后，加入Tween-80和磷酸三丁酯使其最終濃度分別為1%和O. 3%, 250C ±1°C處理6小時(shí)，完成第一次病毒滅活(即SD病毒滅活)；(3)采用以Toyopearl DEAE 650M為凝膠為填料的離子交換層析作進(jìn)一步純化，緩沖液為緩沖液為O. OOlM的枸櫞酸鈉緩沖液，通過(guò)改變層析緩沖液的氯化鈉離子強(qiáng)度，收集得到含人凝血因子VDI的洗脫液。II、配制
(I)用含O. 005M枸櫞酸鈉、O. 0015M氯化鈣、O. 15M鹽酸精氨酸的緩沖液對(duì)步驟I獲得的洗脫液進(jìn)行超濾透析，制得的溶液的成分為人凝血因子珊、枸櫞酸鈉、氯化鈣和鹽酸精氨酸，超濾完成后，加入20%人血白蛋白，使得人血白蛋白的濃度為6g/L ；(2)再進(jìn)行除菌、分裝、凍干，凍干結(jié)束后，作80°C 72小時(shí)的干熱處理，即得。實(shí)施例2本發(fā)明人凝血因子VDI制劑的制備I、制備方法I、分離純化(I)以新鮮冰凍血漿為原料，經(jīng)血漿融化，離心制備冷沉淀，O. 02MTris緩沖液溶解
冷沉淀，后經(jīng)30%聚乙二醇沉淀，氫氧化鋁吸附后離心，得上清；(2)上清合并澄清后，加入Tween-80和磷酸三丁酯使其最終濃度分別為1%和
O.3%, 250C ±1°C處理6小時(shí)，完成第一次病毒滅活(即SD病毒滅活)；(3)采用以Toyopearl DEAE 650M為凝膠為填料的離子交換層析作進(jìn)一步純化，緩沖液為O. 05M的枸櫞酸鈉緩沖液，通過(guò)改變層析緩沖液的氯化鈉離子強(qiáng)度，收集得到含人凝血因子珊的洗脫液。II、配制(I)用含O. 015M枸櫞酸鈉、O. 002M氯化鈣、O. 25M鹽酸精氨酸的緩沖液對(duì)步驟I獲得的洗脫液進(jìn)行超濾透析，制得的溶液成分為人凝血因子珊、枸櫞酸鈉、氯化鈣和鹽酸精氨酸，超濾完成后，加入20%人血白蛋白，使得人血白蛋白的濃度為10g/L ；(2)再進(jìn)行除菌、分裝、凍干，凍干結(jié)束后，作80°C 72小時(shí)的干熱處理，即得。實(shí)施例3本發(fā)明人凝血因子VDI制劑的制備I、制備方法I、分離純化(I)以新鮮冰凍血漿為原料，經(jīng)血漿融化，離心制備冷沉淀，O. 02MTris緩沖液溶解
冷沉淀，后經(jīng)30%聚乙二醇沉淀，氫氧化鋁吸附后離心，得上清；(2)上清合并澄清后，加入Tween-80和磷酸三丁酯使其最終濃度分別為1%和
O.3%, 250C ±1°C處理6小時(shí)，完成第一次病毒滅活(即SD病毒滅活)；(3)采用以Toyopearl DEAE 650M為凝膠為填料的離子交換層析作進(jìn)一步純化,緩沖液為O. 02M的枸櫞酸鈉緩沖液，通過(guò)改變層析緩沖液的氯化鈉離子強(qiáng)度，收集得到含人凝血因子珊的洗脫液。II、配制(I)用含O. OlM枸櫞酸鈉、O. OOlM氯化鈣、O. 19M鹽酸精氨酸的緩沖液對(duì)步驟I獲得的洗脫液進(jìn)行超濾透析，制得的溶液成分為人凝血因子珊、枸櫞酸鈉、氯化鈣和鹽酸精氨酸，超濾完成后，加入20%人血白蛋白，使得人血白蛋白的濃度為8g/L的比例；(2)再進(jìn)行除菌、分裝、凍干，凍干結(jié)束后，作80°C 72小時(shí)的干熱處理，即得。實(shí)施例4本發(fā)明穩(wěn)定劑的篩選試驗(yàn)I、制備方法I、分離純化(I)以新鮮冰凍血漿為原料，經(jīng)血漿融化，離心制備冷沉淀，O. 02MTris緩沖液溶解
冷沉淀，后經(jīng)30%聚乙二醇沉淀，氫氧化鋁吸附后離心，得上清；
(2)上清合并澄清后，加入Tween-80和磷酸三丁酯使其最終濃度分別為1%和
O.3%, 250C ±1°C處理6小時(shí)，完成第一次病毒滅活(即SD病毒滅活)；(3)采用Toyopearl DEAE 650M離子交換層析作進(jìn)一步純化,緩沖液為O. OlM的枸櫞酸鈉緩沖液，通過(guò)改變層析緩沖液的氯化鈉離子強(qiáng)度，收集得到含人凝血因子珊的洗脫液。II、配制(I)按照如下方式分別加入表I所示6種配方中各成分用含鹽酸精氨酸，枸櫞酸鈉，氯化鈣的緩沖液對(duì)獲得的洗脫液進(jìn)行超濾透析，透析完成后加入白蛋白；(2)再進(jìn)行除菌、分裝、凍干，凍干結(jié)束后，作80°C 72小時(shí)的干熱處理(第二次病毒滅活)，即得。2、檢測(cè)F VDI廣品配方優(yōu)劣王要米用的判定指標(biāo)為I.廣品干熱后效價(jià)回收率；2.廣品外觀和可見(jiàn)異物，符合藥典規(guī)定為合格，不符合藥典規(guī)定為不合格。藥典規(guī)定外觀應(yīng)為乳白色疏松體，復(fù)溶后溶液應(yīng)為無(wú)色澄清液體，可帶輕微乳光；可見(jiàn)異物，除允許有微量細(xì)小蛋白顆粒外，其余應(yīng)符合規(guī)定。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表I :表I配方組合試驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種人凝血因子珊的干熱處理穩(wěn)定劑，其特征在于它包括如下配比的成分枸櫞酸鈉O. 005M O. 015M，氯化鈣O. OOlM O. 002M，鹽酸精氨酸O. 15M O. 25M，人血白蛋白6 IOg/L0
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的干熱處理穩(wěn)定劑，其特征在于它由如下配比的成分組成枸櫞酸鈉O. 005M O. 015M,氯化鈣O. OOlM O. 002M,鹽酸精氨酸O. 15M O. 25M,人血白蛋白6 10g/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的干熱處理穩(wěn)定劑，其特征在于它由如下配比的成分組成枸櫞酸鈉O. 01M，氯化鈣O. 001M，鹽酸精氨酸O. 19M，人血白蛋白8g/L。
4.權(quán)利要求廣3任意一項(xiàng)所述的干熱穩(wěn)定劑在制備人凝血因子珊制劑中用途。
5.一種人凝血因子VDI制劑，其特征在于它包括權(quán)利要求f 3任意一項(xiàng)所述的干熱穩(wěn)定劑和人凝血因子珊，其中，人凝血因子VDI的濃度為16-28IU/ml。
6.一種制備權(quán)利要求5所述人凝血因子珊制劑的方法，其特征在于它包括如下步驟(1)取新鮮冰凍血漿，融化，離心制備冷沉淀，溶解，用聚乙二醇沉淀法沉淀，離心，得上清，SD法病毒滅活，離子交換層析法純化，得到含人凝血因子珊的洗脫液；(2)取含有枸櫞酸鈉、氯化鈣和鹽酸精氨酸的緩沖液，對(duì)步驟(I)所得洗脫液進(jìn)行超濾透析，后加入人血白蛋白；(3)取步驟(2)處理后的洗脫液，除菌、分裝、凍干，干熱處理，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟(I)所述聚乙二醇沉淀法采用30%聚乙二醇沉淀。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟(I)所述離子交換層析采用的凝膠為Toyopearl DEAE 650M，緩沖液為O. OOIM^O. 05M的枸櫞酸鈉緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于步驟(3)所述干熱處理的溫度為80°C，時(shí)間為72小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人凝血因子Ⅷ的干熱處理穩(wěn)定劑，它包括如下配比的成分枸櫞酸鈉0.005M~0.015M，氯化鈣0.001M~0.002M，鹽酸精氨酸0.15M~0.25M，人血白蛋白6~10g/L。本發(fā)明還公開(kāi)了一種人凝血因子Ⅷ制劑及其制備方法。本發(fā)明人凝血因子Ⅷ的干熱處理穩(wěn)定劑可有效維持人凝血因子Ⅷ的活性，成本低廉，具有良好的臨床應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K38/37GK102924562SQ201210468069
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月19日
發(fā)明者牟蕾, 魯濤, 王黔川, 李偉, 余偉 申請(qǐng)人:成都蓉生藥業(yè)有限責(zé)任公司