專利名稱：微泡在制備用于聯(lián)合診斷級超聲作為提高腫瘤微血管通透性藥物的用途的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明特別涉及微泡在制備用于聯(lián)合診斷級超聲作為提高腫瘤微血管通透性藥物的用途，屬于非創(chuàng)傷性超聲治療的技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
臨床腫瘤化療時，通過使用抗癌藥物及免疫調(diào)節(jié)劑等藥物直接攻擊腫瘤細胞來治療實體腫瘤，但是實際應用時，由于受到腫瘤脈管系統(tǒng)屏障的影響，難以取得滿意的療效。為使腫瘤區(qū)達到有效治療濃度必須加大藥物劑量，這往往伴隨著較大的毒副作用。因此增加腫瘤微血管通透性可以提高藥物在腫瘤區(qū)的蓄積以增加療效，從而減少藥量和毒副作 用。目前增加腫瘤血管通透性的方法主要有以下幾種I.腫瘤血管內(nèi)皮、基底膜及腫瘤基質(zhì)中可能存在一些潛在的提高血管通透性的靶部位。通過制作攜帶活化血管的載體分子，使之導至血管內(nèi)皮或內(nèi)皮下層組分可以提高藥物作用區(qū)域血管通透性。不足之處是特異性不強，在提高腫瘤血管通透性的同時，對正常組織血管活性也會不加選擇的盲目影響，可能導致血壓調(diào)節(jié)障礙、水腫等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量和生命。2.通過對給藥大分子進行修飾，改變其理化性質(zhì)，有助于其穿過血管內(nèi)皮進人腫瘤組織。例如人們發(fā)現(xiàn)蛋白用某些酐類進行溫和的化學修飾后，可增加原形蛋白藥物在淋巴系統(tǒng)的分布。這種電荷修飾方法可以用來選擇性增加血管內(nèi)皮導向的藥物抗癌制劑與其他大分子藥物在腫瘤中的分布。不足之處是經(jīng)過理化修飾后會改變多數(shù)藥物的活性，使藥物在腫瘤組織中代謝活動變化，治療效果不理想。3.局部穿刺腫瘤組織給藥，雖可使部分藥物進入腫瘤組織內(nèi)部，但為創(chuàng)傷性手段，容易損傷周圍組織，而且可能會造成腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。4.有研究報道高頻率的超聲聯(lián)合微泡方法可暫時提高腫瘤血管內(nèi)皮的通透性，。但是現(xiàn)有的研究中，都集中在聞頻超聲中，如聚焦超聲和治療超聲，這類聞強度超聲都存在以下問題頻率過高，容易對照射周圍組織造成損傷，照射時間太短，效果不理想；缺少病變監(jiān)控系統(tǒng)，不能對病變區(qū)域進行實時、選擇性的超聲輻照。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供微泡在制備用于聯(lián)合診斷級超聲作為提高腫瘤微血管通透性藥物的用途。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案微泡在制備用于聯(lián)合診斷級超聲作為提高腫瘤微血管通透性藥物的用途，所述微泡是超聲照影劑微泡，所述診斷級超聲的形式頻率范圍為I. 7 3. 0MHz，機械指數(shù)范圍為O. 8 I. 4。
所述微泡采用靜脈注射的給藥方式，微泡使用劑量為每公斤體重200 500 μ I。所述診斷超聲的輻照時間為5 10分鐘。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果I、本發(fā)明設計的診斷超聲輻照微泡誘導的超聲空化物理效應產(chǎn)生顯著的生物學效應，即聲孔效應，引起周圍血管內(nèi)皮細胞被"超聲打孔"導致血管通透性增高，使藥物更容易通過內(nèi)皮間隙進入細胞，提高腫瘤細胞內(nèi)藥物的濃度，以減少藥量和毒副作用的發(fā)生，該方案安全有效，效果理想；2、超聲治療儀或者聚焦超聲功率較大，在提高血管通透性的同時往往會伴隨周圍細胞的損傷，診斷級超聲功率相對較小，在聯(lián)合微泡進行治療時對周圍正常組織活細胞造成的損傷較小；
3、使用診斷級超聲，并且能夠準確判斷病變的位置以及周圍結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)靶向性導入特點組織，在治療的同時能夠?qū)崟r監(jiān)測，減少周圍正常組織產(chǎn)生破壞；4、本發(fā)明是首次提出微泡在制備用于聯(lián)合診斷級超聲作為提高腫瘤微血管通透性藥物的用途，可能為將來超聲聯(lián)合微泡技術(shù)在安全、經(jīng)濟的基礎上最大可能提高腫瘤區(qū)藥物的生物學效應提供實驗依據(jù)。本發(fā)明治療方法如下選用診斷超聲聞頻探頭顯不最佳腫瘤部位，周圍組織結(jié)構(gòu)，并觀察血供情況，超聲成像顯示最佳腫瘤影像后即在體表處標記；經(jīng)靜脈注射所需微泡的情況下，經(jīng)診斷超聲顯示在微泡灌注高峰期時，選擇低頻診斷超聲探頭輻照超聲造影劑灌注的腫瘤組織選擇4Ρ1探頭，調(diào)節(jié)頻率和ΜΙ，用設定參數(shù)的治療超聲定點照射腫瘤區(qū)。治療效果評價程序腫瘤區(qū)屏障開放程度，可以用微血管示蹤劑伊文思藍示蹤定量，一般情況下伊文思藍進入血液系統(tǒng)后，與血液中血紅蛋白結(jié)合成大分子物質(zhì)，不會滲透到血管外反映。屏障開放后，伊文思藍可以滲透到腫瘤組織中，進行腫瘤組織中EB含量測定和熒光顯微鏡觀察。


圖I是不同處理組的皮下移植瘤模型的SD大鼠腫瘤組織EB含量的變化示意圖；圖2是激光共聚焦觀察不同處理組腫瘤組織內(nèi)EB外滲圖，a :空白對照組腫瘤組織EB分布圖像；b :單純微泡組腫瘤組織EB分布圖像；c :單純診斷超聲輻照組腫瘤組織EB分布圖像；d :診斷超聲聯(lián)合微泡組組腫瘤組織EB分布圖像；圖3是蛋白質(zhì)印跡法檢測各實驗組P-選擇素蛋白與內(nèi)參蛋白濃度對比圖；圖4是蛋白質(zhì)印跡法檢測各實驗組P-選擇素蛋白表達的改變示意圖。
具體實施例方式將48只已建立Walker-256皮下移植瘤模型的SD大鼠隨機分為以下四組空白對照組A ;單純微泡劑組B ;單純診斷超聲輻照組C ;診斷超聲聯(lián)合微泡組D。給單純微泡劑組和微泡聯(lián)合診斷超聲組的大鼠尾靜脈注射微泡造影劑300 μ Ι/kg，再給四組皆注射伊文氏藍(Evens Blue,EB)指示劑，選擇頻率為1·75ΜΗζ,機械指數(shù)(mechanical index,Ml)為I.4的診斷超聲持續(xù)照射腫瘤區(qū)7min。使用分光光度計和標準曲線法測量大鼠腫瘤組織內(nèi)EB含量變化，激光共聚焦顯微鏡觀察EB外溢情況以證實大鼠移植瘤微血管通透性的改變。同時采用透射電鏡觀察血管內(nèi)皮細胞及細胞連接的相關(guān)變化；蛋白質(zhì)印記法檢測P-選擇素蛋白(血管內(nèi)皮細胞完整性的生物標志物)的相關(guān)變化。結(jié)論I、如圖I、圖2所示，單純診斷超聲輻照組C、單純微泡組B、空白對照組A腫瘤組織的EB含量兩兩相比差異無統(tǒng)計學意義(P < O. 05)，激光共聚焦觀察可見紅色光斑主要集中在血管壁，血管周圍組織紅色光斑不明顯，說明單純超聲輻照和單純微泡組血管通透性無明顯增加，EB外滲不明顯。而微泡聯(lián)合診斷超聲組D腫瘤組織內(nèi)EB含量為約為對照組的5倍，激光共聚焦觀察可見紅色光斑主要集中在血管壁和周圍組織，EB外滲明顯，表明微泡聯(lián)合診斷超聲可以顯著提高腫瘤微血管通透性。2、應用透射電鏡觀察大鼠移植瘤血管內(nèi)皮細胞變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)微泡聯(lián)合診斷超聲組腫瘤血管內(nèi)皮細胞腫脹，細胞連接可逆性中斷。 3、如圖3、圖4所示,微泡聯(lián)合診斷超聲組P-selectin蛋白明顯高于其余各組,說明腫瘤血管內(nèi)皮細胞完整性受損，內(nèi)皮細胞之間的連接狀況與對照組相比明顯減弱，說明腫瘤微血管通透性明顯提高。以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本領域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明結(jié)構(gòu)的前提下，還可以作出若干變形和改進，這些也應該視為本發(fā)明的保護范圍，這些都不會影響本發(fā)明實施的效果和專利的實用性。
權(quán)利要求
1.微泡在制備用于聯(lián)合診斷級超聲作為提高腫瘤微血管通透性藥物的用途，其特征在于，所述微泡是超聲照影劑微泡，所述診斷級超聲的形式頻率范圍為I. 7 3. ΟΜΗζ，機械指數(shù)范圍為O. 8 I. 4。
2.如權(quán)利要求I所述微泡在制備用于聯(lián)合診斷級超聲作為提高腫瘤微血管通透性藥物的用途，其特征在于，所述微泡采用靜脈注射的給藥方式，微泡使用劑量為每公斤體重200 500 μ I ο
3.如權(quán)利要求I所述微泡在制備用于聯(lián)合診斷級超聲作為提高腫瘤微血管通透性藥物的用途，其特征在于，所述診斷超聲的輻照時間為5 10分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了微泡在制備用于聯(lián)合診斷級超聲作為提高腫瘤微血管通透性藥物的用途，所述微泡為超聲照影劑微泡，所述診斷級超聲的形式頻率范圍為1.7～3.0MHz，機械指數(shù)范圍為0.8～1.4，所述微泡采用靜脈注射的給藥方式，微泡使用劑量為每公斤體重200～500μl，所述診斷超聲的輻照時間為5～10分鐘，微泡的該用途適用于提高腫瘤微血管的通透性，能安全、靶向性導入特點組織，并且可以利用這一效應實現(xiàn)非創(chuàng)傷性藥物釋放或基因轉(zhuǎn)染。
文檔編號A61P43/00GK102836119SQ20121030552
公開日2012年12月26日 申請日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者王龔, 卓忠雄, 何芬, 譚偉華, 何穎 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院