專利名稱：鯽魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鯽魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑及其基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor)泛指具有抑制絲氨酸蛋白酶活性作用的一類物質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物體中。在動(dòng)物體中，絲氨酸蛋白酶抑制劑是維持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，一旦平衡失調(diào)即導(dǎo)致多種疾病，任何影響其活性的因素也會(huì)造成嚴(yán)重的病理性疾病。它們最基本的功能是防止不必要的蛋白水解，調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶的水解平衡。作為調(diào)控物，絲氨酸蛋白酶抑制劑在機(jī)體的生理活動(dòng)中扮演著重要的角色，如激活酶原、釋放激素的前體物、參與機(jī)體免疫反應(yīng)、血液凝固、補(bǔ)體形成、蛋白質(zhì)折疊、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、細(xì)胞基質(zhì)重建、血壓調(diào)節(jié)、腫瘤抑制以及病毒或寄生蟲致病性的形成等。鑒于其重要的生理功能，絲氨酸蛋白酶抑制劑一直倍受研究者的關(guān)注，目前已分離得到多種天然的絲氨酸蛋白酶抑制劑，同時(shí)如何將其更好地應(yīng)用于人類也已成為國際研究的熱點(diǎn)。而其研究與開發(fā)則蘊(yùn)含著巨大的臨床治療藥物制備價(jià)值。人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV),顧名思義它會(huì)造成人類免疫系統(tǒng)的缺陷。1981年，人類免疫缺陷病毒在羞里首次發(fā)現(xiàn)。它是一種感染人類免疫系統(tǒng)迦胞的慢病毒(Lentivirus)，屬反轉(zhuǎn)錄病毒的一種。至今無有效療法的致命性傳染病。該病毒破壞人體的免疫能力，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)的失去抵抗力，而導(dǎo)致各種疾病及癌癥得以在人體內(nèi)生存，發(fā)展到最后，導(dǎo)致艾滋病，自1988年Kohl等的實(shí)驗(yàn)證明HIV蛋白酶是HIV感染和復(fù)制的必需酶，可以作為抗AIDS藥物的靶點(diǎn)以來，人們已合成和篩選到近百種有抗病毒活性的化合物。通過與逆 轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的聯(lián)合治療來減少HIV陽性患者體內(nèi)攜帶的病毒；然而，即使在單一治療中仍具有很強(qiáng)的效力。HIV蛋白酶在Phe-Pro，Phe-Leu，Phe-Thr的特異性剪切，使得抑制劑的設(shè)計(jì)必須具備高度可變性。目前，有8類蛋白酶抑制劑用于HIV治療，包括替拉那韋，印地那韋，沙奎那韋，洛匹那韋。新一代的抑制劑正在被開發(fā)以發(fā)揮最大的療效，來治療病患。目前治療HIV的第二代蛋白酶抑制劑TMC-114已進(jìn)入臨床III階段測試中。據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道,絲氨酸蛋白酶抑制劑如aprotinin除已在臨床上廣泛用于胃炎、胰腺炎等疾病的治療外，也在胸外科手術(shù)中用于抗纖溶，抑制接觸性激活、抗炎癥等。絲氨酸蛋白酶類似物如Kallikrein, tryptase在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及許多炎癥中(如鼻炎、結(jié)膜炎、哮喘、胃腸炎、心血管系統(tǒng)炎癥)發(fā)生中起著重要的作用。臨床試驗(yàn)證明其抑制劑是有效地治療藥物。另一方面。目前臨床上還沒有有效地治療皰疹病毒感染的藥物，近年來發(fā)現(xiàn)，抑制皰疹病毒絲氨酸蛋白酶是有效的治療手段。鯽魚魚卵作為一種豐富的水產(chǎn)資源，其綜合利用潛力有待進(jìn)一步開發(fā)，以提高其附加值。研究表明，魚卵中存在多種蛋白酶抑制劑成分，在魚卵中除執(zhí)行生理調(diào)節(jié)功能外，在病原生物防御中也起到了重要作用。然而，截止目前為止只對(duì)少數(shù)魚卵中的蛋白酶抑制劑進(jìn)行了研究，且大多集中于半胱氨酸蛋白酶抑制劑的研究。因此，對(duì)其進(jìn)行研究顯得極為必要，既可以進(jìn)一步揭示魚類的自身防御機(jī)制，探討其在魚卵中生理、防御功能，又可為其在食品醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。發(fā)明人降本發(fā)明的鯽魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑全序列氨基酸結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同多肽。發(fā)明人將本發(fā)明的鯽魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)任何相同基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是基于上述現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，提供一種具有強(qiáng)烈的絲氨酸蛋白酶抑制劑活性，同時(shí)具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞生長抑制活性和免疫調(diào)節(jié)活性的鯽魚卵絲氨酸蛋白酶抑制其基因和在制藥中的應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案鯽魚卵絲氨酸蛋白酶抑制劑成熟蛋白質(zhì)序列:鯽魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑，其特征在于從鯽魚卵中分離得到的一種環(huán)狀蛋白酶抑制劑，分子量42651. 9Da,等電點(diǎn)5. 61,無酶活性，鯽魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑成熟序列為谷氨酸-丙氨酸-組氨酸-脯氨酸-絲氨酸-組氨酸-絲氨酸-甘氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-半胱氨酸-組氨·酸-亮氨酸-亮氨酸-絲氨酸-脯氨酸-組氨酸-天冬酰胺-丙氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-亮氨酸-酪氨酸-賴氨酸-賴氨酸-亮氨酸-丙氨酸-亮氨酸-組氨酸-脯氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸-賴氨酸-天冬酰胺-異亮氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-脯氨酸-纈氨酸-甘氨酸-異亮氨酸-絲氨酸-甲硫氨酸-丙氨酸-亮氨酸-絲氨酸-甲硫氨酸-亮氨酸-丙氨酸-纈氨酸-甘氨酸-丙氨酸-賴氨酸-甘氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-亮氨酸-絲氨酸-谷氨酰胺-異亮氨酸-酪氨酸-絲氨酸-絲氨酸-亮氨酸-甘氨酸-酪氨酸-絲氨酸-甘氨酸-亮氨酸-賴氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-繳氨酸-天冬酰胺-谷氨酸-甘氨酸-酪氨酸-谷氨酸-組氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-組氨酸-蛋氨酸-亮氨酸-甘氨酸-組氨酸-絲氨酸-谷氨酰胺-天冬氨酸-絲氨酸-蛋氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-谷氨酸-丙氨酸-甘氨酸-丙氨酸-甘氨酸-纈氨酸-丙氨酸-異亮氨酸-精氨酸-谷氨酸_甘氨酸_苯丙氨酸_賴氨酸_纟顏氨酸_纟顏氨酸_天冬氨酸_谷氨酰胺_苯丙氨酸_売氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-谷氨酰胺-組氨酸-酪氨酸-酪氨酸-天冬酰胺-絲氨酸-谷氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-纈氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-賴氨酸-脯氨酸-谷氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-丙氨酸-谷氨酸-谷氨酸-異亮氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺-苯丙氨酸-異亮氨酸-丙氨酸-賴氨酸-賴氨酸-蘇氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸-蛋氨酸-纈氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-天冬氨酸-絲氨酸-天冬氨酸-蛋氨酸-纈氨酸-蛋氨酸-蛋氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-天冬酰胺-酪氨酸-甲硫氨酸-酪氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-賴氨酸-色氨酸-天氨酸-賴氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-丙氨酸-谷氨酰胺-亮氨酸-蘇氨酸-組氨酸-賴氨酸-丙氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-賴氨酸-纈氨酸-天氨酸-賴氨酸-天氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-谷氨酰胺-纈氨酸-天氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-賴氨酸-精氨酸-蘇氨酸-甘氨酸-精氨酸-酪氨酸-天氨酸-異亮氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-天氨酸-脯氨酸-纈氨酸-天冬酰胺-谷氨酰胺-蘇氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-纈氨酸-脯氨酸-酪氨酸-賴氨酸-甘氨酸-天冬酰胺-蘇氨酸-絲氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-異亮氨酸-纈氨酸-亮氨酸-脯氨酸-天氨酸-谷氨酸-甘氨酸-賴氨酸-甲硫氨酸-賴氨酸-天氨酸-纈氨酸-谷氨酸-谷氨酸-絲氨酸-異亮氨酸-半胱氨酸-精氨酸-組氨酸-組氨酸-亮氨酸-賴氨酸-天冬酰胺-色氨酸-組氨酸-天氨酸-賴氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-絲氨酸-絲氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-賴氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-異亮氨酸-絲氨酸-丙氨酸-蘇氨酸-絲氨酸-賴氨酸-亮氨酸-天冬酰胺-天冬氨酸-異亮氨酸-亮氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸-纈氨酸-蘇氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-天冬氨酸-蘇氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-絲氨酸-甘氨酸-甲硫氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-谷氨酸-亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-賴氨酸-纈氨酸-絲氨酸-谷氨酰胺-纈氨酸-纈氨酸-組氨酸-賴氨酸-丙氨酸-纈氨酸-亮氨酸-絲氨酸-纈氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-賴氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸-蘇氨酸-蘇氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-異亮氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-甲硫氨酸-絲氨酸-亮氨酸-脯氨酸-甘氨酸-蘇氨酸-纈氨酸-甲硫氨酸-亮氨酸-天冬酰胺-精氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-纈氨酸-谷氨酸-天冬氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-賴氨酸-絲氨酸-異亮氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸-甘氨酸-賴氨酸-異亮氨酸-蘇氨酸-天冬酰胺-脯氨酸-蘇氨酸-纈氨酸。鯽魚卵絲氨酸蛋白酶抑制劑的serpin基因克隆包括鯽魚卵絲氨酸蛋白酶抑制劑鯽魚卵總RNA提取，RNA濃度測定，RNA反轉(zhuǎn)錄，引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增篩選鯽魚卵絲氨酸蛋白酶抑制劑，RACE擴(kuò)增鯽魚卵中serpin基因3’端和5’端的引物設(shè)計(jì)等。擴(kuò)增引物長度23個(gè)核苷酸，其序列為5’ ATGTTCACCATGAAGAAATCCCT3’，PCR另一擴(kuò)增引物為CL0NTECH公司 SMART cDNALibrary Construction Kit 中的 3’PCRPrimer引物，其序列為5’ ATTCTACAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3’所獲陽性單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測定。基因測序結(jié)果表明編碼鯽魚卵絲氨酸蛋白酶抑制劑基因核苷酸序列，其特征=CDNA由1230個(gè)核苷酸組成，其自5’端至3’端序列為

atggcctgggccgcgcctcacgaaggtcatgaccatgacggccacccagctgatcactaccaccatctccaccac 75gggaaggacgaagcccaccccagccacagtggggaggatgcctgccatctgctttctccacacaacgctgacttt 150gccttctccctctacaagaaacttgcgctccatcctgatgcccagggcaagaacattttcttctccccggtcggt 225atctcaatggctttgagcatgctggctgtaggtgccaagggtagcactctatcacaaatatacagcagtctgggt 300tacagcgggctgaaggctcagcaggtcaatgagggctatgagcacttgatccacatgcttggccacagtcaggac 375agcatgcagctggaggcaggtgctggtgtggccatcagagaaggcttcaaagtggttgaccagttcctgaaggac 450gttcagcactactacaacagcgaagccttcagcgttgacttctccaagcctgaaatcgctgcagaagagattaac 525cagttcatcgccaagaaaaccaatgataaaataaccgacatggtgaaggacctggactctgatatggtgatgatg 600ctgattaactatatgtacttcagagggaagtgggataagccatttgaagcacaactgactcacaaagctgagttc 675aaagtggacaaggacaccaccgtgcaagttgacatgatgaaaagaaccggccgctatgacatctatcaagaccct 750gtcaaccaaactacggtcatgatggtgccatacaaaggcaatacttccatgatgatcgttcttcctgatgaaggg 825aagatgaaggatgttgaagaatccatctgcaggcaccatcttaagaactggcatgataaactcttcagaagctct 900gtggacctgttcatgcccaagttctccatctctgcaacgtccaaactgaatgacattctgactgaaatgggagtg 975
actgatgcattcagtgacacagcagatttctctgggatgacagaagagctcaaagtgaaggtgtcacaggtcgtg 1050cataaggcagtcctcagtgtggatgagaagggcacagaggcagcggccgcaaccacaatagagatcatgcccatg 1125tccctgccaggcactgtgatgctcaaccgacctttcttggtactgattgtggaggacagcaccaagagcatcctc 1200ttcatgggcaagattaccaatcctacagtg1230編碼鯽魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑成熟序列的為85-1230位核苷酸,鯽魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑基因作為基因工程制備鯽魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑的應(yīng)用。


圖1 :鯽魚卵中CaSPI抑制CaSPI與trypsin結(jié)合比抑制曲線具體實(shí)施例方式1、鯽魚卵總RNA提取提取所用離心管、槍頭、槍盒等均經(jīng)O. 1% DEPC水浸泡過夜并高壓滅菌處理，所用研缽、玻璃勻漿器、鑷子及剪刀均經(jīng)180°C高溫處理2. 5h。具體操作步驟為 取鯽魚卵樣品，約lOOmg，加入液氮研磨成粉術(shù)，倒入玻璃勻漿器中丨加入Iml Trizol Reagent進(jìn)一步研磨樣品將勻漿樣品轉(zhuǎn)移至1. 5mlEP管(DEPC管)15_30°C放置5minI 加入 200 μ I 氯仿,劇烈振蕩 3min, 4°C, 12000 X g 離心 15min吸取上清至新離心管并加入與上清等體積的異丙醇，室溫靜置IOmin丨 4 , 12000 X g 離心 IOmin棄上清并加入Iml 75%的乙醇清洗沉淀丨 4 , 7500Xg 離心 IOmin棄上清，室溫放置干燥，加DEPC水20-50 μ I溶解，_70°C保存?zhèn)溆谩?、RNA濃度測定取I μ I上述溶于DEPC水的總RNA置于Nanodrop 2000c測定RNA濃度。根據(jù)所測RNA濃度調(diào)整反轉(zhuǎn)錄時(shí)所加RNA模板用量為I μ g。3、RNA 反轉(zhuǎn)錄按照如下配制cDNA合成反應(yīng)體系并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
權(quán)利要求
1.鯽魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑，其特征在于該鯽魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑從鯽魚卵中分離得到的一種環(huán)狀蛋白酶抑制劑，分子量42651. 9Da，等電點(diǎn)為pH 5. 61 ±0.02，鯽魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白質(zhì)全序列為SEQ NO :1。
2.鯽魚卵絲氨酸蛋白酶抑制劑基因，其特征在于核苷酸序列cDNA由1230個(gè)核苷酸組成，其序列為SEQ NO :2。
3.權(quán)利要求2所述的鯽魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑基因，其特征在于，編碼鯽魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑成熟序列的為85-1230位核苷酸，其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列為SEQ NO :1。
4.權(quán)利要求1所述鯽魚卵絲氨酸蛋白酶抑制劑在制備抑菌、腫瘤、胃炎、胰腺炎和/或癌癥等疾病的藥物應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及鯽魚卵中絲氨酸蛋白酶抑制劑及其基因和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過常規(guī)的生物化學(xué)手段，從鯽魚卵中分離純化得到絲氨酸蛋白酶抑制劑，分子量42651.9Da，等電點(diǎn)5.61，鯽魚卵絲氨酸蛋白酶抑制劑具有對(duì)絲氨酸蛋白酶強(qiáng)烈的抑制活性的特點(diǎn)，且不易產(chǎn)生耐藥性，可以為制備腫瘤、胃炎、胰腺炎、癌癥等疾病的藥物應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P1/04GK103044542SQ20121029651
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月17日
發(fā)明者韓曜平, 郭強(qiáng), 劉晶晶, 徐建榮, 顧志良, 梁化亮, 吳杰, 薛飛, 王立 申請(qǐng)人:常熟理工學(xué)院