專利名稱：一種昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin及其制備和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術領域，具體的說是一種昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin及其制備和應用。
背景技術：
隨著青霉素等傳統(tǒng)抗生素的大規(guī)模和不恰當使用，微生物對傳統(tǒng)抗生素產生了越來越強的耐受性，在臨床上已經出現(xiàn)了大量能夠完全耐受青霉素等傳統(tǒng)抗生素的微生物，已有的抗生素對這些病原微生物無能為力?？咕氖且环N新型的抗微生物多肽，大多數(shù)抗菌肽分子量小于lOOOODa，帶正電，富含疏水堿基，能夠形成兩親性的結構?？咕牡臍⒕鷻C制主要是通過靜電相互作用吸引并結合到帶負電的細菌細胞膜表面，進一步在細菌細胞膜上形成跨膜的孔洞，導致細菌細胞內容物的外泄，從而導致細菌細胞的死亡。而傳統(tǒng)抗生素主要是作用于細菌細胞內的一些酶類。正是由于作用方式的不同，抗菌肽介導的殺菌作用遠遠快于傳統(tǒng)抗生素，并且不易使細菌產生耐受性。除此之外，越來越多的文獻報道表明抗菌肽還具有其他的殺菌機制，如抑制細菌細胞壁合成、改變細菌細胞質膜抑制隔膜形成、激活自溶素、抑制細胞內酶活性、抑制DNA、RNA和蛋白質的合成等。兩棲類動物作為水生和陸生動物的中間類群，其生活環(huán)境惡劣，容易滋生各種病原微生物。為了避免微生物感染，兩棲類動物進化出強大的先天免疫系統(tǒng)，用以抵抗病原微生物的侵襲。其中抗菌肽是兩棲類動物先天免疫系統(tǒng)中的重要組分，在兩棲類動物抵御外界微生物侵襲過程中發(fā)揮了重要的作用。到目前為止，已從各種兩棲類動物中發(fā)現(xiàn)大量抗菌肽，這些抗菌肽具有不同的結構和抗菌活性，是新型多肽類抗微生物藥物開發(fā)的優(yōu)良模板庫。目前，國外對多種兩棲類抗菌肽進行了研究開發(fā)，已有多種進入臨床試驗階段。如來源于非洲爪蟾抗菌肽magainin的改造體MSI-78對糖尿病患者的足部潰瘍有顯著療效且副作用小，已進入臨床III期試驗階段。昆箭林娃(Rana kunyuensis)屬于兩棲綱無尾目娃科娃屬，為中國特有種,僅分布于山東省煙臺市昆崳山。目前關于昆崳林蛙形態(tài)、發(fā)育和分子進化已有報道，但是關于昆崳林蛙抗菌肽的研究還沒有報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種昆箭林娃(Rana kunyuensis)抗菌肽Kunyuenin及其制備和應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為—種昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin,昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin為環(huán)狀多肽,分子量1584. 97Da，等電點 8. 96。所述昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin氨基酸序列為Phe1 Leu2 Pro3 Phe4 Phe5 Ala6 Ala7 Cys8 Ala9 lie10 Thr11 Arg12 Lys13 Cys140所述編碼昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin前體的基因由279個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為 atgttcaccttgaagaaatccctgttgcttcttttcttccttgggatcatcaacgtatct 60ctctgtgaggaagagagaaatgccgaggaagaaagaagagatgatcccgaagaaagggcc 120gttgaggtggaaaaaagatttttaccattttttgcagcatgtgcaattaccagaaaatgt 180ggaaaatgatttttctaaatacacatcgggtgtcttataaaaaataaagatgaagcctac 240昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin的制備方法,所述抗菌肽是以化學合成方法產生,氧化環(huán)化，其中兩個半胱氨酸殘基之間形成一對分子內二硫鍵，C末端酰胺化。
昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin的應用，所述昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin用于制備抗微生物藥物或化妝品添加劑的用途。本發(fā)明所具有的優(yōu)點本發(fā)明克隆得到昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin的編碼基因，并利用化學合成的方法合成了 Kunyuenin。該抗菌肽分子量小，對金黃色葡萄球菌和星形諾卡菌具有強的殺滅作用。同時還具有低的溶血活性和一定的抗氧化活性。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發(fā)明的實質性內容，但本發(fā)明的內容并不局限于此。實施例I昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin基因克隆I)昆崳林蛙皮膚總RNA提?、偃?00mg昆崳林蛙皮膚組織，放入研缽中加入液氮研磨成粉末，轉移到EP管中，加入Iml總RNA提取緩沖液(Trizol,美國Invitrogen公司產品)，充分混勻，而后于4°C,12000rpm 離心 lOmin。②離心取上清，加入O. 2ml氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，而后以4°C，12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀。③上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，以4°C，12000rpm離心10分鐘，收集沉淀用75% (V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為昆崳林蛙皮膚總RNA。2)昆崳林蛙皮膚cDNA文庫構建采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit。(I) cDNA第一鏈合成(mRNA反轉錄):①經DEPC處理(DEPC處理是在含0. I % (V/V) DEPC的水浸泡過夜，高壓滅菌，烘干)的離心管中加入I P I昆箭林娃皮膚總RNA、1 μ I 3’端一鏈合成引物(3’ In-FusionSMARTer CDS Primer)和 2. 5 μ I 經 DEPC 處理(DEPC 處理是將含 0. I % (V/V) DEPC 的水，放置過夜，高壓滅菌)的水使總體積達到4. 5μ 1，混勻后短暫離心(2000rpm，30s)，離心后于72°C保溫3分鐘；保溫后再將離心管在42°C孵育2分鐘。②在上述離心管中加入以下試劑(均為CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建庫試劑盒中配備),2. 0 μ I 5Χ 第一鏈緩沖液、0·25μ1 IOOmM DTTU. 0μ I IOmM dNTPMix、I. O μ I SMARTer V Oligonucleotide、0. 25 μ I RNase Inhibitor 和 I. 0 μ I SMARTScribe Reverse Transcriptase 反轉錄酶，混合離心管中試劑并短暫離心(2000rpm,30s),在42°C保溫90min,然后68°C保溫lOmin。保溫處理后將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2μ I所合成的cDNA第一鏈備用。(2)采用長末端聚合酶鏈式反應(LD-PCR)方法擴增第二鏈(所用試劑均為CL0NTECH 公司 In-Fusion SMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 建庫試劑盒中配備)①將2μ1 cDNA 第一鏈(mRNA 反轉錄)、80 μ I 去離子水、10 μ I IOXAdvantage2PCR 緩沖液、2μ1 50 XdNTP 混合物、2 μ I 5’PCR 引物、2μ1 CDS III/3’PCR 引物以及 2 μ I50 X Advantage 2 Polymerase Mix 在 95°C預熱的 PCR 管中進行混合。②在PCR 儀中按以下程序擴增95°C，lmin ; 18 個循環(huán)95°C，15sec，65°C，30sec，68°C，6min。循環(huán)結束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈一 80°C保存。(3)昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin基因克隆篩選根據(jù)蛙科抗菌肽信號肽區(qū)保守序列設計正向引物進行PCR擴增，其序列為 5’ -CCAAAGATGTTCACCTTGAAG-3’，PCR 另一擴增引物為 CL0NTECH 公司 In-FusionSMARTer Directional cDNA Library Construction Kit 中的 3’ -PCR 引物，其序列為5’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。PCR 反應在如下條件下進行94°C 4min,94°C 30sec,57°C 30seC和72°C lmin，30個循環(huán)。擴增完成后用膠回收試劑盒(天根生物)進行目的片段回收。將回收的目的片段連接到PMD19-T載體(Takara，大連)，轉化進CaCl2-MgCl2法制備好的DH5 α感受態(tài)細胞。涂板并進行氨芐青霉素和藍白斑雙重篩選，挑取單菌落用Μ13引物PCR檢測插入片段大小。挑取陽性菌落,搖菌提取質粒,使用Applied Biosystems DNAsequencer, model ABI PRISM 377 進行核苷酸測序。測定結果編碼昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin前體的基因自5’端至3’端序列SEQ ID No. I所示atgttcaccttgaagaaatccctgttgcttcttttcttccttgggatcatcaacgtatct 60ctctgtgaggaagagagaaatgccgaggaagaaagaagagatgatcccgaagaaagggcc 120gttgaggtggaaaaaagatttttaccattttttgcagcatgtgcaattaccagaaaatgt 180ggaaaatgatttttctaaatacacatcgggtgtcttataaaaaataaagatgaagcctac 240昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin基因核苷酸的序列表為序列長度為279個堿基，序列類型核酸，鏈數(shù)單鏈，拓撲學直鏈狀，序列種類cDNA，來源昆崳林蛙皮膚。實施例2昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin的化學合成I、昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin的化學合成方法根據(jù)基因推導的成熟肽氨基酸序列，用自動多肽合成儀(433A, Applied Biosystems)合成其全序列,通過HPLC反相柱層析脫鹽。II、分子量測定采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-T0F)。III、純化的昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測定采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-T0F)，等電聚焦電泳測定等電點，用自動氨基酸測序儀測定氨基酸序列結構。昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin是昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin基因編碼的一種環(huán)狀多肽，含有十四個氨基酸殘基，分子量1584. 97Da，等電點8. 96。昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin全序列為苯丙氨酸一売氨酸一脯氨酸一苯丙氨酸一苯丙氨酸一丙氨酸一丙氨酸一半胱氨酸一丙氨酸一異亮氨酸一蘇氨酸一精氨酸一賴氨酸一半胱氨酸，其中兩個半胱氨酸殘基之間形成一對分子內二硫鍵，且C末端酰胺化。實施例3昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin藥理實驗I.昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin抗菌活性檢測分別挑取保存于斜面上的試驗菌株(金黃色葡萄球菌ATCC25923、金黃色葡萄球菌090223+和星形諾卡菌090312+)均勻涂布于MH固體培養(yǎng)基(購自青島海博生物技術有限公 司)平板上，將經過滅菌的O. 5cm直徑的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加溶解于滅菌去離子水的2mg/ml的昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin樣品溶液10 μ I,于37O倒置培養(yǎng)18 — 20小時，觀察抑菌圈形成與否。若樣品具有抗菌活性，則會在濾紙片周圍形成清晰透明的抑菌圈，抑菌圈越大表明樣品抗菌活性越強。2.昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin最小抑菌濃度(Minimum InhibitoryConcentration)測定試驗菌株(金黃色葡萄球菌ATCC25923、金黃色葡萄球菌090223+和星形諾卡菌090312+)接種到MH液體培養(yǎng)基(青島海博生物技術有限公司)中，37°C振蕩培養(yǎng)到對數(shù)生長期，而后用新鮮MH液體培養(yǎng)基將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的培養(yǎng)液稀釋到2X105cfu/ml待用。取I. 9mL上述稀釋的細菌培養(yǎng)液，加入經O. 22m孔徑膜過濾的2mg/ml的昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin樣品溶液O. ImL作為第一管，第一管混勻后取出ImL加入第2管中，依次倍比稀釋(參見表1)，自第9管吸出ImL棄去，第10管系對照管。表.I稀釋方法
權利要求
1.一種昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin,其特征在于昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin為環(huán)狀多肽，分子量1584. 97Da，等電點8. 96。
2.按權利要求I所述昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin,其特征在于所述昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin氨基酸序列為Phe1 Leu2 Pro3 Phe4 Phe5 Ala6 Ala7 Cys8 Ala9 Ileici Thr11 Arg12 Lys13 Cys140
3.按權利要求I或2所述昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin,其特征在于所述編碼昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin前體的基因由279個核苷酸組成，自5’端至3’端序列為atgttcaccttgaagaaatccctgttgcttcttttcttccttgggatcatcaacgtatct 60ctctgtgaggaagagagaaatgccgaggaagaaagaagagatgatcccgaagaaagggcc 120gttgaggtggaaaaaagatttttaccattttttgcagcatgtgcaattaccagaaaatgt 180ggaaaatgatttttctaaatacacatcgggtgtcttataaaaaataaagatgaagcctac 240
4.一種權利要求I所述的昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin的制備方法,其特征在于所述抗菌肽是以化學合成方法產生，氧化環(huán)化，其中兩個半胱氨酸殘基之間形成一對分子內二硫鍵，C末端酸胺化。
5.—種權利要求I所述的昆箭林娃抗菌肽Kunyuenin的應用，其特征在于所述昆箭 林蛙抗菌肽Kunyuenin用于制備抗微生物藥物或化妝品添加劑的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學技術領域，具體的說是一種昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin及其制備和應用。昆崳林蛙抗菌肽Kunyuenin為環(huán)狀多肽，分子量1584.97Da，等電點8.96。本發(fā)明所得抗菌肽Kunyuenin分子量小、對金黃色葡萄球菌和星形諾卡菌具有強的殺滅作用。此外還具有低的溶血活性和一定的抗氧化活性。
文檔編號A61K8/64GK102796176SQ201210287508
公開日2012年11月28日 申請日期2012年8月13日 優(yōu)先權日2012年8月13日
發(fā)明者王義鵬, 于海寧, 秦松 申請人:中國科學院煙臺海岸帶研究所