專利名稱：小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物制劑及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體及其制備方法和應用。
背景技術(shù)：
肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，因其惡性度高，病情發(fā)展快，治療難度大，療效差，死亡率高，被稱為“癌中之王”。我國每年大約有11萬人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%。目前在治療肝癌方面多依賴于手術(shù)，放療，化療，治療過程中伴有惡心、嘔吐、毛發(fā)脫落等副作用，給病人帶來許多痛苦。在治療過程中，殺死癌細胞的同時人體正常細胞也同 樣受到損害，導致患者的一些正常機體功能喪失，機體免疫力下降，不能從根本上解決患者的治病問題。肝癌治療周期長，花費大，給病人及家庭帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。為此，亟需尋找一種療效好、毒副作用小，易于患者接受的有效抗肝癌藥物及治療方法?？咕氖且活惼毡榇嬖谟谏矬w內(nèi)的陽離子兩親性多肽，是機體免疫防御的重要組成部分，具有抗菌譜廣、作用強且迅速、不易產(chǎn)生耐藥等眾多優(yōu)點。研究進一步發(fā)現(xiàn)，抗菌肽在抗腫瘤方面也具有一定活性，且對哺乳動物正常細胞毒性較低，這些特點使其成為抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點之一。小菜蛾抗菌肽(cecropin from Plutellaxylostella(pxCECAl))是鱗翅目菜蛾科Plutella xylostella (L.)幼蟲飼養(yǎng)至五齡，用蘸有大腸桿菌或金黃色葡萄桿菌菌液針刺激其腹部后，經(jīng)基因工程誘導合成的，合成內(nèi)容見文獻 “Production, purification, and characterization of the cecropin fromPlutella xylostella,pxCECAl, using an intein—induced self-cleavable systemin Escherichia coli，，由 Hong Wang, Xiao-Iin Meng，Jin-ping Xu. et al 發(fā)表于 ApplMicrobio Biotechnolj94(4):1031-1039。脂質(zhì)體(Liposomes)是由一種或多種兩親性分子雙層膜包裹而成的具有一個或多個水性腔室的微泡。脂質(zhì)體作為蛋白質(zhì)及多肽類藥物的載體，不僅能夠起到緩釋和控釋的作用，還能提高蛋白質(zhì)及多肽類藥物的穩(wěn)定性；另外，由于形成脂質(zhì)體的成膜劑和分散劑與生物膜具有較大的相似性和組織相容性，能有效提高蛋白質(zhì)及多肽類藥物的膜通透性，易于被組織吸收從而提高生物利用度。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法。本發(fā)明的另一個目的在于公開了由上述制備方法制得的小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體。本發(fā)明的第三個目的在于公開了小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體在抗肝癌中的應用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法，包括如下步驟(I)、將脂質(zhì)體成膜劑置于燒杯內(nèi)，加入2-6倍有機溶劑溶解；(2)、將溶液加入圓底燒瓶中，35_45°C水浴加熱減壓旋轉(zhuǎn)干燥至有機溶劑揮盡；
(3)、加入含分散劑的水溶液，超聲充分分散后，得空白脂質(zhì)體；(4)、加入小菜蛾抗菌肽，置于渦旋儀上緩緩震蕩均勻，即得混合脂質(zhì)體混懸液；(5)、混懸液放入-20°C冰箱冷凍，然后在室溫下解凍，反復凍融3-5次，取凍融處理的混懸液，經(jīng)冷凍干燥后即得脂質(zhì)體凍干粉。上述技術(shù)方案中所述的小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法，其中，所述的脂質(zhì)體成膜劑為磷脂酰膽堿、腦磷脂、大豆磷脂、卵磷脂、合成二棕櫚酰-DL- α -磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、合成磷脂酰絲氨酸、神經(jīng)鞘磷脂、膽固醇、十八胺或磷脂酸中的一種或兩者以上的組合。上述技術(shù)方案中所述的小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法，其中，磷脂酰膽堿、腦磷 月旨、大豆磷脂、卵磷脂、合成二棕櫚酰-DL-α-磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、合成磷脂酰絲氨酸或神經(jīng)鞘磷脂與膽固醇、十八胺或磷脂酸之間的重量比為(O. 5-6) : I。上述技術(shù)方案中所述的小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法，其中，脂質(zhì)體成膜劑與小菜蛾抗菌肽之間的質(zhì)量比為(10-20): I。上述技術(shù)方案中所述的小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法，其中，所述的有機溶劑為氯仿、異丙醇、丙酮、乙醇和甲醇中的一種或兩者以上的組合；兩者以上的組合為任意比例組合。上述技術(shù)方案中所述的小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法，其中，所述的分散劑包括甘露醇、琥珀酸鹽和葡萄糖溶液中的一種或兩者以上的組合；兩者以上的組合為任意比例組合。上述技術(shù)方案中所述的小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法，其中，所述分散劑在水溶液中的質(zhì)量體積分數(shù)為3%-10%，即IOOml水溶液中含有分散劑的量為3g-10g。小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體，其中，所述小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體是通過上述技術(shù)方案中任一技術(shù)方案所述的方法制備所得。小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體在制備抗肝癌藥物中的應用。小菜蛾抗菌肽具有抗腫瘤、作用強且迅速、不易產(chǎn)生耐藥等眾多優(yōu)點，由于小菜蛾抗菌肽為肽類物質(zhì)，體內(nèi)易被消化系統(tǒng)內(nèi)的蛋白酶水解使其活性喪失，并且在自然條件下也很容易失活，因此，本發(fā)明將小菜蛾抗菌肽制備成脂質(zhì)體通過靜脈注射等非口服途徑給藥。本發(fā)明具有以下有益效果I、脂質(zhì)體可以提高被包裹藥物的穩(wěn)定性，延長抗菌肽的抗肝癌活性；2、脂質(zhì)體可以提高抗菌肽被動靶向性，提高藥物的生物利用度，減少用藥劑量，降低毒性；3、抗菌肽脂質(zhì)體緩慢釋放，延長腎排泄和代謝，從而延長作用時間；4、原料來源豐富，價格低廉，利于擴大化生產(chǎn)和運輸。


I、圖I為小菜蛾抗菌肽小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體對人肝癌細胞H印G II的抑制作用曲線.2、圖2為人肝癌細胞IfepG II在空白對照組的存活情況；
3、圖3為人肝癌細胞IfepG II在濃度為I μ g/ml的小菜蛾抗菌肽中的存活情況；4、圖4為人肝癌細胞H印G II在濃度為2 μ g/ml的小菜蛾抗菌肽中的存活情況；5、圖5為人肝癌細胞IfepG II在濃度為4 μ g/ml的小菜蛾抗菌肽中的存活情況；6、圖6為人肝癌細胞IfepG II在濃度為8 μ g/ml的小菜蛾抗菌肽中的存活情況；
7、圖7為人肝癌細胞IfepG II在濃度為16 μ g/ml的小菜蛾抗菌肽中的存活情況。
具體實施例方式為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體實施方式
對本發(fā)明作進一步的說明。實施例I :小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備:
卵磷脂Ig
膽固醇0.335g
氯仿5mL
甘露醇1.25g
水25inL
小菜蛾抗菌肽O. Ig按處方量，稱取卵磷脂lg、膽固醇O. 335g，置圓底燒瓶中，加入氯仿5ml溶解，40°C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，使脂質(zhì)在器壁上形成一層均勻的薄膜。加入5%甘露醇水溶液25mL，旋轉(zhuǎn)洗膜，水化一定時間后，水浴超聲15min分散，即得空白脂質(zhì)體。加入處方量小菜蛾抗菌肽，置于渦旋儀上緩緩震蕩均勻，即得脂質(zhì)體混懸液；混懸液放入_20°C冰箱冷凍一定時間，然后在室溫下解凍，反復凍融3次。取凍融處理的混懸液冷凍干燥后即得脂質(zhì)體。實施例2 :小菜蛾抗菌妝脂質(zhì)體的制備:
磷脂酰膽堿Ig
膽固醇0.198g
乙醇5mL
甘露醇2g
水25mL
小菜蛾抗菌肽O.lg按處方量，磷脂酰膽堿lg、膽固醇O. 198g，置圓底燒瓶中，加入乙醇5ml溶解，40°C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，使脂質(zhì)在器壁上形成一層均勻的薄膜。加入8%甘露醇水溶液25mL，旋轉(zhuǎn)洗膜，水化一定時間后，水浴超聲15min分散，即得空白脂質(zhì)體。加入處方量小菜蛾抗菌肽，置于渦旋儀上緩緩震蕩均勻，即得脂質(zhì)體混懸液；混懸液放入_20°C冰箱冷凍一定時間，然后在室溫下解凍，反復凍融3次。取凍融處理的混懸液冷凍干燥后即得脂質(zhì)體。實施例3 :小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備:
大豆磷脂Ig
十八胺0.215g
異內(nèi)醇5.5mL
甘露醇2g
水25mL
小菜蛾抗菌肽0.095g按處方量,大豆磷脂lg、十八胺O. 215g,置圓底燒瓶中，加入異丙醇5. 5ml溶解， 40°C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，使脂質(zhì)在器壁上形成一層均勻的薄膜。加入8%甘露醇水溶液25mL，旋轉(zhuǎn)洗膜，水化一定時間后，水浴超聲15min分散，即得空白脂質(zhì)體。加入處方量小菜蛾抗菌肽，置于渦旋儀上緩緩震蕩均勻，即得脂質(zhì)體混懸液；混懸液放入-20°C冰箱冷凍一定時間，然后在室溫下解凍，反復凍融3次。取凍融處理的混懸液冷凍干燥后即得脂質(zhì)體。實施例4 :小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備:
磷脂酰乙醇胺Ig
磷脂酸0.167 g
丙酬3.5mL
琥珀酸鹽1.25g
水25mL
小菜蛾抗菌肽0.12g按處方量，磷脂酰乙醇胺10g、磷脂酸I. 67g，置圓底燒瓶中，加入丙酮35ml溶解，40°C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，使脂質(zhì)在器壁上形成一層均勻的薄膜。加入5%琥珀酸鹽水溶液25mL，旋轉(zhuǎn)洗膜，水化一定時間后，水浴超聲15min分散，即得空白脂質(zhì)體。加入處方量小菜蛾抗菌肽，置于渦旋儀上緩緩震蕩均勻，即得脂質(zhì)體混懸液；混懸液放入-20°C冰箱冷凍一定時間，然后在室溫下解凍，反復凍融3次。取凍融處理的混懸液冷凍干燥后即得脂質(zhì)體。實施例五小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備:
腦磷脂1.053g
磷脂酸0.167 g
甲醇3.8mL
葡萄糖2.5g
水25mL
小菜蛾抗菌肽1.25g
按處方量，腦磷脂I. 053g、磷脂酸O. 167g，置圓底燒瓶中，加入甲醇3. 8ml溶解，40°C水浴旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機溶劑，使脂質(zhì)在器壁上形成一層均勻的薄膜。加入10%葡萄糖溶液25mL，旋轉(zhuǎn)洗膜，水化一定時間后，水浴超聲15min分散，即得空白脂質(zhì)體。加入處方量小菜蛾抗菌肽，置于渦旋儀上緩緩震蕩均勻，即得脂質(zhì)體混懸液；混懸液放入-20°C冰箱冷凍一定時間，然后在室溫下解凍，反復凍融3次。取凍融處理的混懸液冷凍干燥后即得脂質(zhì)體。實施例6 :小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體包封率的測定:I、色譜條件色譜柱:Agilent Alltima C18 (250mmX4. 6mm, 5 μ m);流動相O. 05%三氟乙酸(TFA)溶液-甲醇-乙腈(95:2.5:2. 5);檢測波長275nm ;流速1. Oml/min ;進樣量10μ I ;柱溫25°C。2、樣品包封率的測定(I)、凍干前精密量取小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體混懸液200μ I置IOml量瓶中，加乙醇 lml，超聲20min，放冷至室溫，用流動相定容，進樣測定總藥物量。另取脂質(zhì)體混懸液適量置I. 5ml離心管中，15000rpm離心lOmin，精密量取上清液200 μ I置IOml量瓶中，同上操作，測定游離藥物量，根據(jù)公式包封率(ΕΕ，％) = (1 — I· O X 100%，測定3批樣品的包封率，結(jié)果顯示藥物平均包封率為82. 35%。(2)凍干后精密稱取小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體凍干粉5mg置5ml量瓶中，加蒸餾水復溶，搖勻，得脂質(zhì)體混懸液。精密量取脂質(zhì)體混懸液200μ I置IOml量瓶中，加乙醇1ml，超聲20min，放冷至室溫，用流動相定容，進樣測定總藥物量。另取脂質(zhì)體混懸液適量置I. 5ml離心管中，8000rpm離心lOmin，精密量取上清液200 μ I置IOml量瓶中，同上操作，測定游離藥物量，根據(jù)公式包封率(ΕΕ，%) = (I — Iim /ff,6) X 100%,測定3批樣品的包封率，結(jié)果顯示藥物平均包封率為84. 98%。表I脂質(zhì)體包封率結(jié)果
批次_包封率(％)_平均包封率(％)
185.52
284.47 84.98 _3__84.95__實施例7 :小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體穩(wěn)定性考察:取凍干后的脂質(zhì)體樣品，分別于4和25°C放置3個月，于O、I、2、3月取樣，考察外觀、再分散性、含量、粒徑和滲漏率。兩種條件下脂質(zhì)體凍干品均為類白色塊狀物；除251放置3個月的樣品用水再分散的效果較差外，其它條件的樣品加水振搖下3min都能快速分散成均勻的混懸液,再分散性良好。滲漏率按照包封率的測定方法測定3批，依照公式滲漏率[[(W^-W^/W初]X 100%,結(jié)果顯示平均滲漏率為O. 148%。表2脂質(zhì)體滲漏率結(jié)果
_批次_滲漏率(％)_平均滲漏率(％)
「八…·!I0.153
2 0.147 0.148 _3__OJ45__
以下通過本發(fā)明制備的小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的藥效學試驗來進一步說明小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體在抗肝癌治療中的有益效果試驗例I :小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體對體外肝癌細胞的抑制作用:細胞株人肝癌細胞H印G II，由北京協(xié)和細胞庫提供。藥品及試劑MTT(SIGMA,USA)，DMSO (SIGMA, USA)，胰蛋白酶(SIGMA, USA)，RPMI1640 (GIBCO, Invitragen co. , USA),特級胎牛血清 Fetal Bovine Serum(Hyclone)。儀器超低溫冰箱(Bio-TekInstruments, Inooski, VT, USA)，pH 計(Thermoorion, USA)，超凈工作臺(FLC-哈爾濱東聯(lián)儀器廠)。試驗方法MTT法將肝癌細胞株按照常規(guī)方法培養(yǎng)傳代，收集對數(shù)生長期細胞，調(diào)節(jié)單細胞混懸液濃度I X IO5個/ml。將細胞混懸液加入96孔板中，每個孔加入200 μ I。置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，實驗組加入不同濃度小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體，每個濃度設(shè)4個復孔。并設(shè)有相應的空白對照組及無細胞調(diào)零孔。加藥后細胞在37°C，5%C02條件下培養(yǎng)48小時，每孔加入20 μ I新鮮配制的5mg/ml四甲基偶氮唑鹽(MTT)溶液，并在37°C，5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)4h ;小心棄上清，每孔加入150 μ I DMSO,置搖床搖勻30min，用酶標儀在492nm下檢測各孔的光密度值(0D值)，按下列公式計算肝癌細胞的生長抑制率；試驗重復3次，結(jié)果如表3和圖I所示。圖2至7分別為人肝癌細胞IfepG II在正常情況下(空白對照組)，濃度為I μ g/ml、2 μ g/ml、4 μ g/ml、8 μ g/ml、16 μ g/ml的小菜蛾抗菌肽的存活情況。
權(quán)利要求
1.小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法，包括如下步驟 (1)、將脂質(zhì)體成膜劑置于燒杯內(nèi)，加入2-6倍有機溶劑溶解； (2)、將溶液加入圓底燒瓶中，35-45°C水浴加熱減壓旋轉(zhuǎn)干燥至有機溶劑揮盡； (3)、加入含分散劑的水溶液，超聲充分分散后，得空白脂質(zhì)體； (4)、加入小菜蛾抗菌肽，置于渦旋儀上緩緩震蕩均勻，即得小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體混懸液； (5)、混懸液放入-20°C冰箱冷凍，然后在室溫下解凍，反復凍融3-5次，取凍融處理的混懸液，經(jīng)冷凍干燥后即得小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于所述的脂質(zhì)體成膜劑為磷脂酰膽堿、腦磷脂、大豆磷脂、卵磷脂、合成二棕櫚酰-DL- a -磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、合成磷脂酰絲氨酸、神經(jīng)鞘磷脂與膽固醇、十八胺或磷脂酸中的一種或兩者以上的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于磷脂酰膽堿、腦磷脂、大豆磷脂、卵磷脂、合成二棕櫚酰-DL- a -磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、合成磷脂酰絲氨酸或神經(jīng)鞘磷脂與膽固醇、十八胺或磷脂酸之間的重量比為(0. 5-6) : I。
4.根據(jù)權(quán)利要求廣3中任一權(quán)利要求所述的小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于脂質(zhì)體成膜劑與小菜蛾抗菌肽的質(zhì)量比為(10-20) : I。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于所述的有機溶劑為氯仿、異丙醇、丙酮、乙醇和甲醇中的一種或兩者以上的組合。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于所述的分散劑包括甘露醇、琥珀酸鹽和葡萄糖溶液中的一種或兩者以上的組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于所述分散劑在水溶液中的質(zhì)量體積分數(shù)為3%-10%。
8.小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體，其特征在于所述小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體是通過權(quán)利要求廣7中的方法制備所得。
9.小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體在制備抗肝癌藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體及其制備方法和應用，屬于藥物制劑及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了一種小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體的制備方法，具有制備工藝簡單，制備脂質(zhì)體所用的原輔料經(jīng)濟易得，所用的有機溶劑可回收利用，且包封率高，制劑工藝穩(wěn)定，滲漏率低，顯著提高了抗菌肽的活性周期的特點。小菜蛾抗菌肽脂質(zhì)體具有很好的抗肝癌作用，表現(xiàn)在對體外人肝癌細胞HepGⅡ具有明顯的抑制活性，并對接種肝癌H22的小鼠體內(nèi)的腫瘤生長具有顯著的抑瘤活性。且該藥物具有用量小，毒副作用小，活性強的特點。
文檔編號A61K38/17GK102793667SQ201210269910
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月31日
發(fā)明者韓晉, 袁海龍, 靳世英, 徐和, 徐平華, 靳士曉, 李仙義, 孟小林 申請人:中國人民解放軍第三0二醫(yī)院