專利名稱：一種抗肝癌蛋白質(zhì)pp3501及其制備方法和應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于藥物或保健品技術(shù)領域，特別是一種抗肝癌蛋白質(zhì)PP3501及其制備方法和應用。
背景技術(shù)：
肝癌是嚴重威脅人類健康的疾病之一，抗肝癌藥物的研究與開發(fā)在當今的醫(yī)學領域中具有重大意義。尋找治療肝癌的藥物或其他治療肝癌的方法是具有迫切性和深遠的社會意義。 用限制性差異顯示聚合酶鏈反應技術(shù)分析獲得一基因序列與預測蛋白pp3501的基因序列相似的編碼序列，蛋白質(zhì)氨基酸序列是Met Val Leu Ala AspAla Ala Lys MetArg Ser Pro Arg Val Arg Met Ala Pro Asn Pro Val ProGly Thr Leu lie Arg Arg GlyLys Leu Gly Arg Arg Gln Glu Gly Arg ValLys Thr Glu Ala Glu Thr Gly Gly Gln GlyVal Pro Gly Val Ala Gln SerHis His Gly Leu Gln Glu Val Trp Asp Arg Leu Ser GlnPro Gln Lys GlyPro Ala Pro His Arg Pro Gly Phe Gln Arg Ala Asn lie Ser Val AlaGluAla Pro Ser Ala Phe Ala Val Leu Gly Asp Gly Arg Arg His lie Cys SerTrp ProVal Ser Arg Ser Val Ala Pro Thr Val Ser Gly His Trp Pro GluGly Asn Arg Lys SerTrp Arg Gly Arg His Thr His Glu Pro Phe Arg AsnAsn Glu。編碼蛋白質(zhì)分子量是 16kDa，等電點是11. 6。理論分析pp3501蛋白含有三個α-螺旋結(jié)構(gòu)和6個β-折疊結(jié)構(gòu)。我們實驗發(fā)現(xiàn)ρρ3501抑制多種表型肝癌細胞生長，并增強丁酸鈉抑制肝癌細胞生長。本品可用于制備抗肝癌藥物的成分，并建立基因工程生產(chǎn)該蛋白的方法。經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，在國內(nèi)外均未發(fā)現(xiàn)用ρρ3501抗肝癌的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對肝癌發(fā)病率日益增加，尋找新的抗肝癌藥物和靶點是篩選新型抗肝癌藥物或藥物前體的有效途徑。提供一種抗肝癌蛋白質(zhì)ΡΡ3501及其制備方法，本發(fā)明的另一個目的是提供抗肝癌蛋白質(zhì)ΡΡ3501的新用途，即在治療肝癌藥物和保健品中的應用。這種蛋白能夠抑制多種表型肝癌細胞生長，并增強丁酸鈉抑制肝癌細胞生長。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是該抗肝癌蛋白質(zhì)ΡΡ3501的制備方法是通過基因工程生產(chǎn)抗肝癌蛋白質(zhì)ΡΡ3501，具體按以下步驟(I)用含多聚腺苷酸序列的引物，35 42°C反轉(zhuǎn)錄，然后用上游引物5’ -GATCCGAATTCACCATGGTTTTAGCAGATGC-3’，下游引物5’ -TGTCGACGGGTCTTGCACGTGTCAC-3’ 進行聚合酶鏈反應擴增，聚合酶鏈反應參數(shù)90°C 95°C預變性5分鐘，90°C 95°C加熱10 40秒，53°C 60°C反應25 40秒，70°C 75°C反應25 40秒，25 40個循環(huán)后72°C延伸3 10分鐘，I 2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應產(chǎn)物；(2)分別用制性內(nèi)切酶酶切純化后的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應產(chǎn)物和原核表達載體，再分別純化后，用連接酶連接構(gòu)建成真核或原核表達重組質(zhì)粒，真核表達質(zhì)粒攜帶的PP3501可用于基因治療的成分，原核表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用基因工程技術(shù)制備PP3501 蛋白；(3)將重組原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌，在含有選擇性抗生素的培養(yǎng)基中，35°C 38°C振蕩培養(yǎng)，I 5小時后用終濃度為O. I 3mmol/L的異丙基-beta_D-硫代半乳糖吡喃糖苷誘導2 6小時，4°C，分別收集細菌和上清；(4)上清液濃縮后通過親和樹脂進行純化，大腸桿菌中以包涵體形式存在的蛋白，用尿素處理，溶解，通過親和樹脂進行純化。本發(fā)明的抗肝癌蛋白質(zhì)PP3501在制備治療肝癌藥物和保健品中的應用，是利用PP3501抑制多種表型肝癌細胞的生長，增強丁酸鈉抑制肝癌生長；采用基因工程方法制備抗肝癌蛋白質(zhì)PP3501，利用該成分制備抗癌藥物或藥物組分。
用pp3501蛋白直接作用肝癌細胞，可直接殺傷肝癌細胞。用基因載體將pp3501基因轉(zhuǎn)入肝癌細胞，可顯著抑制肝癌細胞增殖。抗肝癌實驗過程簡介體外培養(yǎng)不同表型的肝癌細胞，加入20 μ g/ml的目的蛋白，培養(yǎng)I 5天(結(jié)果見圖4)。或建立裸鼠荷瘤模型，采用瘤內(nèi)注射，觀察目的蛋白抗肝癌效果(結(jié)果見圖5)。pp3501蛋白的功能抑制多種表型肝癌細胞生長。PP3501蛋白的新用途pp3501蛋白在制備抗肝癌藥物和保健品中的應用。具體的使用形式可制成注射針劑，按注射針劑要求使用。用法I.可單一使用。2.可作為抗肝癌藥物或其中一個組份使用。使用條件使用條件參照蛋白質(zhì)多肽藥物的條件，同時參照抗腫瘤藥物適用范圍。


圖I是克隆產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖；圖中1 :分子量標準；2 :克隆產(chǎn)物圖2是十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對pp3501融合蛋白的可溶性分析圖；圖中1 :分子量標準；2:異丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷誘導轉(zhuǎn)染pET-32a-pp3501細菌抽提物上清液；3 :異丙基-beta_D-硫代半乳糖吡喃糖苷誘導轉(zhuǎn)染pET-32a-pp3501細菌抽提物不溶物.圖3是十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析PP3501融合蛋白的純化圖；圖中1 :異丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷誘導轉(zhuǎn)染pET_32a-pp3501細菌抽提物；2 :純化后的pp3501融合蛋白圖4是pp3501抑制不同表型肝癌細胞生長圖5是動物實驗結(jié)果；*P < O. 05，林P < O. 01與對照組比較；#P < O. 05與丁酸鈉組比較。
具體實施例方式I.用特異引物用含多聚腺苷酸序列的引物，37°C反轉(zhuǎn)錄，然后上游引物5’ -GATCCGAATTCACCATGGTTTTAGCAGATGC-3’，下游引物5’ -TGTCGACGGGTCTTGCACGTGTCAC-3’ 進行聚合酶鏈反應擴增。聚合酶鏈反應參數(shù)94°C預變性5分鐘，94°C 30秒，56 °C 30秒，72 °C 30秒。30個循環(huán)后72°C延伸5分鐘。I %瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應產(chǎn)物。2.原核表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建 分別用制性內(nèi)切酶EcoR I、Sal I酶切純化后的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應產(chǎn)物和pET-32a載體，再分別純化后，用T4連接酶連接構(gòu)建成原核表達重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli DH5 α 03.原核表達重組質(zhì)粒在大腸桿菌的表達將原核表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)表達菌，挑取原核表達重組質(zhì)粒接種到含氨芐青霉素100微克/毫升的培養(yǎng)基，，37°C振蕩培養(yǎng)過夜。取5微升原核表達重組質(zhì)粒的過夜菌和5微升pET-32a空載質(zhì)粒的過夜菌分別接種于含氨芐青霉素100微克/毫升的培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)。3小時后各取一支用終濃度為lmmol/L的異丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷誘導5小時。4°C，12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心I分鐘，分別收集細菌和上清。4.包涵體提取和純化上清液濃縮后通過親和樹脂進行純化。大腸桿菌中以包涵體形式存在的蛋白，用變6mmol/L尿素處理，溶解，通過親和樹脂進行純化。純化產(chǎn)物于10%或12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳進行分析。5. pp3501抑制肝癌細胞生長用pp3501蛋白直接作用肝癌細胞，可直接殺傷肝癌細胞。用基因載體將pp3501基因轉(zhuǎn)入肝癌細胞，可顯著抑制肝癌細胞增殖。制備裸鼠荷瘤模型，瘤內(nèi)分別注射PP3501蛋白質(zhì)(3mg/kg)或丁酸鈉(30mg/kg)，或兩者同時注射。裸鼠荷瘤實驗顯示，瘤內(nèi)注射可顯著抑制肝癌生長，并增強丁酸鈉的作用效果。結(jié)果簡介I、人pp3501基因的克隆pp3501重組表達質(zhì)粒經(jīng)特異性引物的初步鑒定成功擴增出pp3501基因的編碼序列，大小為432堿基對(見圖I)。2、pp3501融合蛋白的表達經(jīng)凝膠電泳檢測，誘導的pp3501重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，在蛋白分子量標準34kDa左右出現(xiàn)了明顯的高表達的蛋白條帶(見圖2)。pp3501基因編碼的蛋白分子量是16kDa, Pet_32a載體編碼的組氨酸標簽分子量為18kDa,重組pp3501蛋白分子量是34kDa。經(jīng)電泳檢測，誘導的pp3501重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的沉淀中，在蛋白分子量標準34kDa處出現(xiàn)了明顯的高表達的蛋白條帶，而在上清中pp3501融合蛋白的表達量較低(見圖2)。用親和樹脂純化出高純度的pp3501融合蛋白(見圖3)。3、pp3501對肝癌細胞的增殖抑制作用
結(jié)果如圖4和圖5所示。pp3501抑制不同表型肝癌細胞生長，各實驗組曲線明顯遲緩于相應對照組。制備裸鼠荷瘤模型，瘤內(nèi)分別注射PP3501蛋白質(zhì)或丁酸鈉，或兩者同時注射均抑制肝癌生長，PP3501增強丁酸鈉抗肝癌效果。
權(quán)利要求
1.一種抗肝癌蛋白質(zhì)PP3501的制備方法，是通過基因工程生產(chǎn)抗肝癌蛋白質(zhì)PP3501，具體按以下步驟 (1)用含多聚腺苷酸序列的引物，35 42°C反轉(zhuǎn)錄，然后用上游引物5’-GATCCGAATTCACCATGGTTTTAGCAGATGC-3’，下游引物5’ -TGTCGACGGGTCTTGCACGTGTCAC-3’ 進行聚合酶鏈反應擴增，聚合酶鏈反應參數(shù)90°C 95°C預變性5分鐘，90°C 95°C加熱10 40秒，53°C 60°C反應25 40秒，70°C 75°C反應25 40秒，25 40個循環(huán)后72°C延伸3 10分鐘，I 2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應產(chǎn)物； (2)分別用制性內(nèi)切酶酶切純化后的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應產(chǎn)物和原核表達載體，再分別純化后，用連接酶連接構(gòu)建成真核或原核表達重組質(zhì)粒，真核表達質(zhì)粒攜帶的PP3501可用于基因治療的成分，原核表達重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用基因工程技術(shù)制備PP3501蛋白； (3)將重組原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌，在含有選擇性抗生素的培養(yǎng)基中，35°C 38°C振蕩培養(yǎng)，I 5小時后用終濃度為O. I 3mmol/L的異丙基-beta_D-硫代半乳糖吡喃糖苷誘導2 6小時，4°C，分別收集細菌和上清； (4)上清液濃縮后通過親和樹脂進行純化，大腸桿菌中以包涵體形式存在的蛋白，用尿素處理，溶解，通過親和樹脂進行純化。
2.—種抗肝癌蛋白質(zhì)pp3501在制備抗癌藥物和保健品的應用。
3.一種抗肝癌蛋白質(zhì)PP3501在制備抗癌藥物組份和保健品組份中的應用。
全文摘要
本發(fā)明屬于藥物或保健品技術(shù)領域，特別是一種抗肝癌蛋白質(zhì)pp3501及其制備方法和應用。這種蛋白可用基因工程的方法生產(chǎn)制備，將重組原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌，在含有選擇性抗生素的培養(yǎng)基中，35℃～38℃振蕩培養(yǎng)。1～5小時后用終濃度為0.1～3mmol/L的異丙基-beta-D-硫代半乳糖吡喃糖苷誘導2～6小時。4℃，分別收集細菌和上清；上清液濃縮后通過親和樹脂進行純化。大腸桿菌中以包涵體形式存在的蛋白，用尿素處理，溶解，通過親和樹脂進行純化。蛋白質(zhì)pp3501在制備抗肝癌藥物和保健品或作為抗肝癌藥物和保健品組份中的應用。這種蛋白能夠抑制多種表型肝癌細胞生長，并增強丁酸鈉抑制肝癌細胞生長。
文檔編號A61K38/17GK102851296SQ20121009024
公開日2013年1月2日 申請日期2012年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月26日
發(fā)明者張海濤, 汪亞君, 馬超, 伍俊 申請人:廣東醫(yī)學院