專利名稱：用于在哺乳動(dòng)物中預(yù)防和治療金迪普拉病毒感染的疫苗制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于在哺乳動(dòng)物中預(yù)防和治療金迪普拉病毒感染的疫苗制劑。更具體地，本發(fā)明提供用于向人類施用的免疫原性制劑，包含在穩(wěn)定制劑中的經(jīng)熱、紫外線、伽瑪輻照或化學(xué)滅活的金迪普拉病毒的完整病毒粒子或其純化的病毒抗原。
背景技術(shù)：
金迪普拉病毒(Chandipura virus, CHPV)是單股負(fù)鏈RNA病毒目(Mononegavirales)、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、水泡性病毒屬(Vesiculovirus)的成員。CHPV基因組結(jié)構(gòu)與充分表征的水皰性口炎病毒(Vesiculo stomatitis virus, VSV)的相似。CHPV感染在兒童中引起通常是致命的腦炎。臨床癥狀包括高燒、頭痛、嗜睡、嘔吐和導(dǎo)致昏迷的抽搐。因?yàn)樯袥]有對(duì)此病毒感染的療法，多數(shù)患者住院24-48小時(shí)內(nèi)死亡。1965年在Nagpur高熱疾病的爆發(fā)期間，金迪普拉病毒(CHPV)首次從患者的血清樣本中分離出來。2003年，當(dāng)此病毒在Andhra Pradesh (Rao等人,2004)和Maharashtra州引起大規(guī)模腦炎爆發(fā)時(shí)，CHPV首次獲得公共衛(wèi)生重要性。由CHPV引起的致死率在AndhraPradesh州高達(dá)55 % (Rao等人.2004)。據(jù)報(bào)道在印度Gujarat發(fā)生流行(Chadha等人.2005)期間的死亡率是78.4%的致命性。從那時(shí)起，此病毒感染已經(jīng)再發(fā)生流行，并表現(xiàn)為廣泛分布，如血清學(xué)調(diào)查在遍及印度以及也在斯里蘭卡和非洲的人類和家養(yǎng)動(dòng)物中鑒定到針對(duì)CHPV的中和抗體。此病毒還已從印度(Geevarghese等人.2005)和西非(Fontenille 等人.1994)的白嶺(sandflies)中分離出。沒有可用于預(yù)防此病毒感染的疫苗。CHPV具有非分段的 Ilkb的負(fù)鏈RNA基因組。此病毒基因組的轉(zhuǎn)錄由病 毒RNA依賴性RNA聚合酶所編碼。CHPV基因組編碼四種主要蛋白質(zhì)，核衣殼蛋白(N蛋白)、憐蛋白(P蛋白)、基質(zhì)蛋白(M蛋白)、糖蛋白(G蛋白)和大蛋白(L蛋白)。N蛋白衣殼化基因組RNA以保護(hù)它免受細(xì)胞RNA酶。所有彈狀病毒的糖蛋白是N-糖基化I類跨膜蛋白，其在病毒表面上形成三聚體刺突。此由糖蛋白形成的刺突介導(dǎo)病毒向細(xì)胞受體的附著以便介導(dǎo)內(nèi)吞作用以及與細(xì)胞膜的融合。糖蛋白引發(fā)中和抗體并且已被證明在小鼠中對(duì)大腦內(nèi)此病毒的攻擊提供保護(hù)效果(Venkateswarlu和Arankalle,2009)。對(duì)于預(yù)防金迪普拉病毒感染沒有商業(yè)上可用的疫苗。對(duì)于CHPV感染的治療沒有特異性的療法。金迪普拉糖蛋白(G蛋白)是高免疫原性的并且提供針對(duì)金迪普拉病毒感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)。CHPV G蛋白已經(jīng)作為分泌蛋白在桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)和純化(Venkateswarlu和Arankalle, 2009)。為了工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)疫苗用桿狀病毒介導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)是昂貴的。至今，沒有太多來源于桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞的產(chǎn)品被商品化，把兒科部分作為目標(biāo)的疫苗更是這樣。因此，沒有向是此疫苗的主要目標(biāo)的嬰兒和兒童施用桿狀病毒來源疫苗的足夠的安全記錄。我們用酵母,特別是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)作為金迪普拉糖蛋白(G蛋白)的表達(dá)系統(tǒng)，其提供了明顯的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗m合于生產(chǎn)低成本和高效的疫苗。有很好的安全紀(jì)錄，由于來源于酵母包括巴斯德畢赤酵母的許多商用產(chǎn)品已經(jīng)被成功地商業(yè)化了。由來源于作為表達(dá)系統(tǒng)的巴斯德畢赤酵母的乙型肝炎小抗原組成的重組疫苗Revac-Bmcf已經(jīng)被成功地商業(yè)化為用于兩歲以下兒童的疫苗。沒有可獲得的信息表明桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞來源的G蛋白在其效能上與完整病毒粒子疫苗是否是相當(dāng)?shù)摹Ｔ诒景l(fā)明中，已經(jīng)將重組畢赤酵母來源的G蛋白疫苗的效能與滅活的金迪普拉病毒完整病毒粒子疫苗比較，以研究它們是否引發(fā)可比較水平的中和抗體并且提供針對(duì)病毒攻擊的保護(hù)效能。這個(gè)信息非常重要，因?yàn)閺脑诒磉_(dá)其的宿主細(xì)胞純化的任何重組抗原應(yīng)該被假定可與完整病毒粒子疫苗同樣有效地引發(fā)中和抗體的構(gòu)象。為了比較這些結(jié)果，得到滅活的完整病毒粒子疫苗所采用的方法也很重要，例如，滅活劑的選擇、將病毒暴露于滅活劑的時(shí)間和溫度、和對(duì)完整病毒的完整性不是有害的病毒純化的方法。在本發(fā)明中描述了金迪普拉病毒滅活的不同的方法。使用金迪普拉病毒的滅活的完整病毒粒子作為一種非常有前景的候選疫苗是本發(fā)明的一個(gè)方面。本發(fā)明的一個(gè)方面描述了在酵母和大腸桿菌(E.coli)中表達(dá)金迪普拉病毒的亞基抗原，重組CHPV G蛋白的純化以及制備適合作為疫苗施用的穩(wěn)定藥物組合物和/或制齊U，以及任選地與CHPV核蛋白和其他細(xì)菌的和/或病毒的蛋白組合。本組合物和方法對(duì)在哺乳動(dòng)物中、特別是在人類中預(yù)防、治療性治療(therapeutic treatment)和診斷金迪普拉病毒感染是有用的。進(jìn)一步，在疫苗制劑中，通過加入藥學(xué)上可接受的賦形劑賦予增強(qiáng)的穩(wěn)定性和延長的保存期限。賦形劑選自包括以下的列表:糖、糖醇、氨基酸、人類血清白蛋白和高分子量聚合物。所有抗原性制劑的免疫原性通過加入佐劑被進(jìn)一步增強(qiáng)。發(fā)明目的本發(fā)明的主要目的是通過提供能夠引發(fā)針對(duì)金迪普拉病毒感染的保護(hù)性抗體和細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答的藥物制劑提供一種針對(duì)金迪普拉病毒(CHPV)的穩(wěn)定的疫苗組合物，由此如果不能完全地，至少基本上排除現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供確定序列的金迪普拉病毒抗原、特別是糖蛋白(G蛋白)以便當(dāng)體內(nèi)施用時(shí)引發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的疫苗組合物和制備和使用方法，所述抗原從宿主細(xì)胞如酵母或大腸桿菌作為重組蛋白表達(dá)和純化。本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供確定序列的金迪普拉病毒抗原、特別是核蛋白(N蛋白)以便當(dāng)體內(nèi)施用時(shí)引發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)的疫苗組合物和制備和使用方法，所述抗原從宿主細(xì)胞如大腸桿菌細(xì)胞作為重組蛋白表達(dá)和純化。本發(fā)明的另一個(gè)方面是提供一種用作在人類中有效的疫苗的免疫原性制劑，其包含通過熱、伽瑪輻照、紫外線或通過使用滅活劑的化學(xué)方法滅活的金迪普拉病毒的完整病毒粒子，并且比較此制劑與亞基抗原的免疫原性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供帶有增強(qiáng)此疫苗制劑的免疫原性的佐劑的疫苗組合物。而本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供用于在哺乳動(dòng)物特別是人類中預(yù)防、治療性治療和診斷金迪普拉病毒(CHPV)感染的金迪普拉病毒的方法和組合物及其亞基抗原的用途。發(fā)明概述本發(fā)明涉及能夠引發(fā)針對(duì)金迪普拉病毒感染的保護(hù)性的抗體和細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的藥物制劑。本發(fā)明涉及從宿主細(xì)胞作為重組蛋白表達(dá)和純化的確定序列的金迪普拉病毒抗原的組合物和制備和使用方法。包含此抗原的組合物用于引發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)。這樣的亞基疫苗的效能與由CHPV的完整滅活病毒粒子組成的疫苗所誘發(fā)的效能相當(dāng)。金迪普拉病毒的滅活完整病毒粒子對(duì)于預(yù)防金迪普拉病毒感染是非常有效的疫苗。本發(fā)明的針對(duì)此病毒或此亞基抗原的抗體能夠用于治療和診斷金迪普拉病毒感染。純化的重組CHPV亞基抗原，例如糖蛋白(G蛋白)，以用于人類體內(nèi)施用的穩(wěn)定組合物配制。包括單獨(dú)地或與其他疫苗組合引發(fā)保護(hù)性抗體和細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的方法。本發(fā)明的針對(duì)病毒或亞基抗原的抗體能夠用于治療和診斷金迪普拉病毒感染。進(jìn)一步，純化的重組CHPV亞基抗原和滅活的病毒粒子以用于體內(nèi)施用哺乳動(dòng)物特別是人類的穩(wěn)定的制劑配制。包含CHPV病毒的完整滅活病毒粒子或亞基抗原的疫苗組合物可單獨(dú)使用，或者聯(lián)合其他病毒和細(xì)菌疫苗使用以獲得在人類中的廣譜保護(hù)性效能。包括單獨(dú)或聯(lián)合其他疫苗引發(fā)保護(hù)性抗體和細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)的方法。能夠聯(lián)合使用的其他疫苗包括但不限于針對(duì)乙型肝炎、甲型肝炎、流感嗜血桿菌(hemophilus influenzae)、傷寒、霍亂、日本腦炎、白喉、百日咳和破傷風(fēng)(DTP)的疫苗，腦膜炎球菌疫苗，任何腸道病毒疫苗例如那些針對(duì)手足口病(HFMD)、腸道病毒腦炎、腸道病毒非脊髓灰質(zhì)炎樣腦炎(enterovirus non-poliolike encephalitis)的疫苗、MMR疫苗、骨髓灰質(zhì)炎疫苗、輪狀病毒疫苗、肺炎球菌疫苗等。附圖簡述



圖1:圖1是用基因特異性引物對(duì)(IA)CHPV糖蛋白(G蛋白)基因和(IB)核蛋白(N蛋白)基因PCR擴(kuò)增的圖示。圖2:圖2是展示純化的金迪普拉病毒的凝膠圖(2A)。圖3:圖3是在誘導(dǎo)的不同時(shí)間間隔，巴斯德畢赤酵母中糖蛋白的表達(dá)。圖4:圖4展示從巴斯德畢赤酵母純化的重組糖蛋白。發(fā)明詳述在本文公開了本發(fā)明的詳細(xì)的實(shí)施方案，然而，應(yīng)該理解公開的實(shí)施方案僅僅是本發(fā)明的示例，本發(fā)明能夠以多種形式實(shí)現(xiàn)。因此，在本文公開的特定的結(jié)構(gòu)和功能細(xì)節(jié)不被解釋為限定，而僅僅作為權(quán)利要求書的基礎(chǔ)并且作為教導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員以幾乎任何合適的詳細(xì)結(jié)構(gòu)來多樣化地采用本發(fā)明的代表性基礎(chǔ)。進(jìn)一步，在本文所用的術(shù)語和短語不意味著限定而是提供本發(fā)明的可以理解的描述。包膜糖蛋白(G蛋白)是金迪普拉病毒表面上的主要蛋白。G蛋白刺突是主要的抗原決定簇。因此該糖蛋白是極佳的疫苗候選物并且是為了預(yù)防CHPV感染的亞基疫苗的免疫原的選擇。候選CHPV G蛋白疫苗的序列和在真核與原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中克隆和表達(dá)的方法包含在本發(fā)明的范圍中。真核表達(dá)系統(tǒng)的選擇包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞中的桿狀病毒、以及任何物種的酵母細(xì)胞，最優(yōu)選的是巴斯德畢赤酵母或釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。由于與其他真核表達(dá)系統(tǒng)相比對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)是成本有效的，巴斯德畢赤酵母作為重組表達(dá)宿主在工業(yè)規(guī)模上是有優(yōu)勢(shì)的。來源于巴斯德畢赤酵母的重組蛋白已經(jīng)成功地商業(yè)化并且發(fā)現(xiàn)其對(duì)人類的使用是安全的。用除常規(guī)層析分析法、沉淀和離心技術(shù)外的專利的Himax 技術(shù)純化病毒抗原幫助以成本有效的方法分離抗原，其是對(duì)人類應(yīng)用安全并且在工業(yè)規(guī)模上比常規(guī)的密度梯度超速離心經(jīng)濟(jì)的。這還使得能夠生產(chǎn)低成本疫苗。發(fā)現(xiàn)巴斯德畢赤酵母中表達(dá)的金迪普拉病毒G蛋白與完整病毒粒子疫苗具有同樣的免疫原性。編碼G蛋白的基因被克隆、表達(dá)和純化為多肽。多肽或者病毒樣顆粒都能夠用作疫苗候選物。它還能夠作為包含CHPV糖蛋白聯(lián)合CHPV核蛋白(N蛋白)和其他細(xì)菌或病毒抗原的嵌合蛋白表達(dá)。所述抗原在被施用給宿主時(shí)能夠誘導(dǎo)強(qiáng)的抗體反應(yīng)和細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。糖蛋白基因序列可以是來自病毒的天然序列或?yàn)榱嗽诤线m的真核宿主如酵母細(xì)胞、特別是巴斯德畢赤酵母中表達(dá)而優(yōu)化的合成的基因序列。本發(fā)明中所用的糖蛋白基因序列由為在酵母細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化的全長序列組成。為酵母表達(dá)的序列優(yōu)化包括在基因5，端添加Kozak共有序列如(gcc) gccRccATGG (其中R是A/G)，如SEQ ID N0.1中所示的，或利用酵母共有序列(5' -[(A/Y)A(A/T)AATGTCT]-3/，其中Y是嘧啶核苷酸)，如SEQID N0.2中所示的。N末端沒有膜靶向序列(前21個(gè)氨基酸)的截短序列也為了在酵母細(xì)胞中表達(dá)而優(yōu)化，在G基因5’端帶有Kozak共有序列，如SEQ ID N0.3中所示的，以及在G基因5’端帶有酵母共有序列，如SEQ ID N0.4中所示的。SEQ ID N0.3的翻譯產(chǎn)生SEQ IDN0.8的蛋白。此外，編碼全長糖蛋白的核苷酸序列為了在巴斯德畢赤酵母中表達(dá)而密碼子優(yōu)化，如SEQ ID N0.9中所示的。SEQ ID N0.9能夠用來克隆沒有N-末端膜靶向序列的成熟糖蛋白基因。為了增強(qiáng)SEQ ID N0.3的表達(dá)和翻譯，用摻入有Kozak共有序列的引物PCR擴(kuò)增序列產(chǎn)生在成熟糖蛋白序列N-末端起始密碼子甲硫氨酸后用天冬氨酸代替天然酪氨酸殘基的蛋白。氨基酸變化幫助摻入為了增強(qiáng)的表達(dá)的Kozak共有序列。全長G蛋白序列是SEQ ID N0.5，并且缺失N-末端膜靶向序列的成熟G蛋白是SEQ ID N0.6。為了幫助通過親和層析來純化，這些蛋白能夠任選地在蛋白的N-末端或C-末端包括6-8個(gè)氨基酸的組氨酸標(biāo)簽。重組蛋白SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6有相等的免疫原性，并且是用于預(yù)防CHPV感染的極佳的疫苗候選物 。如SEQ ID N0.7所示的核衣殼蛋白還能夠單獨(dú)地或與G蛋白聯(lián)合地用作候選疫苗。向蛋白添加組氨酸標(biāo)簽簡化了純化過程。上述的蛋白作為細(xì)胞內(nèi)蛋白在酵母中表達(dá)或作為分泌蛋白表達(dá)并從其純化。任何合適的表達(dá)載體(vector)選自包括但不限于以下的列表:pPIC3.5、pPIC3.5K、ρΑ018、pPIC9、pPIC9K pHIL-D2、pHIL-Sl、pGAPZ 和 pGAP a A、B、C、pPICZ A、B、C 載體等?？梢允褂眠m合在任何酵母生物體中表達(dá)的任何質(zhì)粒載體，所述酵母生物體如巴斯德畢赤酵母、釀酒酵母、多形漢遜酵母(Hanensula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、克魯維酵母屬(Kluveromyces spp)或任何其他屬/種的酵母。使用如GS115、KM71的巴斯德畢赤酵母株以及如SMD1168或SMD1163的蛋白酶缺陷株。上述序列的CHPV G基因能夠以單個(gè)拷貝或者多于一個(gè)拷貝被克隆到上述酵母載體的任一種以及任何酵母株中。G蛋白能夠在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或能夠作為分泌蛋白表達(dá)，其中蛋白從酵母細(xì)胞分泌出、進(jìn)入培養(yǎng)基中。在用保護(hù)小鼠免遭活病毒攻擊感染的中和抗體引發(fā)強(qiáng)免疫反應(yīng)方面，酵母來源和純化的重組G蛋白與完整CHPV病毒粒子是同樣有效的。因此酵母來源的CHPV G蛋白是用于預(yù)防CHPV感染的優(yōu)良的亞基疫苗。病毒G蛋白的純化由包括但不限于以下的任何下述技術(shù)來進(jìn)行:區(qū)帶超速離心、密度梯度離心和膜超濾、離子交換層析、親和層析、疏水相互作用層析、凝膠過濾層析、如硫酸銨的無機(jī)鹽鹽析、以及通過使用專利的Himax 技術(shù)、其他無機(jī)鹽、有機(jī)溶劑和如聚乙二醇的其他有機(jī)化合物。N-末端或C-末端帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白能夠通過任何金屬親和層析來純化。已通過上面提及的方法中的一種或兩種或更多種的組合實(shí)現(xiàn)病毒抗原的純化。將酵母來源的疫苗提供保護(hù)性免疫反應(yīng)的效能與金迪普拉病毒完整病毒粒子疫苗相比較，所述酵母來源的疫苗以以下方式制備，并且其作為候選疫苗的開發(fā)被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。方法是在連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)物中建立穩(wěn)定感染，病毒純化方法、用于生產(chǎn)疫苗批次的滅活方法在實(shí)施例中充分描述。VeiO細(xì)胞(ATCC CCL-81)被用作金迪普拉病毒株適應(yīng)以及從這種細(xì)胞基質(zhì)最終產(chǎn)生疫苗的細(xì)胞基質(zhì)。在培養(yǎng)中能夠體外繁殖的細(xì)胞系能夠用作病毒培養(yǎng)的宿主。例如，可利用如MRC-5和W1-38的二倍體細(xì)胞系以及如Vero、BHK-21、CH0細(xì)胞等的連續(xù)傳代的細(xì)胞系。為了繁殖CHPV株，優(yōu)選地選擇允許病毒良好地生長的允許細(xì)胞(permissive cells)?？墒褂美绯Ｒ?guī)地用于生產(chǎn)病毒疫苗的Vero細(xì)胞、BHK_21、C6/C3蚊細(xì)胞系、MRC-5、CV-1、BSC-1、MA104、MDCK、W1-38、CHO 細(xì)胞、CaC0_2etch 以及 DBS-FLC-1、DBS-FLC-2、DBS-FRh 1-2、ESK-4、HEL、MR-90、WRL68 等(“ATCC Microbes and Cell atWork”，第二版，144頁，美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC) 1991，美國)。本發(fā)明中所用的一種此類細(xì)胞系是Vero細(xì)胞，其已被確認(rèn)用作疫苗生產(chǎn)的宿主細(xì)胞。確認(rèn)的VeiO細(xì)胞系符合世界衛(wèi)生組織(WHO)推薦的關(guān)于生物制品生產(chǎn)的細(xì)胞的使用要求的第50號(hào)生物制品要求(Requirements for Biological Substances N0.50),從而確定這些細(xì)胞系對(duì)疫苗生產(chǎn)是有資格的(WHO Technical report Series，878 號(hào)，19-52 頁，1998)。并且為了在細(xì)胞培養(yǎng)中維持上述提及的細(xì)胞系，能夠采用單層靜止培養(yǎng)、灌注系統(tǒng)培養(yǎng)、搖瓶、滾動(dòng)管/瓶培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)、微載體培養(yǎng)(microcarrier culture)、細(xì)胞工廠(cell factories)和細(xì)胞堆集室(cell stacks)及類似的方法?？墒褂美鏑ytodex (Pharmacia Biotech,瑞典)的任何商業(yè)上可獲得的微載體和其他動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)裝置。本發(fā)明中所描述的方法可適用于金迪普拉病毒的任何基因型/血清型/病毒株。從感染的患者獲得或從該病毒駐留的病毒載體分離的病毒顆粒能夠在細(xì)胞系中適應(yīng)并且在細(xì)胞培養(yǎng)中體外繁殖數(shù)代。在可選的方案中，此病毒顆粒通過2天大的乳鼠傳代一次并且再次分離病毒和在體外細(xì)胞培養(yǎng)中傳代。這增加了細(xì)胞培養(yǎng)中病毒的效價(jià)。通過物理的或化學(xué)的手段并且優(yōu)選地二者的組合實(shí)現(xiàn)病毒的純化。物理的方法利用例如密度、尺寸、質(zhì)量、沉降系數(shù)等物理特性并且包括但不限于任何下面的技術(shù):區(qū)帶超速離心、密度梯度離心、用截留尺寸大于IOOkDa的膜超濾以除去血清和細(xì)胞組分。通過化學(xué)手段純化使用例如通過化學(xué)的或生理化學(xué)的反應(yīng)的吸附/解吸附的方法并且包括例如通過超速離心、密度梯度離心、離子交換層析、親和層析、疏水相互作用層析、凝膠過濾層析，如硫酸銨的無機(jī)鹽鹽析、以及通過使用專利的Himax 技術(shù)、有機(jī)鹽、有機(jī)溶劑、磷酸鋁、氫氧化鋁和如聚乙二醇的有機(jī)化合物而純化。對(duì)病毒的純化通過上述方法的一種或兩種或更多種的組合來實(shí)現(xiàn)。病毒能夠通過利用2% (w/v)乙酸雙氧鈾負(fù)染色法來可視化，在放大大約20，000至大約200，000倍的電子顯微鏡下能夠觀察到。病毒通過熱、伽瑪輻照、紫外線或者通過化學(xué)滅活而滅活?；瘜W(xué)滅活劑選自包括但不限于以下的列表:福爾馬林、β丙內(nèi)酯(BPL)、戊二醛、N-乙酰乙烯亞胺、雙乙烯亞胺、三乙烯亞胺、抗壞血酸、辛酸、psolarens、包含非離子去垢劑等的去垢劑被添加到病毒懸液以滅活病毒。例如，當(dāng)應(yīng)用福爾馬林和β丙內(nèi)酯時(shí)，將添加的量是大約0.001%至0.5% (ν/V)。最優(yōu)地用于滅活的福爾馬林的濃度是福爾 馬林比病毒懸液1: 2000至1: 4000，優(yōu)選地，I: 2500和1: 3000稀釋度；在β丙內(nèi)酯的情況下，β丙內(nèi)酯比病毒懸液的最優(yōu)濃度范圍從1: 1500至1: 4000，最優(yōu)選地，在1: 2500至1: 3500之間的范圍。最優(yōu)滅活溫度是大約2-8°C，持續(xù)48小時(shí)至200小時(shí)，優(yōu)選地在4°C下持續(xù)7天。在大約22°C的中間溫度較短的持續(xù)到4-5天滅活也是有效的。對(duì)于金迪普拉病毒，在高于37°C的任何溫度下，優(yōu)選地從50°C至65°C下持續(xù)30分鐘至6小時(shí)熱滅活是有效的。發(fā)現(xiàn)伽瑪輻照對(duì)病毒傳染性是有效的，并且伽瑪輻照的疫苗引發(fā)高水平的中和抗體。病毒對(duì)伽瑪輻照的最優(yōu)暴露是10千戈瑞至25千戈瑞持續(xù)30分鐘至48小時(shí)的時(shí)間段，暴露于輻照的不同時(shí)間段引發(fā)不同水平的中和抗體效價(jià)。通過用伽瑪輻照的以穩(wěn)定制劑的疫苗制劑免疫獲得的中和抗體效價(jià)通過體外血清中和測試來估計(jì)并是疫苗保護(hù)功效的量度。通過本發(fā)明中所描述的方法滅活病毒顆粒可在病毒純化之前或之后進(jìn)行。為了在人類中免疫，金迪普拉病毒的抗原性組合物用藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體(carrier)來配制。在加強(qiáng)免疫反應(yīng)的明礬中配制抗原性制劑。磷酸鋁也提供類似的效能；如硫酸鋁磷酸鹽的其他鋁化合物也能夠與金迪普拉病毒抗原一起使用。與伽瑪菊粉一起配制提高疫苗的效能。如α菊粉、δ菊粉和ε形式的菊粉或任何其他高分子量菊粉的其他多態(tài)形式的菊粉能夠被用作金迪普拉病毒抗原的佐劑。伽瑪菊粉的制備方法可以在現(xiàn)有技術(shù)中(US4, 954, 622 ；PCT/AU86/00311)獲得。被稱為阿伽目林(algammulin)的菊粉和明礬的組合被發(fā)現(xiàn)是高效佐劑，其增加疫苗的效能數(shù)倍。伽瑪菊粉和阿伽目林的制備方法與它們作為疫苗佐劑的用途也公開于現(xiàn)有技術(shù)中(Cooper和Steele，1991)。本發(fā)明的新穎性是金迪普拉病毒抗原與作為疫苗佐劑增加病毒抗原的免疫原性數(shù)倍的伽瑪菊粉/阿伽目林的疫苗組合物。當(dāng)佐劑化疫苗被接種到小鼠時(shí)沒有觀察到不利事件。菊粉可以與其他有機(jī)和無機(jī)化合物組合使用，如硫酸鋁磷酸鹽和磷酸鈣、及其他。其他佐劑能夠選自包括但不限于以下的列表:磷酸I丐、脂質(zhì)體、殼聚糖以及復(fù)雜糖類(complex carbohydrates)例如右旋糖酐、糊精、淀粉、甘露聚糖和葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、β -葡聚糖、肝素、纖維素、果膠和果膠酸鹽(pectinates)、凝集素和任何其他糖類，無論是合成的或者來源于任何來源；任何可生物降解的和生物相容性的聚合物，例如聚丙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯；PLG)或PLGA ;任何乳劑，包括但不限于水包油乳劑，一個(gè)例子是AS03，其他基于鯊烯的佐劑如MF59等，任何油包水乳劑；用膽鈣化醇作為成分之一與其他脂溶性化合物一起制備的脂質(zhì)體；其他組成的脂質(zhì)體；RIBI佐劑系統(tǒng)；皂苷包括但不限于QS-21、QuilA、番茄苷、ISC0M、ISC0MATRIX等、脂肽、糖肽、脂多糖、胞壁酰二肽以及任何基于肽的佐劑、寡核苷酸、作為佐劑的任何TLR配體、任何細(xì)胞因子、維生素和無毒細(xì)菌毒素如單磷酰脂A和衍生物、含CpG和不含CpG的寡核苷酸、等。當(dāng)與金迪普拉病毒抗原組合時(shí)增加體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫的任何其他有機(jī)的和無機(jī)的化合物適合用在此疫苗制劑中。當(dāng)單獨(dú)使用時(shí)或者當(dāng)組合使用時(shí)金迪普拉病毒抗原引發(fā)高水平的保護(hù)性中和抗體。例如，當(dāng)與日本腦炎(JE)疫苗組合使用時(shí)，滅活的CHPV疫苗引發(fā)針對(duì)兩種病毒的中和抗體并且因此良好地組合用于預(yù)防腦炎感染。組合疫苗還能夠包括針對(duì)腸道病毒介導(dǎo)的腦炎的疫苗與CHPV疫苗和JE疫苗、或者CHPV滅活病毒疫苗聯(lián)合單獨(dú)JE疫苗的組合。在小鼠中檢測時(shí)，發(fā)現(xiàn)如此的組合引發(fā)針對(duì)兩種病毒的保護(hù)性中和抗體?？蛇x擇地，抗原性制劑可以包括CHPV糖蛋白與兩種或者 更多種純化的抗原如滅活日本腦炎病毒和腸道病毒的組合。重組腸道病毒抗原或完整滅活病毒粒子可以組合使用。上述疫苗的組合是病毒抗原在用于人類施用的藥學(xué)上可接受的制劑中的混合物。上述組合的疫苗抗原能夠以引發(fā)針對(duì)候選疫苗病毒的保護(hù)性抗體所需的適合的比例混合?？乖灾苿┠軌蛲ㄟ^多種方法之一在哺乳動(dòng)物優(yōu)選地人類受治療者中遞送，通過口腔、粘膜或通過腸胃外途徑，優(yōu)選地皮內(nèi)的或肌內(nèi)途徑，以引發(fā)保護(hù)性抗體和/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。抗原還能夠在藥學(xué)上可接受的生物可降解的聚合物中遞送。上述制劑用于金迪普拉病毒感染的預(yù)防或治療性治療。針對(duì)G蛋白的抗體用于CHPV感染的診斷和治療性治療。
金迪普拉病毒疫苗的免疫原是針對(duì)由金迪普拉病毒的任何株或金迪普拉病毒的基因型變體弓I起的感染性疾病的疫苗的免疫原的代表性例子。本發(fā)明的疫苗以液體或凍干形式在密封小瓶或安瓿瓶中提供。在液體制劑的情形中，其可以每人大約0.05ml至5ml的量腸胃外或口腔或通過鼻內(nèi)途徑施用于待接種的受治療者。在干燥的凍干制劑的情形中，將其用合適的增溶溶液重新溶解后注射。根據(jù)本發(fā)明，適用于本發(fā)明中所用的金迪普拉病毒株的方法適用于具有廣抗原譜的任何CHPV株。廣譜抗原反應(yīng)將提供針對(duì)除用于疫苗生產(chǎn)的病毒株外的多種CHPV株的滿意的免疫保護(hù)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的，二價(jià)或多價(jià)疫苗可以通過混合從已經(jīng)在遺傳學(xué)上被確認(rèn)為CHPV的兩種或多種CHPV株產(chǎn)生的疫苗來制備，并且混合是以基于免疫原性蛋白含量的合適的比例。如此混合將提供具有保護(hù)免受感染的更廣的抗原譜的疫苗制品。用任何合適的藥學(xué)上可接受的稀釋劑稀釋本發(fā)明的滅活病毒顆粒以便獲得所需的效價(jià)。制劑中所用的緩沖液可以是磷酸鹽緩沖液或者磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液或其他任何藥學(xué)上可接受的緩沖液。疫苗可以任選地包含防腐劑、穩(wěn)定劑等。還原性和非還原性糖、如山梨糖醇和甘露醇的糖醇、甘油、氨基酸、人類血清白蛋白對(duì)于液體制劑以0.0I %至10 %的范圍添加，并且對(duì)于凍干制劑以總固體的最多到60 %添加。如此的免疫原穩(wěn)定制劑是以液態(tài)或凍干形式，并且在藥學(xué)上可接受的緩沖液或水中重構(gòu)后適合于在人類宿主中腸胃外施用，還能夠配制為用于口服和鼻內(nèi)施用。在本發(fā)明的另一方面，根據(jù)本發(fā)明所獲得的病毒顆粒、以及重組病毒蛋白和抗病毒抗體或病毒抗原能夠用作診斷檢測的試劑，例如，用作免疫沉淀方法、血凝抑制(HI)檢測、補(bǔ)體結(jié)合(CF)反應(yīng)、ELISA、放射免疫測試、免疫熒光、Western印跡以及類似方法中的抗原。更具體地，利用本發(fā)明的滅活病毒顆粒的整體或部分，能夠?yàn)闄z測金迪普拉病毒不同株感染提供高靈敏度和特異性的診斷檢測。如在本文所用的術(shù)語滅活病毒顆粒的“部分”指的是保留期望的抗原性并且來源于病毒顆粒的病毒部分，包括例如，在所給實(shí)施例中描述的純化步驟期間溶解或者在重組表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的結(jié)構(gòu)蛋白。對(duì)病毒特異的多克隆抗體或單克隆抗體能夠用于金迪普拉病毒感染的診斷測試。對(duì)于疫苗的效能測試，在Balb/c小鼠中測試疫苗制劑，且使用兔來產(chǎn)生多克隆抗血清。所得的血清通過中和針對(duì)CHPV的抗體的體外中和測試來檢測，且用ELISA來確定抗體效價(jià)。在用本發(fā)明中描述的疫苗制劑免疫的動(dòng)物中觀察到了血清轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的疫苗是穩(wěn)定的。本發(fā)明的疫苗是更有效和安全的，因?yàn)橹耙言谛律鷥汉蛢和惺┯媒湍竵碓吹囊呙纭１景l(fā)明的疫苗是成本有效的，并且酵母表達(dá)系統(tǒng)在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)低成本和安全的疫苗是高度有益的。
實(shí)施例實(shí)施例1-
在Vero細(xì)朐中金迪普柃病毒培養(yǎng)的律立:2007年在知情同意和醫(yī)務(wù)監(jiān)督下，從懷疑患有日本腦炎或者其他未知感染的患者的血清樣本和咽喉拭子樣本分離金迪普拉病毒。通過用基因特異性引物做RT-PCR，樣本對(duì)JE和基孔肯雅病毒(Chikungunya viruses)是陰性的。在培養(yǎng)中在Vero細(xì)胞中生長時(shí)產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(cpe)的病毒的身份后來通過PCR擴(kuò)增和對(duì)糖蛋白基因測序鑒定為金迪普拉病毒。病毒通過蝕斑純化，并且在Vero細(xì)胞(ATCC N0.CCL-81)和BHK-21細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞中連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)增殖。用于病毒感染的培養(yǎng)基是包含0% -1% FBS的DMEM(Dulbecco’sModified Eagle Medium ;Sigma_Aldrich,產(chǎn)品號(hào) D5523,按照制造商的說明使用)。48 小時(shí)感染結(jié)束時(shí)，細(xì)胞病變效應(yīng)在Vero和BHK21細(xì)胞中接近完全，并且病毒主要存在于細(xì)胞外培養(yǎng)基中。病毒效價(jià)經(jīng)過2天大的小鼠腦傳代后顯著地提高到大于108 5TCID5(l/ml。病毒感染和增殖還交替地在無血清培養(yǎng)基中測試。為了擴(kuò)大病毒感染細(xì)胞的生產(chǎn)，包含來自工作細(xì)胞庫的5xl06個(gè)活VeiO細(xì)胞的一個(gè)冷凍管用來接種一個(gè)T175細(xì)胞培養(yǎng)等級(jí)燒瓶。包含5% FBS和 50 μ g/ml硫酸新霉素的DMEM用來復(fù)蘇和補(bǔ)充細(xì)胞。在T175燒瓶中細(xì)胞單層的90%匯合后，細(xì)胞被胰酶化并進(jìn)一步在細(xì)胞工廠/細(xì)胞堆集室(CFlO)中繁殖。DMEM培養(yǎng)基被用于繁殖( 2.0L/CF10)。使用基因特異性引物通過病毒糖蛋白(G蛋白)和核蛋白(N蛋白)的完全RT-PCR以及通過DNA測序來證實(shí)金迪普拉病毒分離株的身份。實(shí)施例2-滅活病毒的制備:將金迪普拉病毒的純化的病毒粒子在50°C _60°C范圍的不同溫度加熱滅活最多6小時(shí)。通過在Vero細(xì)胞中病毒的再次感染來檢查病毒粒子的感染性。當(dāng)在從50°C至60°C的溫度范圍熱處理直到6小時(shí)時(shí)，在病毒的三個(gè)連續(xù)傳代中沒有觀察到再次感染。用福爾馬林或者β丙內(nèi)酯來執(zhí)行病毒的化學(xué)滅活。當(dāng)使用福爾馬林(甲醛)時(shí)，從2-8°C至22°C的溫度范圍從直到14天的不同時(shí)間段在1: 1500至1: 4000范圍內(nèi)測試濃度。用福爾馬林滅活的最優(yōu)時(shí)間和溫度是2-8°C在1: 3000或1: 3500的稀釋度下7天。在22°C下4天或2-8°C下7天從1: 1500至1: 3500的稀釋度下測試時(shí)，β丙內(nèi)酯完全地滅活病毒。福爾馬林和β丙內(nèi)酯滅活的制劑都有高免疫原性并在用作疫苗制劑時(shí)引發(fā)中和抗體。以從30分鐘至48小時(shí)的不同時(shí)間間隔用6tlCo源照射IOkGy (千戈瑞)執(zhí)行伽瑪輻照疫苗，并且在免疫小鼠后測試在不同的暴露時(shí)間下的中和抗體效價(jià)。在輻照期間病毒母液在干冰中保持冷凍。病毒滅活的完成度通過在配制為疫苗之前在Vero細(xì)胞中連續(xù)傳代而測試。用于伽瑪輻照的疫苗制劑緩沖液任選地包含20mM抗壞血酸和20mM組氨酸。實(shí)施例3-金迪普拉病毒的純化:來自CFlO細(xì)胞工廠的病毒收獲物用0.45 μ m濾器來凈化，通過300kDa截留膜過濾來濃縮，并且用50mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4交換緩沖液。將濃縮的病毒收獲物上樣到用相同緩沖液平衡的柱中預(yù)充注的cellufine sulphate樹脂上。柱用包含50mM NaCl的緩沖液徹底沖洗，并且在從150mM至IOOOmM增加的鹽濃度下連續(xù)地洗脫結(jié)合的病毒。合并包含病毒的級(jí)分并在凝膠上分析純度。濃縮包含病毒顆粒的級(jí)分，并且用300kDa截留膜交換緩沖液。濃縮的主體病毒用0.22 μ m囊式過濾器無菌過濾，并且在使用前凍存于_80°C。實(shí)施例4-
病毒糖蛋白和核蛋白基因的重組克隆和表達(dá):糖蛋白(G蛋白)和核蛋白(N蛋白)基因在CHPV病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)之后分別克隆到酵母載體和大腸桿菌載體中。用Absolutely RNA微量制備試劑盒(Stratagene, La Jolla, CA，USA)來從感染的 Vero 細(xì)胞(ATCC CCL-81)中分離病毒RNA。用AccuScript高保真第一鏈cDNA合成試劑盒(Stratagene)依照試劑盒的方案進(jìn)行RT-PCR，并且糖蛋白和核蛋白基因用PfuUltra高保真DNA聚合酶(Stratagene)來擴(kuò)增。用基因特異性引物擴(kuò)增編碼糖蛋白(G蛋白)基因和核蛋白(N蛋白)基因的基因。當(dāng)通過RT-PCR從CHPV病毒中克隆天然G蛋白基因時(shí)，用于G蛋白基因的RT-PCR擴(kuò)增的弓I物為:正向引物1: 5，ACATGAATTCGCCGCCACCATGGATTTGAGTATAG3 ’或正向引物2:5，ACATGAATTCGCCGCCACCATGGCTTTGAGTATAG3 ’反向引物1: 5，GCATGGATCCGCGGCCGCTCATACTCTGGCTCTCATGTTG3，可選擇地，編碼G蛋 白的密碼子優(yōu)化的合成基因用作模板，用如下PCR引物通過PCR克隆成熟的G蛋白基因:正向引物3:5 ’ CATGAATTCGCCGCCACCATGGACTTGTCCATCGCATTCCCTGAG3 ’反向引物2:5 ’ GCATGGATCCGCGGCCGCTTAGACTCTTGCTCTCATG3，PCR擴(kuò)增如下進(jìn)行:94°C下變性40秒、58°C下退火45秒和70°C下延伸3分鐘的30個(gè)循環(huán)，和70°C下最終延伸10分鐘。擴(kuò)增后的PCR片段用凝膠純化并用EcoRl和Notl消化，并且克隆到PPIC3.5K或pPIC9載體的EcoRl和Notl位點(diǎn)中的在AOXl啟動(dòng)子控制下的AOXl基因座中，并且轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母GS115株,依照Invitrogen corporation,Carlsbad, USA概述的方案通過甲醇誘導(dǎo)，并且轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母GS115是依照制造商(Invitrogen)的用戶手冊(cè) “A Manual of Methods for Expression of RecombinantProteins in Pichia pastoris”(M版2002年I月，畢赤酵母表達(dá)試劑盒，目錄編號(hào)K1710-01, Invitrogen corporation, Carlsbad, USA)。編碼核蛋白的序列用RT-PCR擴(kuò)增。CHPV cDNA的PCR用如下基因特異性引物來執(zhí)行:NP FPI (正向引物):5，ACACCATATGAGTTCTCAAGTATTCTGC3 ’以及NP RPI (反向引物):5 ’ ACATGGATCCTCATGCAAAGAGTTTCCTGGC3 ’PCR片段用Ndel和BamHl消化并且克隆到原核表達(dá)載體pET_lIB的Ndel和BamHl位點(diǎn)中，并且將包含插入物的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5CI感受態(tài)細(xì)胞。為了蛋白的重組表達(dá)，將從DH5 α細(xì)胞分離的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞。實(shí)施例5-CHPV重纟目杭原的鈍化:收獲用甲醇誘導(dǎo)后的酵母細(xì)胞，并且在含有0.2% Triton X-100和5mM EDTA的50mM Tris-HCl緩沖液，pH8.0中通過超聲和/或用玻璃珠裂解。細(xì)胞懸液在8000 Xg下離心10分鐘。上清液用鹽處理(Himax,專利的混合物)來沉淀并且沉淀了。用Tris-HCl緩沖液，pH8.2從鹽沉淀物洗脫蛋白。濃縮洗脫液，用50mM Tris-HCl，pH8.2滲濾并且上樣到用同樣的緩沖液平衡的cellufine sulphate柱。蛋白質(zhì)用不同濃度的NaCl洗脫。制備物的純度用銀染在12% SDS-PAGE上檢查。蛋白的身份用Western印跡來確認(rèn)。在大腸桿菌細(xì)胞中克隆的核蛋白基因在20°C下用0.2mM IPTG(異丙基β _D_1_硫代吡喃半乳糖苷)誘導(dǎo)12小時(shí)。8，OOOrpm離心10分鐘后的細(xì)胞沉淀用含2mM EDTA和0.1% Triton X-100的pH8.0的50mM Tris-HCl來沖洗。細(xì)胞用超聲來裂解，10, OOOrpm離心20分鐘，包含可溶性核蛋白的上清液在強(qiáng)陽離子交換POROS^j IS柱和苯基瓊脂糖柱上連續(xù)地純化。合并包含蛋白質(zhì)的級(jí)分并通過IOkDa膜過濾來濃縮。通過二喹啉甲酸(BCA)方法來估計(jì)純化的重組糖蛋白和核蛋白的蛋白濃度。實(shí)施例6-疫苗制劑的制備:金迪普拉病毒抗原的制劑在包含154mM NaCl的pH6.9-7.2的40mM磷酸鹽緩沖液中制備。病毒制品在0.025%至4%終濃度的氫氧化鋁/磷酸鋁的液體制劑中配制并測試。用于疫苗制劑的終濃度為從0.025%至0.1%的氫氧化鋁。其他佐劑的添加進(jìn)一步增強(qiáng)疫苗制品的效能。如通過ELISA確定的以及通過血清中和測試(SNT)估計(jì)中和抗體效價(jià)，菊粉的多態(tài)形式、特別是伽瑪菊粉的添加，增加疫苗效能至少五倍。試驗(yàn)了在5mg/ml至200mg/ml的范圍的多種濃度的伽瑪菊粉濃度。伽瑪菊粉包含8000道爾頓以上的分子量的顆粒并且在37°C的水中是幾乎不溶的。伽瑪菊粉的制備在現(xiàn)有技術(shù)中是眾所周知的。高分子量菊粉OraftiCDHPX是從比利時(shí)Beneo Orafti獲得的。伽瑪菊粉級(jí)分通過現(xiàn)有技術(shù)(US4, 954，622 ；PCT/AU86/00311)中概述的方法制備，并且依照Cooper和Steelel991年所描述的方法來制備阿伽目林。在從0.lmg/ml至50mg/ml濃度范圍下測試這些后,0.5mg/ml的濃度的伽瑪菊粉和阿伽目林制品用在疫苗制劑中。添加佐劑和抗原并且允許在室溫下吸附2小時(shí)并且立即用于注射。另外包含糖如蔗糖、麥芽糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇或山梨醇以及菊粉的一種或者組合的制劑賦予疫苗制劑良好的穩(wěn)定性。0.5%-10%范圍以及優(yōu)選地0.5% -5%的范圍的糖的存在賦予制劑良好的穩(wěn)定性，如在37°C四周下加速的穩(wěn)定性所確定的。相似的制劑還在PH6.8-7.2的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中測試，沒有觀察到區(qū)別。高達(dá)總固體的60%的上述糖、緩沖液和鹽的較高濃度賦予疫苗凍干制劑良好的穩(wěn)定性。向制劑添加從0.2%直到5%的人類血清白蛋白增加了凍干制劑的疫苗穩(wěn)定性。制劑的穩(wěn)定性通過在37 °C四周的加速穩(wěn)定性測試，隨后在小鼠中做效能測試。實(shí)施例7-疫苗制品的免疫原性的確定:每組中使用六只一月齡的Balb/c小鼠。對(duì)每組中的動(dòng)物肌肉注射大約0.1ml/小鼠的從20 μ g的最高劑量開始并且稀釋直到IOOng/小鼠的連續(xù)地稀釋的疫苗制品。金迪普拉病毒抗原通過BCA方法和用兔抗金迪普拉病毒抗血清的ELISA來估計(jì)。在如先前實(shí)施例所概述的包含合適量的佐劑和穩(wěn)定劑的緩沖液中進(jìn)行稀釋。對(duì)于對(duì)照動(dòng)物，注射無病毒抗原、包含相同量的佐劑的相等體積。試驗(yàn)的疫苗抗原包括如實(shí)施例中其他地方所描述的用β丙內(nèi)酯(BPL)或福爾馬林或伽瑪輻照或熱滅活的CHPV的完整病毒粒子，以及純化的CHPV糖蛋白和核蛋 白。還試驗(yàn)了糖蛋白和核蛋白的組合。如本實(shí)施例所描述的所有疫苗制劑和稀釋度在7、14和28天的三個(gè)劑量施用。在加強(qiáng)注射7天后收集血液。對(duì)每組合并相等量的血清并且在56°C滅活補(bǔ)體大約30分鐘。所得的血清被用于通過血清微中和測試估計(jì)中和抗體，并且通過間接ELISA估計(jì)總抗體效價(jià)。在一種替代的試驗(yàn)中，通過其他途徑施用相似量的滅活病毒制品。用于所有制劑的緩沖液是包含150mM NaCl的40mM磷酸鹽緩沖液，pH6.8-7.2。通過給兔肌內(nèi)注射100 μ g純化的病毒分離株，并且在首次抗原施用后的14和28天注射相似量的抗原作為加強(qiáng)劑量來產(chǎn)生多克隆抗體。對(duì)于ELISA，在pH9.6的碳酸鹽緩沖液的96孔ELISA板中2-8°C包被I μ g的抗原過夜。板用pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中3%脫脂奶粉封閉。板在37°C下孵育一小時(shí)，并且板用含0.05%吐溫-20的PBS(PBST)沖洗五次。在PBST中進(jìn)行疫苗抗血清的系列稀釋，并在37°C培養(yǎng)兩小時(shí)。用PBST沖洗板8次，然后添加在PBST中1: 2500稀釋的小鼠抗IgG作為二抗并且在37°C下孵育一小時(shí)?？子肞BST沖洗五次，用PBS沖洗三次并且通過添加OPD (鄰苯二胺，Sigma Aldrich，美國)和H2O2來顯色。添加IN硫酸10分鐘后獲取讀數(shù)。作為動(dòng)物中血清轉(zhuǎn)化的量度的抗體效價(jià)以高于對(duì)照動(dòng)物的血清稀釋度的倒數(shù)+3X對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)差來估計(jì)。ELISA結(jié)果顯示，來自甚至IOOng的BPL滅活CHPV抗原的疫苗引發(fā)高抗體反應(yīng)。由ELISA的IgG抗體效價(jià)(血清稀釋度的倒數(shù))在沒有明礬時(shí)對(duì)于IOOng是3200直到對(duì)于20 μ g是64，000，在有明礬作為佐劑時(shí)從12，800直到320，000。由于中和估計(jì)對(duì)于疫苗效能是重要的，疫苗抗血清中的中和抗體效價(jià)通過100TCID50/ml的CHPV在Vero E6細(xì)胞單層中細(xì)胞病變效應(yīng)的完全抑制來確定。計(jì)算出50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)，并且每次分析用IOOTCID5ci的病毒。微中和檢測用在最小必須培養(yǎng)基(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA)中連續(xù)稀釋的血清來執(zhí)行。將血清稀釋液與包含IOOTCID5ci病毒的相等體積培養(yǎng)基一起在37°C孵育90分鐘，并且添加到96孔平底板中的Vero E6細(xì)胞單層(每孔100，000細(xì)胞)。板在5% CO2溫箱中37°C孵育六天。中和效價(jià)表示為導(dǎo)致完全抑制病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)的血清最高稀釋度。每種血清稀釋度以四份測試。來自對(duì)照動(dòng)物的合并的血清用作測試中的對(duì)照。在另一試驗(yàn)中，試驗(yàn)了從0.5 μ g至20 μ g濃度范圍的CHPV聯(lián)合包含6 μ g日本腦炎(JE)滅活完整病毒粒子疫苗(JENVAC )的滅活疫苗。組合疫苗以0.25mg明礬配制并且給6只小鼠肌肉注射。在7、14和28天施用三劑，并且在最后一劑施用7天后收集血液樣本。為了估計(jì)抗JE中和抗體效價(jià)，采用了蝕斑減少中和試驗(yàn)(PRNT50)。疫苗抗血清連續(xù)地四倍稀釋并且與合適的CHPV稀釋度混合并且在37°C下 孵育90分鐘?？寡?病毒混合物被添加到6孔板中的VeiO細(xì)胞匯合單層并且在37°C下孵育60分鐘。向每個(gè)孔添加0.9%羧甲基纖維素溶液，并且板在0)2溫箱中在37°C下孵育5天。在孵育結(jié)束時(shí)，計(jì)數(shù)蝕斑數(shù)量。與無血清病毒相比減少50%蝕斑數(shù)量的血清的稀釋度是作為PRNT5tl值的病毒中和抗體的量度。附圖中的圖1顯示用基因特異性引物對(duì)(IA)大約 1.53Kb CHPV糖蛋白(G蛋白)基因和(IB) 1.3Kb核蛋白(N蛋白)基因的PCR擴(kuò)增。在兩種情形中，擴(kuò)增的基因片段的尺寸顯示為相對(duì)于IKb梯子。在兩個(gè)凝膠圖片中，G基因和N基因的PCR產(chǎn)物標(biāo)為粗箭頭。圖-2顯示凝膠圖(2A)顯示純化的金迪普拉病毒；純化的CHPV在變性條件下在10% SDS-PAGE上運(yùn)行；三種主要蛋白糖蛋白(G)、核蛋白(N)和基質(zhì)蛋白(M)在圖中示出。2B是用兔抗CHPV多克隆血清對(duì)CHPV顯色的Western印跡。CHPV抗原用粗箭頭來表明。圖-3顯示在甲醇誘導(dǎo)不同時(shí)間間隔時(shí)在巴斯德畢赤酵母中糖蛋白的表達(dá)。泳道1-未誘導(dǎo)的細(xì)胞；泳道2-添加甲醇后O小時(shí)；泳道3-甲醇誘導(dǎo)后24小時(shí)；泳道4-甲醇誘導(dǎo)后48小時(shí)，泳道5-分子大小標(biāo)記；泳道6-甲醇誘導(dǎo)后72小時(shí)；泳道6-甲醇誘導(dǎo)后96小時(shí)；泳道7-甲醇誘導(dǎo)后120小時(shí)。粗箭頭示出誘導(dǎo)的 65kD G蛋白。圖-4顯示來自巴斯德畢赤酵母的純化的重組糖蛋白。表1:下面的表-1闡明了通過血清中和抗體效價(jià)來估計(jì)金迪普拉病毒滅活的完整病毒粒子和重組抗原的免疫原性。每個(gè)劑量組注射六只balb/c小鼠。括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表明接種疫苗的動(dòng)物的血清轉(zhuǎn)化的％。對(duì)照動(dòng)物被注射相等體積的載運(yùn)體(vehicle)(數(shù)據(jù)未顯示)?？贵w效價(jià)表示為導(dǎo)致在Vero細(xì)胞中病毒的細(xì)胞病變效應(yīng)的完全抑制的血清稀釋度的倒數(shù)。ND-未確定。表-1-
權(quán)利要求
1.一種用于在哺乳動(dòng)物中預(yù)防和治療金迪普拉病毒感染的疫苗制劑，所述疫苗制劑包含任何基因型的金迪普拉病毒或其病毒抗原作為治療活性成分。
2.如權(quán)利要求1所述的疫苗制劑，其中所述金迪普拉病毒是由熱、紫外線、通過化學(xué)方法或通過伽瑪輻照滅活的。
3.如權(quán)利要求2所述的疫苗制劑，其中金迪普拉病毒的所述化學(xué)滅活由選自如下的條件進(jìn)行: a.使用β丙內(nèi)酯(BPL):病毒懸液為1: 1500至1: 4000、優(yōu)選地在1: 2000至I: 3500之間的稀釋度的濃度的BPL，在2-8°C下2-14天的時(shí)間段、優(yōu)選地在2-8°C下7天、或者在22°C下4-6天的時(shí)間段； b.使用福爾馬林(甲醛)比病毒懸液為1: 2500至1: 4000稀釋度的濃度的福爾馬林，在2-8°C下4-15天的時(shí)間段或在25°C的溫度下4_8天的時(shí)間段。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗制劑，其中在Vero細(xì)胞中培養(yǎng)的所述金迪普拉病毒是滅活的，其中所述滅活在所述病毒的純化之前或之后進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗制劑，其中所述金迪普拉病毒抗原是純化的金迪普拉病毒的糖蛋白。
6.如權(quán)利要求5所述的疫苗制劑，其中所述糖蛋白是從真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)和純化的重組蛋白，所述真核表達(dá)系統(tǒng)例如桿狀病毒介導(dǎo)的昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、酵母或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
7.用于根據(jù)權(quán)利要求6中所述的重組表達(dá)的宿主細(xì)胞是酵母，例如酵母菌屬(Saccharomyces spp)、克魯維酵母菌屬(Kluveromyces spp)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、多形漢遜酵母(Hanensula polymorpha)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)等, 優(yōu)選巴斯德畢赤酵母。
8.—種重組DNA構(gòu)建體，包含(i)載體和(ii)編碼根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的氨基酸序列為 SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6 或 SEQ ID N0.8 的糖蛋白的 SEQ ID N0.1、SEQ IDN0.2、SEQ ID N0.3 或 SEQ ID N0.4 或 SEQ ID N0.9 中的至少一種核酸片段。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性制品，其中所述金迪普拉病毒抗原是從原核宿主例如大腸桿菌(E.coli)表達(dá)和純化的SEQ ID N0.7的重組核蛋白。
10.一種用于產(chǎn)生前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的重組蛋白的方法，包括下列步驟: i)培養(yǎng)用權(quán)利要求8和9所述的重組構(gòu)建體克隆的宿主細(xì)胞； )收集細(xì)胞并且從中分離所述重組蛋白； iii)通過以下方法中的至少一種純化所述蛋白:離子交換層析、凝膠過濾、親和層析、疏水柱層析、用鹽、有機(jī)溶劑分級(jí)、離心等。
11.一種濃縮和純化病毒的方法，包括下列方法的一種或多種: a.通過IOOkD-1OOOkD膜超濾； b.超速離心和密度梯度離心； c.柱層析，例如凝膠過濾、離子交換層析、疏水相互作用層析、親和基質(zhì)層析、用聚乙二醇、Himax 、有機(jī)鹽和無機(jī)鹽沉淀。
12.如權(quán)利要求1所述的穩(wěn)定的疫苗制劑，包含: a.純化和滅活的金迪普拉病毒抗原；b.磷酸鹽緩沖液IOmM至500mMpH6.7至7.4、或者相似pH的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液； c.濃度在0.1%至5%范圍內(nèi)的糖和糖醇，其中所述糖選自包括以下的列表:乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、和糖醇例如甘露醇或山梨醇、菊粉和/或其中不同糖的組合；d.25mM-200mM NaCl ； e.選自以下組成的列表的佐劑:氫氧化鋁、磷酸鋁、伽瑪菊粉、阿伽目林或其組合； f.任選地包括濃度在0.1%至5%的蛋白添加劑，例如人類血清白蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的凍干制劑，包含: a.純化和滅活的金迪普拉病毒作為抗原； b.磷酸鹽緩沖液IOmM至500mMpH6.7至7.4、或者相似pH的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液； c.濃度在0.1%至50%范圍內(nèi)的糖或糖醇，優(yōu)選地1-5%，其中所述糖選自以下組成的列表:乳糖、麥芽糖、蔗糖或海藻糖、菊粉、糖醇或其組合；d.25mM-200mM NaCl ； e.任選地，以在0.1%至5%的濃度范圍使用的蛋白添加劑例如人類血清白蛋白。
14.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的抗原，所述抗原以將作為疫苗施用的有效量在藥理學(xué)可接受的運(yùn)載體中，通過以下途徑的至少一種施用，所述途徑例如肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)、口服、和鼻內(nèi)途徑在哺乳動(dòng)物中優(yōu)選地在人類中施用以引發(fā)保護(hù)性抗體反應(yīng)。
15.一種使用根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的抗原性分子用于制備針對(duì)金迪普拉病毒感染的疫苗制劑、免疫診斷劑和免疫治療劑的體外或體內(nèi)方法。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，所述免疫原性組合物是金迪普拉病毒抗原和日本腦炎病毒抗原的組合，所述免疫原性組合物用于人類施用，用于預(yù)防金迪普拉病毒感染和日本腦炎病毒感染二者。
全文摘要
本發(fā)明涉及能夠在人類和其他哺乳動(dòng)物宿主中引發(fā)針對(duì)金迪普拉病毒感染的保護(hù)性免疫反應(yīng)的藥物制劑。免疫原性制劑包括作為重組蛋白從宿主細(xì)胞表達(dá)和純化的金迪普拉病毒糖蛋白(G蛋白)和/或核蛋白。包含該重組蛋白的疫苗組合物引發(fā)中和抗體，類似于在穩(wěn)定的制劑中的純化的滅活金迪普拉病毒的疫苗組合物。公開了滅活金迪普拉病毒用作候選疫苗的方法。此疫苗組合物與增強(qiáng)免疫反應(yīng)的佐劑一起配制。本發(fā)明中公開的疫苗組合物是高度免疫原性的并且在哺乳動(dòng)物宿主中引發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)。此免疫原性組合物配制為用于向人類體內(nèi)施用。此免疫原性制劑還可用于此病毒的存在的診斷。
文檔編號(hào)A61K39/12GK103228293SQ201180056615
公開日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月30日
發(fā)明者K·M·埃拉, K·蘇馬堤 申請(qǐng)人:巴拉特生物技術(shù)國際有限公司