專利名稱：用于評(píng)價(jià)hiv疫苗功效的動(dòng)物模型的制作方法
用于評(píng)價(jià)HIV疫苗功效的動(dòng)物模型本申請(qǐng)涉及HIV預(yù)防性疫苗開(kāi)發(fā)的新觀點(diǎn)、其產(chǎn)生和組成描述的具體細(xì)節(jié)及在實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物模型-嚴(yán)重聯(lián)合T-B-免疫缺陷小鼠(SCID小鼠)中評(píng)價(jià)HIV疫苗功效的方法。另夕卜，本發(fā)明涉及用于評(píng)價(jià)HIV疫苗功效的動(dòng)物模型。本發(fā)明的背景是文庫(kù)方法和質(zhì)譜法定量性HIV包膜蛋白變異性分析以及體內(nèi)證實(shí)HIV gpl20-gpl60感染活性包膜蛋白復(fù)合物呈遞與負(fù)責(zé)人類中HIV感染獲得和形成的人細(xì)胞CD4和輔助受體的變異性之間的相關(guān)性。本申請(qǐng)描述了免疫和攻擊能夠移入人類免疫活性細(xì)胞的免疫缺陷SCID小鼠(Hu-SCID-小鼠)的方法，其中所述免疫缺陷SCID小鼠作為動(dòng)物模型用于評(píng)價(jià)HIV疫苗的
有效性。發(fā)明簡(jiǎn)述使用抗體文庫(kù)和反相淘洗技術(shù)所收集的HIV包膜蛋白的變異性的首個(gè)數(shù)學(xué)建模計(jì)算和質(zhì)譜分析顯示在一位患者至多到IO6種可能的序列變異性和負(fù)責(zé)HIV感染獲得(infection catching)及進(jìn)一步AIDS病情進(jìn)展的眾多gpl20主要代表之間的巨大差距。在這些“計(jì)算的”和“找到的”序列數(shù)方面的差異與培養(yǎng)基中以拷貝/ml度量的HIV RNA滴度和通常為IO6-1O8的組織細(xì)胞感染量(TCID5tl)之間的體外不一致相似，其中所述的組織細(xì)胞感染量低于實(shí)驗(yàn)室毒株的HIV RNA滴度。找到了這些差異的簡(jiǎn)單解釋。gpl20序列變異性的數(shù)目和/或提供有感染活性的H1-病毒粒子存活選擇和優(yōu)勢(shì)以便進(jìn)一步增殖的眾多gpl60三聚體同工型取決可用于病毒侵入的人細(xì)胞受體如⑶4、CCR5和CXCR4變種的數(shù)目。由于人外周血單核細(xì)胞(PBMC)和其他細(xì)胞膜蛋白序列和同工型的變異性 存在但是受真核基因組穩(wěn)定性限制，故通過(guò)細(xì)胞侵入選擇的有感染能力的HIV gpl60包膜蛋白變種的數(shù)目限于數(shù)十年或最多1-2百個(gè)變體。這種理論分析在HIV-1實(shí)驗(yàn)室毒株和它們的“再現(xiàn)者(playback) ” (相同實(shí)驗(yàn)室毒株的人PBMC體外培養(yǎng)分離株的疫苗組合物)中得到證實(shí)。結(jié)果作為SCID小鼠中的體內(nèi)免疫效率評(píng)價(jià)獲得，其中所述SCID小鼠移入人類免疫活性細(xì)胞(PBMC，DC)并且根據(jù)發(fā)明說(shuō)明書(shū)詳述的操作方案用HIV實(shí)驗(yàn)室毒株和它們的“再現(xiàn)者” PBMC體外衍生物攻擊。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，HIV疫苗是由HIV-1包膜肽/蛋白混合物在佐劑存在下組成的免疫原性組合物，其中所述蛋白質(zhì)或肽是重組多克隆來(lái)源的并且所述免疫強(qiáng)化佐劑增強(qiáng)經(jīng)皮下接種的疫苗效率。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于評(píng)價(jià)HIV疫苗的方法，其中Hu-SCID-小鼠用所述HIV疫苗接種并且此后用H1-病毒攻擊，其中通過(guò)確定針對(duì)HIV攻擊的保護(hù)作用確定功效。用于研究HIV感染的動(dòng)物模型是本領(lǐng)域已知的。這些模型包括猴，并且也包括SCID小鼠，其任選地移入人白細(xì)胞。然而，在過(guò)去，用于研究HIV疫苗形式的臨床前分析的動(dòng)物模型僅在非常有限數(shù)目的動(dòng)物模型中進(jìn)行，大多僅在兩種模型-恒河猴(MacaqueRhesus)和黑猩猩中進(jìn)行。在恒河猴中，人HIV感染不起作用，因此僅用極端敏感的ELISPOT試劑盒測(cè)定法對(duì)疫苗測(cè)試激發(fā)HIV-特異性抗體反應(yīng)。在攜帶HIV感染但不形成免疫缺陷病(AIDS)的任何癥狀的黑猩猩中，試驗(yàn)結(jié)果最終回到相同的ELISPOT數(shù)據(jù)。因此，需要用于測(cè)試HIV疫苗的有效動(dòng)物模型并且需要新的高效的HIV疫苗組合物。
在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及移入人類免疫活性細(xì)胞的嚴(yán)重聯(lián)合T-B免疫缺陷(SCID)小鼠(Hu-SCID-小鼠)作為動(dòng)物模型用于評(píng)價(jià)HIV疫苗有效性的用途。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，免疫活性細(xì)胞能夠形成針對(duì)HIV的人型免疫反應(yīng)。優(yōu)選地，這種免疫反應(yīng)是在動(dòng)物的血液中、尤其在血清中可檢測(cè)的。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人類免疫活性細(xì)胞是PBMC、樹(shù)狀細(xì)胞或PBMC和樹(shù)狀細(xì)胞的混合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，人類免疫活性細(xì)胞是PBMC，尤其是體外預(yù)培育的PBMC，更具體地是體外預(yù)培育持續(xù)短暫時(shí)間段、甚至更優(yōu)選持續(xù)約I日至約6周的PBMC。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，已經(jīng)通過(guò)在能夠誘導(dǎo)樹(shù)狀細(xì)胞體外形成的細(xì)胞因子存在下培養(yǎng)人PBMC獲得樹(shù)狀細(xì)胞。優(yōu)選地，細(xì)胞因子也能夠阻斷細(xì)胞分化。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，人類免疫活性細(xì)胞源自人類供體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，小鼠已經(jīng)移入5-15X IO6個(gè)細(xì)胞、尤其免疫活性細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Hu-SCID小鼠是特定品種的動(dòng)物，所述動(dòng)物在它們自身的內(nèi)源免疫系統(tǒng)中有缺陷并被導(dǎo)入人類免疫活性細(xì)胞或任何其他的人類細(xì)胞、尤其人類免疫活性細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Hu-SCID小鼠是特定品種的動(dòng)物，所述動(dòng)物在它們自身的內(nèi)源免疫系統(tǒng)中有缺陷并且可以攜帶能夠形成針對(duì)HIV的人型免疫反應(yīng)的以下移入物:人類免疫活性細(xì)胞、PBMC、樹(shù)狀細(xì)胞(DC)或PBMC及樹(shù)狀細(xì)胞的混合物。在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于評(píng)價(jià)HIV疫苗的方法，其中本發(fā)明的Hu-SCID-小鼠用HIV疫苗接種并且此后用H1-病毒攻擊。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述HIV疫苗是HIV-1包膜肽/蛋白混合物，優(yōu)選地其中所述蛋白質(zhì)或肽是重組來(lái)源的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)確定疫苗的功效決定所述疫苗的評(píng)價(jià)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)確定針對(duì)HIV攻擊的保護(hù)作用確定所述功效。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，Hu-SCID-小鼠在最后移入人類免疫活性細(xì)胞后I至4周用HIV疫苗接種。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，意在用于一個(gè)實(shí)驗(yàn)的一只小鼠的人類免疫活性細(xì)胞PBMC或DC或PBMC和樹(shù)狀細(xì)胞的混合物從一位人類供體中遞送并且已經(jīng)作為5-15 X IO6個(gè)細(xì)胞移入用于單只動(dòng)物的一次接種。將PBMC培育的HIV毒株和實(shí)驗(yàn)室HIV毒株的5X IO2-1O4TCID5ci或更高、優(yōu)選高于IO4TCID50的感染量用于攻擊一只Hu-SCID動(dòng)物。優(yōu)選地，使用至少I(mǎi)O4TCID5tl、更優(yōu)選地至少I(mǎi)O5TCID5tl、甚至更優(yōu)選至少I(mǎi)O6TCID5tl的感染量。優(yōu)選地，使用至多到IO7TCID5tl的感染量。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)小鼠體液樣品中的病毒載量，尤其不存在/存在病毒載量和/或免疫反應(yīng)的特異性和/或強(qiáng)度確定HIV疫苗的功效。具體而言，通過(guò)檢測(cè)小鼠體液樣品中病毒載量不存在/存在和/或免疫反應(yīng)的特異性確定HIV疫苗的功效。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，體液樣品是血清。由于人類中在血液樣品內(nèi)檢測(cè)到HI病毒感染，因此其他檢驗(yàn)如腹內(nèi)液體/細(xì)胞病毒載量PCR測(cè)定法或ELISA免疫反應(yīng)測(cè)定法可以歸因于殘留的離體效應(yīng)并且不應(yīng)當(dāng)視為疫苗效率結(jié)果。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，用疫苗接種在佐劑存在的情況下進(jìn)行。對(duì)照Hu-SCID小鼠對(duì)HIV攻擊的可接受性以及接種后它們對(duì)攻擊的抵抗性優(yōu)選地作為血流中的病毒載量進(jìn)行檢測(cè)，所述病毒載量由實(shí)時(shí)PCR度量為Iml血清中的HIV RNA拷貝數(shù)。優(yōu)選地通過(guò)實(shí)時(shí)PCR和p24ELISA實(shí)施HIV實(shí)驗(yàn)室毒株和PBMC-DC- “再現(xiàn)者”毒株體外復(fù)制對(duì)照的動(dòng)力學(xué)。優(yōu)選地通過(guò)ELISA用包膜pl20_pl60抗原實(shí)施小鼠體液樣品中免疫反應(yīng)的HIV特異性。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，PBMC-Hu-SCID或DC-PBMC-Hu_SCID小鼠的HIV特異性免疫反應(yīng)是在最后接種后的幾周時(shí)間內(nèi)可檢測(cè)的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR或ELISA實(shí)施疫苗的評(píng)價(jià)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一個(gè)HIV實(shí)驗(yàn)室毒株再現(xiàn)者用來(lái)使Hu-SCID小鼠感染和/或暴露于HIV。一種用于產(chǎn)生HIV疫苗的方法在W02009/046984中描述。關(guān)于所述方法和方法步驟的描述和公開(kāi)內(nèi)容， 明確參考W02009/046984中相應(yīng)的部分。具體而言，本發(fā)明還涉及一種用于產(chǎn)生HIV疫苗和從而所獲得的重組蛋白/肽混合組合物的方法，其中所述方法包括步驟:a)產(chǎn)生包含HIV-1特異性抗體的文庫(kù)，b)通過(guò)用HIV-1肽、尤其天然和/或重組HIV-1肽淘洗，富集所述文庫(kù)中的HIV-1-特異性抗體，c)擴(kuò)增包含HIV-1肽、多肽或蛋白質(zhì)的HIV-1材料，d)使用與支持物結(jié)合的步驟b)的HIV-1-特異性抗體收集所擴(kuò)增HIV-1材料的HIV-1 肽，e)通過(guò)質(zhì)譜法、尤其通過(guò)MS-MS鑒定和表征在步驟d)中獲得的HIV-1肽，f)克隆編碼在步驟e)中所鑒定的肽的gpl20gpl60基因片段，g)使用步驟f)的結(jié)果，在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)糖基化的env HIV-1肽，h)純化糖基化的env HIV-1肽，和i)產(chǎn)生疫苗組合物，其特征在于為了克隆和/或表達(dá)步驟f)和/或g)中的糖基化env HIV-1肽,使用選自以下的至少一種引物:(i)用于亞型A、G、B、C、F1和H的Vl正向:5，-CTC TGY GTY ACT TTA XXX XXX XXX-3，(SEQ ID N0.1)，(ii)用于全部亞型的V2正向:5’-AAA ACT GCT CTT、CA XXX XXX XXX-3’ (SEQ ID N0.3),(iii)用于A、B、G亞型的V3正向:5’-TAV AAA TTA ATT GTA XXX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.5)，
(iv)用于D亞型的V3正向:5’-TAV CAA TTA ATT GCA XXX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.7)，(V)用于全部亞型的V4正向:5’-GAA TTT TTC TAT TGY AAXXX XXX XXX-3’ (SEQ ID N0.9)，(vi)用于A、B、D、G亞型的V5正向:5，-ACA AGA GAT GGT GGX XXX XXX X_3，(SEQ ID N0.11)，和(vii)用于C亞型的V5正向:5，-ACA CGT GAT GGA GGX XXX XXX X_3，(SEQ ID N0.13)，和至少一種選自以下的引物:(viii)用于A、B、D亞型的gp41 (160)反向，其包含編碼His-標(biāo)簽的序列:ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AG YM AGC YCT TTC NAA GCCCTG TC (SEQ ID N0.46),(ix) (viii)的引物衍生物，其缺少編碼His-標(biāo)簽的序列和/或包含編碼標(biāo)簽的序列，(X)用于A亞型稀有變體的gp41 (160)反向:ATA GCG GCC G·CC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC MA GCY CTT TCN GCG CCCTGT C(SEQ ID N0.66)，(xi)用于C亞型的gp41 (160)反向:ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT WGC MA GCT GCT TCA MG CCCTGT C (SEQ ID N0.67)，(xii)用于 G 亞型的 gp41 (160)反向:ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC MA GCY CTT TCN MG CCTTGT C(SEQ ID N0.68)，(xiii)用于全部亞型的gpl20反向Const5,其包含編碼His-標(biāo)簽的序列:5’-ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT CTT TTT TCT CTY TSC ACCACT CTY CT-3’ (SEQ ID N0.52)，和(xiiii) (viii)的引物衍生物，其缺少編碼His-標(biāo)簽的序列和/或包含編碼標(biāo)簽的序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所使用的引物適于亞型鑒定。例如，引物(Xi)用于C亞型的gp41 (160)反向和引物(vii)用于亞型C的V5正向可以用于C亞型鑒定。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用引物(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)、(vi)和/或(vii)的2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18種或更多種變體，其中所述變體差異在于變量“X”。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用引物⑴至(vii)及(X)至(xii)和(xiii)和(xiiii)之一以及(viii)和(ix)之一。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生HIV疫苗組合物的方法，所述方法包括步驟:a)產(chǎn)生包含HIV-1特異性抗體的文庫(kù)，b)通過(guò)用HIV-1肽、尤其天然和/或重組HIV-1肽淘洗，富集所述文庫(kù)中的HIV-1-特異性抗體，c)擴(kuò)增包含HIV-1肽、多肽或蛋白質(zhì)的HIV-1材料，d)使用與支持物結(jié)合的步驟b)的HIV-1-特異性抗體收集所擴(kuò)增HIV-1材料的HIV-1 肽，e)通過(guò)質(zhì)譜法、尤其通過(guò)MS-MS鑒定和表征在步驟d)中獲得的HIV-1肽，f)克隆編碼在步驟e)中所鑒定的肽的gpl20gpl60基因片段，g)使用步驟f)的結(jié)果，在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)糖基化的env HIV-1肽，h)純化糖基化的env HIV-1肽，和i)產(chǎn)生疫苗組合物，其特征在于為了克隆和/或表達(dá)步驟f)和/或g)中的糖基化env HIV-1肽,使用選自以下的至少一種引物:(i)用于A亞型的正向gpl20Constl (在5’末端上具有Xba I位點(diǎn)):5，-AAT TCT AGA CRC TRC AGA AAA CTT GTG GGT YAC -3，(SEQ ID N0.52)，或其在5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物，

(ii)用于B亞型的正向gpl20Constl (在5’末端上具有Xba I位點(diǎn)):5’ -AAT TCT AGA CGC TRC AGA AMA ATT GTG GGT CAC-3’ (SEQ ID N0.69)，或其在5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物，(iii)用于C亞型的正向gpl20Constl (在5’末端上具有Xba I位點(diǎn)):5’ -AAT TCT AGA CGT RRT GGG RAA CTT GTG GGT CAC-3’ (SEQ ID N0.70)，或其在5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物，和(iv)用于G亞型的正向gpl20Constl (在5’末端上具有Xba I位點(diǎn)):5，-AAT TCT AGA CGC CTC ARA TAA CTT GTG GGT CAC AG-3，(SEQ ID N0.71)，或其在5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物，和至少一種選自以下的引物:(V)用于全部亞型的Vl反向:5’-GCA GTT TTT YAT TTC TYX XXX XXX XXX-3’ (SEQ ID N0.25),(vi)用于A、D、C亞型的V2反向:5’-AGG TAT TRC AAT TTA TTX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.28)，(vii)用于B亞型的V2反向:5’-CTG AGG TRT TAC AAX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.29)，(viii)用于G亞型的V2反向:5’-AGA CAT TAC AAT TTA TTX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.30)，(ix)用于Fl亞型的V2反向:5’-TTG AGG TAT TRC AAX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.31)，(X)用于A、D、(C)亞型的V3反向:5’-AAA GTT TBA TTC CAX XXX XXX XX-3’ (SEQ ID N0.40),(xi)用于B亞型的V3反向:5’-AAA GTG TTR TTC CAX XXX XXX XX-3’ (SEQ ID N0.41),(xii)用于G亞型的V4反向:
5’-CAA TTT GTT TTA TYY TAC A XX XXX XXX X_3，(SEQ ID N0.19)，(xiii)用于 A、B、C、D 亞型的 V4 反向:5’-TAA TTT GYT TTA TTY TGC A XX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.20)，(xiv)用于全部亞型的V5反向:5，-TCC TCC TSC AGG TCT GAA XXX XXX XXX X_3，(SEQ ID N0.15)，(XV)用于A、B、D亞型的gp41 (160)反向，其包含編碼His-標(biāo)簽的序列:ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AG YM AGC YCT TTC NAA GCCCTG TC (SEQ ID N0.46),(xvi) (viii)的引物衍生物，其缺少編碼His-標(biāo)簽的序列和/或包含編碼標(biāo)簽的序列，(xvii)用于A亞型稀有變體的gp41 (160)反向:ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC MA GCY CTT TCN GCG CCCTGT C(SEQ ID N0.66)，(xviii)用于 C 亞型的 gp41 (160)反向:ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT WGC MA GCT GCT TCA MG CCCTGT C (SEQ ID N0.67 )，和(xix)用于 G 亞型的 gp41 (160)反向:ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC MA GCY CTT TCN AAG CCTTGT C (SEQ ID N0.68)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所使用的引物適于亞型鑒定。例如，引物⑴用于A亞型的正向gpl20Constl和引物(vi)用于A、D、C亞型的V2反向可以用于A亞型鑒定。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用引物(V)、(vi)、(vii)、(viii)、(ix)、(x)、(xi)、(xii)、(xiii)和 / 或(xiv)的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18 種或更多種變體，其中所
述變體差異在于變量，尤其變量“X”。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用引物⑴至(xiv)及(xvii)至(xix)和(xv)和(xvi)之一。根據(jù)本發(fā)明，將核苷酸序列中的“X”彼此獨(dú)立地理解為選自A、C、T和G的DNA核苷酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，文庫(kù)是人抗體文庫(kù)。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，文庫(kù)是噬菌粒文庫(kù)或天然抗體文庫(kù)，或與固相支持物結(jié)合的HIV包膜特異性肽/蛋白質(zhì)文庫(kù)。這些抗體可以處于IgG,尤其 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4 或 IgM、IgAl、IgA2、IgAsec、IgD或IgE形式。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，文庫(kù)的抗體處于IgG形式。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以使用scFv抗體,尤其曬菌粒文庫(kù)中的scFv抗體，如實(shí)施例中所示。HIV包膜特異性肽/蛋白質(zhì)文庫(kù)可以呈遞為針對(duì)HIV特異性所選擇的和能夠在酶免疫反應(yīng)、流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微術(shù)或蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)中結(jié)合HIV gpl20-gpl60蛋白的蛋白質(zhì)和/或肽。這類包膜特異性肽/蛋白質(zhì)可以基于支架如DARPIN或脂籠蛋白支架。
根據(jù)本發(fā)明，將“抗體”理解為包括抗體、抗體片段和抗體模擬物。抗體片段包括例如Fab、F(ab’)2、scFv (單鏈Fv)、雙體抗體、單結(jié)構(gòu)域VHH、VH或VL單結(jié)構(gòu)域。特別優(yōu)選的抗體是scFv抗體片段。抗體模擬物包括，例如DARPIN和脂籠蛋白。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，引物中的序列變量“X”由以下規(guī)定(a)根據(jù)以上的方法步驟(e)鑒定肽序列或其部分，并且(b)鑒定編碼步驟(a)的肽序列或其部分的核苷酸序列。具體而言，通過(guò)考慮標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)體代碼進(jìn)行步驟(b)。這例如在實(shí)施例4.1中描述。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種組合物，其包含以下核酸的至少一種:(i)用于六、6、8、(:、卩1、!1亞型的￥1正向:5，-CTC TGY GTY ACT TTA XXX XXX XXX-3，(SEQ ID N0.1)，(ii)用于全部亞型的V·2正向:5’-AAA ACT GCT CTT WCA XXX XXX XXX-3’ (SEQ ID N0.3)，(iii)用于A、B、G亞型的V3正向:5’-TAV AAA TTA ATT GTA XXX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.5)，(iv)用于D亞型的V3正向:5’-TAV CAA TTA ATT GCA XXX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.7)，(V)用于全部亞型的V4正向:5’-GAA TTT TTC TAT TGY AAXXX XXX XXX-3’ (SEQ ID N0.9),(vi)用于A、B、D、G亞型的V5正向:5’-ACA AGA GAT GGT GGX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.11)，(vii)用于C亞型的V5正向:5’-ACA CGT GAT GGA GGX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.13)，(viii)用于A、B、D亞型的gp41 (160)反向，其包含編碼His-標(biāo)簽的序列:ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AG YM AGC YCT TTC NAA GCCCTG TC (SEQ ID N0.46)或其衍生物，所述衍生物缺少編碼His-標(biāo)簽的序列和/或包含編碼標(biāo)簽的序列，(ix)用于亞型A稀有變體的gp41(160)反向:ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC MA GCY CTT TCN GCG CCCTGT C(SEQ ID N0.66)，(X)用于亞型C的gp41 (160)反向:ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT WGC MA GCT GCT TCA MG CCCTGT C (SEQ ID N0.67)，(xi)用于亞型G的gp41 (160)反向:ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC MA GCY CTT TCN MG CCTTGT C(SEQ ID N0.68)，和(xii)用于全部亞型的gpl20反向Const5,其包含編碼His-標(biāo)簽的序列:5’-ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT CTT TTT TCT CTY TSC ACCACT CTY CT-3’ (SEQ ID N0.52)，或其衍生物，所述衍生物缺少編碼His-標(biāo)簽的序列和/或包含編碼標(biāo)簽的序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該組合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12種以上的核酸。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種組合物，其包含以下核酸的至少一種:(i)用于A亞型的正向gpl20Constl (在5’末端上具有Xba I位點(diǎn)):5’ -AAT TCT AGA CRC TRC AGA AAA CTT GTG GGT YAC -3’ (SEQ ID N0.52)，或其在5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物，(ii)用于B亞型的正向gpl20Constl (在5’末端上具有Xba I位點(diǎn)):5’ -AAT TCT AGA CGC TRC AGA AMA ATT GTG GGT CAC-3’ (SEQ ID N0.69)，或其在5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物，(iii)用于C亞型的正向gpl20Constl (在5’末端上具有Xba I位點(diǎn)):5，-AAT TCT AGA CGT RRT GGG RAA CTT GTG GGT CAC-3，(SEQ ID N0.70)，或其在5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物，(iv)用于G亞型的正向gpl20Constl (在5’末端上具有Xba I位點(diǎn)):5，-AAT TCT AGA CGC CTC ARA TAA CTT GTG GGT CAC AG-3，(SEQ ID N0.71)，或其在5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物，(V)用于全部亞型的Vl反向:5’-GCA GTT TTT YAT TTC TYX XXX XXX XXX-3’ (SEQ ID N0.25),(vi)用于A、D、C亞型的V2反向:5’-AGG TAT TRC AAT TTA TTX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.28)，(vii)用于B亞型的V2反向:5’-CTG AGG TRT TAC AAX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.29)，(viii)用于G亞型的V2反向:5’-AGA CAT TAC AAT TTA TTX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.30)，(ix)用于Fl亞型的V2反向:5’-TTG AGG TAT TRC AAX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.31)，(X)用于A、D、(C)亞型的V3反向:5’-AAA GTT TBA TTC CAX XXX XXX XX-3’ (SEQ ID N0.40),(xi)用于B亞型的V3反向:5’-AAA GTG TTR TTC CAX XXX XXX XX-3’ (SEQ ID N0.41),(xii)用于亞型G的V4反向:5’-CAA TTT GTT TTA TYY TAC A XX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.19)，(xiii)用于亞型 A、B、C、D 的 V4 反向:5’-TAA TTT GYT TTA TTY TGC A XX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.20)，(xiv)用于全部亞型的V5反向:5’-TC C TCC TSC AGG TCT GAA XXX XXX XXX X_3’ (SEQ ID N0.15)，(xv)用于A、B、D亞型的gp41 (160)反向，其包含編碼His-標(biāo)簽的序列:ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AG YM AGC YCT TTC NAA GCCCTG TC (SEQ ID N0.46)或其衍生物，所述衍生物缺少編碼His-標(biāo)簽的序列和/或包含編碼標(biāo)簽的序列，(xvi)用于A亞型稀有變體的gp41 (160)反向:ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC MA GCY CTT TCN GCG CCCTGT C(SEQ ID N0.66)(xvii)用于 C 亞型的 gp41 (160)反向:ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT WGC MA GCT GCT TCA MG CCCTGT C (SEQ ID N0.67)，和(xviii)用于 G 亞型的 gp41 (160)反向:ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC MA GCY CTT TCN MG CCTTGT C (SEQ ID N0.68)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該組合物包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、
16、17或18種的上述核酸。這些引物和引物組合物用于克隆HIV-1肽，所述HIV-1肽隨后是HIV-1疫苗混合物的部分。因此，這些引物分別限定所擴(kuò)增核酸的5’和3’末端。當(dāng)然可以理解，除編碼env肽或蛋白質(zhì)片段的序列之外，在引物中還添加編碼His-標(biāo)簽的序列或?qū)腩~外限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的 序列。在又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種試劑盒，其包含至少一種本發(fā)明組合物和任選地包含適于PCR的其他化合物。合適的其他化合物例如是熱穩(wěn)定性聚合酶和緩沖液。本發(fā)明還涉及包含由以上序列定義的核酸的組合物作為引物用于產(chǎn)生HIV疫苗組合物的用途。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生HIV疫苗組合物的方法，所述方法包括步驟:a)產(chǎn)生包含HIV-1特異性抗體的文庫(kù)，b)通過(guò)用HIV-1肽、尤其天然和/或重組HIV-1肽淘洗，富集所述文庫(kù)中的HIV-1-特異性抗體，c)擴(kuò)增包含HIV-1肽、多肽或蛋白質(zhì)的HIV-1材料，d)使用與支持物結(jié)合的步驟b)的HIV-1-特異性抗體收集所擴(kuò)增HIV-1材料的HIV-1 肽，e)通過(guò)質(zhì)譜法、尤其通過(guò)MS-MS鑒定和表征在步驟d)中獲得的HIV-1肽，f)克隆編碼在步驟e)中所鑒定的肽的gpl20gpl60基因的片段，g)使用步驟f)的結(jié)果，在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)糖基化的env HIV-1肽，h)純化糖基化的env HIV-1肽，和i)產(chǎn)生疫苗組合物，其中步驟g)中的所述糖基化env HIV-1肽特征如下:⑴所述gpl20肽具有441-541個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度和/或約90_115kDa的糖基化蛋白分子量，和(ii)所述gpl60肽具有816-923個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度和/或145_175kDa的糖基化蛋白分子量，和(iii)表達(dá)至少50種、優(yōu)選地至少70種、更優(yōu)選地至少100種、甚至更優(yōu)選地至少150種不同的HIV-1包膜肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟i)的所述疫苗組合物包含(a)至少一種以N端序列LCVTL (SEQ ID N0.72)為特征的肽，(b)至少一種以N端序列NCSX (SEQ ID N0.73)為特征的肽，其中X是Y或F，(c)至少一種以N端序列XINC (SEQ ID N0.74)為特征的肽，其中X是K或Q或E，(d)至少一種以N端序列XINC (SEQ ID N0.75)為特征的肽，其中X是T或P或A，(e)至少一種以N 端序列EFFYC (SEQ ID N0.76)為特征的肽，(f)至少一種以N端序列TRDG (SEQ ID N0.77)為特征的肽，和(g)至少一種以N端序列LDXXENLWVLD (SEQ ID N0.78)為特征的肽，其中X彼此獨(dú)立是是T或A。本發(fā)明還涉及一種HIV疫苗組合物，其通過(guò)本發(fā)明的方法可獲得。本發(fā)明還涉及一種HIV疫苗組合物，所述HIV疫苗組合物包含至少50種、優(yōu)選地至少70種、更優(yōu)選地至少100種、甚至更優(yōu)選地至少150種不同的HIV-1包膜蛋白/肽，其特征在于:(i) gpl20肽具有441-541個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度和/或約90_115kDa的糖基化蛋白分子
量，和(i)gpl60肽具有816-923個(gè)氨基酸的長(zhǎng)度和/或145_175kDa的糖基化蛋白分子量。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，這種疫苗組合物還包含(a)至少一種以N端序列LCVTL (SEQ ID N0.72)為特征的肽，(b)至少一種以N端序列NCSX (SEQ ID N0.73)為特征的肽，其中X是Y或F，(c)至少一種以N端序列XINC (SEQ ID N0.74)為特征的肽，其中X是K或Q或E，(d)至少一種以N端序列XINC (SEQ ID N0.75)為特征的肽，其中X是T或P或A，(e)至少一種以N端序列EFFYC (SEQ ID N0.76)為特征的肽，(f)至少一種以N端序列TRDG (SEQ ID N0.77)為特征的肽，和(g)至少一種以N端序列LDXXENLWVLD (SEQ ID N0.78)為特征的肽，其中X彼此獨(dú)立是是T或A。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，HIV-1包膜肽重組地產(chǎn)生。這些肽可以在適于表達(dá)真核肽和蛋白質(zhì)的表達(dá)系統(tǒng)中，例如在酵母菌株、昆蟲(chóng)細(xì)胞或真核細(xì)胞寄生蟲(chóng)系統(tǒng)中表達(dá)。具體而言，這些肽可以在蜥蜴利什曼原蟲(chóng)(L.tarentolae)中表達(dá)，如實(shí)施例4.2中和/或W02009/046984中例舉。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，gpl20肽重組地產(chǎn)生和/或由具有1323至1623bp長(zhǎng)度的核酸編碼。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，gpl60肽重組地產(chǎn)生和/或由具有2448至2769bp長(zhǎng)度的核酸編碼。
在本發(fā)明的又一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼HIV疫苗組合物的肽的核酸任選地包含編碼標(biāo)簽、尤其His-標(biāo)簽的序列和/或編碼適合于重組表達(dá)的信號(hào)肽的序列和/或使得在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)能夠進(jìn)行的序列。具體而言，將編碼HIV疫苗組合物的肽的核酸插入用于真核表達(dá)的合適載體中。載體可以包含編碼HIV疫苗組合物的一種或多種肽的一種或多種核酸。使用上文描述的引物獲得用于表達(dá)HIV疫苗組合物的肽的原始PCR產(chǎn)物，并且在合適的(蜥蜴利什曼原蟲(chóng)(Leishmania tarentolae))載體中分別在_rev末端環(huán)鑒定的Vl至V5之間進(jìn)行修飾。免疫原性組合物的免疫原性組分在合適的真核宿主在體內(nèi)系統(tǒng)中、尤其在蜥蜴利什曼原蟲(chóng)(L.tarentolae)中表達(dá)并且從其中提取。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，HIV疫苗組合物是有效的，如通過(guò)檢測(cè)本發(fā)明小鼠模型的體液樣品中病毒載量不存在/存在和/或免疫反應(yīng)的特異性所確定。免疫原性組分由 眾多重組HIV-1包膜肽/蛋白(不少于它們的幾十種變體)組成，其中g(shù)pl20代表的長(zhǎng)度是1323至1623bp (441-541個(gè)氨基酸)并且糖基化蛋白分子量是90-115kDa，并且其中g(shù)pl60代表的長(zhǎng)度是2448至2769bp (分別是816-923個(gè)氨基酸)和糖基化蛋白分子量是145-175kDa。本發(fā)明的“標(biāo)簽”是適合于分離并與目的肽或蛋白質(zhì)序列共價(jià)連接的肽序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，標(biāo)簽是His-標(biāo)簽。His-標(biāo)簽是由6個(gè)組氨酸組成的肽序列。His-標(biāo)簽與金屬基質(zhì)結(jié)合。其他合適的標(biāo)簽是殼多糖結(jié)合蛋白(CBP)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和FLAG-標(biāo)簽。根據(jù)實(shí)施例，將His-標(biāo)簽用于純化表達(dá)的肽。然而，也可以使用其他標(biāo)簽，尤其親和標(biāo)簽用于純化肽。另外，本發(fā)明的幾種引物包含Xba I位點(diǎn)。這個(gè)位點(diǎn)適于克隆擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物至合適的表達(dá)載體中。可以理解，其他限制性位點(diǎn)也適于克隆PCR產(chǎn)物至表達(dá)載體中。在實(shí)施例2.1,2.2中和在W02009/046984中描述了含有HIV-1特異性scFv抗體片段的人重組IgG噬菌粒文庫(kù)的產(chǎn)生和通過(guò)用天然或重組HIV-1肽淘洗而富集該噬菌粒文庫(kù)中的HIV特異性scFv抗體片段。在W02009/046984中并且在本發(fā)明中描述了用于擴(kuò)增包含HIV-1肽、多肽或蛋白質(zhì)的HIV-1材料的方法。具體而言，可以在PBMC培養(yǎng)細(xì)胞中擴(kuò)增HIV-1。在實(shí)施例2.3中和在W02009/046984中描述了通過(guò)使用與支持物結(jié)合的上文描述的富集的HIV-1噬菌粒文庫(kù)反向淘洗擴(kuò)增的HIV-1材料而收集HIV-1肽。例如在W02009/046984中并且在本發(fā)明的實(shí)施例3.1和3.2中描述了如此獲得的HIV-肽的鑒定和表征。例如在實(shí)施例3中描述通過(guò)質(zhì)譜法、尤其通過(guò)MS-MS、更優(yōu)選通過(guò)LC-MS鑒定和表征HIV-1肽。在W02009/046984中或在本發(fā)明的實(shí)施例4.1、4.2和4.3中描述在表達(dá)系統(tǒng)中使用以上步驟的結(jié)果表達(dá)糖基化的env HIV-1肽。在W02009/046984中或在本發(fā)明的實(shí)施例4.3中描述糖基化env HIV-1肽的純化。在W02009/046984中描述疫苗組合物的產(chǎn)生。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，從中獲得HIV材料的個(gè)體被相同或不同的HIV亞型感染。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，從中獲得病毒材料的個(gè)體是從未進(jìn)行過(guò)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法的患者或已經(jīng)進(jìn)行過(guò)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法的患者。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)以下步驟制備噬菌粒文庫(kù)a)制備源自核酸的DNA片段，所述核酸分別編碼免疫球蛋白的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)，所述免疫球蛋白在從HIV感染的眾多個(gè)體所獲得的B-淋巴細(xì)胞中表達(dá)，

b)連接編碼免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA片段，以允許分別包含免疫球蛋白輕鏈和重鏈的可變區(qū)的多肽表達(dá)，以便產(chǎn)生眾多不同的特異性，c)在噬菌粒載體中克隆連接的片段并且轉(zhuǎn)化細(xì)菌菌株用于表達(dá)在噬菌體表面上，優(yōu)選地其中擴(kuò)增用W02009/046984的表1_7中所列出的任何引物組合實(shí)施，更優(yōu)選地其中獲得的scFv曬菌粒重組抗體對(duì)經(jīng)歷過(guò)HAART或任何其他抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法的患者中所攜帶的抗性HIV變體有特異性。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟a)進(jìn)一步包括以淘洗過(guò)程富集呈遞抗體scFv片段的噬菌粒文庫(kù)，所述淘洗過(guò)程用從不同供體分離的重組gpl20多肽、gp41多肽和天然HIV多肽結(jié)合HIV-特異性抗體。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將LC質(zhì)譜法用于HIV_lgpl20和HIV_lgp41及其標(biāo)準(zhǔn)和可變片段的定量分析、鑒定和測(cè)序。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，通過(guò)任選地添加和/或綴合免疫原性刺激劑、佐劑或載體(如立體穩(wěn)定的脂質(zhì)體(SSL))實(shí)現(xiàn)制備HIV預(yù)防性疫苗組合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的HIV疫苗組合物，所述HIV疫苗組合物還包含免疫原性刺激劑、佐劑或載體，如立體穩(wěn)定的脂質(zhì)體(SSL)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的HIV疫苗組合物用于免疫未感染個(gè)體抵抗獲得并形成HIV感染和AIDS病的用途。圖注:

圖1顯示在具有或沒(méi)有割用于胰蛋白酶水解的標(biāo)記條帶的情況下，制備型PAAG電泳的樣品，連同進(jìn)一步質(zhì)譜分析:A-PokA-79-PBMC 和 U455-PBMC 樣品(分別 FIL-1 和 FIL-2)，考馬斯染色；B-H9/IIIB和PokA_79實(shí)驗(yàn)室毒株樣品，銀染法。圖2顯示對(duì)于采用分離的U455實(shí)驗(yàn)室毒株蛋白進(jìn)行的免疫，與BalbC反應(yīng)相比，SCID小鼠內(nèi)源性免疫缺陷測(cè)試。圖3顯示SCID-PBMC和BalbC針對(duì)用重組pl20_l和pl20_2蛋白混合物免疫的免
疫反應(yīng)。圖4顯示3次攻擊其間間隔7日在U937和MT-4背景上的PokA_79病毒載量率。圖5顯示2次攻擊其間間隔3日在U937和MT-4背景上的PokA_79病毒載量率。圖6顯示SCID小鼠中攻擊之間不同間隔的PokA_79_MT4和U937-背景的病毒載
曰.里牟。圖7顯示PokA-79毒株體外復(fù)制動(dòng)力學(xué)、淋巴細(xì)胞MT_4、單核細(xì)胞U937培養(yǎng)物、PBMC和DC背景。
圖8顯示PokA-79毒株體外復(fù)制動(dòng)力學(xué)、p24表達(dá)、淋巴細(xì)胞MT-4、單核細(xì)胞U937
背景圖9顯示在體外培養(yǎng)第3日細(xì)胞培養(yǎng)物的形態(tài)和HIV-1毒株感染表現(xiàn)。用箭頭標(biāo)出 Syncithyum 形成。A)MT_4淋巴細(xì)胞B) PokA-79-MT4圖10顯示在體外培養(yǎng)第5日U937單核細(xì)胞培養(yǎng)物的形態(tài)和HIV-1毒株感染表現(xiàn)。用箭頭標(biāo)出Syncithyum形成。A) U937 完整的單核細(xì)胞，B) PokA_79_U937 和 C)U455_U937圖11顯示在PBMC傳代體外培養(yǎng)第5日PBMC的形態(tài)和HIV-1毒株感染表現(xiàn)。用箭頭標(biāo)出Syncithyum形成。A)健康供體PBMCB) PokA-79-PBMC 第 6 次傳代(6 周)C) U455-PBMC 第 5 次傳代(5 周) 圖12顯示在DC傳代第3日DC和PokA_79_DC毒株培養(yǎng)的形態(tài)——在供體樹(shù)狀細(xì)胞和被處于第5代的PokA-79DC慢性感染的樹(shù)狀細(xì)胞之間沒(méi)有可見(jiàn)到的差異。A)健康供體DCB) PokA-79-DC 第 5 次傳代(5 周)圖13顯示4次攻擊其間間隔7日在MT-4和U937細(xì)胞培養(yǎng)背景上的實(shí)驗(yàn)室毒株U455和H9/IIIB病毒載量率。圖14顯示在淋巴細(xì)胞MT-4和單核細(xì)胞U937背景上的U455和H9/IIIB體外復(fù)制動(dòng)力學(xué)。圖15顯示U455和H9/IIIB體外復(fù)制動(dòng)力學(xué)、p24表達(dá)、淋巴細(xì)胞MT-4和單核細(xì)胞U937培養(yǎng)。圖16顯示在細(xì)胞培養(yǎng)物U937和MT4背景上取決于攻擊次數(shù)的PokA-79病毒載量率。圖17顯示對(duì)于分別用PokA-PBMC和PokA-79毒株攻擊的SCID-PBMC和SCID-細(xì)
胞培養(yǎng)背景病毒載量率。圖18顯示與第6-8次PBMC傳代和U937背景相比，樹(shù)狀細(xì)胞(DC)和新鮮PBMCPokA-79-U937和U455-U937實(shí)驗(yàn)室毒株(PBMC第I周)的陰性攻擊結(jié)果。圖19顯示PokA-79體外傳代復(fù)制動(dòng)力學(xué)、DC和PBMC背景、第I周和第5_6周傳代。圖20顯示U455和PokA-79體外復(fù)制動(dòng)力學(xué)、樹(shù)狀細(xì)胞(DC)或PBMC背景、第5和第6次傳代。圖21顯示:A) Scaffold軟件HIV包膜蛋白的鑒定和可信分析，B) HIV包膜蛋白的圖譜，OHIV包膜蛋白的胰蛋白酶解肽作圖，D) Scaffold軟件HIV包膜蛋白的鑒定和可信分析，
E) HIV包膜蛋白的胰蛋白酶解肽作圖。圖22顯示HIV包膜蛋白的胰蛋白酶解肽作圖。圖23A)至23M)顯示:HIV包膜蛋白的圖譜。圖24顯示針對(duì)比對(duì)的幾種序列所作圖的用于修改免疫原性組合物的PCR產(chǎn)物的引物配置 圖25A)顯示用PokA-79-PBMC毒株攻擊的SCID-PBMC小鼠中針對(duì)gp 160-1和gpl60-2的免疫反應(yīng)。圖25B)顯示用PokA-79-PBMC第6代毒株攻擊的SCID-PBMC的重組gpl60_l和gpl60-2免疫效果。圖25C顯示用PokA79_PBMC和U455_PBMC6_8周毒株攻擊時(shí)的重組gpl60-PokA-PBMC 和 gpl60_U455_PBMC 的免疫效果。圖26顯示A)HIV_lgpl20中的恒定區(qū)和可變區(qū)的示意圖和引物排列，和B) Gpl60示意圖和引物排列。技術(shù)狀況:本發(fā)明涉及用于HIV疫苗有效性評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型和新HIV疫苗組合物。具體而言，提出的方法包括用于檢驗(yàn)預(yù)防性HIV疫苗防止體內(nèi)HIV攻擊的免疫效果的內(nèi)源性免疫系統(tǒng)缺陷性CSID-人源化小鼠模型應(yīng)用。將移入SCID人源化外周血淋巴細(xì)胞(SCID-PBMC)或SCID人源化樹(shù)狀細(xì)胞的小鼠(SCID-DC-PBMC)用于免疫，并且隨后用HIV實(shí)驗(yàn)室毒株攻擊，其中根據(jù)反向淘洗和質(zhì)譜分析 方法獲得所述實(shí)驗(yàn)室毒株的包膜蛋白的庫(kù)。將一種供體PBMC或未混合的一種供體DC-PBMC衍生物接種至一種動(dòng)物中。嚴(yán)重聯(lián)合T-B免疫缺陷(SCID)和無(wú)胸腺裸鼠從未在實(shí)踐中用于體內(nèi)評(píng)價(jià)HIV疫苗有效性，盡管自上世紀(jì)90年代早期以來(lái)，已知可以向這類小鼠成功地移入人外周血細(xì)胞(PBMC)、樹(shù)突細(xì)胞(DC)和干細(xì)胞，據(jù)信所述細(xì)胞能夠形成抗HIV免疫反應(yīng)[1，13，16]和抗體內(nèi)HIV感染形成[2，3，9，12，22]。討論了聯(lián)合這兩種特征并且使用hu_SCID小鼠用于接種測(cè)定的構(gòu)想[9]?；贒NA和基于肽的HIV疫苗形式的臨床前測(cè)定在非常有限數(shù)目的動(dòng)物模型中進(jìn)行，大多僅在兩種模型中-即在恒河猴(Rhesus Macaques)和黑猩猩(Chimps)中進(jìn)行。在恒河猴中，人HIV感染不起作用，因此用極度敏感的ELISPOT測(cè)定法檢測(cè)時(shí)，僅對(duì)疫苗測(cè)試激發(fā)HIV-特異性抗體反應(yīng)。在攜帶HIV感染但不形成獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)的任何癥狀的黑猩猩中，試驗(yàn)結(jié)果最終回到相同的ELISPOT數(shù)據(jù)。因此，現(xiàn)存的猴模型根本不是令人滿意的，因?yàn)樵谶@些動(dòng)物中，HIV感染根本沒(méi)有像在人類中那樣形成。通常，疫苗與其他治療性/預(yù)防性醫(yī)學(xué)藥物區(qū)分，在于它們?cè)陉?yáng)性效果檢驗(yàn)方面缺少第一階段的體外研究。從開(kāi)始疫苗開(kāi)發(fā)研究至以大規(guī)模藥物目的生產(chǎn)結(jié)束，存在主要的兩代疫苗。第一代疫苗以用化學(xué)化合物處理和進(jìn)一步中和可能的毒性、發(fā)酵性病原體裂解成肽和蛋白質(zhì)、通過(guò)用于保留疫苗活性組分的高壓滅菌或任何其他相似方法消毒而失活的天然病原體或其衍生物為代表。這種產(chǎn)生疫苗的方式在XX世紀(jì)成功地用于全部細(xì)菌性病原體如結(jié)核病、霍亂、白喉毒素，并且也用于大型穩(wěn)定的DNA病毒病如天花，穩(wěn)定的單鏈和雙鏈RNA病毒病，如麻疹、甲型和乙型肝炎、人腦炎、狂犬病和其他更罕見(jiàn)的熱帶病疫苗。第一類疫苗正常情況下提供足夠防止感染發(fā)展的病原體特異性、延長(zhǎng)和強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)形成。然而這代疫苗的缺點(diǎn)總是在施用時(shí)缺少安全性，原因在于存活病原體的活性的高風(fēng)險(xiǎn)，所述高風(fēng)險(xiǎn)引起形成真實(shí)的疾病，而非抵抗疾病的免疫，并且還引起免疫系統(tǒng)針對(duì)外來(lái)蛋白形成過(guò)敏反應(yīng)和進(jìn)一步造成免疫易損性和免疫病。第二代疫苗開(kāi)發(fā)始于基因工程和分子生物學(xué)的貢獻(xiàn)，作為自上世紀(jì)80年代晚期以來(lái)正在替換第一類疫苗的基于重組蛋白/肽的疫苗。重組疫苗被迅速地接受，因?yàn)樗鼈冊(cè)谑┯煤蜕a(chǎn)時(shí)提供更高程度的安全性，原因在于它們是不含激發(fā)疾病的病原體[14，20]。在將它們靶向保守和穩(wěn)定的病原體的情況下，在幾年努力開(kāi)發(fā)后，它們高度地匹配特異性免疫并且接近于完全保護(hù)免受傳染病影響。在廉價(jià)和易于維持的原核表達(dá)系統(tǒng)(大腸桿菌轉(zhuǎn)化菌株)中產(chǎn)生的重組蛋白或肽的混合物能夠精確地模擬表現(xiàn)原核生物病原體表面“檢查點(diǎn)”，所述檢查點(diǎn)對(duì)于抗體識(shí)別和針對(duì)眾多細(xì)菌性傳染病的接種至關(guān)重要。細(xì)菌細(xì)胞表面在正常情況下含有標(biāo)準(zhǔn)數(shù)目的十分保守的蛋白質(zhì)，總共約I千種。對(duì)于不同家族如冠狀病毒科、腺病毒科、痘病毒科的許多大型DNA和RNA致病性病毒等，觀察到標(biāo)準(zhǔn)表面抗原展示和它們數(shù)目的相似情況。一些小型RNA病毒也在其宿主中、實(shí)際上在全世界范圍內(nèi)具有十分穩(wěn)定的基因型范圍，例如微RNA病毒科甲型肝炎病毒。對(duì)于歷史上每種已知的重組疫苗，耗費(fèi)多年來(lái)解決以下難題:從幾百種可能的候選物中區(qū)分出負(fù)責(zé)針對(duì)當(dāng)前病原體的免疫的這些蛋白質(zhì)“檢查點(diǎn)”。隨后，免疫原性肽混合制備物和臨床前功效分析耗費(fèi)更多年的工作。在接下來(lái)的幾年臨床試驗(yàn)內(nèi)，醫(yī)生研究并且展示重組疫苗勝過(guò)天然病原體衍生物施用的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于每個(gè)重組疫苗開(kāi)發(fā)，這個(gè)過(guò)程正常情況下耗費(fèi)15-50年。如果我們盡 力將HIV疫苗開(kāi)發(fā)嘗試轉(zhuǎn)移至上文所述的這種兩階段方案，則馬上顯而易見(jiàn)，HIV疫苗不適于這種方案。對(duì)此存在幾個(gè)主要原因。首先，開(kāi)發(fā)來(lái)自上世紀(jì)90年代早期的幾項(xiàng)專利中所述的基于天然病原體的抗HIV疫苗[5，11]是不可能的，原因在于不可能以或多或少合理的量產(chǎn)生和收集病毒基材。在我們的研究中，我們確定地證明，不可能用重力加速度超過(guò)200000g的標(biāo)準(zhǔn)蔗糖梯度超速離心方法以足夠用于分析目的的量濃縮病毒包膜蛋白[7]。因此對(duì)于HIV疫苗不存在第一階段，嘗試第二階段-重組疫苗開(kāi)發(fā)嘗試[8，14]。在試圖產(chǎn)生重組形式之前的病毒基因組測(cè)序揭示約三分之一病毒基因組的變異如此巨大，以至于即便從一位患者或混合在一起的患者群組的相同樣品中找到兩個(gè)相同的全長(zhǎng)變體的機(jī)會(huì)也渺茫[15]。因此，經(jīng)頒布用于臨床試驗(yàn)的現(xiàn)代HIV疫苗譜以DNA載體形式為代表——就疫苗開(kāi)發(fā)演進(jìn)而言，它是不完整的重組第二階段，所述重組第二階段仍未實(shí)現(xiàn)接種效果必需的蛋白質(zhì)組合物。因此，DNA HIV疫苗臨床前測(cè)定在恒河猴和黑猩猩中進(jìn)行。同時(shí)，用于研究人HIV感染及其抗病毒藥治療的動(dòng)物模型最初在上世紀(jì)80年代晚期由Derek Mosier產(chǎn)生[13]并且由世界上幾家實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)用于HIV研究中的不同實(shí)際應(yīng)用[2，6，9，10]。移入人白細(xì)胞(PBL)的SCID小鼠為采用不同抗原的免疫提供人樣免疫反應(yīng)，所述抗原包括HIV肽和蛋白[1，2，4，6]。動(dòng)物在2-5周年齡中以腹內(nèi)方式供給20-50X 106PBL[9，10]，接下來(lái)的兩個(gè)月，對(duì)它們檢查人淋巴細(xì)胞在腹腔、脾、淋巴結(jié)、肝中的存在和血流中人樣細(xì)胞因子譜。在2-3個(gè)月后，在長(zhǎng)大的動(dòng)物中觀察到淋巴細(xì)胞耗盡、貧血，在一些情況下白血病形成[9，16]。為避免這類副作用(移植物抗宿主病-GVHD)，提供了將移入之前用人IL-2、IL-12、INF-γ處理人白細(xì)胞所產(chǎn)生的樹(shù)狀細(xì)胞移入免疫缺陷小鼠[6，9，10]。一些研究者將人器官和組織的部分——脾、胸腺、樹(shù)狀細(xì)胞移入新生CSID小鼠[19]。一種用于單只小鼠的人類供體器官的組織移入由Stoddart小組[18]成功地進(jìn)行。不同方法適應(yīng)于在SCID和NOD-SCID小鼠中建立HIV感染模型，95%的這些實(shí)驗(yàn)基于體外在細(xì)胞培養(yǎng)物上培育的實(shí)驗(yàn)室HIV毒株。使用表達(dá)⑶4、CCR5和CXCR4受體的培養(yǎng)物如轉(zhuǎn)染的HeLa-CD4、MT2、MT4、MAG1-CCR5、U937等作為病毒性感染的移入基材[10，21]。人組織的移植物(Hu-SCID Thy/Liv)、分離的人白細(xì)胞(PBL)和其實(shí)驗(yàn)室毒株感染的變體腹內(nèi)施用并且提供HIV感染[2，11，22]。用RT-PCR或?qū)崟r(shí)PCR從腹內(nèi)灌洗液、肝、脾和胸腺區(qū)域度量感染率[9]。但更經(jīng)常地，將樹(shù)狀細(xì)胞移入SCID小鼠，其中所述樹(shù)狀細(xì)胞在體外隨來(lái)自人外周血白細(xì)胞(PBL)的白介素因子一起培育。這類人源化嵌合小鼠據(jù)報(bào)道能夠長(zhǎng)時(shí)間(1-6個(gè)月)攜帶HIV感染[3，9]并且用于檢驗(yàn)和展示不同類別抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的抗病毒活性[9，17，21]。證實(shí)移入樹(shù)狀細(xì)胞的動(dòng)物在正常情況下受到保護(hù)免于形成移植物抗宿主病并且在異體移植物嵌入后存活數(shù)月[22]。眾多研究者，尤其在臨床試驗(yàn)中確信他們親自開(kāi)發(fā)的HIV疫苗不起作用的那些研究者，宣稱不可能發(fā)明將保護(hù)人類免于獲得和形成病毒性感染的HIV免疫疫苗[17]。一些采用在HIV實(shí)驗(yàn)室毒株細(xì)胞培養(yǎng)物或培養(yǎng)基存在下體外培育并且隨后移入SCID或NOD-SCID小鼠中的樹(shù)狀細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)顯示，這些動(dòng)物沒(méi)有因采用相同實(shí)驗(yàn)室毒株攻擊而獲得HIV感染并且沒(méi)有因此而維持HIV感染[9]。也曾描述了將樹(shù)狀細(xì)胞移入SCID小鼠并且阻斷天然HIV分離株感染的相同實(shí)驗(yàn)，其中所述天然HIV分離株在健康供體PBL上培育[9]。然而在本發(fā)明范圍內(nèi)，可以理解，可以使用其他免疫缺陷實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，如裸鼠、免疫缺陷大鼠、免疫缺陷貓等。嚴(yán)重聯(lián)合T-B免疫缺陷缺陷小鼠(SCID小鼠)和用于產(chǎn)生它們的方法是本領(lǐng)域已知的。另外，SCID小鼠也是市售的。然而，從未描述下述hu-SCID小鼠的產(chǎn)生，其中所述hu-SCID小鼠存在血清可檢測(cè)的針對(duì)HIV包膜蛋白的免疫反應(yīng)和HIV攻擊后血清可測(cè)量的病毒載量，所述病毒·載量作為每ml具有相同PBMC背景的未免疫小鼠的血清的HIV RNA拷貝數(shù)。盡管高的HIV特異性免疫原性和宣稱的HIV攻擊能力，但是沒(méi)有一個(gè)人曾經(jīng)發(fā)表SCID小鼠用于檢驗(yàn)DNA HIV疫苗功效的結(jié)果[2，6，9，10]。所開(kāi)發(fā)的全部hu-SCID小鼠模型中僅一個(gè)模型——在生命的前1-3周移入人胸腺和肝臟的長(zhǎng)大的SCID后代(hu-SCIDThy/Liv)——證明能夠在相同動(dòng)物的血流中攜帶HIV特異性免疫反應(yīng)和病毒攻擊結(jié)果[2, 11,22] 0然而，這類人源化小鼠的產(chǎn)生是十分費(fèi)力和和高度昂貴的。一只經(jīng)人胸腺和肝臟人源化的SCID小鼠的成本超過(guò)用于實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)的一只小型靈長(zhǎng)類(如恒河猴)的成本。有利的是，Hu-SCID小鼠可以提供快速世代更替，這歸因于壽命短暫，并且還提供有效的統(tǒng)計(jì)分析，因?yàn)轶w重15-25克的小動(dòng)物每次需要的檢驗(yàn)用免疫材料比體重幾公斤的獼猴少大約50倍。為小鼠提供足夠的用于移入的免疫活性人細(xì)胞材料的真實(shí)可能性也值得考慮。發(fā)明詳述本發(fā)明顯示，Hu-SCID小鼠代表一種用于評(píng)價(jià)HIV疫苗的高效動(dòng)物模型。然而，在本發(fā)明范圍內(nèi)，可以理解，也可以使用裸鼠、免疫缺陷大鼠、免疫缺陷貓和其他免疫缺陷動(dòng)物。
嚴(yán)重聯(lián)合T-B免疫缺陷缺陷小鼠(SCID小鼠)和用于產(chǎn)生它們的方法是本領(lǐng)域已知的。另外，SCID小鼠也是市售的。將人類免疫活性細(xì)胞移入SCID小鼠的技術(shù)也是本領(lǐng)域已知的，并且額外地在所附實(shí)施例中描述。如本發(fā)明中所用，術(shù)語(yǔ)“免疫活性細(xì)胞”包括特異性免疫系統(tǒng)的任何細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞并且尤其T和B淋巴細(xì)胞，其中所述細(xì)胞已經(jīng)在體外或體內(nèi)暴露于特定目的抗原，即待評(píng)價(jià)的HIV-疫苗。T-淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞、胸腺細(xì)胞)的實(shí)例是輔助T細(xì)胞、細(xì)胞毒T細(xì)胞、NKT-細(xì)胞、Y δ -T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。T細(xì)胞可以分別是⑶4和/或⑶8陽(yáng)性和/或陰性，這取決于它們的成熟狀態(tài)。B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞，骨細(xì)胞)的實(shí)例包括血漿B細(xì)胞、BI細(xì)胞和Β2細(xì)胞，邊緣區(qū)B細(xì)胞和記憶B細(xì)胞。免疫活性細(xì)胞可以例如從個(gè)體(如外周血單核細(xì)胞(PBMC))或從細(xì)胞系獲得。優(yōu)選地，免疫活性細(xì)胞可以選自PBMC、樹(shù)狀細(xì)胞、B細(xì)胞和T-細(xì)胞。更優(yōu)選地，人類免疫活性細(xì)胞是PBMC或樹(shù)狀細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)使用任何常規(guī)途徑，如通過(guò)腹內(nèi)或腸胃外途徑實(shí)現(xiàn)人源細(xì)胞導(dǎo)入SCID小鼠中。正常情況下，優(yōu)選腹內(nèi)途徑，原因在于易于施用并且允許施用大量液體。這些細(xì)胞可以按處于允許細(xì)胞存活的任何適合介質(zhì)(如磷酸鹽緩沖鹽水PBS或Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、Roswell Park Memorial Institute 培養(yǎng)基(RPMI)或 Glasgow 極限基本培養(yǎng)基(GMEM))中的懸液形式導(dǎo)入。在導(dǎo)入SCID小鼠之前，免疫活性細(xì)胞可以用免疫刺激劑刺激。用于此目的的免疫刺激劑可以是上文提 到的免疫刺激劑。優(yōu)選的刺激劑包括但不限于白介素因子如IL-2(白介素-2)、IL-4(白介素-4)、IL-12(白介素-12)和其他因子如INF-Y和GCSF(粒細(xì)胞集落刺激因子)。也可以使用其他或不同因子或這類因子的組合。免疫刺激劑促進(jìn)例如T、B和造血細(xì)胞的生長(zhǎng)和/或發(fā)育?？梢酝ㄟ^(guò)在能夠誘導(dǎo)樹(shù)狀細(xì)胞體外形成的細(xì)胞因子存在下培養(yǎng)人PBMC獲得樹(shù)狀細(xì)胞。用于體內(nèi)產(chǎn)生樹(shù)狀細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的(見(jiàn)例如[25])。人源細(xì)胞每次導(dǎo)入的細(xì)胞計(jì)數(shù)可以是約IX IO3至IX IO8個(gè)細(xì)胞/導(dǎo)入，優(yōu)選地是約I X IO3至I X IO7個(gè)細(xì)胞/導(dǎo)入，更優(yōu)選地是約I X IO4至I X IO7個(gè)細(xì)胞/導(dǎo)入，甚至更優(yōu)選是約I X IO5至I X IO7個(gè)細(xì)胞/導(dǎo)入，并且甚至更優(yōu)選是約1-15 X IO6個(gè)細(xì)胞/導(dǎo)入(即對(duì)于僅單次移入)。人源細(xì)胞的導(dǎo)入可以在步驟(b)之前重復(fù)，如2次至3次，每周一次，或每周二次，或在第三次或進(jìn)一步導(dǎo)入之前暫停。在將PBMC導(dǎo)入SCID小鼠中隨后免疫的情況下，這些小鼠稱作“PBMC_Hu_SCID小鼠”。在將樹(shù)狀細(xì)胞(DC)導(dǎo)入SCID小鼠中隨后免疫并且然后導(dǎo)入免疫原性背景細(xì)胞如PBMC的情況下，這些小鼠稱作“DC-PBMC-Hu-SCID小鼠”。優(yōu)選地，意在用于一只小鼠的免疫活性細(xì)胞來(lái)自一位人類供體。在使用多種小鼠的情況下，對(duì)于一種測(cè)定法而言，優(yōu)選免疫活性細(xì)胞源自一位人類供體并且隨后被移入不同的小鼠中。如上文討論，本發(fā)明涉及一種用于評(píng)價(jià)HIV疫苗的方法，其中如上文定義的Hu-SCID-小鼠用所述HIV疫苗接種并且此后用H1-病毒攻擊。這種疫苗可以按任何適合介質(zhì)中的懸液或混合物形式施加/導(dǎo)入，并且暴露(接種)可以在一種或多種佐劑(如調(diào)節(jié)HIV-疫苗效果的藥理學(xué)或免疫學(xué)物質(zhì)(如有效刺激細(xì)胞介導(dǎo)免疫的免疫強(qiáng)化劑(也稱作免疫系統(tǒng)增強(qiáng)劑)))存在的情況下實(shí)施。用于此目的的優(yōu)選佐劑是弗氏佐劑。對(duì)于體內(nèi)接種，待檢驗(yàn)的疫苗可以在最后導(dǎo)入免疫活性細(xì)胞或?qū)朊庖咴员尘凹?xì)胞后次日直接施用至小鼠，或它可以在最后導(dǎo)入所述細(xì)胞后相隔一些時(shí)間(例如兩日或甚至兩周，優(yōu)選地在兩周后)施用。免疫可以實(shí)施一次或在眾多后續(xù)步驟中實(shí)施，例如它可以在一些時(shí)間后重復(fù)，例如在I至3周后，優(yōu)選地在2周后重復(fù)2次至4次，優(yōu)選地3次。Hu-SCID-小鼠可以在移入人類免疫活性細(xì)胞后I至3周用HIV疫苗接種。
可以使用認(rèn)為合適的任何途徑，例如通過(guò)腸胃外途徑或通過(guò)腹內(nèi)途徑如靜脈內(nèi)注射、皮下注射、或肌內(nèi)注射實(shí)施向小鼠施用疫苗。施用疫苗至小鼠的優(yōu)選途徑是通過(guò)皮下注射。待檢驗(yàn)的疫苗可以向Hu-SCID小鼠施用I次、2次或更頻繁地施用(3至6次)。優(yōu)選地，在2至4周內(nèi)、優(yōu)選地在3周內(nèi)，將Hu-SCID小鼠接種總計(jì)4次。在疫苗是肽或蛋白質(zhì)的情況下，施用至Hu-SCID小鼠的疫苗肽或蛋白質(zhì)的量可以在每個(gè)步驟中對(duì)于每只小鼠是在I和100 μ g之間,優(yōu)選地在10和80 μ g之間，更優(yōu)選地在15和50 μ g之間，甚至更優(yōu)選地在20和40 μ g之間和最優(yōu)選約25 μ g疫苗肽或蛋白質(zhì)。施用可以在一個(gè)或多個(gè)獨(dú)立步驟中進(jìn)行，所述步驟由延續(xù)I日、數(shù)日或數(shù)周的延遲期間隔。通過(guò)使用細(xì)胞培養(yǎng)物中一定量的HIV毒株感染量，例如約5X IO2至5X IO6TCID50 (50%組織培養(yǎng)感染量)，優(yōu)選地約5X IO2至5X IO4TCID50,進(jìn)行hu-SCID小鼠的感染。例如，為了感染具有新鮮分離的PBMC或DC作為背景的Hu-SCID小鼠，向每只個(gè)體小鼠施用細(xì)胞培養(yǎng)物中約5X IO3-1O4TCID5ci的HIV-1實(shí)驗(yàn)室毒株感染量或約5 X 102-5 X IO3TCID5tl感染量。用于這個(gè)目的的合適細(xì)胞培養(yǎng)物包括但不限于MT-4或U937培養(yǎng)細(xì)胞。優(yōu)選地，Hu-SCID小鼠可以用MT-4培養(yǎng)細(xì)胞中5 X IO3-1O4TCID5q的HIV-1實(shí)驗(yàn)室毒株感染量，或用U937培養(yǎng)細(xì)胞中約5X 102-5X IO3TCID5tl感染量攻擊。應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于用HIV感染Hu-SCID小鼠/使Hu-SCID小鼠暴露于HIV，可以使用不同范圍的細(xì)胞數(shù)和TCID5Q。另外，用于此目的的HIV毒株不限于特定毒株。相反，可以使用全部已知的HIV毒株，包括HIV-1毒株和HIV-2毒株，只要確保未保護(hù)的免疫活性細(xì)胞/小鼠(即沒(méi)有用待檢驗(yàn)的HIV-疫苗接種的細(xì)胞/小鼠)將成功地被HIV感染。優(yōu)選地，HIV毒株是HIV-1毒株。更優(yōu)選地，HIV毒株選自U455、9H/IIIB和PokA-79。具體而言，可以使用5X IO2-1O4TCID5ci或更高的感染量用于攻擊一只Hu-SCID動(dòng)物。優(yōu)選地，使用至少I(mǎi)O4TCID5tl、更優(yōu)選地至少I(mǎi)O5TCID5tl、甚至更優(yōu)選至少I(mǎi)O6TCID5tl的感染量。優(yōu)選地，使用可達(dá)IO7TCID5tl的感染量。根據(jù)本發(fā)明，“HIV實(shí)驗(yàn)室毒株再現(xiàn)者(HIV laboratory strain playback)”理解為通過(guò)在健康供體的PBMC細(xì)胞中培養(yǎng)HIV實(shí)驗(yàn)室毒株持續(xù)幾周代次，尤其持續(xù)至少約2周傳代并且可達(dá)約10周傳代所獲得的HIV實(shí)驗(yàn)室毒株。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，至少一個(gè)HIV實(shí)驗(yàn)室毒株再現(xiàn)者用來(lái)使Hu-SCID小鼠感染和/或暴露于HIV。作為用細(xì)胞培養(yǎng)物中一定量的HIV毒株感染量攻擊Hu-SCID小鼠的替代，可以用感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞的混合物同時(shí)攻擊Hu-SCID小鼠。這種感染細(xì)胞和未感染細(xì)胞的混合物可以包含約I X IO4至10 X IO8個(gè)，優(yōu)選地約IX IO5至IXlO8個(gè)和最優(yōu)選地約IOXlO6個(gè)純(未感染)細(xì)胞和約I X IO4至10 X IO7個(gè)，優(yōu)選地約I X IO6至I X IO7個(gè)和最優(yōu)選地約5 X IO6個(gè)被HIV毒株感染的細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，SCID小鼠用例如5-10 X IO6個(gè)MT-4或U937純培養(yǎng)細(xì)胞并且用細(xì)胞培養(yǎng)物中5 X IO2-1O6TCID5ci的HIV-1實(shí)驗(yàn)室毒株感染量攻擊。優(yōu)選地，小鼠用MT-4培養(yǎng)物中5 X IO3-1O4TCID5q的HIV-1實(shí)驗(yàn)室毒株感染量，或用U937培養(yǎng)物中5 X 102-5 X IO3TCID5tl感染量攻擊。用HIV攻擊可以重復(fù)許多次，例如2-5次，優(yōu)選地2至3次，其間存在不同的時(shí)間間隔。為了在淋巴細(xì)胞背景培養(yǎng)物中實(shí)現(xiàn)高病毒載量數(shù)，優(yōu)選攻擊之間的3日間隔，并且為了在巨噬細(xì)胞背景培養(yǎng)物中實(shí)現(xiàn)高病毒載量，優(yōu)選7日間隔。為度量疫苗的功效，可以使用通常本領(lǐng)域已知用于這個(gè)目的的全部方法。具體而言，通過(guò)確定小鼠體液樣品中的病毒載量確定HIV疫苗的功效。所述體液樣品可以是血清。為了確定病毒載量，可以使用本領(lǐng)域已知的每種方法。這包括實(shí)時(shí)PCR、RT-PCR和ELISA。本文中提供的附圖、科學(xué)著作和實(shí)例意在說(shuō)明而非限制本發(fā)明。1.HIV包膜蛋 白變異性建模分析在開(kāi)發(fā)本發(fā)明免疫原性組合物伊始，采用基于差分分析和分子生物化學(xué)參數(shù)的新數(shù)學(xué)建模法，我們?cè)噲D對(duì)患者隊(duì)列估計(jì)主要包膜蛋白gpl20中眾多可能的變種[23，24]。gpl20核苷酸序列的長(zhǎng)度是可變的并且取決于缺失和插入的存在、它們的數(shù)目和大小。存在一種gpl20作圖示意圖，其中C 1-C 5-保守區(qū)；V1-V5-可變環(huán)或可變區(qū)。
權(quán)利要求
1.一種用于產(chǎn)生Hiv疫苗組合物的方法，其包括步驟 a)產(chǎn)生包含HIV-I特異性抗體的文庫(kù)， b)通過(guò)用HIV-I肽、尤其天然和/或重組HIV-I肽淘洗，富集所述文庫(kù)中的HIV-I-特異性抗體， c)擴(kuò)增包含HIV-I肽、多肽或蛋白質(zhì)的HIV-I材料， d)使用與支持物結(jié)合的步驟b)的HIV-I-特異性抗體收集所擴(kuò)增HIV-I材料的HIV-I肽， e)通過(guò)質(zhì)譜法、尤其通過(guò)MS-MS鑒定和表征在步驟d)中獲得的HIV-I肽， f)克隆編碼在步驟e)中所鑒定的肽的gpl20gpl60基因片段， g)使用步驟f)的結(jié)果，在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)糖基化的envHIV-I肽， h)純化糖基化的envHIV-I肽，和 i)產(chǎn)生疫苗組合物， 其特征在于為了克隆和/或表達(dá)步驟f)和/或g)中的糖基化env HIV-I肽，使用選自以下的至少一種引物 (i)用于A、G、B、C、F1、H亞型的Vl正向5’-CTC TGY GTY ACT TTA XXX XXX XXX-3’ (SEQ ID No. I)， (ii)用于全部亞型的V2正向5’-AAA ACT GCT CTT WCA XXX XXX XXX-3’ (SEQ ID No. 3)， (iii)用于A、B、G亞型的V3正向5’-TAV AAA TTA ATT GTA XXX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 5)， (iv)用于D亞型的V3正向5’-TAV CAA TTA ATT GCA XXX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 7)， (V)用于全部亞型的V4正向5’-GAA TTT TTC TAT TGY AAXXX XXX XXX-3’ (SEQ ID No. 9)， (vi)用于A、B、D、G亞型的V5正向5’-ACA AGA GAT GGT GGX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 11)，和 (vii)用于C亞型的V5正向5’-ACA CGT GAT GGA GGX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 13)， 和至少一種選自以下的引物 (viii)用于A、B、D亞型的gp41(160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AG YAA AGC YCT TTC NAA GCC CTGTC(SEQ ID No. 46)， (ix)(viii)的引物衍生物，其缺少編碼His-標(biāo)簽的序列和/或包含編碼標(biāo)簽的序列， (X)用于亞型A稀有變體的gp41(160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC AM GCY CTT TCN GCG CCC TGTC(SEQ ID No. 66)， (xi)用于C亞型的gp41 (160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT WGC MA GCT GCT TCA AAG CCC TGTC(SEQ ID No. 67)，(xii)用于G亞型的gp41(160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC AM GCY CTT TCN MG CCT TGTC(SEQ ID No. 68)， (xiii)用于全部亞型的gpl20反向Const5.5’-ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT CTT TTT TCT CTY TSC ACC ACTCTY CT-3’ (SEQ ID No. 52)， 和 (xiiii) (viii)的引物衍生物，其缺少編碼His-標(biāo)簽的序列和/或包含編碼標(biāo)簽的序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中使用引物⑴、(ii)、(iii)、(iv)、(V)、(vi)和/或(vii)的2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18種或更多種變體，其中所述變體差異在于變量“X”。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中使用引物⑴至(vii)及(X)至(xii)和(xiii)和(xiiii)之一以及(viii)和(ix)之一。
4.一種用于產(chǎn)生HIV疫苗組合物的方法，其包括步驟 a)產(chǎn)生包含HIV-I特異性抗體的文庫(kù)， b)通過(guò)用HIV-I肽、尤其天然和/或重組HIV-I肽淘洗，富集所述文庫(kù)中的HIV-I-特異性抗體， c)擴(kuò)增包含HIV-I肽、多肽或蛋白質(zhì)的HIV-I材料， d)使用與支持物結(jié)合的步驟b)的HIV-I-特異性抗體收集所擴(kuò)增HIV-I材料的HIV-I肽， e)通過(guò)質(zhì)譜法、尤其通過(guò)MS-MS鑒定和表征在步驟d)中獲得的HIV-I肽， f)克隆編碼在步驟e)中所鑒定的肽的gpl20gpl60基因片段， g)使用步驟f)的結(jié)果，在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)糖基化的envHIV-I肽， h)純化糖基化的envHIV-I肽，和 i)產(chǎn)生疫苗組合物， 其特征在于為了克隆和/或表達(dá)步驟f)和/或g)中的糖基化env HIV-I肽，使用選自以下的至少一種引物 (i)用于A亞型的正向gpUOConstl5’ -AAT TCT AGA CRC TRC AGA AAA CTT GTG GGT YAC-3’ (SEQ ID No. 52)，或其在 5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物， (ii)用于B亞型的正向gpl20Constl5’ -AAT TCT AGA CGC TRC AGA AMA ATT GTG GGT CAC-3’ (SEQ ID No. 69)，或其在 5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物， (iii)用于C亞型的正向gpl20Constl5’ -AAT TCT AGA CGT RRT GGG RAA CTT GTG GGT CAC-3’ (SEQ ID No. 70)，或其在 5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物，和(iv)用于G亞型的正向gpl20Constl5’-AAT TCT AGA CGC CTC ARA TAA CTT GTG GGT CAC AG-3’ (SEQ ID No. 71)，或其在5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物， 和至少一種選自以下的引物 (V)用于全部亞型的Vl反向5’-GCA GTT TTT YAT TTC TYX XXX XXX XXX-3’ (SEQ ID No. 25)， (vi)用于A、D、C亞型的V2反向5’-AGG TAT TRC AAT TTA TTX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 28)， (vii)用于B亞型的V2反向5’-CTG AGG TRT TAC AAX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 29)， (viii)用于G亞型的V2反向5’-AGA CAT TAC AAT TTA TTX XXX XXX X_3’ (SEQ ID No. 30)， (ix)用于Fl亞型的V2反向5’-TTG AGG TAT TRC AAX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 31)， (X)用于A、D、(C)亞型的V3反向5’-AAA GTT TBA TTC CAX XXX XXX XX-3’ (SEQ ID No. 40)， (xi)用于B亞型的V3反向5’-AAA GTG TTR TTC CAX XXX XXX XX-3’ (SEQ ID No. 41)， (xii)用于G亞型的V4反向5’-CAA TTT GTT TTA TYY TAC A XX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 19)， (xiii)用于A、B、C、D亞型的V4反向5’-TAA TTT GYT TTA TTY TGC A XX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 20)， (xiv)用于全部亞型的V5反向5，-TCC TCC TSC AGG TCT GAA XXX XXX XXX X_3，(SEQ ID No. 15)， (XV)用于A、B、D亞型的gp41 (160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AG YAA AGC YCT TTC NAA GCC CTGTC(SEQ ID No. 46)，(xvi)(viii)的引物衍生物，其缺少編碼His-標(biāo)簽的序列和/或包含編碼標(biāo)簽的序列， (xvii)用于A亞型稀有變體的gp41(160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC AM GCY CTT TCN GCG CCC TGTC(SEQ ID No. 66)， (xviii)用于C亞型的gp41(160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT WGC MA GCT GCT TCA MG CCC TGTC(SEQ ID No. 67)， 和 (xix)用于G亞型的gp41(160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC AM GCY CTT TCN AAG CCT TGTC(SEQ ID No. 68)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其中使用引物(V)、(vi)、(vii)、(viii)、(ix)、(x)、(xi)、(xii)、(xiii)和 / 或(xiv)的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、18 種或更多種變體，其中所述變體差異在于變量，尤其變量“ X ”。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法,其中使用引物⑴至(xiv)及(xvii)至(xix)和(XV)和(xvi)之一。
7.一種用于產(chǎn)生HIV疫苗組合物的方法，其包括步驟 a)產(chǎn)生包含HIV-I特異性抗體的文庫(kù)， b)通過(guò)用HIV-I肽、尤其天然和/或重組HIV-I肽淘洗，富集所述文庫(kù)中的HIV-I-特異性抗體， c)擴(kuò)增包含HIV-I肽、多肽或蛋白質(zhì)的HIV-I材料， d)使用與支持物結(jié)合的步驟b)的HIV-I-特異性抗體收集所擴(kuò)增HIV-I材料的HIV-I肽， e)通過(guò)質(zhì)譜法、尤其通過(guò)MS-MS鑒定和表征在步驟d)中獲得的HIV-I肽， f)克隆編碼在步驟e)中所鑒定的肽的gpl20gpl60基因片段， g)使用步驟f)的結(jié)果，在真核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)糖基化的envHIV-I肽， h)純化糖基化的envHIV-I肽，和 i)產(chǎn)生疫苗組合物， 其中步驟g)中的所述糖基化env HIV-I肽特征如下 (i)所述gpl20肽具有441-541個(gè)氨基酸長(zhǎng)度和/或約90_115kDa的糖基化蛋白分子量，和 (ii)所述gpl60肽具有816-923個(gè)氨基酸長(zhǎng)度和/或145_175kDa的糖基化蛋白分子量，和 (iii)表達(dá)至少50種、優(yōu)選地至少70種、更優(yōu)選地至少100種、甚至更優(yōu)選地至少150種不同的HIV-I包膜肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中步驟i)的所述疫苗組合物包含 (a)至少一種以N端序列LCVTL(SEQ ID No. 72)為特征的肽， (b)至少一種以N端序列NCSX(SEQ ID No. 73)為特征的肽，其中X是Y或F，(c)至少一種以N端序列XINC(SEQ ID No. 74)為特征的肽，其中X是K或Q或E，(d)至少一種以N端序列XINC(SEQ ID No. 75)為特征的肽，其中X是T或P或A， (e)至少一種以N端序列EFFYC(SEQ ID No. 76)為特征的肽， (f)至少一種以N端序列TRDG(SEQ ID No. 77)為特征的肽， 和 (g)至少一種以N端序列DXXENLWVLD(SEQID No. 78)為特征的肽，其中X彼此獨(dú)立是T或A。
9.HIV疫苗組合物，其通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的方法可獲得。
10.一種HIV疫苗組合物，其包含至少50種、優(yōu)選地至少70種、更優(yōu)選地至少100種、甚至更優(yōu)選地至少150種不同的HIV-I包膜肽，特征在于 (i)所述gpl20肽具有441-541個(gè)氨基酸長(zhǎng)度和/或約90_115kDa的糖基化蛋白分子量，和 (i)所述gpl60肽具有816-923個(gè)氨基酸長(zhǎng)度和/或145_175kDa的糖基化蛋白分子量。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的疫苗組合物，還包含(a)至少一種以N端序列LCVTL(SEQ ID No. 72)為特征的肽， (b)至少一種以N端序列NCSX(SEQ ID No. 73)為特征的肽，其中X是Y或F， (c)至少一種以N端序列XINC(SEQ ID No. 74)為特征的肽，其中X是K或Q或E， (d)至少一種以N端序列XINC(SEQ ID No. 75)為特征的肽，其中X是T或P或A， (e)至少一種以N端序列EFFYC(SEQ ID No. 76)為特征的肽， (f)至少一種以N端序列TRDG(SEQ ID No. 77)為特征的肽， 和 (g)至少一種以N端序列DXXENLWVLD(SEQID No. 78)為特征的肽，其中X彼此獨(dú)立是是T或A。
12.—種組合物，其包含以下核酸的至少一種 (i)用于A、G、B、C、F1、H亞型的Vl正向5’-CTC TGY GTY ACT TTA XXX XXX XXX-3’ (SEQ ID No. I)， (ii)用于全部亞型的V2正向5’-AAA ACT GCT CTT WCA XXX XXX XXX-3’ (SEQ ID No. 3)， (iii)用于A、B、G亞型的V3正向5’-TAV AAA TTA ATT GTA XXX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 5)， (iv)用于D亞型的V3正向5’-TAV CAA TTA ATT GCA XXX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 7)， (V)用于全部亞型的V4正向5’-GAA TTT TTC TAT TGY AAXXX XXX XXX-3’ (SEQ ID No. 9)， (vi)用于A、B、D、G亞型的V5正向5’-ACA AGA GAT GGT GGX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 11)， (vii)用于亞型C的V5正向5’-ACA CGT GAT GGA GGX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 13)， (viii)用于A、B、D亞型的gp41(160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AG YAA AGC YCT TTC NAA GCC CTGTC (SEQ ID No. 46)或其衍生物，所述衍生物缺少編碼His-標(biāo)簽的序列和/或包含編碼標(biāo)簽的序列， (ix)用于亞型A稀有變體的gp41(160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC AM GCY CTT TCN GCG CCC TGTC(SEQ ID No. 66)， (X)用于C亞型的gp41 (160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT WGC MA GCT GCT TCA MG CCC TGTC(SEQ ID No. 67)， (xi)用于G亞型的gp41(160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC AM GCY CTT TCN MG CCT TGTC(SEQ ID No. 68)， 和 (xii)用于全部亞型的gpl20反向Const5·5’-ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT CTT TTT TCT CTY TSC ACC ACTCTY CT-3’ (SEQ ID No. 52)，或其衍生物，所述衍生物缺少編碼His-標(biāo)簽的序列和/或包含編碼標(biāo)簽的序列。
13.—種組合物，其包含以下核酸的至少一種 (i)用于A亞型的正向gpUOConstl·5’ -AAT TCT AGA CRC TRC AGA AAA CTT GTG GGT YAC-3’ (SEQ ID No. 52)，或其在 5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物， (ii)用于B亞型的正向gpl20Constl·5’ -AAT TCT AGA CGC TRC AGA AMA ATT GTG GGT CAC-3' (SEQ ID No. 69)，或其在 5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物， (iii)用于C亞型的正向gpl20Constl·5’ -AAT TCT AGA CGT RRT GGG RAA CTT GTG GGT CAC-3' (SEQ ID No. 70)，或其在 5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物， (iv)用于G亞型的正向gpl20Constl·5’-AAT TCT AGA CGC CTC ARA TAA CTT GTG GGT CAC AG-3’ (SEQ ID No. 71)，或其在·5’末端缺少Xba I位點(diǎn)和/或包含限制性位點(diǎn)的衍生物， (V)用于全部亞型的Vl反向 · 5’-GCA GTT TTT YAT TTC TYX XXX XXX XXX-3’ (SEQ ID No. 25)， (vi)用于A、D、C亞型的V2反向 · 5’-AGG TAT TRC AAT TTA TTX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 28)， (vii)用于B亞型的V2反向·5’-CTG AGG TRT TAC AAX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 29)， (viii)用于G亞型的V2反向·5’-AGA CAT TAC AAT TTA TTX XXX XXX X_3’ (SEQ ID No. 30)， (ix)用于Fl亞型的V2反向5’-TTG AGG TAT TRC AAX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 31)， (X)用于A、D、(C)亞型的V3反向 · 5’-AAA GTT TBA TTC CAX XXX XXX XX-3’ (SEQ ID No. 40)， (xi)用于B亞型的V3反向·5’-AAA GTG TTR TTC CAX XXX XXX XX-3’ (SEQ ID No. 41)， (xii)用于G亞型的V4反向·5’-CAA TTT GTT TTA TYY TAC A XX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 19)， (xiii)用于A、B、C、D亞型的V4反向·5’-TAA TTT GYT TTA TTY TGC A XX XXX XXX X-3’ (SEQ ID No. 20)， (xiv)用于全部亞型的V5反向·5，-TCC TCC TSC AGG TCT GAA XXX XXX XXX X_3，(SEQ ID No. 15)， (XV)用于A、B、D亞型的gp41 (160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AG YAA AGC YCT TTC NAA GCC CTGTC (SEQ ID No. 46)或其衍生物，所述衍生物缺少編碼His-標(biāo)簽的序列和/或包含編碼標(biāo)簽的序列， (xvi)用于亞型A稀有變體的gp41(160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC AM GCY CTT TCN GCG CCC TGTC(SEQ ID No. 66)， (xvii)用于C亞型的gp41(160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT WGC MA GCT GCT TCA MG CCC TGTC(SEQ ID No. 67)， 和 (xviii)用于G亞型的gp41(160)反向ATA GCG GCC GCC TAG TGG TGG TGA TGG TGG TGT AGC AM GCY CTT TCN AAG CCT TGTC(SEQ ID No. 68)。
14.移入人類免疫活性細(xì)胞的嚴(yán)重聯(lián)合T-B免疫缺陷(SCID)小鼠(Hu-SCID-小鼠)作為動(dòng)物模型用于評(píng)價(jià)HIV疫苗有效性的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述免疫活性細(xì)胞能夠形成針對(duì)HIV的人型免疫反應(yīng)。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述人類免疫活性細(xì)胞是PBMC，尤其是體外預(yù)培育的PBMC，更具體地是體外預(yù)培育約I日至約6周的PBMC。
17.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述免疫活性細(xì)胞是樹(shù)狀細(xì)胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述免疫活性細(xì)胞是PBMC和樹(shù)狀細(xì)胞的混合物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的用途，其中已經(jīng)通過(guò)在能夠誘導(dǎo)樹(shù)狀細(xì)胞體外形成的細(xì)胞因子存在下培養(yǎng)人PBMC獲得所述樹(shù)狀細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求14至19中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述人類免疫活性細(xì)胞源自人類供體。
21.根據(jù)權(quán)利要求14至20中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述小鼠已經(jīng)移入5-15X IO6個(gè)細(xì)胞、尤其免疫活性細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求14至21中任一項(xiàng)所述的用途，其中所述Hu-SCID小鼠是特定品種的動(dòng)物，所述動(dòng)物在它們自身的內(nèi)源免疫系統(tǒng)中有缺陷并被導(dǎo)入人類免疫活性細(xì)胞或任何其他的人類細(xì)胞。
23.用于評(píng)價(jià)HIV疫苗的方法，其中如權(quán)利要求14至22中任一項(xiàng)所定義的Hu-SCID-小鼠用所述HIV疫苗接種并且此后用HI-病毒攻擊。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述HIV疫苗是HIV-I包膜肽/蛋白混合物，優(yōu)選地其中所述蛋白質(zhì)或肽是重組來(lái)源的。
25.根據(jù)權(quán)利要求14或24中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)確定所述疫苗的功效決定所述疫苗的評(píng)價(jià)。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中通過(guò)確定針對(duì)HIV攻擊的保護(hù)作用確定所述功效。
27.根據(jù)權(quán)利要求23至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述Hu-SCID-小鼠在最后移入人類免疫活性細(xì)胞后I至4周用HIV疫苗接種。
28.根據(jù)權(quán)利要求23至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中使用5XIO2-IO4TCID5ci或更高、尤其至多到用于攻擊一只Hu-SCID動(dòng)物的IO7TCID5tl的感染量。
29.根據(jù)權(quán)利要求23至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)確定小鼠體液樣品中的病毒載量和/或免疫反應(yīng)的特異性和/或強(qiáng)度確定所述HIV疫苗的功效。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述體液樣品是血清。
31.根據(jù)權(quán)利要求23至30中任一項(xiàng)所述的方法，其中用疫苗接種在佐劑存在的情況下進(jìn)行。
32.根據(jù)權(quán)利要求23至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中HIV特異性免疫反應(yīng)是在最后接種后的幾周時(shí)間內(nèi)可檢測(cè)的。
33.根據(jù)權(quán)利要求23至32中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR或ELISA、尤其借助RT-PCR、實(shí)時(shí)PCR和ELISA實(shí)施所述疫苗的評(píng)價(jià)。
34.根據(jù)權(quán)利要求14至33中任一項(xiàng)所述的方法，其中至少一個(gè)HIV實(shí)驗(yàn)室毒株再現(xiàn)者用來(lái)使Hu-SCID小鼠感染和/或暴露于HIV。
全文摘要
本發(fā)明涉及移入人類免疫活性細(xì)胞的嚴(yán)重聯(lián)合T-B免疫缺陷(SCID)小鼠(Hu-SCID-小鼠)作為動(dòng)物模型用于評(píng)價(jià)HIV疫苗有效性的用途。另外，本發(fā)明涉及一種用于評(píng)價(jià)HIV疫苗的方法，其中本發(fā)明的Hu-SCID-小鼠用所述HIV疫苗接種并且此后用HI-病毒攻擊。本發(fā)明也涉及可以使用所述動(dòng)物模型予以評(píng)價(jià)的新HIV疫苗組合物。
文檔編號(hào)A61K39/21GK103237443SQ201180048813
公開(kāi)日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月27日
發(fā)明者E·Y·菲利諾娃 申請(qǐng)人:技術(shù)積分有限公司