專利名稱：放射線治療劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及一種放射線治療劑，其含有將特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子結(jié)合到含有過氧化鈦的基體粒子上而形成的復(fù)合體粒子，該復(fù)合體粒子通過放射線照射產(chǎn)生羥基自由基。本申請(qǐng)要求作為參照而被援用于此的日本申請(qǐng)?zhí)卦?010-032055號(hào)的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
作為治療癌的方法之一，進(jìn)行放射線治療。放射線治療是通過照射X射線或Y射線等來抑制癌細(xì)胞的增殖或殺傷癌細(xì)胞的治療法。放射線治療通常為局部治療，對(duì)全身的 損傷小，因此被認(rèn)為是對(duì)患者負(fù)擔(dān)少、緩和醫(yī)療的重要的手段。放射線治療中，外部照射法為從體外對(duì)準(zhǔn)病灶進(jìn)行照射的方法，使用X射線、Y射線、電子射線、粒子射線等。在外部照射法中，為了使充分的放射劑量到達(dá)腫瘤、且腫瘤周圍的正常組織不太會(huì)照射到放射線，而需要探討放射線照射的方向。放射線既存在從一個(gè)方向照射的情況，也存在從多個(gè)方向照射的情況。在治療位于體內(nèi)深部的腫瘤時(shí)，需要照射強(qiáng)放射線，從而存在副作用的問題。由放射線治療引起的對(duì)正常組織的副作用基本上在被照射的區(qū)域中產(chǎn)生。作為正常組織的反應(yīng)，有照射中引起的粘膜、上皮細(xì)胞的傷害、或治療結(jié)束后經(jīng)過六個(gè)月 數(shù)年后產(chǎn)生的間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的傷害等。放射線治療的副作用根據(jù)照射劑量、照射部位、患者的年齡、全身狀態(tài)等不同而不同。期望能夠在減少副作用的同時(shí)有效地殺傷癌細(xì)胞那樣的放射線治療。近年來，二氧化鈦等的光催化作用被利用于各種領(lǐng)域而受到關(guān)注。所謂的光催化作用，是基于通過對(duì)二氧化鈦等照射380nm以下的短波長(zhǎng)的光而生成的活性氧簇的氧化力的作用。光催化作用被利用于環(huán)境激素等有害化學(xué)物質(zhì)的分解處理、有害微生物的殺菌、抗菌，進(jìn)而正在進(jìn)行對(duì)癌治療的應(yīng)用研究(非專利文獻(xiàn)I 4)。利用親水性高分子修飾二氧化鈦、進(jìn)而將對(duì)目標(biāo)分子具有特異性結(jié)合能力的分子固定化后的二氧化鈦復(fù)合體具有通過光催化作用分解癌細(xì)胞等的作用的情況已被公開(專利文獻(xiàn)I)。該二氧化鈦復(fù)合體通過紫外線照射發(fā)揮光催化作用。此外，確認(rèn)了 當(dāng)對(duì)二氧化鈦照射超聲波時(shí)會(huì)生成高濃度的羥基自由基(二氧化鈦/超聲波催化法)。有文獻(xiàn)公開了一種復(fù)合體粒子，其是用聚丙烯酸包覆二氧化鈦并使肝細(xì)胞識(shí)別蛋白質(zhì)pre/S2結(jié)合到二氧化鈦上而形成的，該復(fù)合體粒子能夠特異性地靶向肝癌細(xì)胞，發(fā)揮通過超聲波的照射殺傷、損傷癌細(xì)胞的作用(專利文獻(xiàn)2)。雖然期待光催化作用在放射線治療中的應(yīng)用，但是存在照射劑量的問題等，未發(fā)現(xiàn)可耐實(shí)用的光催化材料。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :國(guó)際公開公報(bào)TO2004/087765號(hào)
專利文獻(xiàn)2 :日本特開2008-195653號(hào)公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :R，Cai , Y. Kubota, T. Shuin, e t a I. , CancerRes. 52(1992)2346-2348.非專利文獻(xiàn)2 :World J Gastroenterol 10(2004)3191-3193.非專利文獻(xiàn)3 Q. Liu, X. Wang, P. Wang, et al.，Ultrasonics 2006 ；45 :56-60.非專利文獻(xiàn)4 H. Honda, Q. L. Zhao, T. Kondo. , Ultrasound inMed. &Biol. 28 (2002) 673-682.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于，提供一種含有通過放射線照射而產(chǎn)生羥基自由基的粒子的放射線治療劑。為了解決上述課題，本發(fā)明人進(jìn)行了專心研究的結(jié)果是，著眼于過氧化鈦通過放射線照射產(chǎn)生羥基自由基，發(fā)現(xiàn)能夠?qū)⑦^氧化鈦使用于放射線治療，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明如下構(gòu)成。I. 一種放射線治療劑，其含有復(fù)合體粒子，所述復(fù)合體粒子是將特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子結(jié)合到含有過氧化鈦的基體粒子上而形成的，且通過放射線照射而產(chǎn)生對(duì)目標(biāo)物造成傷害的活性氧。2.根據(jù)前項(xiàng)I所述的放射線治療劑，其中，所述活性氧為羥基自由基。3.根據(jù)前項(xiàng)I或2所述的放射線治療劑，其特征在于，所述基體粒子的過氧化鈦主要分布在基體粒子的表面上。4.根據(jù)前項(xiàng)I 3中任一項(xiàng)所述的放射線治療劑，其中，基體粒子進(jìn)而含有二氧化鈦。5.根據(jù)前項(xiàng)I 4中任一項(xiàng)所述的放射線治療劑，其中，基體粒子的平均分散粒徑為Inm以上且200nm以下。6.根據(jù)前項(xiàng)I 5中任一項(xiàng)所述的放射線治療劑，其中，特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子為抗體。7.根據(jù)前項(xiàng)I 6中任一項(xiàng)所述的放射線治療劑，其中，所述復(fù)合體粒子是通過將基體粒子的表面的至少一部分用高分子被膜包覆，特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子介由該高分子被膜結(jié)合到基體粒子上而形成的。8.根據(jù)前項(xiàng)I 7中任一項(xiàng)所述的放射線治療劑，其中，放射線為X射線。9. 一種分散液，其在水、pH緩沖液、輸液或生理鹽水中自分散有復(fù)合體粒子，該復(fù)合體粒子是將特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子結(jié)合到含有過氧化鈦的基體粒子上而形成的、且通過放射線照射而產(chǎn)生對(duì)目標(biāo)物造成傷害的活性氧的復(fù)合體粒子。10.根據(jù)前項(xiàng)9所述的分散液，其中，所述復(fù)合體粒子的表面電位為+20mV以上。11. 一種放射線治療劑，其是前項(xiàng)9或10所述的分散液。12. 一種抗腫瘤劑，其含有特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子為能夠特異性地識(shí)別腫瘤細(xì)胞的抗體的、前項(xiàng)I 8、11中任一項(xiàng)所述的放射線治療劑。(發(fā)明效果)
根據(jù)本發(fā)明的放射線治療劑，能夠通過特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子而使復(fù)合體粒子集聚到目標(biāo)物，并通過放射線照射使得過氧化鈦產(chǎn)生羥基自由基，從而損傷目標(biāo)物。當(dāng)使用本發(fā)明的放射線治療劑時(shí)，即使以少的放射劑量也能夠有效地?fù)p傷目標(biāo)物。在利用本發(fā)明的放射線治療劑進(jìn)行例如腫瘤治療的情況下，能夠減少對(duì)腫瘤以外的正常組織的因放射線引起的副作用。此外，當(dāng)以少的劑量得到高的治療效果時(shí)，放射療法對(duì)患者的負(fù)擔(dān)減少，放射療法的有用性增加。在目前的放射療法中，從副作用等觀點(diǎn)考慮，對(duì)照射的劑量、照射的次數(shù)等進(jìn)行了限制，但通過并用本發(fā)明的放射線治療劑，可期待在該范圍內(nèi)也能夠得到充分的治療效果。


圖I是表示對(duì)過氧化鈦一二氧化鈦的基體粒子照射X射線時(shí)的羥基自由基產(chǎn)生量的坐標(biāo)圖。(實(shí)驗(yàn)例I)圖2是表示對(duì)過氧化鈦一二氧化鈦的基體粒子照射紫外線時(shí)的羥基自由基產(chǎn)生 量的坐標(biāo)圖。(實(shí)驗(yàn)例I)圖3是表示使用臨床用X射線照射裝置(圖3a、b)或Spring-8 (圖3c)對(duì)過氧化鈦一二氧化鈦的基體粒子照射X射線時(shí)的羥基自由基產(chǎn)生量的坐標(biāo)圖。(實(shí)驗(yàn)例I)圖4是表示使用臨床用X射線照射裝置(圖4a)或Spring-8 (圖4b)對(duì)修飾了聚丙烯酸(PAA)的二氧化鈦微粒照射X射線時(shí)的羥基自由基產(chǎn)生量的坐標(biāo)圖。(實(shí)驗(yàn)例I)圖5是表示未對(duì)本發(fā)明的復(fù)合體粒子照射紫外線時(shí)的細(xì)胞毒性的照片。(實(shí)驗(yàn)例2)圖6是表示對(duì)本發(fā)明的復(fù)合體粒子照射了紫外線時(shí)的細(xì)胞毒性的照片。(實(shí)驗(yàn)例2)圖7是表示對(duì)本發(fā)明的復(fù)合體粒子照射了 X射線時(shí)和未照射X射線時(shí)的細(xì)胞毒性的照片。(實(shí)驗(yàn)例3)
具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種放射線治療劑，其含有將特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子結(jié)合到含有過氧化鈦的基體粒子上而形成的復(fù)合體粒子，過氧化鈦通過放射線照射產(chǎn)生羥基自由基，由此發(fā)揮攻擊目標(biāo)物的作用。(含有過氧化鈦的基體粒子)本發(fā)明中的含有過氧化鈦的基體粒子，是指含有過氧化鈦且能夠分散在溶液中的粒子，并且，是能夠通過放射線照射在溶液中生成活性氧、特別是羥基自由基(^OH)的粒子。在本說明書中，也存在將含有過氧化鈦的基體粒子簡(jiǎn)稱為“基體粒子”的情況。在基體粒子中，過氧化鈦只要至少在基體粒子的表面上存在即可。基體粒子也可以含有過氧化鈦以外的材料。過氧化鈦以外的材料可以是任何物質(zhì)，例如可以列舉氧化物半導(dǎo)體，其可以列舉二氧化鈦(TiO2)、氧化鋅(ZnO)、氧化錫(SnO2)、氧化鉭(Ta2O3)、氧化鎳(NiO)、氧化鐵(FeO)、氧化鉻(CrO、Cr2O3)、氧化鑰(MoO3)等?；w粒子優(yōu)選為除過氧化鈦以外還含有二氧化鈦(TiO2)的材料，優(yōu)選使用以后述的制作方法制作的材料。以下，也存在將除過氧化鈦以外還含有二氧化鈦的基體粒子稱為“過氧化鈦一二氧化鈦微?！钡那闆r。
此外，本發(fā)明的基體粒子優(yōu)選以分散液的形式存在。分散液的溶劑只要是能夠分散基體粒子的物質(zhì)便可以為任何物質(zhì)，可以列舉蒸餾水。分散液中的基體粒子的平均分散粒徑，在生理?xiàng)l件下為Inm以上且200nm以下，優(yōu)選為IOnm以上且IOOnm以下，更優(yōu)選為20nm以上且60nm以下。這是因?yàn)?，若基體粒子的平均分散粒徑在該范圍內(nèi)，則本發(fā)明中的復(fù)合體粒子也在相同范圍內(nèi)的可能性高，是足夠使特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子結(jié)合的大小，因此能夠在哺乳動(dòng)物的血流中等水溶液中確保充分的分散穩(wěn)定性和流動(dòng)性。在此，所謂的“分散粒徑”，表示水溶液中的基體粒子的大小，包括基體粒子的結(jié)晶凝聚后的凝聚體的大小。平均分散粒徑，表示通過動(dòng)態(tài)光散射法進(jìn)行測(cè)定并根據(jù)累積量法分析而算出的平均值。此外，本說明書中所述的生理?xiàng)l件下，表示在25 °C、 I個(gè)大氣壓、且蒸餾水的存在下，或者，在25°C、I個(gè)大氣壓、且磷酸緩沖鹽水(組成為137mM NaCl,8. ImMNa2HPO4、2. 68mM KCl、I. 47mM KH2PO4) (pH7. 4)存在下。(含有過氧化鈦的基體粒子的制作方法)含有過氧化鈦的基體粒子只要是能夠制作具有如上述那樣的性質(zhì)的粒子便可以利用任何方法來制作。含有過氧化鈦的基體粒子例如能夠如下進(jìn)行制作。通過進(jìn)行氯化鈦或其水合物與季銨鹽的中和反應(yīng)，將中和反應(yīng)后的溶液在80°C 150°C的水熱條件下進(jìn)行水熱處理，向所得到的分散液中添加雙氧水并進(jìn)行過濾清洗，由此能夠制作包含含有過氧化鈦的基體粒子的分散液。作為氯化鈦，優(yōu)選為四氯化鈦，作為季銨鹽，可以列舉四甲基氫氧化銨、四甲基碳酸銨、四甲基碳酸氫銨、膽堿、碳酸膽堿和膽堿碳酸氫鹽等，但優(yōu)選四甲基氫氧化銨。更具體地說，通過向四氯化鈦(TiCl4)中加入水(例如蒸餾水)、四甲基氫氧化銨(TMAH)，在125°C下進(jìn)行加熱處理來進(jìn)行水熱處理，然后加入雙氧水，在這之后用超濾膜進(jìn)行過濾清洗，由此能夠得到含有基體粒子的分散液。(特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子)本發(fā)明的放射線治療劑中，在含有過氧化鈦的基體粒子上結(jié)合有特異性地識(shí)別特定目標(biāo)物的分子。將包含含有過氧化鈦的基體粒子和特異性地識(shí)別特定目標(biāo)物的分子的物質(zhì)，稱為“復(fù)合體粒子”。含有過氧化鈦的基體粒子和復(fù)合體粒子均為納米粒子，納米粒子通常是指具有Inm以上且200nm以下的直徑的粒子。特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子是具有使本發(fā)明的復(fù)合體粒子集聚到目標(biāo)物的作用的分子，例如為與存在于目標(biāo)物的分子特異性結(jié)合的分子。該分子可以為蛋白質(zhì)、多肽、DNA等任意分子。該分子優(yōu)選為蛋白質(zhì)，作為蛋白質(zhì)，例如可以列舉抗體、配體、受體。這些之中，特別優(yōu)選抗體。例如，在目標(biāo)物為腫瘤的情況下，只要使用針對(duì)特異性地存在于腫瘤細(xì)胞中的分子的抗體即可。針對(duì)特異性地存在于腫瘤細(xì)胞中的分子的抗體，具體可以使用針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的抗體、識(shí)別癌抗原的抗體、識(shí)別游離抗原的抗體。作為癌抗原的具體例，可以舉出表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor ;EGFR)、雌激素受體(ER)、孕酮受體(PgR)等。作為將特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子固定化時(shí)的目標(biāo)官能團(tuán)，在該分子為單純蛋白質(zhì)的情況下，使用氨基和硫醇基即可，在糖蛋白的情況下，使用糖的醛基即可。例如，可以通過在被水溶性高分子修飾的基體粒子的羧基上預(yù)先導(dǎo)入生物素(或親和素)，使蛋白質(zhì)與親和素(或生物素)交聯(lián)，由此利用生物素親和素的相互作用進(jìn)行固定化。
(高分子被膜)本發(fā)明中的復(fù)合體粒子優(yōu)選基體粒子的表面的至少一部分被高分子被膜包覆。通過該高分子被膜，能夠容易地使特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子結(jié)合到基體粒子的表面。本發(fā)明中的高分子被膜優(yōu)選為水溶性高分子，作為水溶性高分子，可以列舉親水性的陽離子聚合物或親水性的陰離子聚合物。含有過氧化鈦的基體粒子其本身具有在溶液中(水系溶劑中)的分散性，例如，通過使水溶性高分子牢固地結(jié)合到基體粒子的表面上，能夠增強(qiáng)復(fù)合體粒子在包括中性附近在內(nèi)的寬廣范圍PH的溶液中的分散穩(wěn)定性。此外，即使在含有培養(yǎng)基等之類的復(fù)合體粒子以外的各種成分那樣的溶液中，也能夠通過水溶性高分子的被膜來保持復(fù)合體粒子的分散穩(wěn)定性。在含有過氧化鈦的基體粒子(優(yōu)選為過氧化鈦一二氧化鈦微粒)的情況下，在含有水或鹽的各種pH緩沖液中，在生理?xiàng)l件下、且不添加分散劑等其他物質(zhì)的狀態(tài)下，分散性變得非常良好，能夠?qū)崿F(xiàn)24小時(shí)以上的穩(wěn)定的分散性。
作為本發(fā)明中的高分子被膜的材料，優(yōu)選為具有羧基的水溶性高分子或胺的水溶性高分子。作為水溶性高分子，只要是重均分子量為1000以上且100000以下的范圍的物質(zhì)便可以使用任意物質(zhì)。在羧基殘基或氨基上能夠固定所期望的特異性地識(shí)別特定目標(biāo)物的分子，是有用的。作為具有羧基的高分子，例如可以舉出羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、羧甲基纖維素、聚羧酸類、和具有羧基單元的共聚物(copolymer)等。具體地說，從水溶性高分子的水解性和溶解度的觀點(diǎn)考慮，更適宜使用聚丙烯酸、聚馬來酸等聚羧酸類，和丙烯酸/馬來酸或丙烯酸/磺酸系單體的共聚物(copolymer)。作為胺的高分子，例如可以舉出聚氨基酸、多肽、聚胺類、以及具有胺單元的共聚物(copolymer)等。具體地說,從水溶性高分子的水解性和溶解度的觀點(diǎn)考慮,更適宜使用聚乙烯亞胺、聚乙烯胺、聚烯丙基胺等聚胺類。此外，作為高分子被膜的材料，也可以使用重均分子量為1000以上且100000以下
的聚乙二醇等。通過利用這些水溶性高分子來修飾含有過氧化鈦的基體粒子，即使在特異性地識(shí)別特定目標(biāo)物的分子的固定化之后，通過水溶性高分子的官能團(tuán)(羧基或氨基、羥基)而粒子間的電性斥力發(fā)生作用，因此不會(huì)發(fā)生凝聚，從而也能夠在PH3 pH9的水系分散介質(zhì)中長(zhǎng)時(shí)間維持穩(wěn)定地分散的狀態(tài)。包含水溶性高分子的被膜的復(fù)合體粒子的分散粒徑在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定為Inm以上且200nm以下，因此，在哺乳動(dòng)物的血流中顯示出優(yōu)異的分散穩(wěn)定性和流動(dòng)性，通過對(duì)到達(dá)目標(biāo)物的復(fù)合體粒子照射放射線，能夠促進(jìn)目標(biāo)物的破壞。(高分子被膜的形成)作為在本發(fā)明的基體粒子上形成高分子被膜的方法，可以使用專利文獻(xiàn)2中所記載的方法。具體地說，可以使用如下方法。例如，為了在基體粒子(優(yōu)選為過氧化鈦一二氧化鈦微粒)上形成具有多個(gè)羧基的水溶性高分子的被膜，使基體粒子和具有多個(gè)羧基的水溶性高分子分散在二甲基甲酰胺中并在90°C 180°C下進(jìn)行水熱反應(yīng)I 12小時(shí)，從而使兩者通過酯鍵來結(jié)合即可。在此，基體粒子與水溶性高分子進(jìn)行酯鍵合是由于粒子表面的過氧化鈦被反應(yīng)體系中的水水合而在其表面上生成羥基，該羥基與水溶性高分子的羧基反應(yīng)而形成酯鍵。作為確認(rèn)酯鍵的方法，可以適用各種分析方法，例如可以通過紅外光譜法，根據(jù)作為酯鍵的吸收頻帶的nOOcnT1 lSOOcnT1附近的紅外吸收的有無來確認(rèn)。具有高分子被膜的基體粒子在分散液中的平均分散粒徑與不具有高分子被膜的基體粒子實(shí)質(zhì)上相同，在生理?xiàng)l件下為Inm以上且200nm以下，優(yōu)選為IOnm以上且IOOnm以下，更優(yōu)選為20nm以上且60nm以下。(特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子向基體粒子的結(jié)合)特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子可以直接結(jié)合到基體粒子本身，或者可以介由公知的連接子結(jié)合，也可以介由包覆有基體粒子的高分子被膜結(jié)合。作為使特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子結(jié)合到包覆有基體粒子的高分子被膜上的方法，可以使用專利文獻(xiàn)2中所記載的方法。由于在基體粒子的表面上形成有高分子被膜，因此，能夠在高分子被膜中所含有的水溶性高分子的羧基或氨基上固定對(duì)目標(biāo)分子具有特異性結(jié)合能力的分子。例如，為了將具有特異性結(jié)合能力的分子固定在基體粒子表面的高分子被膜上，主要使用該分子所具有的氨基或羧基進(jìn)行氨基偶聯(lián)法。例如，能夠使用水溶性碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)對(duì)高分子被膜的羧基結(jié)合特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子中的氨基。 (含有復(fù)合體粒子的分散液)本發(fā)明還涉及含有復(fù)合體粒子的分散液。作為本發(fā)明的復(fù)合體粒子的表面電位的最佳范圍，只要為+20mV以上即可，作為通常能夠充分實(shí)現(xiàn)自分散(粒子未沉淀的狀態(tài))的電位，更優(yōu)選+40mV以上。此外，在本發(fā)明的含有復(fù)合體粒子的分散液中，優(yōu)選含有鹽，鹽濃度為IM以下，優(yōu)選為IOOmM 300mM左右。另外，分散液中的復(fù)合體粒子的濃度只要以重量百分比(wt% )計(jì)為20wt%以下即可，更理想的是以重量百分比計(jì)為0.0001Wt% IOwt優(yōu)選為0. 00Iwt% 5wt*%,更優(yōu)選為0. 0025wt*% 2wt*%。另外，在本說明書中，重量百分比(wt% )和質(zhì)量百分比(mass% )的意思相同,可以相互轉(zhuǎn)換使用。本發(fā)明中的分散液可以以如下分散液的形式提供使用了水、各種pH緩沖液、輸液、或生理鹽水的、均一且穩(wěn)定的分散液。本發(fā)明的含有復(fù)合體粒子的分散液即使在中性附近的生理?xiàng)l件下也不會(huì)凝聚，因此在施用于活體時(shí)是有利的。(放射線治療劑)在本發(fā)明中，“放射線治療劑”是指放射線治療時(shí)能夠使用的藥劑。本發(fā)明的放射線治療劑發(fā)揮如下作用，即，通過放射線照射，基體粒子中所含有的過氧化鈦產(chǎn)生羥基自由基，該羥基自由基攻擊目標(biāo)物的作用。本申請(qǐng)發(fā)明的放射線治療劑是發(fā)揮通過放射線照射而損傷作為目標(biāo)物的細(xì)胞的功能的藥劑。本發(fā)明的放射線治療劑能夠形成為各種劑型(例如，液劑、固體制劑或膠囊劑等)，作為其劑型，例如可以舉出注射劑或口服劑(片劑、顆粒劑、細(xì)粒劑、散劑、軟膠囊劑或硬膠囊劑、液劑、乳劑、懸浮劑或糖漿劑等)等。本發(fā)明的放射線治療劑，能夠按照本身公知的方法制成這些各種劑型。在制造本發(fā)明的放射線治療劑的情況下，按照制劑的種類，根據(jù)需要可以添加各種添加劑，作為添加劑，例如可以舉出穩(wěn)定劑、賦形劑、潤(rùn)滑劑、崩解劑、結(jié)合劑、助溶劑、表面活性劑、崩解抑制劑、抗氧化劑、無痛劑或等滲劑等。在將本發(fā)明的放射線治療劑以注射劑形式施用于患者等的情況下，能夠適當(dāng)選擇給藥途徑進(jìn)行給藥。例如，既可以對(duì)存在有癌的組織直接給藥或局部給藥，也可以向靜脈、動(dòng)脈、皮下、肌肉內(nèi)或腹腔內(nèi)等給藥。作為能夠通過與本發(fā)明的放射線治療劑并用而使對(duì)目標(biāo)物的殺傷效果增大的放射線，例如可以舉出X射線、Y射線、電子射線、質(zhì)子射線、氦射線、碳離子射線、氖離子射線、氬離子射線、硅離子射線、負(fù)n介子射線、中子射線、UV(紫外線)或微波等。本發(fā)明中的放射線優(yōu)選為X射線。本發(fā)明的放射線治療劑向活體的給藥次數(shù)未特別地限制，例如為I次 10次，給藥時(shí)期可以為在對(duì)患者照射放射線之前或之后、或者照射同時(shí)中的任一時(shí)期，最優(yōu)選照射放射線之前。放射線治療中對(duì)目標(biāo)物照射放射線的方法可以使用公知的方法，例如可以舉出直接地進(jìn)行分次照射(例如，I天幾分鐘、I 2個(gè)月內(nèi)多次)的方法。放射線的初始能量能夠根據(jù)患者等的腫瘤的大小、狀態(tài)或部位或者其周邊的狀況等適當(dāng)?shù)剡x擇，但通常為約100MeV/n 500MeV/n。另外，對(duì)患者等的放射線的照射量能夠根據(jù)患者等的腫瘤的大小、狀態(tài)或部位或者其周邊的狀況等適當(dāng)?shù)剡x擇，但通常為約0. IGy lOOGy，對(duì)患者等的放射線的照射率通常為約0. 05Gy/分鐘 50Gy/分鐘，放射線對(duì)目標(biāo)物賦予的能量(linearenergy transfer (線性能量傳遞)LET)通常為約 50keV/ u m 70keV/ u m。
本發(fā)明的放射線治療劑的目標(biāo)物可以為活體內(nèi)的任何病變組織，可以舉出含癌的腫瘤、炎癥組織、感染病毒的組織等。作為腫瘤，例如可以舉出肺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、膽囊癌、腎癌、前列腺癌、乳癌、食道癌、肝癌、口腔癌、結(jié)腸癌、大腸癌、子宮癌、膽管癌、胰島細(xì)胞癌、腎上腺皮質(zhì)癌、膀胱癌、睪丸癌、睪丸腫瘤、甲狀腺癌、皮膚癌、惡性類癌瘤、惡性黑色素瘤、骨肉瘤、軟組織肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、Wilms瘤(腎母細(xì)胞瘤)、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、黑色素瘤或膠質(zhì)瘤等。本發(fā)明的放射線治療劑的目標(biāo)物優(yōu)選為胰腺癌或大腸癌。 本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明的放射線治療劑的抗腫瘤劑。本發(fā)明的抗腫瘤劑可以與使用了其他抗腫瘤劑的化學(xué)療法、或外科療法等組合使用。作為其他抗腫瘤劑，例如可以舉出烷化劑、各種代謝拮抗劑、抗腫瘤抗生素等。實(shí)施例以下，為了加深本發(fā)明的理解，通過實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例具體地進(jìn)行說明，當(dāng)然它們并不限制本發(fā)明的范圍。(實(shí)施例I)復(fù)合體粒子的制作(I)作為過氧化鈦一二氧化鈦微粒的基體粒子的制作作為過氧化鈦一二氧化鈦微粒的基體粒子如下進(jìn)行制備。在四氯化鈦(TiCl4)(和光純藥社制)0.02mol中，加入水10ml、25% (重量百分比)四甲基氫氧化銨(TMAH)(多摩化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社制)30ml，用水調(diào)整成共計(jì)50ml。將其在125°C下進(jìn)行加熱處理I小時(shí)，冷卻至室溫。然后，加入30% (重量百分比)雙氧水5ml。將其用超濾膜(Amicon ；Millipore社制；截留分子量IOOkDa)過濾清洗5次,得到了作為過氧化鈦一二氧化鈦微粒的基體粒子的分散液(溶劑為蒸餾水)。(2)利用高分子的基體粒子的修飾利用以下方法，使作為高分子的聚丙烯酸對(duì)⑴中所得到的基體粒子的表面進(jìn)行修飾。首先，在聚丙烯酸(PAA)(重均分子量5000，和光純藥)中，加入DMF (二甲基甲酰胺)并混合，制作了 100mg/ml PAA溶液。對(duì)上述(I)中所制作的5% (重量百分比)的基體粒子的分散液Iml和100mg/ml PAA溶液用超聲波發(fā)生裝置照射30分鐘超聲波。依次混合DMF 37. 5ml、PAA溶液2ml、基體粒子的分散液0. 5ml。對(duì)混合物進(jìn)行超聲波処理，直至沉淀消失。放入到特氟龍(注冊(cè)商標(biāo)、TEFLON ))制的密閉容器中，在150°C下反應(yīng)5小時(shí)。在每個(gè)50ml管(Corning (商標(biāo)))內(nèi)分裝IOml反應(yīng)液,加入2倍量(20ml)的丙酮并攪拌后，在室溫下靜置I小時(shí)。利用離心分離機(jī)，以4000rpm、15°C進(jìn)行離心分離20分鐘，將所分離的上清液傾濾除去。加入2倍量(20ml)的99% (重量百分比)乙醇平穩(wěn)地?cái)嚢瑁⒗秒x心分離機(jī)以4000rpm進(jìn)行離心分離10分鐘。將所分離的上清液傾濾除去后，用蒸餾水懸浮至所需濃度，從而制作出進(jìn)行了 PAA修飾的基體粒子(以下也存在稱為“PAA-基體粒子”的情況)的分散液。另外,利用DLS (動(dòng)態(tài)光散射法)(Zetasizer Nano ZS,Malvern社制)測(cè)定的平均分散粒徑為約58. 4nm。平均分散粒徑的測(cè)定條件為在I個(gè)大氣壓、25°C、蒸餾水的存在下測(cè)定。(3)抗EGFR抗體向PAA-基體粒子的結(jié)合 在0. 4M水溶性碳二亞胺(EDC、和光純藥)溶液125 U I中，加入0. IM的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS、和光純藥)溶液125 yl，并將250 U I混合液加入到上述(2)中所制作的5% (重量百分比)PAA-基體粒子溶液500 Ul中，在室溫下一邊平穩(wěn)地?cái)嚢枰贿叿磻?yīng)I小時(shí)。在混合液中，添加0. 02M的AB-NTA溶液250iil，然后添加0. 015M的Ni2+500 iil并進(jìn)行攪拌。對(duì)該50 u I混合液加入0. 02M抗EGFR抗體溶液(抗EGFR抗體是利用文獻(xiàn)Journalof Biochemistry, 46 (6) ,867-874中記載的方法制備的)50 ii I,并在4°C下一邊緩慢攪拌一邊反應(yīng)4小時(shí) I晚。加入0. IM單乙醇胺Iml,在4°C下一邊緩慢攪拌一邊反應(yīng)30分鐘，從而制作出抗EGFR抗體結(jié)合到PAA-基體粒子上的復(fù)合體粒子(以下也存在稱為“抗EGFR抗體-PAA-基體粒子”的情況)。制作了復(fù)合體粒子后，使用超濾膜(Amicon ；Mi 11 ipore社制)截留分子量100kDa，將復(fù)合體粒子和未修飾的抗體分離。加入HEPES緩沖液，進(jìn)行了 3次超濾。(實(shí)驗(yàn)例I)由放射線引起的基體粒子的自由基產(chǎn)生的確認(rèn)APF(Aminophenyl Fluoroscein、氨基苯基突光素)在中性水溶液中幾乎不發(fā)突光，但是當(dāng)APF與具有強(qiáng)活性的活性氧簇(特別是 0H、 02_)反應(yīng)時(shí)，會(huì)生成作為強(qiáng)熒光性化合物的熒光素，可觀察到熒光強(qiáng)度增大。利用該反應(yīng)對(duì)實(shí)施例1(1)中得到的基體粒子(0,0. 00025,0. 0025,0. 025,0. 25,2. 5mass% (質(zhì)量百分比))確認(rèn)了由放射線照射引起的自由基的產(chǎn)生量的變化。放射線照射利用臨床用高能X射線照射裝置LINAC :三菱EXL-15DP(以下也稱為“臨床用X射線照射裝置”)或Spring-8的裝置，使照射劑量的戈瑞(Gy)數(shù)一致(OGy lOOGy)，并按照裝置的說明書來進(jìn)行。此外，作為陽性對(duì)照，對(duì)基體粒子進(jìn)行紫外線照射，確認(rèn)了自由基的產(chǎn)生量的變化。紫外線照射使用ATTO社制的DNA-FIX，將照射焦耳量調(diào)準(zhǔn)(OJ/cm2 16J/cm2)后進(jìn)行。進(jìn)而，作為陰性對(duì)照，使用進(jìn)行了 PAA修飾的二氧化鈦微粒(分散在蒸餾水中)，進(jìn)行放射線照射。另外，二氧化鈦微粒使用產(chǎn)品名為“STSOI” (石原產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社制)的微粒。將結(jié)果表示于圖I 4。圖I表示使用臨床用X射線照射裝置對(duì)基體粒子照射了X射線的結(jié)果，圖2表示對(duì)基體粒子照射了紫外線的結(jié)果。圖3表示使用臨床用X射線照射裝置或Spring-8對(duì)含有過氧化鈦的基體粒子照射了 X射線的結(jié)果，圖4表示使用臨床用X射線照射裝置或Spring-8對(duì)進(jìn)行了 PAA修飾的二氧化鈦微粒照射了 X射線的結(jié)果。確認(rèn)到了含有過氧化鈦的基體粒子通過放射線照射而產(chǎn)生自由基?？芍珊羞^氧化鈦的基體粒子產(chǎn)生的自由基產(chǎn)生量大于由二氧化鈦微粒產(chǎn)生的自由基產(chǎn)生量。另外可知，在達(dá)到一定的濃度之前，隨著含有過氧化鈦的基體粒子的濃度升高，所生成的自由基量增加。(實(shí)驗(yàn)例2)由復(fù)合體粒子引起的細(xì)胞傷害效果的確認(rèn)對(duì)實(shí)施例I中制作的復(fù)合體粒子針對(duì)癌細(xì)胞的特異性以及由復(fù)合體粒子引起的殺傷、損傷癌細(xì)胞的效果進(jìn)行了探討。在實(shí)驗(yàn)例I中確認(rèn)到含有過氧化鈦的基體粒子通過放射線產(chǎn)生自由基，因此，在本實(shí)驗(yàn)例中為了方便，未采用放射線照射而是采用紫外線照射來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在每個(gè)3. 5cm培養(yǎng)皿(dish)中添加2ml癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)懸浮液，以成為2父10506118/(^811(細(xì)胞/培養(yǎng)皿)。培養(yǎng)基使用DMEM培養(yǎng)基(日本Nacalai Tesque制)。在37°C、5% CO2中培養(yǎng)24小時(shí)。將培養(yǎng)基去除，添加新的培養(yǎng)基2ml，并添加1% (重量百分比)的復(fù)合體粒子(抗EGFR抗體-PAA-基體粒子)0. 15mlo接著,進(jìn)行了紫外線照射(條件3. OJ/cm2)。作為對(duì)照，也對(duì)僅有培養(yǎng)基的試樣、添加了 RFP(紅色熒光蛋白)的試樣、僅 添加抗EGFR抗體的試樣、添加了 PAA-基體粒子的試樣、添加了用RFP修飾了 PAA-基體粒子的試樣(以下也稱為“RFP-PAA-基體粒子”)進(jìn)行了紫外線照射。然后，添加乙錠均二聚物-I (EthD-I)和鈣黃綠素，在熒光顯微鏡下觀察了細(xì)胞。存活的細(xì)胞顯示出綠色熒光，死亡的細(xì)胞顯示出紅色熒光。圖5是未進(jìn)行紫外線照射時(shí)的細(xì)胞的照片，圖6是進(jìn)行了紫外線照射時(shí)的細(xì)胞的照片。圖5和圖6的上段的照片為透射光圖像，中段的照片為綠色熒光圖像(活細(xì)胞)，下段的照片為紅色熒光圖像(死細(xì)胞)。在對(duì)本發(fā)明的復(fù)合體粒子進(jìn)行了紫外線照射的照片中，明顯可見死亡的細(xì)胞，可知由復(fù)合體粒子發(fā)揮了細(xì)胞毒性作用。另外，在沒有抗EFGR抗體的情況下，也發(fā)現(xiàn)了死亡的細(xì)胞，但在具有抗EGFR抗體的復(fù)合體粒子的情況下，更多的細(xì)胞死亡，因此暗示了向癌細(xì)胞的集聚性對(duì)于發(fā)揮特異性細(xì)胞毒性是重要的。(實(shí)驗(yàn)例3)由復(fù)合體粒子引起的細(xì)胞傷害效果的確認(rèn)對(duì)實(shí)施例I中制作的復(fù)合體粒子針對(duì)癌細(xì)胞的特異性以及由復(fù)合體粒子引起的殺傷、損傷癌細(xì)胞的效果進(jìn)行了探討。在本實(shí)驗(yàn)例中進(jìn)行了放射線照射，并確認(rèn)了效果。在96孔板中添加癌細(xì)胞(MIA PaCa-2細(xì)胞人胰腺癌、HCTp53+/+細(xì)胞人大腸癌(均由ATCC獲得))，以成為1\103(^118/冊(cè)11(細(xì)胞/孔)。培養(yǎng)基均使用RPMI培養(yǎng)基(Nacalai Tesque 制)。已知 MIA PaCa-2 細(xì)胞、HCTp53+/+ 細(xì)胞均表達(dá) EGFR0 在 37°C>5%CO2中培養(yǎng)24小時(shí)。將培養(yǎng)基去除，添加新的培養(yǎng)基2ml，并添加I. 6% (重量百分比)的復(fù)合體粒子(抗EGFR抗體-PAA-基體粒子)0. 15ml。接著，進(jìn)行了 X射線照射(0，5Gy)。X射線照射使用與實(shí)驗(yàn)例I同樣的臨床用高能X射線照射裝置LINAC :三菱EXL-15DP(150kVp、5-、1.(^1過濾器)來進(jìn)行。作為對(duì)照，對(duì)僅有培養(yǎng)基的試樣、添加了 1.6% (重量百分比)的PAA-基體粒子的試樣進(jìn)行了 X射線照射。將照射了 X射線日設(shè)為第0天，在第7天對(duì)MIA PaCa-2細(xì)胞測(cè)定了活細(xì)胞數(shù)，在第12天對(duì)HCTp53+/+細(xì)胞測(cè)定了活細(xì)胞數(shù)?；罴?xì)胞數(shù)的測(cè)定是通過在添加WST-8(Cell Counting Kit_8、株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所)并培養(yǎng)3小時(shí)后，在490nm下測(cè)定吸光度來進(jìn)行。細(xì)胞存活率，以相對(duì)于OGy時(shí)的細(xì)胞數(shù)的比例而算出。將結(jié)果表示于圖7。圖7a為MIA PaCa-2細(xì)胞的結(jié)果，圖7b為HCTp53+/+細(xì)胞的結(jié)果。與僅有培養(yǎng)基的對(duì)照相比，在添加了 PAA-基體粒子的試樣、添加了含有抗EGFR抗體的復(fù)合體粒子的試樣中，細(xì)胞數(shù)減少，從而可以確認(rèn)通過對(duì)基體粒子照射X射線而產(chǎn)生的細(xì)胞傷害效果。與添加了 PAA-基體粒子的情況相比，在添加了含有抗體的復(fù)合體粒子的情況下，兩種細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)均減少，因此可預(yù)測(cè)，復(fù)合體粒子通過含有抗EGFR抗體，集聚到癌細(xì)胞，增強(qiáng)了細(xì)胞傷害效果。(工業(yè)上的利用可能性)根據(jù)本發(fā)明的放射線治療劑，能夠通過特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子而使復(fù)合體粒子集聚到目標(biāo)物，并通過放射線照射使得過氧化鈦產(chǎn)生羥基自由基，從而損傷目標(biāo)物。當(dāng)使用本發(fā)明的放射線治療劑時(shí)，即使以少的放射劑量也能夠有效地?fù)p傷目標(biāo)物。在利用本發(fā)明的放射線治療劑進(jìn)行例如腫瘤治療時(shí)，能夠減少對(duì)腫瘤以外的正常組織的因放射線引起的副作用，減少了放射療法對(duì)患者的負(fù)擔(dān)，放射療法的有用性增加。通過利用本發(fā)明的放射 線治療劑，不必對(duì)存在于深部的腫瘤等照射強(qiáng)放射線，期待能夠在保持患者的Q0L(生命質(zhì)量)的狀態(tài)下進(jìn)行癌治療。
權(quán)利要求
1.一種放射線治療劑，其特征在于，含有復(fù)合體粒子， 所述復(fù)合體粒子是將特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子結(jié)合到含有過氧化鈦的基體粒子上而形成的，且通過放射線照射而產(chǎn)生對(duì)目標(biāo)物造成傷害的活性氧。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的放射線治療劑，其特征在于，所述活性氧為羥基自由基。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的放射線治療劑，其特征在于，所述基體粒子的過氧化鈦主要分布在基體粒子的表面上。
4.根據(jù)權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的放射線治療劑，其特征在于，基體粒子進(jìn)而含有二氧化鈦。
5.根據(jù)權(quán)利要求I 4中任一項(xiàng)所述的放射線治療劑，其特征在于，基體粒子的平均分散粒徑為Inm以上且200nm以下。
6.根據(jù)權(quán)利要求I 5中任一項(xiàng)所述的放射線治療劑，其特征在于，特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子為抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求I 6中任一項(xiàng)所述的放射線治療劑，其特征在于，所述復(fù)合體粒子是通過將基體粒子的表面的至少一部分用高分子被膜包覆，特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子介由該高分子被膜結(jié)合到基體粒子上而形成的。
8.根據(jù)權(quán)利要求I 7中任一項(xiàng)所述的放射線治療劑，其特征在于，放射線為X射線。
9.一種分散液，其特征在于，在水、PH緩沖液、輸液或生理鹽水中自分散有復(fù)合體粒子，該復(fù)合體粒子是將特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子結(jié)合到含有過氧化鈦的基體粒子上而形成的、且通過放射線照射而產(chǎn)生對(duì)目標(biāo)物造成傷害的活性氧的復(fù)合體粒子。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的分散液，其特征在于，所述復(fù)合體粒子的表面電位為+20mV以上。
11.一種放射線治療劑，其特征在于，其是權(quán)利要求9或10所述的分散液。
12.一種抗腫瘤劑，其特征在于，其含有特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子為能夠特異性地識(shí)別腫瘤細(xì)胞的抗體的、權(quán)利要求I 8、11中任一項(xiàng)所述的放射線治療劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種放射線治療劑，其含有將特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子結(jié)合到含有過氧化鈦的基體粒子上而形成的、通過放射線照射產(chǎn)生活性氧的復(fù)合體粒子；此外，本發(fā)明的放射線治療劑由于含有特異性地識(shí)別目標(biāo)物的分子，因而具有集聚到目標(biāo)物的功能；本發(fā)明的放射線治療劑能夠增大放射線治療的效果，能夠減少對(duì)活體的副作用，有效地攻擊目標(biāo)物。
文檔編號(hào)A61K33/40GK102781472SQ20118000854
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2011年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月17日
發(fā)明者佐佐木良平, 田中勉, 荻野千秋, 近藤昭彥 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人神戶大學(xué)