專利名稱：一種溫莪術(shù)油提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥溫莪術(shù)油提取物及其制備方法和用途，特別涉及一種含有倍半萜類成分的溫莪術(shù)油提取物及其在制備治療癌癥的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
溫莪術(shù)為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujin Y. H. Chen et C. Ling的干燥根莖， 習(xí)稱“溫莪術(shù)”。溫莪術(shù)藥材、溫莪術(shù)油及溫莪術(shù)油的注射液為中國(guó)藥典收載品種，溫莪術(shù)油是一種經(jīng)臨床證明療效確切的抗病毒、抗癌藥(中國(guó)藥典2005版)。中國(guó)藥典收載的溫莪術(shù)油一直是采用水蒸氣蒸餾法提取，傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝由于加熱時(shí)間長(zhǎng)，加熱溫度高，使得到的莪術(shù)油含雜質(zhì)多，特別是活性成分主要為含氧環(huán)狀倍半烯萜類化合物，它們?cè)陂L(zhǎng)時(shí)間高熱條件下易發(fā)生轉(zhuǎn)化，影響了莪術(shù)油的臨床療效和制劑穩(wěn)定性。例如溫莪術(shù)油抗癌主成分-呋喃二烯(Furanodiene，又名蓬莪術(shù)環(huán)二烯，分子式=C15H2tlO)在100°C或100°C以上長(zhǎng)時(shí)間加熱過程中易發(fā)生周環(huán)化發(fā)應(yīng)，生成莪術(shù)烯(6-甲二叉甲基-4，5，6，7-四氫-3，6- 二甲基-5異丙烯基-反式-苯并呋喃)。莪術(shù)烯經(jīng)家兔肌肉刺激性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，莪術(shù)烯會(huì)產(chǎn)生一定的刺激性作用。此外，由于溫莪術(shù)中含有較多的淀粉粒，在長(zhǎng)時(shí)間的加熱蒸餾過程中易與水蒸氣、揮發(fā)油一起被蒸出，造成提取的揮發(fā)油中含有大量的泡沫，油水易形成乳濁液， 難于分層，使得質(zhì)量不穩(wěn)定，存在熱源不過關(guān)等問題，給揮發(fā)油的精制帶來難度。因此提供一種質(zhì)量穩(wěn)定、無刺激性的溫莪術(shù)油提取物具有深遠(yuǎn)的臨床意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種溫莪術(shù)油提取物，該提取物主要含有倍半萜類組分，其中呋喃二烯+吉馬酮+莪術(shù)二酮在總油中的含量> 50%。本發(fā)明提供了一種溫莪術(shù)油提取物的制備方法。本發(fā)明提供了一種溫莪術(shù)油提取物的檢測(cè)方法。本發(fā)明提供了溫莪術(shù)油提取物在制備治療宮頸癌、喉癌、白血病、腦膠質(zhì)瘤、腹水癌、胃癌、前列腺癌的藥物中的用途。本發(fā)明提供的溫莪術(shù)油提取物采用(X)2超臨界萃取方法制備將莪術(shù)藥材粉碎成 20 40目的細(xì)粉，投入到超臨界萃取儀中，萃取壓力為5 18Mpa，萃取溫度20 55°C，分離釜I、II的壓力為 30Mpa，分離溫度45 70°C，CO2的流量為20 100kg/h，萃取時(shí)間2 8h。本發(fā)明提供的溫莪術(shù)油提取物的檢測(cè)方法為選用HPLC法和TLC法分離分析溫莪術(shù)油中的有效成分及進(jìn)行指紋圖譜的研究，目的是由高效液相色譜法(HPLC)和薄層色譜法(TLC)代替氣相色譜法(GC)或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MQ分離分析溫莪術(shù)油的成分，避免了氣相色譜法(GC)或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MQ中進(jìn)樣室和色譜柱的高溫對(duì)溫莪術(shù)油有效成分的破壞，而影響溫莪術(shù)油成分的真實(shí)性。本發(fā)明提供的溫莪術(shù)油提取物中倍半萜類成分不受破壞，提高了提取率，質(zhì)量穩(wěn)定，不含莪術(shù)烯(6-甲叉亞甲基_4，5，6，7-四氫-3，6- 二甲基-5異丙烯基-反式-苯并呋喃)，無刺激性，且其在抗宮頸癌、喉癌、白血病、腦膠質(zhì)瘤、腹水癌、胃癌、前列腺癌中的效果
顯者ο


圖1為檢測(cè)方法2中對(duì)照品的色譜圖。圖2為制備例1得到的提取物的色譜圖。
具體實(shí)施例方式制備例1 取溫莪術(shù)藥材1. ^g，粉碎成20 40目的細(xì)粉，投入到萃取釜(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司產(chǎn)HA221-50-06型超臨界(X)2萃取裝置)中，選擇萃取壓力18Mpa，萃取溫度為；分離釜I壓力12Mpa，溫度為55°C，分離釜II壓力為7Mpa，溫度為45°C ；CO2 流量為80 100kg/h，萃取時(shí)間2h，得到油210g，萃取率為14. 0%。經(jīng)高效液相色譜法分離分析(分析條件見檢測(cè)方法2 選用HPLC法定性定量分析莪術(shù)油中的有效成分及有關(guān)物質(zhì))，檢測(cè)結(jié)果為呋喃二烯含量為31.3%，吉馬酮(櫳牛兒酮)含量為15.5%，莪術(shù)二酮含量為11.7%，色譜圖見圖2。制備例2:取溫莪術(shù)藥材1. ^g，粉碎成20 40目的細(xì)粉，投入到超臨界萃取儀(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司產(chǎn)HA221-50-06型超臨界(X)2萃取裝置)中，選擇17Mpa為超臨界CO2萃取莪術(shù)油的萃取壓力，溫度為50°C ；分離釜I壓力lOMpa，溫度為50°C，分離釜II 壓力為7. 5Mpa，溫度為600C ；CO2流量為2^g/h，萃取2. 5h，得到莪術(shù)油198g，萃取率達(dá)到 13.2%，其中呋喃二烯在溫莪術(shù)油中的含量為33. 8%，吉馬酮(櫳牛兒酮)含量為14. 1 %， 莪術(shù)二酮含量為12.6%。制備例3:取溫莪術(shù)藥材1. ^g，粉碎成20 40目的細(xì)粉，投入到超臨界萃取儀(江蘇南通華安超臨界萃取有限公司產(chǎn)HA221-50-06型超臨界(X)2萃取裝置)中，選擇15Mpa為超臨界 CO2萃取莪術(shù)油的萃取壓力，溫度為55°C;分離釜I壓力12Mpa，溫度為50°C，分離釜II壓力為8Mpa，溫度為63°C；CO2流量為25kg/h，萃取2. 5h，得到莪術(shù)油191g，萃取率達(dá)到12.7%, 其中呋喃二烯在溫莪術(shù)油中的含量為30. 4%，吉馬酮(櫳牛兒酮)含量為15. 1 %，莪術(shù)二酮含量為12.7%。制備例4.溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑將5. Og溫莪術(shù)油提取物、IOOg注射用大豆油、12g注射用蛋黃磷脂、0. 02g維生素 E混合均勻后，置60°C恒溫水浴攪拌至澄清油溶液；將2g泊洛沙姆188、22. 5g注射用甘油溶解分散在800ml注射用水中，加熱至60°C為水相；將上述油溶液與水相按一定比例置組織搗碎機(jī)中，分次以8000 IOOOOrpm高速攪拌，制成初乳劑；然后迅速降溫后，調(diào)整pH值 8 9，用注射用水使乳劑成IOOOml ；再經(jīng)高壓均質(zhì)機(jī)勻化后，用0. 22 μ m微孔濾膜濾過，灌封，即得100支乳劑(每支含溫莪術(shù)油提取物50mg/10ml)。試驗(yàn)例1 溫莪術(shù)油提取物對(duì)人早幼粒白血病HL-60、胃癌SGC-7901、前列腺癌PC3
4的作用(體外篩選，MTT法)。1、材料溫莪術(shù)油提取物按制備例1方法制備；水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油(自提，依據(jù)《中國(guó)藥典》2005版1部莪術(shù)油項(xiàng)下提取工藝制得)。實(shí)驗(yàn)瘤株體外培養(yǎng)細(xì)胞人早幼粒白血病HL-60、胃癌SGC-7901、前列腺癌PC3， 購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。2.方法進(jìn)行體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MTT活細(xì)胞染色法)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人早幼粒白血病HL-60、胃癌SGC-7901、前列腺癌PC3各株體外培養(yǎng)細(xì)胞(貼壁細(xì)胞用消化液消化)，臺(tái)盼藍(lán)排染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，其中HL-60和SGC-7901用新鮮RPMI1640培養(yǎng)液，PC3用新鮮DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為1 X IO5個(gè)/ml，于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加細(xì)胞懸液200 μ L (每孔約2 X IO4個(gè))。在37°C、體積分?jǐn)?shù)為5%的(X)2飽和濕度培養(yǎng)箱中將HL-60培養(yǎng)Ih后，SGC-7901、PC3培養(yǎng)24h后加藥處理。2種溫莪術(shù)油以 DMSO為溶劑；以滅菌的生理鹽水為溶劑，配制成5檔劑量組，試藥組每孔加試液0. 4μ L，組每孔加試液2 μ L，空白對(duì)照組不加任何試液，每檔樣品設(shè)三復(fù)孔。在37°C、體積分?jǐn)?shù)為5% 的0)2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 后，每孔加入8 μ L MTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4h后每孔加入100 μ L DMS0,置搖床搖勻至結(jié)晶全部溶解，選用Synergy HT酶聯(lián)儀于570 630nm處測(cè)各孔吸光度值，將各加試液孔均值(T)與對(duì)照孔值(C)比較，以下列公式計(jì)算出各濃度組的百分抑制率[IC%= (1-T/C) X 100%]，并以此計(jì)算樣品的回歸方程，再求出各樣品的IC5tl值。該試驗(yàn)重復(fù)3次以上，重復(fù)性良好。結(jié)果見表1表1數(shù)據(jù)說明溫莪術(shù)油提取物對(duì)人早幼粒白血病HL-60、胃癌SGC-7901、前列腺癌PC3的體外增殖抑制作用明顯高于參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油。結(jié)果還表明溫莪術(shù)油提取物對(duì)人早幼粒白血病HL-60體外增殖抑制作用最強(qiáng)。見表1 表1溫莪術(shù)油提取物體外抗癌的IC5tl值(MITT法)
腫瘤細(xì)胞類型分組回歸方程相關(guān)系數(shù)IC50(Y)(r)(pg/ml)白血病細(xì)胞(HL-60)溫莪術(shù)油提取物-1.587+20.4471nx0.983612.477.5733+18.8281nx0.99559.52水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油-2.574+15.2631nx0.989831.331-5.492 +17.2141nx0.996825.12前列腺癌(PC3)溫莪術(shù)油提取物-20.152+24.6891nx0.993817.14-21.377+23.8871nx0.986819.85水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油-15.236+20.5621nx0.995923.87-18.894+20.4571nx0.994829.01胃癌(SGC-7901)溫莪術(shù)油提取物-31.783+26.4891nx0.978521.92-8.763+20.1161nx0.986218.56水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油-40.259+22.4811nx0.988955.41-42.351+25.4591nx0.989437.62 試驗(yàn)例2 溫莪術(shù)油提取物對(duì)人早幼粒白血病HL-60、人宮頸癌Hela、人喉癌H印-2 的作用(體外篩選，SRB法)。
1、材料溫莪術(shù)油提取物按制備例1方法制備；水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油(自提，依據(jù)《中國(guó)藥典》2005版1部莪術(shù)油項(xiàng)下提取工藝制得)；實(shí)驗(yàn)瘤株體外培養(yǎng)細(xì)胞人早幼粒白血病HL-60、人宮頸癌Hela、人喉癌!fep-2 細(xì)胞，購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。2.方法進(jìn)行體外細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(SRB法)。采用SRB法測(cè)定上述2種溫莪術(shù)油對(duì)3種人癌細(xì)胞增殖的體外抑制作用。分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-60、Hela, Hep-2的人癌細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)排染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，HL-60用新鮮的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度都為3. OX 105cell/mL，Hela,Hep-2用新鮮的RPMI 1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度都為1.0X105cell/mL以每孔100 μ L接種于96孔板內(nèi)。在37°C、體積分?jǐn)?shù)5%的C02飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 后加藥處理。2種溫莪術(shù)油提取物以DMSO-乙醇(體積比1 1)為溶劑，配制成5檔劑量組，每孔加藥100 μ L，每檔樣品設(shè)三復(fù)孔，以不接種細(xì)胞只加培養(yǎng)液的為空白對(duì)照。藥物處理細(xì)胞4 后，細(xì)胞HL-60每孔各加入50 μ L、 4°C預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)80%的三氯醋酸，使其最終達(dá)到體積分?jǐn)?shù)為16%。細(xì)胞Hela、!fep-2每孔各加入50 μ L，4°C預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)50%的三氯醋酸，使其最終達(dá)到體積分?jǐn)?shù)為10%。4°C 冰箱固定細(xì)胞Ih后，倒掉固定液，用去離子水沖洗96孔板5遍，空氣干燥。經(jīng)三氯醋酸固定后的細(xì)胞加入體積分?jǐn)?shù)0. 4%的SRB (磺酰羅丹明B)，每孔50 μ L，室溫染色30min。用體積分?jǐn)?shù)1 %的醋酸沖洗96孔板5遍，空氣干燥。最后加入lOmmol. T1Tris堿，每孔150 μ L， 在微量振蕩器上振蕩15min，直至染料全部溶解，利用酶標(biāo)儀在540nm處測(cè)每孔溶液的吸光度值(A值)、空白孔吸光度值。將各加試液孔均值⑴與對(duì)照孔值(C)比較，以下列公式計(jì)算出各濃度組的百分抑制率[IC%= (l-T/C)X100%]o并以此計(jì)算樣品的回歸方程，再求出各樣品的IC5tl值。 該試驗(yàn)重復(fù)3次以上，重復(fù)性良好。結(jié)果見表2。表2數(shù)據(jù)表明溫莪術(shù)油提取物對(duì)人喉癌H印-2、人宮頸癌Hela、人早幼粒白血病 HL-60細(xì)胞的體外增殖抑制作用明顯高于參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油。表2數(shù)據(jù)結(jié)果還表明溫莪術(shù)油提取物對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞的體外增殖抑制作用強(qiáng)于人宮頸癌Hela細(xì)胞，強(qiáng)于人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞。且MTT法和SRB法試驗(yàn)結(jié)果都證實(shí)溫莪術(shù)油提取物對(duì)人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞有明顯體外增殖抑制作用。表2溫莪術(shù)油提取物體外抗癌的IC5tl值(SRB法)腫瘤細(xì)胞類型
Hep-2
Hela
HL-60
分組
溫莪術(shù)油提取物
水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油
溫莪術(shù)油提取物
水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)袖
溫莪術(shù)油提取物
水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油
回歸方程相關(guān)系數(shù)IC50(Y)(r)(pg/ml)8.9903+34.63 Ilnx0.98883.2632.919+ 14.3231nx0.98693.30■10.254+18.5691nx0.985225.66 15.264 4-19.5211nx0.987828.317.2854+27.3431nx0.98698.131.2256+26.44 Ilnx0.99236.94■18.882+19.5261nx0.985433.82-17.564+18.4871nx0.991538.66-11.688+21.91 Ilnx0.986916.7010.404+15.7261nx0.991112.40■ 14.254+16.5611nx0.994548.42-19.265+18.5921nx0.992641.49試驗(yàn)例3 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞荷瘤裸鼠模型、小鼠宮頸癌U14實(shí)體瘤模型的生長(zhǎng)抑制作用。1藥品溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的制備見制備例4。水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑(依據(jù)《中國(guó)藥典》2005版2部莪術(shù)油注射液項(xiàng)下制備工藝制得)。2動(dòng)物BALB/c2nu裸鼠40只，購自上海中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，5 6周齡， 雌雄各半，體重平均(21. 27 士 0.80) g。無特定病原體條件飼養(yǎng)，保持一定濕度、溫度(25 28°C)0所用食物、水、飼養(yǎng)籠和墊料均經(jīng)高壓消毒。昆明小鼠由山東綠葉制藥有限責(zé)任公司動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SYXK(魯)20030020)體重18 20g。雌雄皆可，每批實(shí)驗(yàn)使用同一性別。動(dòng)物數(shù)實(shí)驗(yàn)組、參照組及陰性對(duì)照組昆明小鼠均各為10只。3瘤源喉鱗狀細(xì)胞癌H印_2、小鼠宮頸癌U14細(xì)胞株購于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫。4劑量設(shè)置人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞荷瘤裸鼠模型溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑腹腔注射100(qd)、50(qd)和10(qd)mg/kg。參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑腹腔注射 100(qd)mg/kg。小鼠宮頸癌U14模型溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑腹腔注射100 (qd)、50 (qd)、10 (qd) 和50(bid)mg/kg。參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑腹腔注射100(qd)mg/kg。5給藥方案人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株H印-2細(xì)胞荷瘤裸鼠模型以劑量設(shè)置溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑小鼠尾腹腔100、50和10mg/kg注射給藥，每3天腹腔給藥1次，共給藥8 次。強(qiáng)化給藥分別采用劑量設(shè)置的溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的中劑量靜脈輸注輸液小鼠腹腔注射給藥，每3天腹腔給藥，每天2次，共給藥16次。以劑量設(shè)置參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑小鼠尾腹腔注射100mg/kg注射給藥，每3天腹腔給藥1次，共給藥8次。小鼠宮頸癌U14模型以劑量設(shè)置溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑小鼠尾腹腔100、50和 10mg/kg注射給藥，每天1次，連續(xù)9d，共給藥9次。強(qiáng)化給藥分別采用劑量設(shè)置的的中劑量靜脈輸注輸液小鼠腹腔注射給藥，每天2次，連續(xù)9d，共給藥18次。參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑腹腔注射100 (qd)mg/kg。以劑量設(shè)置參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑小鼠尾腹腔注射100mg/kg注射給藥，每3天腹腔給藥1次，共給藥8次。6實(shí)驗(yàn)對(duì)照陰性對(duì)照給與實(shí)驗(yàn)組高劑量等體積等濃度的相應(yīng)溶劑，給藥方案均為小鼠腹腔注射途徑，每天1次，連續(xù)10d。7實(shí)驗(yàn)方法取體外培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的喉癌!fep-2細(xì)胞，每只裸鼠于右耳后下皮下種植1 X 109/L 喉癌Hep-2細(xì)胞懸液0. 2ml使之生長(zhǎng)，建立喉癌裸鼠動(dòng)物模型。觀察接種部位液體吸收、腫瘤生長(zhǎng)過程及裸鼠狀況，待腫瘤生長(zhǎng)25d，至直徑> Icm時(shí)進(jìn)行治療。8組動(dòng)物每3天腹腔給藥1次，并稱量鼠重，重新調(diào)整給藥劑量。分別于1、4、7、10、13、16、19和22d給藥。停藥后3d，處死裸鼠，離腫瘤，稱量瘤重和鼠重抑瘤率。無菌抽取傳代第8天的宮頸癌U14小鼠的腹水，以無菌生理鹽水調(diào)整細(xì)胞數(shù)在 8X IO6個(gè)/ml，于每鼠右側(cè)腋窩皮下接種0. 2ml, 24小時(shí)后，腹腔注射給藥，每天一次，連續(xù)給藥9天，停藥后24h稱重，處死小鼠，分離瘤塊，計(jì)算出抑瘤率。以t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 按下列公式計(jì)算腫瘤抑制率抑瘤率％ = (1-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對(duì)照組平均瘤重)X 100%。8 結(jié)果(1)人喉鱗狀細(xì)胞癌H印-2模型的抑制率溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑輸液樣品的劑量分別為100mg/kg、50mg/kg及10mg/kg，試驗(yàn)抑制率結(jié)果分別為55. 23,50. 35，41. 85,43. 22，20. 14,22. 53% ；溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑采用低劑量50mg/kg強(qiáng)化方案給藥，試驗(yàn)抑制率結(jié)果分別為60.59、62.82%。詳細(xì)數(shù)據(jù)見
表3o(2)小鼠宮頸癌U14模型的抑制率溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑輸液樣品的劑量分別為100mg/kg ipX9qd、50mg/kg ipX9qd 及 30mg/kg ipX9qd,試驗(yàn)抑制率結(jié)果為 41. 55,40. 55,33. 68,28. 61,21. 51、 22. 99%;溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑采用低劑量50mg/kg ivX9bid強(qiáng)化方案給藥，試驗(yàn)結(jié)果分別為46. 39、47.02%。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表4。溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)人喉癌Hep-2裸鼠及小鼠宮頸癌U14兩個(gè)模型試驗(yàn)顯示溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑具有良好的抗腫瘤作用，三個(gè)治療劑量間具有量效關(guān)系，采用同劑量但不同給藥方案時(shí)，每天兩次腹腔給藥較一次腹腔給藥效果好，甚至超過高劑量組。其在劑量100mg/kg的抗腫瘤效果是同劑量參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的2倍， 要明顯強(qiáng)于參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的抗腫瘤效果。水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑在劑量100mg/kg時(shí)近似于無效。表3溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)人喉癌裸鼠模型的療效試驗(yàn)樣品
陰性對(duì)照組
溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑
參照組
水蒸氣蒸館溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑
劑量動(dòng)物數(shù)(只)瘤重抑制率mg/kg/d始/終X±SD (g)%10/101.855±0.157相應(yīng)溶劑10/101.987±0.14310/100.830±0.042***55.2310010/100.986±0.051***50.3510/101.079±0.062***41.855010/101.128±0.088***43.2210/101.481 士0.095***20.141010/101.539±0.142***22.5310/100.731±0.053***60.595010/100.739±0.04P**62.8210/101.336±0.101***27.9810010/101.356±0.081***31.76
***P值< 0.01與陰性對(duì)照組相比
表4溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)小鼠U14宮頸癌實(shí)體瘤型的療效試驗(yàn)
樣品劑量給藥方案動(dòng)物數(shù)(只)瘤重抑制率mg/kg/d始/終X±SD (g)%陰性對(duì)照組相應(yīng)溶劑ipx9qd10/103.381±0.42410/103.567±0.98溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑100ipx9qd10/101.976±0.203***41.5510/102.121±0.315***40.5550ipx9qd10/102.242±0.425***33.6810/102.546±0.241***28.6110ipx9qd10/102.654±0.451***21.5110/102.747±0.561***22.9950ipx9 bid10/101.813±0.078***46.3910/101.890±0.065***47.02參照組100ipx9qd10/102.559±0.126***24.31水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑10/102.642±0.213***25.93***P值< 0. 01與陰性對(duì)照組相比試驗(yàn)例4 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)顱內(nèi)接種的小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤G-422及B16小鼠黑色素瘤實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移的抗腫瘤療效。1藥品溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的制備見制備例4，水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑(依據(jù)《中國(guó)藥典》2005版2部莪術(shù)油注射液項(xiàng)下制備工藝制得)2動(dòng)物C57BL/6小鼠、昆明小鼠由上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)滬動(dòng)合證字第107號(hào)。體重18 20g。雌雄皆可，每批實(shí)驗(yàn)使用同一性別。動(dòng)物數(shù)實(shí)驗(yàn)組及參照組昆明小鼠均各為10只、陰性對(duì)照組20只。3瘤源G_422小鼠腦瘤模型、B16小鼠黑色素瘤模型由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理室傳代維持。4劑量設(shè)置溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑靜脈注射40和20mg/kg。水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑靜脈注射40mg/kg。5給藥方案以劑量設(shè)置溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑小鼠尾靜脈40和20mg/kg注射給藥，每天1次，連續(xù)10d，共給藥10次。強(qiáng)化給藥分別采用劑量設(shè)置的溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的低劑量靜脈輸注輸液小鼠尾靜脈注射給藥，每天2次，連續(xù)10d，共給藥20次。參照水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑小鼠尾靜脈40mg/kg注射給藥，每天1次，連續(xù)10d，共給藥 10次。6實(shí)驗(yàn)對(duì)照陰性對(duì)照給與實(shí)驗(yàn)組高劑量等體積等濃度的相應(yīng)溶劑，給藥方案均為小鼠尾靜脈途徑，每天1次，連續(xù)10d。7實(shí)驗(yàn)方法顱內(nèi)接種動(dòng)物腫瘤模型取生長(zhǎng)旺盛的小鼠G-422瘤源，無菌條件下勻漿法制備成約3 4X IO7AiL均菜，于昆明小鼠顱內(nèi)接種0. 05mL/鼠，分組，接種24h后開始靜脈給藥治療。B16小鼠黑色素瘤模型取體外培養(yǎng)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞，從 C57BL/6小鼠尾靜脈接種5X IO4個(gè)細(xì)胞。G-422觀察荷瘤小鼠30天內(nèi)的存活率，與陰性對(duì)照組比較，計(jì)算腫瘤抑制率；B16試驗(yàn)三周后取各組動(dòng)物的肺臟，檢查肺克隆數(shù)。按下列公式求出荷瘤宿主的生命延長(zhǎng)率生命延長(zhǎng)率(％)=[(對(duì)照組平均生存天數(shù)-給藥組平均生存天數(shù))/對(duì)照組平均生存天數(shù)]X 100%依據(jù)各組腫瘤平均集落數(shù)，按下列公式計(jì)算腫瘤抑制率腫瘤抑制率(％)=[(對(duì)照組平均集落數(shù)-給藥組平均集落數(shù))/對(duì)照組平均集落數(shù)]X 100%統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用X2檢驗(yàn)。結(jié)果顱內(nèi)接種的小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤G422對(duì)荷瘤宿主的生命延長(zhǎng)率溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑高劑量40mg/kg ivXIOqd及低劑量20mg/kg ivX IOqd試驗(yàn)結(jié)果為53. 61、55. 99， 48. 45,50. 83%;溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑采用低劑量20mg/kgivX IObid強(qiáng)化方案給藥，試驗(yàn)結(jié)果為58. 06%。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表5。B16小鼠黑色素瘤試驗(yàn)性肺轉(zhuǎn)移模型的腫瘤抑制率溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的高劑量 40mg/kg ivXIOqd 及低劑量 20mg/kg ivXIOqd 試驗(yàn)結(jié)果為 43. 93,40. 99，36. 76、 39. 83% ；溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑采用低劑量20mg/kg ivX IObid強(qiáng)化方案給藥，試驗(yàn)結(jié)果為48. 06%。詳細(xì)數(shù)據(jù)見表6。溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)顱內(nèi)接種的小鼠G-422腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤(腦內(nèi)接種)及 B16小鼠黑色素瘤實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移兩個(gè)模型試驗(yàn)結(jié)果顯示溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑具有良好的抗腫瘤作用，其中對(duì)原位接種的腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤效果更為顯著，顯示本品有通過血腦屏障的特點(diǎn)，兩個(gè)治療劑量間具有量效關(guān)系。采用同劑量但不同給藥方案時(shí)，每天兩次靜脈給藥較一次靜脈給藥效果好，甚至超過高劑量組。其中溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)顱內(nèi)接種的小鼠 G-422腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的抗腫瘤效果在劑量40mg/kg/d的抗腫瘤效果是參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的2倍，表明其要明顯強(qiáng)于參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的抗腫瘤效果。表5溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)G-422小鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤的療效試驗(yàn)劑量給藥方案動(dòng)物數(shù)平均生存時(shí)間生命延長(zhǎng)樣品始/終(只)mg/kgX±SD (天〉%ivxlOqd20/09.71±2.2陰性對(duì)照組相應(yīng)溶劑ivxlOqd20/09.68±2.210/014.9±3.1***53.6140ivxlOqd10/015.1±2.9***55.99溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑10/1014.4±2.3***48.45ivxlOqd2010/014.6±1.8***50.83iv χ IObid10/015.3±3.7***58.06參照組10/10\2.62±\3***29.9740ivxlOqd水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑10/1011.86 士 1.8***22.52***P值< 0. 01與陰性對(duì)照組相比表6溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)小鼠黑色素瘤B16實(shí)驗(yàn)肺轉(zhuǎn)移療效試驗(yàn)
劑量給藥方案動(dòng)物數(shù)(只)肺克隆數(shù)抑制率樣品XiSD (個(gè))mg/kg/d始/終%ivxlOqd20/2048.5±11.3陰性對(duì)照組相應(yīng)溶劑ivxlOqd20/2049.6±12.210/1027.2±3.1***43.9340ivxlOqd10/10293±2.7***40.99溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑10/1030.7±2.3***36.76ivxlOqd2010/1029.8±1.8***39.83ivx IObid10/1025.8±3.4***48.06參照組10/1028.4±2.2 …41.4440ivxlOqd水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑10/1030.5±3.0***38.51***P值< 0. 01與陰性對(duì)照組相比試驗(yàn)例5 溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑注射液對(duì)移植性P388白血病小鼠移植性和艾氏腹水癌(EAC)的體內(nèi)抗腫瘤療效。1藥品溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的制備按制備例4。水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑(依據(jù)《中國(guó)藥典》2005版2部莪術(shù)油注射液項(xiàng)下制備工藝制得)。2動(dòng)物昆明小鼠由上海中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)滬動(dòng)合證字第107號(hào)。體重18 20g。DBA/2 小鼠，19士2g，由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)中科動(dòng)005號(hào))。雌雄皆可，每批實(shí)驗(yàn)使用同一性別。動(dòng)物數(shù)實(shí)驗(yàn)組及參照組昆明小鼠均各為10只、陰性對(duì)照組20
P3瘤源小鼠P388白血病瘤株模型和艾氏腹水癌瘤(EAC)模型由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理室傳代維持。4劑量設(shè)置溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑靜脈注射40和20mg/kg。水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑靜脈注射40mg/kg。5給藥方案以劑量設(shè)置的溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑和水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑于接種后的Mh、72h、120h小鼠腹腔40和20mg/kg給藥，共給藥3次。6實(shí)驗(yàn)對(duì)照陰性對(duì)照給與實(shí)驗(yàn)組高劑量等體積的生理鹽水，給藥方案均為小鼠
11腹腔途徑，每天1次，連續(xù)3d。7實(shí)驗(yàn)方法小鼠P388白血病瘤株模型取腹水生長(zhǎng)旺盛的P388白血病小鼠，以艾氏腹水癌瘤EAC模型相同的方法，無菌條件下抽取腹水，用生理鹽水1 10稀釋后，接種于DBA/2小鼠，每只小鼠腹腔接種0.2mL。于接種后M，72，120h腹腔注射給藥3次。求得各組的平均生存天數(shù)，與陰性對(duì)照組比較，求出生命延長(zhǎng)率。艾氏腹水癌瘤EAC模型取健康狀況良好，傳代第7天的EAC荷瘤小鼠，頸椎脫臼處死，新潔爾滅浸泡消毒，無菌條件下抽取腹水，按1 4加入無菌生理鹽水制成細(xì)胞懸液， 每只小鼠腹腔接種0.2mL[細(xì)胞數(shù)為(1 5)X106]。接種后，動(dòng)物隨機(jī)分組，每組10只，共分4組，于接種后的Mh、72h、120h按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案給藥。停藥后觀察小鼠的存活情況，求得各組的平均生存天數(shù)，與陰性對(duì)照組比較，按下列公式求出生命延長(zhǎng)率生命延長(zhǎng)率(％)=[(對(duì)照組平均生存天數(shù)-給藥組平均生存天數(shù))/對(duì)照組平均生存天數(shù)]X 100%8 結(jié)果溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)小鼠移植性腫瘤P388白血病模型試驗(yàn)顯示使P388小鼠生存期顯著延長(zhǎng)，其平均存活時(shí)間和生命延長(zhǎng)率與陰性對(duì)照組比較有顯著差異，見表7。 其在劑量40mg/kg/d的抗腫瘤效果是參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的5倍，要明顯強(qiáng)于參照組水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑的抗腫瘤效果。溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)小鼠移植性艾氏腹水癌瘤(EAC)模型試驗(yàn)顯示使EAC 小鼠生存期顯著延長(zhǎng)，其平均存活時(shí)間和生命延長(zhǎng)率與陰性對(duì)照組比較有顯著差異，見表 8。表7溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)小鼠P388白血病的療效試驗(yàn)
樣品陰性對(duì)照組
溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑參照組
水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑***P值< 0. 01與陰性對(duì)照組相比表8溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑對(duì)艾氏腹水癌瘤EAC的療效試驗(yàn)
劑量動(dòng)物數(shù)平均生存時(shí)間生命延書mg/kg始/終(只)XiSD (天)%20/20.11.1±1.5相應(yīng)溶劑20/2010.4 士 2.510/1016.5±1.9***48.654010/1015.6±2.2***50.0010/1012.6±1.5***13.512010/1013.1±1.6***25.9610/1012.1±1.0***9.014010/1011.1±1.4***6.73樣品劑量動(dòng)物數(shù)平均生存時(shí)間生命延長(zhǎng)率mg/kg始/終(只)XiSD (天)%陰性對(duì)照組相應(yīng)溶劑20/09.8士2.320/010.8±2.0溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑4010/833.3±11.2***239.8010/830.6±13.2***183.332010/820.4±13.5***108.1610/822.1±10.8***104.63參照組4010/828.9±9.5***194.9水蒸氣蒸餾溫莪術(shù)油脂肪乳注射劑10/826.4±10.2***144.4***P值< 0. 01與陰性對(duì)照組相比檢測(cè)方法1 選用薄層色譜法(TLC法)分離分析溫莪術(shù)油中的成分TLC 溫莪術(shù)油中主要成分的分離分析TLC條件娃膠層析，展開劑為正己烷-乙酸乙酯(9 1)；顯色劑為10%的硫酸乙醇溶液；對(duì)照品吉馬酮(櫳牛兒酮)由黑龍江省藥品檢驗(yàn)所提供；莪術(shù)醇由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)100185-200405 ；莪術(shù)二酮、呋喃二烯、莪術(shù)烯自提，純度均大于98%，由有機(jī)波譜和單晶X-衍射確證結(jié)構(gòu)和構(gòu)型。供試品制備例1、2、3中的溫莪術(shù)油作為待測(cè)樣品；結(jié)果顯示，制備例1、2、3中的溫莪術(shù)油均含有吉馬酮(櫳牛兒酮)、莪術(shù)二酮、呋喃二烯、莪術(shù)醇等成分，基本不含有莪術(shù)烯。檢測(cè)方法2 選用HPLC法定性定量分析溫莪術(shù)油中的有效組分及有關(guān)物質(zhì)儀器美國(guó)Agilent 1100 型 HPLC 儀色譜條件DiscoveryC18HPLC Column :25cmX4. 6mmX 5um ；流動(dòng)相乙腈-水 (75 25)或甲醇-水(90 10)；檢測(cè)波長(zhǎng):215nm ；柱溫室溫20 30°C ；流速:lml/min ；進(jìn)樣量:20ul。供試品制備例1中的溫莪術(shù)油作為檢測(cè)樣品；對(duì)照品吉馬酮(櫳牛兒酮)由黑龍江省藥品檢驗(yàn)所提供；莪術(shù)醇由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；β -欖香烯由大連醫(yī)藥科學(xué)研究所提供；莪術(shù)二酮、呋喃二烯、莪術(shù)烯自提，純度均大于98%，由有機(jī)波譜和單晶X-衍射確證結(jié)構(gòu)和構(gòu)型；結(jié)果顯示6個(gè)對(duì)照品在上述色譜條件下(流動(dòng)相為甲醇-水(90 10))所得色譜圖中的色譜峰從左到右分別為莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、莪術(shù)烯、呋喃二烯和欖香烯(見圖1)，且6個(gè)對(duì)照品可達(dá)到完全分離，分離度均大于1. 5 ；其中對(duì)制備例1中溫莪術(shù)油檢測(cè)結(jié)果見圖2。
權(quán)利要求
1.溫莪術(shù)油提取物在制備治療宮頸癌、喉癌、白血病、腦膠質(zhì)瘤、腹水癌、胃癌、前列腺癌的藥物中的用途，其中溫莪術(shù)油提取物的制備方法為將莪術(shù)藥材粉碎成20 40目的細(xì)粉，投入到超臨界萃取儀中，萃取壓力為5 18Mpa，萃取溫度20 55°C，分離釜I、II的壓力為7 30Mpa，分離溫度45 70°C，CO2的流量為20 100kg/h，萃取時(shí)間2 他。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，溫莪術(shù)油提取物的制備方法為取溫莪術(shù)藥材1.^g，粉碎成20 40目的細(xì)粉，投入到萃取釜中，選擇萃取壓力18Mpa，萃取溫度為55°C ；分離釜I 壓力12Mpa，溫度為55°C，分離釜II壓力為7Mpa，溫度為45°C ；CO2流量為80 100kg/h， 萃取時(shí)間池。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，溫莪術(shù)油提取物的制備方法為取溫莪術(shù)藥材1.^g，粉碎成20 40目的細(xì)粉，投入到超臨界萃取儀中，選擇17Mpa為超臨界(X)2萃取莪術(shù)油的萃取壓力，溫度為50°C ；分離釜I壓力lOMpa，溫度為50°C，分離釜II壓力為7. 5Mpa，溫度為 60 0C ；CO2 流量為 25kg/h，萃取 2. 5h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，溫莪術(shù)油提取物的制備方法為取溫莪術(shù)藥材1.5kg, 粉碎成20 40目的細(xì)粉，投入到超臨界萃取儀中，選擇15Mpa為超臨界CO2萃取莪術(shù)油的萃取壓力，溫度為55°C ；分離釜I壓力12Mpa，溫度為50°C，分離釜II壓力為8Mpa，溫度為 63 0C ；CO2 流量為 25kg/h，萃取 2. 5h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種溫莪術(shù)油提取物及其制備、檢測(cè)方法和用途。具體地涉及溫莪術(shù)油提取物采用CO2超臨界萃取方法制備。本發(fā)明提供的溫莪術(shù)油質(zhì)量穩(wěn)定、可控，無刺激性，基本不含有莪術(shù)烯，同時(shí)有效成分提取完全，制備簡(jiǎn)單。本發(fā)明提供了溫莪術(shù)油在制備治療抗癌藥物中的用途。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102363019SQ201110342240
公開日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2007年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日
發(fā)明者孫秀燕 申請(qǐng)人:煙臺(tái)大學(xué)