專利名稱：生血丸在制備預(yù)防或修復(fù)環(huán)境污染致細(xì)胞損傷藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥制劑技術(shù)領(lǐng)域，涉及中藥的新用途，更具體的說(shuō)是生血丸在制備預(yù)防或修復(fù)環(huán)境污染致細(xì)胞損傷藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
達(dá)仁堂生血丸源于中醫(yī)研究院廣安門醫(yī)院名老中醫(yī)謝海洲教授數(shù)十年臨床之驗(yàn)方。善于補(bǔ)腎陽(yáng)和腎精，精足則血旺?，F(xiàn)代研究，生血丸有保肝利膽、抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)靜、 降血糖等多種作用，治療放、化療后的全血細(xì)胞減少、再生障礙性貧血有確切療效。方中有鹿茸、黃柏、山藥、炒白術(shù)、桑枝、白扁豆、稻芽、紫河車。具有補(bǔ)腎健脾，填精補(bǔ)髓之功效。主藥鹿茸溫腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋健骨、生精益血，是峻補(bǔ)元陽(yáng)之要藥，用于治療精血兩虧，活血又補(bǔ)血，具有促進(jìn)造血之功能；紫河車益氣、養(yǎng)血、補(bǔ)精，有強(qiáng)壯作用；白術(shù)、山藥為健脾開(kāi)胃之品，于大補(bǔ)之中防滋膩，有益氣生血之作用黃柏為瀉火滋陰、清解清瀉之品，取其緩解滋補(bǔ)過(guò)峻之作用而有利于體內(nèi)吸收，該方組方嚴(yán)謹(jǐn)，臨床應(yīng)用功效確切。在人們?nèi)粘Ｉ詈凸ぷ鳝h(huán)境中如辦公室、居室、小汽車內(nèi)存在的揮發(fā)性有機(jī)化合物中都存在苯，苯除了能引起人們神經(jīng)、血液、免疫系統(tǒng)功能障礙外，近年來(lái)苯引起癌癥，是一種致癌物的報(bào)告不斷出現(xiàn)。有研究表明，化學(xué)物苯、二甲苯、甲醛對(duì)小鼠骨髓紅細(xì)胞微核率的存在顯著影響。甲醛是一種常見(jiàn)的化學(xué)性室內(nèi)空氣污染物，主要來(lái)源于保濕材料、絕緣材料、地板膠、涂料、塑料貼面、壁紙、家具的粘合樹脂、家用燃料和煙葉的不完全燃燒。在所有因室內(nèi)裝修引起的有機(jī)類空氣污染物中(例如苯系物、其他的醛、酮、酚、烷等)，甲醛單獨(dú)的污染水平?？筛哌_(dá)0. 1-0. 4mg/m3,這樣的濃度水平不但遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他單個(gè)污染物的水平，有時(shí)甚至高于其他揮發(fā)性有機(jī)化合物的總量。結(jié)果表明甲醛污染能造成生物染色體損傷。鉛是一種嚴(yán)重危害人類健康的重金屬元素。鉛其化合物可通過(guò)消化道、呼吸道進(jìn)入人體，影響身體的各器官，特別是神經(jīng)系統(tǒng)、造血系統(tǒng)對(duì)鉛最感，是鉛作用的主要靶器官。還有研究認(rèn)為鉛還可以對(duì)小鼠生殖遺傳細(xì)胞產(chǎn)生損傷。香煙煙霧中含有尼古丁、煙焦油、氫氰酸、醛等多種化學(xué)物質(zhì)，成分十分復(fù)雜，估計(jì)含有3 500多種化合物，且許多物質(zhì)已證明具有致癌、致畸和致突變作用。目前認(rèn)為煙霧凝聚物中各種致突變物的作用具有協(xié)同效應(yīng)。此外，煙霧凝聚物中某些物質(zhì)雖無(wú)誘變性， 但可大大加強(qiáng)其它誘變劑的誘變作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首先公開(kāi)了生血丸在制備預(yù)防或修復(fù)環(huán)境污染致骨髓細(xì)胞損傷藥物中的應(yīng)用；其中所述的環(huán)境污染為鉛、香煙污染、苯、二甲苯、甲醛；所述的預(yù)防或修復(fù)骨髓細(xì)胞損傷指的是抑制癌前細(xì)胞的增殖。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了生血丸在制備提前預(yù)防環(huán)境污染致白血病、多臟器腫瘤發(fā)生藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了生血丸在制備早期修復(fù)環(huán)境污染致白血病、多臟器腫瘤發(fā)生藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的研究實(shí)驗(yàn)說(shuō)明生血丸可有效降低外周血淋巴細(xì)胞微核率，降低由醋酸鉛污染導(dǎo)致的周圍血淋巴細(xì)胞DNA的損傷。本發(fā)明的研究實(shí)驗(yàn)說(shuō)明生血丸預(yù)防組和治療組均能很好改善外周血淋巴細(xì)胞微核率，修復(fù)細(xì)胞損傷。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)還提示生血丸能有效預(yù)防甲醛的細(xì)胞損傷，并能修復(fù)已損傷的造血細(xì)胞。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)還提示生血丸不但可以預(yù)防苯、二甲苯污染導(dǎo)致的骨髓細(xì)胞損傷還可以清除自由基，促進(jìn)ODC的生成，抑制異形細(xì)胞的增值修復(fù)已損傷的骨髓細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式為了更充分的解釋本發(fā)明的實(shí)施，下面通過(guò)典型的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明這些實(shí)施實(shí)例僅僅是解釋、而不是限制本發(fā)明的范圍。特別加以說(shuō)明的是，為了更加清楚地說(shuō)明本發(fā)明的應(yīng)用效果，分為四個(gè)部分分別加以介紹，具體的實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下
實(shí)施例1
第一部分生血丸修復(fù)鉛污染致骨髓細(xì)胞損傷的病理研究 1材料和方法 1.1動(dòng)物
中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供雄性BalB/C小鼠150只，體重 20 士 2g，8-12 周齡，許可證號(hào) SCXK —(軍)2007— 004。2. 2主要材料和試劑
快速姬姆薩染液南京建成科技，批號(hào)20101109
類標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清100ml，中美合資蘭州民海生工程有限公司，批號(hào)20100921肝素鈉注射液2ml，1.25萬(wàn)單位，批號(hào)20100502 敵百蟲:250mg, Sigma，批號(hào):8021X
醋酸鉛500ml，天津大學(xué)科威公司，批號(hào)2008年10月9日羥自由基檢測(cè)試劑盒南京建成科技，批號(hào)20110224
超氧陰離子檢測(cè)試劑盒南京建成科技，批號(hào)20110303鳥氨酸脫羧酶ELISA試劑盒華北制藥金坦生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)E0300007
玻璃點(diǎn)樣細(xì)管北京醫(yī)科大學(xué)儀器廠
生血丸干粉達(dá)仁堂制藥廠提供
2. 3主要儀器和設(shè)備
OLYMPUS顯微鏡日本，BX51
酶標(biāo)儀上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司型號(hào)ST-360
高速低溫離心機(jī)美國(guó)sigma公司，3k-30
電子分析天平Sartorius德國(guó)，BP61型
137Cs γ 身寸線源Nordion, Ottawa, Canada Gamma, cell 40 Exactor恒溫恒濕環(huán)境模擬光催化反應(yīng)艙南開(kāi)大學(xué)環(huán)境系研制，YSSN-I型 2.4動(dòng)物模型制備、分組和給藥
BalB/C小鼠150只，雄性，體重20 士 2g，8-12周齡。分為五組正常組，30只，普食正常飲水40天；模型組1，30只，普食，醋酸鉛溶液5 g/L飼喂20天后，改普食，正常飲水 20天；模型組2，30只，普食，正常飲水20天后，改醋酸鉛溶液5 g/L飼喂20天；預(yù)防組，30 只，生血丸2. 5g/kg，正常飲水20天后，普食，醋酸鉛溶液5 g/L飼喂20天；治療組30只， 普食，醋酸鉛溶液5 g/L喂養(yǎng)20天后，生血丸2. 5g/kg，正常飲水20天。2.5外周血淋巴細(xì)胞微核率的檢測(cè)方法
小鼠目?jī)?nèi)眥眶靜脈取血0. 1ml，肝素抗凝，與1/2量的3%明膠放入離心管中，加蓋混勻，垂直至于37°C水浴箱中自然沉降40分鐘左右。吸取上清液，注入離心管中，1000rpm/5 分鐘，棄上清，取沉淀物推片，干后，甲醇固定1分鐘，瑞-姬氏染色1 0分鐘。微核計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)在油鏡下觀察1000個(gè)淋巴細(xì)胞，按Country-man的標(biāo)準(zhǔn)確定微核， 即微核大小為主核的1/20 1/3，與主核核膜完全分離，形態(tài)較規(guī)正，圓形或橢圓形，染色性與主核相似或稍淡，無(wú)明顯折光性。觀察5000個(gè)淋巴細(xì)胞中所含微核的淋巴細(xì)胞數(shù)。2.6骨髓細(xì)胞微核率的檢測(cè)方法
小鼠頸椎脫臼法處死以后，取雙側(cè)的小鼠股骨，剪去骨的兩端，用小牛血清沖洗骨髓，直至骨髓腔發(fā)白為止。將骨髓沖洗液1500r/min離心8min，棄上清，然后用約0. 5mL的小牛血清將沉淀懸浮起來(lái)。每個(gè)載玻片滴一滴，涂開(kāi)后于空氣中自然干燥，甲醇固定15min，晾干，瑞姬染色15min，細(xì)水流沖洗晾干，即可觀察。統(tǒng)計(jì)1000個(gè)骨髓細(xì)胞中所含微核的細(xì)胞。2. 7骨髓細(xì)胞抑制羥自由基能力的檢測(cè)方法
小鼠頸椎脫白法處死以后，取雙側(cè)的小鼠股骨，剪去骨的兩端，用生理鹽水沖洗骨髓， 直至骨髓腔發(fā)白為止。將骨髓沖洗液1500r/min離心8min，棄上清。細(xì)胞勻漿，按羥自由基檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，各樣本以吸光值表示(OD )。2.8骨髓細(xì)胞抗超氧陰離子能力的檢測(cè)方法
小鼠頸椎脫白法處死以后，取雙側(cè)的小鼠股骨，剪去骨的兩端，用生理鹽水沖洗骨髓， 直至骨髓腔發(fā)白為止。將骨髓沖洗液1500r/min離心8min，棄上清。細(xì)胞勻漿，采用比色法測(cè)定抗超氧陰離子活性，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。蛋白測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。各樣本以吸光值表示(OD)。2. 9骨髓細(xì)胞鳥氨酸脫羧酶(ODC)表達(dá)的檢測(cè)方法
小鼠頸椎脫白法處死以后，取雙側(cè)的小鼠股骨，剪去骨的兩端，用生理鹽水沖洗骨髓，直至骨髓腔發(fā)白為止。將骨髓沖洗液1500r/min離心8min，棄上清。細(xì)胞勻漿，按 ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，在酶標(biāo)儀以波長(zhǎng)450nm檢測(cè)。各樣本以吸光值表示(OD)。3 結(jié)果
3. 1生血丸對(duì)鉛污染小鼠外周血淋巴細(xì)胞及骨髓細(xì)胞微核率的影響表1生血丸對(duì)鉛污染小鼠外周血淋巴細(xì)胞及骨髓細(xì)胞微核率的影響( X±S，n=10)
權(quán)利要求
1.生血丸在制備預(yù)防或修復(fù)環(huán)境污染致骨髓細(xì)胞損傷藥物中的應(yīng)用；其中所述的環(huán)境污染為鉛、香煙污染、二甲苯或甲醛；所述的預(yù)防或修復(fù)骨髓細(xì)胞損傷指的是抑制癌前細(xì)胞的增殖。
2.生血丸在制備提前預(yù)防環(huán)境污染致白血病、多臟器腫瘤發(fā)生藥物中的應(yīng)用。
3.生血丸在制備早期修復(fù)環(huán)境污染致白血病、多臟器腫瘤發(fā)生藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了生血丸在制備預(yù)防或修復(fù)環(huán)境污染致骨髓細(xì)胞損傷藥物中的應(yīng)用；其中所述的環(huán)境污染為鉛、香煙污染、苯、二甲苯、甲醛；所述的預(yù)防或修復(fù)骨髓細(xì)胞損傷指的是抑制癌前細(xì)胞的增殖。本發(fā)明從血液淋巴細(xì)胞、骨髓微核率的變化；自由基的清除能力；癌前細(xì)胞增殖的抑制等方面，檢驗(yàn)生血丸抗環(huán)境污染致畸的功效，為生血丸的臨床應(yīng)用開(kāi)辟更廣闊的前景。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102370905SQ201110331310
公開(kāi)日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者嚴(yán)蘇純, 張曉樂(lè), 王光普 申請(qǐng)人:天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司達(dá)仁堂制藥廠