專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于烏頭類(lèi)中藥毒性效價(jià)檢測(cè)的生物檢定方法及裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種烏頭類(lèi)中藥毒性效價(jià)檢測(cè)的生物檢定方法及裝置。
背景技術(shù)：
附子、川烏、草烏等烏頭類(lèi)中藥在臨床上應(yīng)用十分廣泛，特別是附子在危重癥的搶救和久治不愈的疑難病例的治療中發(fā)揮了突出的作用，自古為中藥回陽(yáng)救逆之第一品。烏頭類(lèi)中藥有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即均有劇毒，治療量和致死量接近，安全窗較窄，這給臨床安全用藥帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)，如附子被稱(chēng)為“最有用亦最難用”的中藥。雙酯型生物堿是烏頭類(lèi)中藥的主要毒性成分，主要包括烏頭堿、新烏頭堿與次烏頭堿三種，其毒性極強(qiáng)，主要是對(duì)神經(jīng)和心血管系統(tǒng)造成嚴(yán)重傷害，人口服烏頭堿0. 2mg即可引起中毒，致死量為2 5mg。由于烏頭類(lèi)中藥藥性劇烈，作用時(shí)間短，且治療劑量與中毒劑量、致死劑量接近，因用藥不慎而中毒甚至死亡的情況在臨床上屢見(jiàn)不鮮。因此，評(píng)價(jià)藥物的安全性是烏頭類(lèi)中藥質(zhì)量控制的重中之重?，F(xiàn)在控制烏頭類(lèi)中藥毒性的方法主要是用高效液相色譜等分析手段測(cè)定烏頭堿、 新烏頭堿與次烏頭堿三種雙酯型生物堿的含量。但是，現(xiàn)行的烏頭類(lèi)藥材安全性控制方法和標(biāo)準(zhǔn)存在諸多局限性，無(wú)法滿足生產(chǎn)和臨床的需要。中藥本身是一個(gè)具有多成分、多作用靶點(diǎn)特性的復(fù)雜體系，不同成分之間在活性上一般存在著協(xié)同、拮抗等諸多相互作用，簡(jiǎn)單的測(cè)定幾個(gè)特定成分往往難以表征藥物的整體藥效或毒性。例如，烏頭類(lèi)藥材中毒性物質(zhì)種類(lèi)較多，除了雙酯型生物堿外，其他生物堿也有毒，三種雙酯型生物堿的含量并不能準(zhǔn)確的表征藥材的整體毒性。已進(jìn)行的藥理實(shí)驗(yàn)也表明藥材總提物的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于三種雙酯型生物堿毒性的總和，不同批次藥材之間甚至出現(xiàn)三種雙酯型生物堿含量較低但總毒性高的現(xiàn)象，這樣會(huì)給臨床用藥帶來(lái)很大風(fēng)險(xiǎn)。其次，三種雙酯型生物堿含量的測(cè)定無(wú)法直觀地說(shuō)明藥材毒性的大小，不利于不同藥材毒性大小的比較和安全性控制。因此，需要一種能夠直觀、客觀地標(biāo)示出烏頭類(lèi)藥材的總毒性大小，保障臨床用藥安全性的烏頭類(lèi)中藥毒性檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是提供一種烏頭類(lèi)中藥毒性效價(jià)檢測(cè)的生物檢定方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于烏頭類(lèi)中藥毒性效價(jià)檢測(cè)的生物檢定方法的裝置。本發(fā)明的烏頭類(lèi)中藥毒性效價(jià)檢測(cè)的生物檢定方法包括下述步驟a.標(biāo)準(zhǔn)品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制用無(wú)水乙醇將標(biāo)準(zhǔn)品配制成lmg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在4°C下貯存；測(cè)定時(shí)，用0. 9%的氯化鈉溶液稀釋得標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的注射體積不得大于動(dòng)物單次靜脈注射最大承受體積；b.供試品溶液和供試品稀釋液的配制稱(chēng)取過(guò)10 100目篩的供試品粉末，置于錐形瓶中，加入其重量(g) 5 15倍體積(ml)的50% 95%的乙醇，浸泡30分鐘，超聲處理15 60分鐘；用孔徑0. 2 μ m的微孔濾膜過(guò)濾提取液，濾液減壓濃縮至原來(lái)體積的十分之一得供試品溶液。測(cè)定時(shí)，估計(jì)供試品效價(jià)，用0. 9%氯化鈉溶液對(duì)供試品溶液進(jìn)行稀釋得供試品稀釋液。調(diào)節(jié)供試品稀釋液濃度使其注射體積與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液注射體積相近；C.測(cè)定取健康合格的動(dòng)物，試驗(yàn)前M小時(shí)移去飼料，但仍給予飲水，臨試驗(yàn)前準(zhǔn)確稱(chēng)重，每次試驗(yàn)所用動(dòng)物的體重相差不得超過(guò)體重均值的20% ；將動(dòng)物平均分為兩組，每組至少6只，一組注入所述標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，另一組注入所述供試品稀釋液；將動(dòng)物用固定器固定，于靜脈中插入注射針頭，用勻速注射儀以每分鐘0. 2 1. Oml的速度勻速連續(xù)注入藥液，至動(dòng)物中毒死亡立即停止注入；以動(dòng)物瞳孔迅速放大、呼吸停止為注入終點(diǎn)；分別記錄所注入的以ml計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和供試品稀釋液的總量；d.按中國(guó)藥典2010版二部附錄XI V生物檢定統(tǒng)計(jì)法中的直接測(cè)定法計(jì)算毒性效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差，可信限率FL%不得超過(guò)15% ；直接測(cè)定法的計(jì)算公式如下xs和&為標(biāo)準(zhǔn)品⑶和供試品⑴組各只動(dòng)物的對(duì)數(shù)最小致死量，它們的均值& 和4為S和T的對(duì)數(shù)等反應(yīng)劑量；M是S和T對(duì)數(shù)等反應(yīng)劑量之差，即Λ/= & — (1);R是 S 和 T 等反應(yīng)劑量的比值，即i = antilg(&—JT) = antilgA/ (2);ns和ητ為S和T組的動(dòng)物數(shù)； Pt是T的測(cè)得效價(jià)，At為T(mén)的估計(jì)效價(jià)，Pt = AT · R (3)；
方差2 _ S
ns+nT-2
⑷; M 的標(biāo)準(zhǔn)誤& =(5);
]j ns-nT自由度f(wàn) = ns+nT_2，用此自由度查t值表得t值(P = 0. 95)；Pt 的可信限 FL = At · antilg(M士 t · Sm) (6)；
^001 D 的f ■卞譏 O/ — Aantilg (M + tSu)-ATmtHg (Μ-^m)Pt 的可f目限率hL·/?！?-—- (7)。優(yōu)選地，所使用的動(dòng)物可以是大鼠、小鼠、豚鼠、鴿子、青蛙中的一種。所采用的標(biāo)準(zhǔn)品可為烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿中的一種。當(dāng)選用同一標(biāo)準(zhǔn)品， 所使用動(dòng)物不同時(shí)，藥材毒性效價(jià)(即標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)量)不變。本發(fā)明的用于烏頭類(lèi)中藥毒性效價(jià)檢測(cè)的生物檢定方法的裝置包括固定器、帶導(dǎo)管的針頭和勻速注射儀，其特征在于所述帶導(dǎo)管的針頭的針頭端插入固定在固定器中的動(dòng)物靜脈中，另一端固定在勻速注射儀的注射器上。本發(fā)明裝置中的固定器可以為本領(lǐng)域中任何合適的容器，只要?jiǎng)游镏糜谄渲胁荒芤苿?dòng)即可，如可以采用圓柱形的筒。本發(fā)明裝置中的勻速注射儀可以為本領(lǐng)域中任何合適的勻速注射儀，如可以采用包括注射器、機(jī)箱、推進(jìn)機(jī)構(gòu)、微電腦芯片和控制電路五部分的勻速注射儀。推進(jìn)機(jī)構(gòu)在微電腦芯片和控制電路的控制下可帶動(dòng)注射器活塞左右平行勻速移動(dòng)。通過(guò)微電腦芯片可以設(shè)置注射速度和注射體積。本發(fā)明的烏頭類(lèi)中藥毒性效價(jià)檢測(cè)的生物檢定方法與現(xiàn)有的烏頭類(lèi)中藥安全性評(píng)價(jià)方法相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)1)本發(fā)明的毒性效價(jià)生物檢定方法可以評(píng)價(jià)藥物的整體毒性；2)以最小致死量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)使藥物毒性大小更加直觀明了，同時(shí)該評(píng)價(jià)指標(biāo)由藥理實(shí)驗(yàn)得到，與臨床相關(guān)性更強(qiáng)；3)將藥材總毒性以標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)量表示，可以對(duì)藥材毒性大小進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)示，便于不同藥材間毒性大小的比較及毒性限量的設(shè)定；4)本發(fā)明的毒性效價(jià)生物檢定方法結(jié)果準(zhǔn)確，精密度高，同時(shí)操作簡(jiǎn)便，用時(shí)較短，經(jīng)濟(jì)成本低；5)本發(fā)明的裝置采用動(dòng)物固定器和勻速注射儀的合理組合，成本較低，其中動(dòng)物固定器簡(jiǎn)單實(shí)用，可使注射過(guò)程方便快捷；勻速注射儀可以方便地控制生物檢定方法中的關(guān)鍵影響因素——注射速度，因而極大地提高了該生物檢定方法的效率和結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明提供的毒性效價(jià)生物檢定法可以準(zhǔn)確、快捷地檢測(cè)烏頭類(lèi)中藥的整體毒性，對(duì)藥材進(jìn)行統(tǒng)一的毒性效價(jià)標(biāo)示。在烏頭類(lèi)藥材生產(chǎn)、加工、銷(xiāo)售等環(huán)節(jié)，毒性效價(jià)檢測(cè)可以作為藥材質(zhì)量控制的手段之一；在臨床上，醫(yī)生可以根據(jù)藥材的標(biāo)示毒性效價(jià)調(diào)整用藥劑量，從而保證用藥安全。


圖1為本發(fā)明的用于烏頭類(lèi)中藥毒性效價(jià)檢測(cè)的生物檢定方法的裝置的示意圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中采用的物質(zhì)，除了注明的之外，其余均為市售。實(shí)施例供試品由生附子炮制得到的兩個(gè)批次的白附片1和2標(biāo)準(zhǔn)品烏頭堿，賦值Img = IOOOu, u為單位數(shù)動(dòng)物=SD大鼠，雄性，0. 2士0. 02kg步驟如下a.精密稱(chēng)取烏頭堿IOmg置于IOml容量瓶中，加無(wú)水乙醇至刻度，密塞，振搖使完全溶解，在4°C下貯存。測(cè)定時(shí)，精密量取烏頭堿溶液0.5ml置于IOOml的容量瓶中，用 0. 9%氯化鈉溶液稀釋至刻度得烏頭堿稀釋液。b.精密稱(chēng)取白附片1和白附片2的粉末(過(guò)100目篩)各10g，置于兩個(gè)磨口錐形瓶中，分別加入IOOml的70%乙醇，浸泡30分鐘，超聲處理30分鐘。提取液用0. 2 μ m微孔濾膜過(guò)濾，濾液濃縮至IOml得到兩份供試品溶液。測(cè)定時(shí)，精密量取白附片1或白附片 2的溶液5ml置于50ml容量瓶中，用0. 9%氯化鈉溶液稀釋至刻度得供試品稀釋液。c.取18只健康合格的SD大鼠。試驗(yàn)前M小時(shí)移去飼料，但仍給予飲水，臨試驗(yàn)前準(zhǔn)確稱(chēng)重。將動(dòng)物平均分為三組，分別用于烏頭堿、白附片1和白附片2最小致死量的測(cè)定。測(cè)定時(shí)，將動(dòng)物置于固定器1內(nèi)，于尾靜脈中插入帶導(dǎo)管的針頭2的針頭，用勻速注射儀3以每分鐘0. 5ml的速度勻速連續(xù)注入烏頭堿稀釋液或白附片稀釋液，至動(dòng)物中毒死亡立即停止注入。以瞳孔迅速放大、呼吸停止為注入終點(diǎn)。記錄所注入的烏頭堿稀釋液的總量(ml)或白附片稀釋液的總量(ml)，計(jì)算最小致死量，結(jié)果見(jiàn)表1。d.按中國(guó)藥典2010版二部附錄XI V生物檢定統(tǒng)計(jì)法中的直接測(cè)定法計(jì)算毒性效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差。計(jì)算結(jié)果如下表1烏頭堿、白附片1和白附片2最小致死量測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于烏頭類(lèi)中藥毒性效價(jià)檢測(cè)的生物檢定方法，其特征在于所述生物檢定方法包括下述步驟a.標(biāo)準(zhǔn)品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液的配制用無(wú)水乙醇將所述標(biāo)準(zhǔn)品配制成lmg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在4°C下貯存；測(cè)定時(shí)，用 0. 9%的氯化鈉溶液稀釋得所述標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液；b.供試品溶液和供試品稀釋液的配制稱(chēng)取過(guò)10 100目篩的供試品粉末，置于錐形瓶中，加入其重量(g) 5 15倍體積(ml) 的50% 95%的乙醇，浸泡30分鐘，超聲處理15 60分鐘；用孔徑0. 2 μ m的微孔濾膜過(guò)濾提取液，濾液減壓濃縮至原來(lái)體積的十分之一得供試品溶液。測(cè)定時(shí)，估計(jì)供試品效價(jià)， 用0.9%氯化鈉溶液對(duì)供試品溶液進(jìn)行稀釋得供試品稀釋液。調(diào)節(jié)供試品稀釋液濃度使其注射體積與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液注射體積相近；c.測(cè)定取健康合格的動(dòng)物，試驗(yàn)前M小時(shí)移去飼料，但仍給予飲水，臨試驗(yàn)前準(zhǔn)確稱(chēng)重，每次試驗(yàn)所用動(dòng)物的體重相差不得超過(guò)體重均值的20% ；將動(dòng)物平均分為兩組，每組至少6只， 一組注入所述標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，另一組注入所述供試品稀釋液；將動(dòng)物用固定器固定，于靜脈中插入注射針頭，用勻速注射儀以每分鐘0. 2 1. Oml的速度勻速連續(xù)注入藥液，至動(dòng)物中毒死亡立即停止注入；以動(dòng)物瞳孔迅速放大、呼吸停止為注入終點(diǎn)；分別記錄所注入的以 ml計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液和供試品稀釋液的總量；d.按中國(guó)藥典2010版二部附錄XIV生物檢定統(tǒng)計(jì)法中的直接測(cè)定法計(jì)算毒性效價(jià)及實(shí)驗(yàn)誤差，可信限率FL %不得超過(guò)15%。
2.如權(quán)利要求1所述的生物檢定方法，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)品為烏頭堿、新烏頭堿和次烏頭堿中的一種。
3.如權(quán)利要求1所述的生物檢定方法，其特征在于所述動(dòng)物為大鼠、小鼠、豚鼠、鴿子、青蛙中的一種。
4.一種用于權(quán)利要求1所述的生物檢定方法的裝置，其特征在于所述裝置包括固定器、帶導(dǎo)管的針頭和勻速注射儀，所述帶導(dǎo)管的針頭的針頭端插入固定在所述固定器中的動(dòng)物靜脈中，另一端固定在所述勻速注射儀的注射器上。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種烏頭類(lèi)中藥毒性效價(jià)檢測(cè)的生物檢定方法。本發(fā)明提供的毒性效價(jià)檢測(cè)的生物檢定法可以準(zhǔn)確、快捷地檢測(cè)烏頭類(lèi)中藥的整體毒性，對(duì)藥材進(jìn)行統(tǒng)一的毒性效價(jià)標(biāo)示。本發(fā)明還涉及一種用于烏頭類(lèi)中藥毒性效價(jià)檢測(cè)的生物檢定方法的裝置。
文檔編號(hào)A61K49/00GK102172409SQ20111000819
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月14日
發(fā)明者山麗梅, 王伽伯, 秦誼, 肖小河, 金城 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三〇二醫(yī)院