專利名稱：特定寡糖對nfk-b介導的病毒復制的抑制的制作方法
特定寡糖對NFK-B介導的病毒復制的抑制技術領域
本發(fā)明屬于病毒復制領域，用于治療NFK-B介導的病毒感染，特別是HIV感染。
技術背景
腸源細菌產物(例如脂多糖(LPS)和肽聚糖(PG))促進高度免疫活化，導致HIV-I 感染的疾病程度增加。這種高度免疫活化的原因可能是慢性LPS或PG誘導的Toll樣受體 (TLR)介導的NF-κ B活化，導致HIV-I復制增加。果膠水解產物(pAOS)中的食用酸性寡糖已顯示可抑制細菌性病原體在胃腸道中的附著。
WO 2009/0976772 (
公開日期2009年8月6日)公開了用于激發(fā)天然殺傷細胞活性的包含食用纖維的營養(yǎng)組合物，特別是包含低聚半乳糖、低聚果糖和果膠降解產物的混合物的營養(yǎng)組合物。
US 2006/0178341公開了來源自酵母變種菌株的可溶性葡聚糖低聚物用于制備治療和預防由流感病毒和可傳染性腸胃炎冠狀病毒感染引起的疾病的治療劑的用途。其作用基于一氧化氮(NO)產生的增加。其未提及葡聚糖的病毒復制效應。
WO 02/47612公開了用于促進總體健康和免疫系統(tǒng)支持的膳食添加組合物。組分 (例如葡聚糖)是適合作為免疫系統(tǒng)的強效調節(jié)物的候選物。對于葡聚糖，參見對癌癥細胞生長和轉移以及細菌感染的研究。例如，果膠與血液膽固醇降低和腫瘤生長抑制有關。然而所述文件仍然未提及病毒復制。發(fā)明內容
本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)特定寡糖能夠通過抑制NF-K B活化而抑制病毒復制。 所附實驗數(shù)據(jù)表明在體外模型中，Toll樣受體誘導的和TNF-α誘導的NF-κ B激發(fā)可被抑制。在進一步實驗中檢測了大量化合物，但所述實驗顯示人免疫缺陷病毒的產生只受到極少數(shù)特定寡糖的抑制。
因此本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案是寡聚糖醛酸(oligouronic acid)和/或聚糖醛酸、阿拉伯糖基木聚糖(優(yōu)選來自米糠)、葡聚糖(優(yōu)選例如來自酵母的β-ι， 3/1，6-葡聚糖)、D-核糖和/或它們的混合物用于抑制患有病毒性疾病的哺乳動物中的病毒復制的用途，其中所述病毒性疾病優(yōu)選地選自AIDS(HIV)-AIDS相關綜合征、水痘 (Chickenpox ；Varicella)、普通感冒、巨細胞病毒感染、科羅拉多蜱傳熱、登革熱、埃博拉出血熱、手足口病、肝炎、單純皰疹、帶狀皰疹、皰疹乳頭狀瘤病毒、流行性感冒(流感)、拉沙熱(lassa fever)、麻疹、馬爾堡出血熱(marburg hemorrhagic fever)、傳染性單核細胞增多癥、腮腺炎、諾羅病毒(norovirus)、脊髓灰質炎、進行性多灶性白質腦病、狂犬病、風疹、 SARS、天花(痘癥)、病毒性腦炎、病毒性胃腸炎、病毒性腦膜炎、病毒性肺炎、西尼羅河病和黃熱病。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及(適合)用于抑制患有上述病毒性疾病的哺乳動物中的病毒復制的組合物，所述組合物包含寡聚糖醛酸和/或聚糖醛酸、阿拉伯糖基木聚糖(優(yōu)選來自米糠)、來自面包酵母的β-葡聚糖、D-核糖或它們的混合物。
此外，本發(fā)明還涉及以下物質中的一種或多種和/或其混合物用于制備抑制患有上述病毒性疾病的哺乳動物中的病毒復制的組合物的用途
-聚糖醛酸，優(yōu)選二半乳糖醛酸(digalacturonicacid)、三半乳糖醛酸 (trigalacturonic acid)和/或聚半乳糖醛酸(優(yōu)選包含二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸和 /或聚半乳糖醛酸的果膠)、包含二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸和/或聚半乳糖醛酸的果膠或者以二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸和/或聚半乳糖醛酸形式的果膠，
-阿拉伯糖基木聚糖，優(yōu)選來自米糠，
-來自面包酵母的β-葡聚糖，優(yōu)選例如來自酵母的β-1，3/1，6-葡聚糖，
-D-核糖。
此外，本發(fā)明涉及一種治療患有病毒性疾病或有患病風險的人的方法，所述方法包括給予所述人上述組合物。
在一個優(yōu)選實施方案中，所述組合物包含聚糖醛酸(優(yōu)選二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸和/或聚半乳糖醛酸)和半胱氨酸等價物(優(yōu)選N-乙酰半胱氨酸(NAC))，聚糖醛酸與半胱氨酸等價物的重量比優(yōu)選為10 1至1 10，更優(yōu)選為5 1至1 5。替代地或額外地，所述組合物的每日劑量包含IOOmg至IOg聚糖醛酸，優(yōu)選果膠AOS。對于本說明書指定的其他糖類，優(yōu)選相同的重量和比例。所有糖類優(yōu)選地具有2-250單元的鏈長。這些可來自天然來源，如必要可如本領域所知的用酸或酶水解。
在一個優(yōu)選的實施方案中，所述組合物包含3種多不飽和脂肪酸，優(yōu)選至少包含 EPA，其單獨存在或者與一種或多種半胱氨酸等價物相結合。


圖1半乳糖醛酸寡糖的鏈長對NFK B抑制的影響。對于聚半乳糖醛酸寡糖的抑制， 需要2個半乳糖醛酸基團的最小鏈長。用包含至少3個半乳糖醛酸基團的寡糖可獲得最佳效果。
圖2在用AOS孵育22. 5小時并且用NAC(A)或L-半胱氨酸⑶與TNF-α孵育 2. 5小時后，ΗΕΚ293細胞中的NF κ B響應。在對NAC或半胱氨酸的影響進行校正后，獲得C 曲線和D曲線，表明所述組分是嚴格累加性的。
圖3不同NAC和AOS濃度下的谷胱甘肽濃度。所述結合物的影響大于單獨組分對整個曲線的影響。在這些附圖中，“AOS”代表pAOS。
具體實施方式
⑶4+T細胞計數(shù)是AIDS進展的良好指示物，因為HIV主要感染⑶4+輔助T細胞， 最終導致細胞死亡。慢性的免疫過度活化——進行性HIV疾病中的一種典型特征——在進行中的 CD4+T 細胞去除中起重要作用。Brenchley et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 2006 ； 12 1365-1371.已經提出了腸在HIV誘導的慢性免疫活化中的重要作用。腸滲透性增加在HIV 感染的患者中較常見并導致微生物產物的易位。循環(huán)的脂多糖(LPQ——一種微生物易位的可靠標記物——已被證明在HIV感染患者中顯著增加，這與免疫過度活化一致。而且，LPS水平在用HAART治療時降低。LPS是革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要組分并因此是一種強效的免疫激發(fā)產物。這些發(fā)現(xiàn)表明HIV感染導致腸屏障功能受損，繼而導致微生物易位增加， 最終促進慢性免疫活化。HIV復制似乎在維持這種受損的腸屏障功能時起重要作用。HIV感染時腸滲透性的原因尚未被完全理解，但是其可能是由于⑶4+T細胞感染。 胃腸道可能是體內最大的淋巴器官，占T細胞總載量的至少一半。由于CD4+T細胞在胃腸道中最豐富，因此HIV感染在腸內形成一個促炎癥環(huán)境。推測此環(huán)境導致胃腸粘膜屏障損壞，從而增加微生物易位。這些細菌產物(如脂多糖和肽聚糖(PG))通過與TLR受體結合而誘導炎癥應答，這不但誘導炎癥，而且觸發(fā)HIV病毒進行復制。所釋放的HIV顆粒感染其他 ⑶4+T細胞，其形成甚至更大的促炎癥環(huán)境并增加腸滲透性。此正向反饋環(huán)路驅動慢性免疫活化。不囿于理論，本發(fā)明人推測通過LPS誘導的或者PG誘導的Toll樣受體(TLR)活化介導免疫過度活化。每種Toll樣受體子集均被特定微生物產物所激發(fā)；LPS激發(fā)TLR-4，而PG 激發(fā)TLR-2。TLR的活化誘導信號傳導通路，從而活化NF-κ B，導致炎癥。NF-κ B是由轉錄因子的Rel/κ B家族的兩種蛋白組成的二聚體，所述兩種蛋白均為DNA結合所需。NF-K B組成型表達，但在未激發(fā)細胞的細胞質中以與I κ B抑制物蛋白的無活性復合體的形式存在。 當NF- κ B從其與I κ B的復合體中釋放時，它能自由易位至細胞核，并在那里作為轉錄因子發(fā)揮作用。NF-K B的磷酸化增加了核定位、蛋白-蛋白相互作用和轉錄活性。當白細胞被 HIV-I感染時，NF-κ B至細胞核的易位在病毒復制中還起其他作用。NF-K B識別HIV-I的長末端重復序列(LTR)中具有連續(xù)序列5，-GGGPuNNPuPuCC-3，的兩個IObp DNA片段。在瞬時轉染研究中，任一 κ B位點的突變均導致LTR啟動子活性的劇烈降低，表明NF- κ B在 HIV復制中起重要作用。由于NF-K B的該作用，NF-κΒ是治療HIV感染個體的潛在靶標。 實際上，已發(fā)現(xiàn)抑制NF- κ B活化在體外降低了 HIV-I的復制(參見實施例)，并可因此可能會在體內推遲AIDS發(fā)展。據(jù)推測如實施例1中提及的特定營養(yǎng)寡糖的主要作用位點為腸。實施例1顯示對一大組食用纖維進行了 NF-K B抑制能力的測試。已發(fā)現(xiàn)只有包含酸性寡糖(顯示為果膠(以二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸、聚半乳糖醛酸的形式))、來自米糠的阿拉伯糖基木聚糖、來自面包酵母的β -葡聚糖、D-核糖的少數(shù)選擇能夠在所述測試系統(tǒng)中抑制NF-K B。對于HIV感染，已知所述腸在急性和慢性感染期中在相關CD4+T白細胞中具有高水平的病毒復制。還已知所述腸被看作是常規(guī)抗反轉錄病毒療法難以到達的獨立區(qū)室(例如血液病毒水平可以抗反轉錄病毒療法來降低，但不影響腸中的病毒載量)。推定的食用寡糖調節(jié)NF-K B活化的不同通路——這導致病毒產生特別是腸中病毒產生的減少——的能力使得食用寡糖在HIV感染治療中具有潛在有益作用。食用寡糖可導致腸內病毒載量減少，這可全身性地表現(xiàn)為病毒載量的減少或CD4計數(shù)的增加或者兩者的結合。由于上述推理，用NF- κ B抑制物(例如AOS和/或NAC)進行的治療并不直接改變患者外周血液中的病毒載量。這可為腸的區(qū)室化所解釋，在腸中這些營養(yǎng)組分似乎具有其最強的作用?？共《舅幬锇邢蚩狗崔D錄病毒療法難以到達的區(qū)室的推定特性也表明使用這些特定寡糖可能與現(xiàn)有的抗病毒療法特別是與抗反轉錄病毒療法(HAART)具有協(xié)同效應。由于本發(fā)明寡糖的NF-K B抑制活性，本發(fā)明的優(yōu)選組合物包含抗病毒療法(例如HAART)與本發(fā)明組合
5物的結合物。為治療HIV，所述權利要求的組合物可以與以下物質結合使用抗病毒疫苗， 抗病毒藥物如奧司他韋(oseltamivir ；Tamiflu)、扎那米韋(zanamivir ；Relenza)等，或者用于治療AIDS的抗反轉錄病毒治療劑例如核苷和核苷酸反轉錄酶抑制劑(nRTI)、非核苷反轉錄酶抑制劑(NNRTI)、蛋白酶抑制劑(PI)、整合酶抑制劑如雷特格韋(Raltegravir)、 進入抑制劑(或融合抑制劑)如馬拉維若(Maraviroc)和恩夫韋地(Enfuvirtide)或者突變抑制劑如貝韋立馬(Bevirimat)和Vivecon。組合物本發(fā)明組合物優(yōu)選地包含糖醛酸寡糖和/或糖醛酸多糖，優(yōu)選寡聚半乳糖醛酸和 /或聚半乳糖醛酸。最優(yōu)選地，這些是果膠水解產物，在本領域中通常被認為是果膠酸性寡糖(pAOS)。最優(yōu)選地，果膠(水解產物)以二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸、聚半乳糖醛酸的形式存在或包含二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸、聚半乳糖醛酸。糖醛酸寡糖(優(yōu)選果膠水解產物)優(yōu)選地通過以果膠裂合酶、果膠酸裂合酶、多聚半乳糖醛酸內切酶和/或果膠酶對果膠的酶法消化獲得。在本發(fā)明上下文中，術語“寡聚糖醛酸”和“聚糖醛酸”可互換使用，并且寡聚糖醛酸和聚糖醛酸被理解為具有2-250的DP，更優(yōu)選2-100的DP，甚至更優(yōu)選2_50的DP，最優(yōu)選2-20的DP。所述糖醛酸寡糖和糖醛酸多糖優(yōu)選地是半乳糖醛酸寡糖和半乳糖醛酸多糖 (包括二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸)。最優(yōu)選地，所述聚合度為平均DP。在一個實施方案中，所述組合物包含聚半乳糖醛酸。半胱氨酸或半胱氨酸來源本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)N-乙酰半胱氨酸(NAC)也能夠抑制NF- κ B活化。此抑制能力背后的機制尚不清楚，但已經推測其涉及NAC間接通過GSH水平恢復而降低氧化脅迫的能力。氧化脅迫已被證明通過一種仍有爭論并很可能是細胞類型特異性的機制促進NF-κ B活化。 然而，大多數(shù)研究表明ROS誘導的NF- κ B活化倚賴于磷酸化IKK (間接通過PKD (蛋白激酶 D)活化)的經典通路。由于本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)NAC和AOS可一起對NF- κ B活化起作用，因此推測NAC和AOS 對GSH水平具有累加效應。為確定這一點，將HEK293細胞用AOS孵育22. 5小時，并且用 NAC與TNF- α孵育2. 5小時。將獲得的GSH水平針對細胞數(shù)進行校正，并將結果與TNF- α 激發(fā)細胞(對照)的水平相比較。IOmM濃度的NAC的加入增強了 GSH水平。在加入2和 3mg/l后，AOS能夠顯著增加GSH水平。NAC和AOS的組合使得GSH產生最高增加至對照的 278%。將數(shù)據(jù)集與其基線對照(0mg/ml AOS與其特定濃度的NAC或L-半胱氨酸)進行比較并示于實施例2中。AOS和NAC的高濃度導致GSH水平相對更強的增加。據(jù)此，可得出 AOS和NAC對HEK293細胞中GSH的產生具有協(xié)同效應。所提供的組合物除包含一種或多種上述寡糖以外，還包含合適量的半胱氨酸和/ 或半胱氨酸源。短語“半胱氨酸源”在本文中是指含有任意形式的生物可利用的半胱氨酸的所有化合物，并且以化合物中存在的或者可在攝入后在體內從化合物產生的半胱氨酸氨基酸的量(以摩爾計)計算。下文中“半胱氨酸等價物”是指一份的半胱氨酸本身，或者是指半胱氨酸源中存在的一份的半胱氨酸。例如IOOmg NAC (N-乙酰半胱氨酸；麗=163. 2)等價于半胱氨酸 (MW 121.15)。因此IOOmgNAC是半胱氨酸等價物。這同樣也適用于蛋白或肽。當肽(MW = χ道爾頓)含有3個半胱氨酸氨基酸(3y道爾頓)時，IOOmg該肽等價于100X3Y/X 半胱氨酸。因此IOOmg該肽為300y/x mg半胱氨酸等價物。本發(fā)明合適的半胱氨酸來源為，例如變性和/或非變性形式的蛋白，例如乳蛋白如乳清蛋白或酪蛋白。卵蛋白富含半胱氨酸并因此也是合適的。植物蛋白例如豌豆、馬鈴薯、大豆和稻也可用于提供半胱氨酸。也可使用這些蛋白來源的水解產物或者富含半胱氨酸的蛋白質或肽的富集組分(例如EP1201137中所述)。此外，還可使用合成的半胱氨酸等價物，例如半胱氨酸衍生物，如半胱氨酸、胱氨酸、半胱氨酸鹽、N-乙酰半胱氨酸和/或二乙酰半胱氨酸。HIV感染的受試者適合被給予的每日劑量為至少約IOOmg的半胱氨酸等價物，優(yōu)選每日至少約200、400或600mg半胱氨酸等價物，更優(yōu)選每天至少約IOOOmg半胱氨酸等價物。應理解每日劑量可再分為一天服用數(shù)次的2、3或更多個劑量單位。在另一個實施方案中，本發(fā)明的組合物包含一種或多種激發(fā)谷胱甘肽水平的化合物。例如，硫辛酸、丙酮酸(pyruvate)、草酰乙酸(oxaloacetate)、草酰天冬氨酸鹽 (oxaloaspartate)能夠激發(fā)谷胱甘肽水平。這類激發(fā)谷胱甘肽水平的化合物可與半胱氨酸一起使用，也可替代半胱氨酸。ω-3多不飽和脂肪酸本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)ω-3多不飽和脂肪酸也能夠抑制NF-κ B活化。這在所附實施例中已證明，其中只展示了在這類多不飽和脂肪酸與AOS和半胱氨酸結合的情況下的效應。所提供的組合物優(yōu)選地另外包含ω-3多不飽和脂肪酸。本發(fā)明的用于治療的不飽和脂肪酸優(yōu)選地選自(18-以6 -3多不飽和脂肪酸。優(yōu)選的ω-3多不飽和脂肪酸包括二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳四烯酸(ETA)和二十二碳五烯酸(DPA)，最優(yōu)選至少包括EPA和/或DHA。在用于所述寡糖測試的相同體外模型中，EPA顯示出NF κ B抑制作用。C20-(^6 ω -3不飽和脂肪酸的每日劑量可為200mg-2000g。實施例實施例1寡糖NF κ -B抑制活性的篩查
權利要求
1.一種包含平均聚合度D)P]為2-250糖單元的聚糖醛酸、來自米糠的阿拉伯糖基木聚糖、來自面包酵母的β -葡聚糖、D-核糖或其混合物的組合物用于制造抑制患有病毒性疾病的哺乳動物中的病毒復制的組合物的用途。
2.權利要求1的用途，所述聚糖醛酸包含果膠水解產物。
3.權利要求2的用途，所述果膠水解產物為二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸和/或聚半乳糖醛酸的形式或者所述果膠水解產物包含二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸和/或聚半乳糖醛酸。
4.前述權利要求任一項的用途，其中所述病毒性疾病選自AIDS、HIV感染和巨細胞病毒感染、腺病毒感染、普通感冒(鼻病毒)、登革熱、腸病毒感染、肝炎(A、B、C)、單純皰疹和流感(流感病毒)。
5.權利要求4的用途，其中所述病毒性疾病選自AIDS、HIV感染和巨細胞病毒感染。
6.前述權利要求任一項的用途，還包含選自胱氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸鹽、N-乙酰半胱氨酸和二乙酰半胱氨酸的半胱氨酸源。
7.前述權利要求任一項的用途，還包含ω-3多不飽和脂肪酸。
8.權利要求7的用途，至少包含二十碳五烯酸(EPA)。
9.前述權利要求任一項的用途，其中將抗病毒藥物共給藥。
10.一種營養(yǎng)組合物，包含至少20en%的蛋白、至少5en%的脂肪，以及以所述組合物的干重計至少10wt%的至少一種碳水化合物，所述碳水化合物選自平均聚合度[DP]為 2-250糖單元的聚糖醛酸、來自米糠的阿拉伯糖基木聚糖、來自面包酵母的β -葡聚糖和 D-核糖。
11.權利要求10的營養(yǎng)組合物，還包含至少一種選自胱氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸鹽、 N-乙酰半胱氨酸和二乙酰半胱氨酸的半胱氨酸等價物。
12.權利要求10或11的營養(yǎng)組合物，所述聚糖醛酸包含果膠水解產物。
13.權利要求12的營養(yǎng)組合物，所述果膠水解產物為二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸和/ 或聚半乳糖醛酸的形式或者所述果膠水解產物包含二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸和/或聚半乳糖醛酸。
14.權利要求10-13任一項的營養(yǎng)組合物，還包含ω-3多不飽和脂肪酸。
15.權利要求14所述的營養(yǎng)組合物，至少包含二十碳五烯酸(EPA)。
16.權利要求10-15任一項的營養(yǎng)組合物，還包含抗病毒藥物。
17.一種包含平均聚合度為2-250糖單元的聚糖醛酸、來自米糠的阿拉伯糖基木聚糖、 來自面包酵母的葡聚糖、D-核糖或其混合物的組合物，用于抑制患有病毒性疾病的哺乳動物中的病毒復制。
全文摘要
本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)特定寡糖能夠通過抑制NF-κB活化而抑制病毒復制。本發(fā)明因此涉及一種用于抑制患有病毒性疾病的哺乳動物中的病毒復制的組合物，所述組合物包含果膠(以二半乳糖醛酸、三半乳糖醛酸、聚半乳糖醛酸的形式)、來自米糠的阿拉伯糖基木聚糖、來自面包酵母的β-葡聚糖、D-核糖或其混合物。
文檔編號A61K31/732GK102481460SQ201080036643
公開日2012年5月30日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權日2009年6月19日
發(fā)明者B·波考特, B·范特蘭德博塔拜爾, F·J·迪克, K·范諾仁 申請人:N.V. 努特里奇亞