專利名稱：抗-Siglec-15抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用作骨代謝異常的治療劑和/或預(yù)防劑的物質(zhì)以及治療和/或預(yù)防骨代謝異常的方法。
背景技術(shù)：
已知骨骼為動(dòng)態(tài)性器官，其通過重復(fù)形成和吸收，進(jìn)行持續(xù)重建，從而改變其本身的形態(tài)并維持血鈣水平。健康的骨骼維持由成骨細(xì)胞進(jìn)行的骨形成和由破骨細(xì)胞進(jìn)行的骨吸收之間的平衡關(guān)系，從而骨量保持恒定。然而，當(dāng)骨形成和骨吸收之間的平衡被破壞時(shí)，則產(chǎn)生諸如骨質(zhì)疏松癥等骨代謝異常(W0 07/093042和Endocrinological Review, (1992) 13，第 66-80 頁)。作為調(diào)節(jié)骨代謝的因子，報(bào)道了很多全身性激素以及局部性細(xì)胞因子，且這些因子互相合作以形成和維持骨(W0 07/093042和Endocrinological Review, (1996) 17，第 308-332頁)。作為因老齡化導(dǎo)致的骨組織的變化，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病眾所周知，但是其發(fā)病機(jī)理包含各種因素，如性激素的分泌降低以及該激素受體異常、骨局部細(xì)胞因子表達(dá)變動(dòng)、老化基因的表達(dá)、破骨細(xì)胞或成骨細(xì)胞的分化衰退或功能不全，因此，難以將它理解為單純的年齡相關(guān)的生理現(xiàn)象。原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥主要分為由雌激素分泌降低導(dǎo)致的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和由老齡化導(dǎo)致的老年性骨質(zhì)疏松癥，為了闡明其發(fā)病機(jī)理和開發(fā)針對(duì)它的治療劑，在骨形成和骨吸收的調(diào)節(jié)機(jī)制方面的基礎(chǔ)研究的進(jìn)展很重要。破骨細(xì)胞是源自造血干細(xì)胞的多核細(xì)胞，通過在破骨細(xì)胞粘附的骨表面上釋放氯離子和氫離子，破骨細(xì)胞使骨表面與破骨細(xì)胞之間的間隙成為酸性，并且還分泌作為酸性蛋白酶的組織蛋白酶K 等(American Journal of Physiology, (1991) 260, C1315-C1324)。這引發(fā)磷酸鈣的降解、酸性蛋白酶的活化以及骨基質(zhì)蛋白的降解，導(dǎo)致骨吸收。業(yè)已發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞通過存在于骨表面上的成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)的RNAKL (NF-κ B配體的受體活化因子)的刺激，分化為破骨細(xì)胞(Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998)95， 第3597-3602頁，和Cell, (1998) 93，第165-176頁)。已發(fā)現(xiàn)RNAKL是成骨細(xì)胞/基質(zhì)細(xì)胞所產(chǎn)生的膜蛋白，其表達(dá)受骨吸收因子的調(diào)節(jié)，RNAKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞向成熟的多核破骨細(xì)胞的分化等(Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998) 95，第 3597—3602 頁，禾口 Journal of Bone and Mineral Research, (199幻23，S222)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)敲除RNAKL的小鼠發(fā)生(develop)骨硬化病樣疾病，因此，已經(jīng)證明RNAKL是生理性的破骨細(xì)胞分化誘導(dǎo)因子(Nature，(1999) 397，第 315-323 頁)。使用二膦酸鹽、活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、PTH和鈣制劑等作為治療骨代謝疾病或縮短治療時(shí)間的藥物制劑。但是，這些藥物不會(huì)總是表現(xiàn)出令人滿意的治療效果，已經(jīng)需要開發(fā)具有更有效的治療效果的藥物。免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜上被多種聚糖(諸如唾液酸化的聚糖)高度覆蓋，所述聚糖被各種聚糖結(jié)合蛋白識(shí)別。結(jié)合唾液酸的免疫球蛋白樣凝集素(在下文中稱為“Siglecs”)為識(shí)別并結(jié)合唾液酸化的聚糖的I型膜蛋白家族。許多siglecs在免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜上表達(dá)，并識(shí)別類似地存在于免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜上的唾液酸，調(diào)節(jié)細(xì)胞相互作用或細(xì)胞功能，并被認(rèn)為參與免疫應(yīng)答(Nature Reviews Immunology, (2007) 7，第 255-266 頁)。然而， 也有很多尚未闡明其生理功能的siglec分子。最近報(bào)道Siglec-15 (結(jié)合唾液酸的免疫球蛋白樣凝集素15)為屬于Siglecs的分子(參見，例如，非專利文件10)，其與被稱為 ⑶33L3 (⑶33分子樣3)的分子相同。該分子從魚類到人類是進(jìn)化高度保守的，業(yè)已發(fā)現(xiàn)在人脾和淋巴結(jié)的樹突細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)。此外，使用唾液酸探針的結(jié)合測(cè)試的結(jié)果是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人Siglec-15結(jié)合Neu5Ac α 2_6GalNAc，小鼠Siglec-15進(jìn)一步結(jié)合 Neu5Ac α 2_3Gal β l_4Glc 等(參見，例如，Glycobiology, (2007) 17，第 838-846 頁)。 直至最近，還未揭示Siglec-15的生理作用，但業(yè)已報(bào)道，隨著破骨細(xì)胞的分化和成熟， Siglec-15的表達(dá)增加，通過用RNA干擾使Siglec-15的表達(dá)下降，可以抑制破骨細(xì)胞的分化(參見，例如，WO 07/093042)。此外，在WO 09/48072 (2009年4月16日公開)中已經(jīng)首次披露了抗-Siglec-15抗體對(duì)破骨細(xì)胞分化的作用，但是，尚未闡明可以施用給人類的抗體序列。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題
本發(fā)明的目的在于提供在各種形式的骨代謝異常(可見為骨質(zhì)疏松癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、癌的骨轉(zhuǎn)移等)中特異表達(dá)的基因；抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟及其活性的物質(zhì)；以及骨代謝異常的治療劑和/或預(yù)防劑。解決問題的手段
為了找到對(duì)骨代謝異常具有治療和/或預(yù)防效果的物質(zhì)，本發(fā)明人以闡明破骨細(xì)胞的分化、成熟和活化機(jī)制為目標(biāo)進(jìn)行了研究。結(jié)果本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)隨著破骨細(xì)胞的分化和成熟， Siglec-15基因的表達(dá)增加，還發(fā)現(xiàn)特異性地結(jié)合Siglec-15的抗體可以抑制破骨細(xì)胞的分化。此外，發(fā)明人人源化了得到的大鼠抗-小鼠Siglec-15抗體從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明包括以下發(fā)明。(1) 一種抗體或所述抗體的功能片段，所述抗體結(jié)合包含由SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基39-165的多肽，并抑制破骨細(xì)胞形成和/或破骨性骨吸收。(2)根據(jù)(1)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于
重鏈序列含有具有⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3的可變區(qū)，且所述⑶RHl包含由SEQ ID NO: 44表示的氨基酸序列，所述⑶RH2包含由SEQ ID NO: 45和SEQ ID N0: 97表示的任一個(gè)氨基酸序列，所述⑶RH3包含由SEQ ID N0: 46表示的氨基酸序列；且
輕鏈序列含有具有⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3的可變區(qū)，且所述⑶RLl包含由SEQ ID N0: 47表示的氨基酸序列，所述⑶RL2包含由SEQ ID NO 48表示的氨基酸序列，且所述⑶RL3 包含由SEQ ID N0: 49表示的氨基酸序列。(3)根據(jù)(2)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有包含由SEQID NO: 41表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和包含由SEQ ID NO: 43表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-132的輕鏈可變區(qū)序列。(4)根據(jù)(1)至(3)中任一項(xiàng)所述的抗體功能片段，其選自Fab、F(ab，)2, Fab' 禾口 Fv0(5)根據(jù)⑴至(3)中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于是scFv。(6)根據(jù)(1)至中任一項(xiàng)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于所述抗體是嵌合抗體。(7)根據(jù)(6)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID NO: 41表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-470，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID NO: 43表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-237。(8)根據(jù)(1)至(4)和(6)中任一項(xiàng)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于所述抗體是人源化的。(9)根據(jù)(7)或⑶所述的抗體，其中所述重鏈具有人免疫球蛋白G2重鏈的恒定區(qū)，且所述輕鏈具有人免疫球蛋白κ輕鏈的恒定區(qū)。(10) 一種抑制破骨細(xì)胞形成和/或破骨性骨吸收的抗體或所述抗體的功能片段，其中所述抗體含有
(a)選自下述氨基酸序列的重鏈可變區(qū)
al) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 51表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 20-140 ；
a2) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 53表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 20-140 ；
a3) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 55表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 20-140 ；
a4) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 57表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 20-140 ；
a5) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 59表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 20-140 ；
a6) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 99表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 20-140 ；
a7) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 101表示的氨基酸序列的氨基酸殘基
20-140；
a8) 一種氨基酸序列，其與選自al)至a7)的任一個(gè)氨基酸序列具有至少95%同源性； a9) 一種氨基酸序列，其與選自al)至a7)的任一個(gè)氨基酸序列具有至少99%同源性；
和
alO) 一種氨基酸序列，其包含在選自al)至a7)的任一個(gè)氨基酸序列中的一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的置換、刪除或添加；和
(b)選自下述氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)
bl) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 61表示的氨基酸序列的氨基酸殘基
21-133；b2) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 63表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 21-133 ；
b3) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 65表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 21-133 ；
b4) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 67表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 21-132 ；
b5) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 69表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 21-133 ；
b6) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 21-133 ；
b7) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 103表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 21-133 ；
b8) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 105表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 21-133 ；
b9) 一種氨基酸序列，其與選自bl)至a8)的任一個(gè)氨基酸序列具有至少95%同源性； blO) 一種氨基酸序列，其與選自bl)至b8)的任一個(gè)氨基酸序列具有至少99%同源性；和
bll) 一種氨基酸序列，其包含在選自bl)至b8)的任一個(gè)氨基酸序列中的一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的置換、刪除或添加。(11)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 51表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 61表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。(12)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 53表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 63表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。(13)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 55表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 65表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。(14)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 55表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 67表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。
(15)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 57表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 69表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。(16)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 59表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 71表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。(17)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 99表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 69表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。(18)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 101表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 69表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。(19)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 99表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 103表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。(20)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 99表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 105表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。(21)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID N0: 51表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-470，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 61表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。(22)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID N0: 53表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-470，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 63表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。(23)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID N0: 55表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-470，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 65表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。
(24)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID NO: 55表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-470，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID NO: 67表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-237。(25)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID NO: 57表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-470，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID NO: 69表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。(26)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID NO: 59表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-470，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 71表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。(27)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID N0: 99表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 69表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。(28)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID N0: 101表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466， 且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 69表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。(29)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID N0: 99表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 103表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。(30)根據(jù)(10)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID N0: 99表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 105表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。(31) 一種藥物組合物，其特征在于包含至少一種根據(jù)(1)至(30)所述的抗體或所述抗體的功能片段。(32)根據(jù)(31)所述的藥物組合物，其特征在于是骨代謝異常的治療劑和/或預(yù)防劑。(33) 一種用于治療和/或預(yù)防骨代謝異常的藥物組合物，其特征在于包含至少一種根據(jù)(1)至(30)所述的抗體或所述抗體的功能片段和至少一個(gè)選自下述的成員二膦酸鹽、活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺激素)、非甾體類抗炎藥、可溶性TNF受體、抗-TNF-α抗體或所述抗體的功能片段、抗-PTHrP (甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白)抗體或所述抗體的功能片段、IL-I受體拮抗劑、抗-IL-6受體抗體或所述抗體的功能片段、抗-RANKL抗體或所述抗體的功能片段以及OCIF (破骨細(xì)胞生成抑制因子)。(34)根據(jù)(3 或(3 所述的藥物組合物，其中所述骨代謝異常選自骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤或癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞、巨細(xì)胞瘤、骨質(zhì)減少、牙周炎導(dǎo)致的牙缺失、人工關(guān)節(jié)周圍的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破壞、骨佩吉特病、腎性骨營養(yǎng)不良和成骨不全。(35)根據(jù)(34)所述的藥物組合物，其特征在于所述骨代謝異常是骨質(zhì)疏松癥、 伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、或伴隨癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞。(36)根據(jù)(3 所述的藥物組合物，其特征在于所述骨代謝異常是骨質(zhì)疏松癥。
(37)根據(jù)(36)所述的藥物組合物，其特征在于所述骨質(zhì)疏松癥是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用諸如類固醇或免疫抑制劑等治療劑導(dǎo)致的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。(38) 一種治療和/或預(yù)防骨代謝異常的方法，其特征在于施用至少一種根據(jù)(1) 至(30)所述的抗體或所述抗體的功能片段。(39) 一種治療和/或預(yù)防骨代謝異常的方法，其特征在于同時(shí)或相繼施用至少一種根據(jù)(1)至(30)所述的抗體或所述抗體的功能片段和至少一個(gè)選自下述的成員二膦酸鹽、活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺激素)、非甾體類抗炎藥、可溶性TNF受體、抗-TNF-α抗體或所述抗體的功能片段、抗-PTHrP (甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白)抗體或所述抗體的功能片段、IL-I受體拮抗劑、抗-IL-6受體抗體或所述抗體的功能片段、抗-RANKL抗體或所述抗體的功能片段以及OCIF (破骨細(xì)胞生成抑制因子)。(40)根據(jù)(38)或(39)所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述骨代謝異常是骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、或伴隨癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞。(41)根據(jù)00)所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述骨代謝異常是骨質(zhì)疏松癥。(42)根據(jù)所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述骨質(zhì)疏松癥是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用諸如類固醇或免疫抑制劑等治療劑導(dǎo)致的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。(43) 一種多核苷酸，其編碼根據(jù)(3)、(7)和(10)至(30)中任一項(xiàng)所述的抗體。(44)根據(jù)G3)所述的多核苷酸，其特征在于含有包含由SEQ ID NO: 40表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列，和包含由SEQ ID NO: 42表示的核苷酸序列的核苷酸61-396的核苷酸序列。(45)根據(jù)G4)所述的多核苷酸，其特征在于含有包含由SEQ ID NO: 40表示的核苷酸序列的核苷酸58-1410的核苷酸序列，和包含由SEQ ID NO: 42表示的核苷酸序列的核苷酸61-711的核苷酸序列。(46)根據(jù)03)所述的多核苷酸，其特征在于含有
(a)一種多核苷酸，其選自下述的核苷酸序列al)一種核苷丨酸序列，其包含由SEQ ID NO50表示的核苷酸？序列的核苷酸58--420 ；a2)一種核苷丨酸序列，其包含由SEQ ID NO52表示的核苷酸？序列的核苷酸58--420 ；a3)一種核苷丨酸序列，其包含由SEQ ID NO54表示的核苷酸？序列的核苷酸58--420 ；a4)一種核苷丨酸序列，其包含由SEQ ID NO56表示的核苷酸？序列的核苷酸58--420 ；a5)一種核苷丨酸序列，其包含由SEQ ID NO58表示的核苷酸？序列的核苷酸58--420 ；a6)一種核苷丨酸序列，其包含由SEQ ID NO98表示的核苷酸？序列的核苷酸58--420 ；a7)一種核苷丨酸序列，其包含由SEQ ID NO100表示的核苷丨酸序列的核苷環(huán)i58-420a8)多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷醛；在嚴(yán)格條件下與包含選自al)至a7)的任
一個(gè)核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列的多核苷酸雜交；和
a9) 一種核苷酸序列，其包含在選自al)至a7)的任一個(gè)核苷酸序列中的一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的置換、刪除或添加；和(b)一種多核苷酸，其選自下述的核苷酸序列bl)一種核苷 駿序列，其包含由SEQ ID NO60表示的核苷酸？序列的核苷酸.61--399 ；b2)一種核苷 駿序列，其包含由SEQ ID NO62表示的核苷酸？序列的核苷酸.61--399 ；b3)一種核苷 駿序列，其包含由SEQ ID NO64表示的核苷酸？序列的核苷酸.61--399 ；b4)一種核苷 駿序列，其包含由SEQ ID NO66表示的核苷酸？序列的核苷酸.61--396 ；b5)一種核苷 駿序列，其包含由SEQ ID NO68表示的核苷酸？序列的核苷酸.61--399 ；b6)一種核苷 駿序列，其包含由SEQ ID NO70表示的核苷酸？序列的核苷酸.61--399 ；b7)一種核苷 駿序列，其包含由SEQ ID NO102表示的核苷丨酸序列的核苷環(huán),61-399 ；b8)一種核苷 駿序列，其包含由SEQ ID NO104表示的核苷丨酸序列的核苷環(huán)_61-399 ；b9)多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷醛；在嚴(yán)格條件下與包含選自bl)至b8)的任
一個(gè)核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列的多核苷酸雜交；和
blO) 一種核苷酸序列，其包含在選自bl)至b8)的任一個(gè)核苷酸序列中的一個(gè)至幾個(gè)核苷酸的置換、刪除或添加。(47)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 50表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID NO: 60表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。(48)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 52表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID NO: 62表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。(49)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: M表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 64表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。(50)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: M表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 66表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。(51)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 56表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 68表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。(52)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 58表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 70表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。(53)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 98表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 68表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。(54)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 100表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 68表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。(55)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 98表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 102表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。(56)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 98表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID NO: 104表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。(57)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 50表示的核苷酸序列的核苷酸58-1410的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID NO: 60表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。(58)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 52表示的核苷酸序列的核苷酸58-1410的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 62表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。(59)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: M表示的核苷酸序列的核苷酸58-1410的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 64表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。(60)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: M表示的核苷酸序列的核苷酸58-1410的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 66表示的核苷酸序列的核苷酸61-711的核苷酸序列。(61)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 56表示的核苷酸序列的核苷酸58-1410的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 68表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。(62)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 58表示的核苷酸序列的核苷酸58-1410的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 70表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。(63)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 98表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 68表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。(64)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 100表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 68表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。(65)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 98表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 102表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。(66)根據(jù)06)所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 98表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 104表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。(67) 一種載體，其包含根據(jù)至(66)所述的任一種多核苷酸。(68) 一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)至(66)所述的任一種多核苷酸。(69) 一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)(67)所述的載體。(70) 一種生產(chǎn)根據(jù)(3)、(7)和(10)至(30)中任一項(xiàng)所述的抗體的方法，所述方法包括培養(yǎng)根據(jù)(68)或(69)所述的宿主細(xì)胞，并從得到的培養(yǎng)產(chǎn)物純化抗體。
發(fā)明優(yōu)點(diǎn)
根據(jù)本發(fā)明，可以得到骨代謝異常的治療劑和/或預(yù)防劑，其作用機(jī)制是抑制破骨細(xì)胞的分化和成熟及其骨吸收活性。


圖1顯示了通過SDS-聚丙烯酰胺電泳和銀染色評(píng)估用HisTrap HP柱色譜法和 Resource Q柱色譜法純化的小鼠Siglec-15-His純度的結(jié)果。圖2顯示了通過SDS-聚丙烯酰胺電泳和使用抗-V5-HRP抗體的蛋白印跡法檢測(cè)用HisTrap HP柱色譜法和Resource Q柱色譜法純化的小鼠Siglec-15-His特征的結(jié)果。圖3顯示了通過SDS-聚丙烯酰胺電泳和銀染色評(píng)估用HiTrap蛋白A柱色譜法純化的小鼠Siglec-15-Fc純度的結(jié)果。圖4顯示了通過ELISA法測(cè)試大鼠抗-小鼠Siglec-15單克隆抗體結(jié)合其上固定有小鼠Siglec-15-Fc的板的結(jié)果。符號(hào)( )表示#1A1抗體，符號(hào)(■)表示#3A1抗體，符號(hào)(▲)表示#8A1抗體，符號(hào)(X)表示#24A1抗體，符號(hào)(·)表示#32A1抗體，符號(hào)(〇)表示#34A1抗體，符號(hào)(+)表示#39A1抗體，符號(hào)(_)表示#40A1抗體，符號(hào)(一) 表示#41B1抗體，符號(hào)( )表示#61A1抗體，且符號(hào)(口)表示對(duì)照IgG。圖5顯示了測(cè)試添加大鼠抗-小鼠Siglec-15單克隆抗體(#3A1、#8A1或#32A1) 對(duì)小鼠骨髓非貼壁細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化(用RANKL刺激)的影響的結(jié)果。此外，圖中大鼠對(duì)照IgG是圖5和6共有的陰性對(duì)照。圖6顯示了測(cè)試添加大鼠抗-小鼠Siglec-15單克隆抗體(#34A1、#39A1或 #40A1)對(duì)小鼠骨髓非貼壁細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化(用RANKL刺激)的影響的結(jié)果。此外，圖中兔抗-小鼠Siglec-15多克隆抗體No. 3是圖5和6共有的陽性對(duì)照。圖7顯示了通過SDS-聚丙烯酰胺電泳和銀染色評(píng)價(jià)用HisTrap HP柱色譜法和 Resource Q柱色譜法純化的人Siglec-15-His純度的結(jié)果。圖8顯示了通過SDS-聚丙烯酰胺電泳評(píng)價(jià)用蛋白A柱色譜法純化的人 Siglec-15-Fc純度的結(jié)果。圖9顯示了通過ELISA法測(cè)試大鼠抗-小鼠Siglec-15單克隆抗體結(jié)合其上固定有人Siglec-15-Fc的板的結(jié)果。符號(hào)( )表示#1A1抗體，符號(hào)(■)表示#3A1抗體， 符號(hào)(▲)表示#8A1抗體，符號(hào)(X)表示#24A1抗體，符號(hào)(·)表示#32A1抗體，符號(hào) (〇)表示#34A1抗體，符號(hào)(+)表示#39A1抗體，符號(hào)(_)表示#40A1抗體，符號(hào)(一)表示#41B1抗體，符號(hào)( )表示#61A1抗體，且符號(hào)(口)表示對(duì)照IgG。圖10顯示了通過TRAP染色描繪的通過添加大鼠抗-小鼠Siglec-15單克隆抗體抑制從正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞形成巨大破骨細(xì)胞的顯微照片。圖11顯示了通過TRAP染色描繪的通過添加大鼠抗-小鼠Siglec-15單克隆抗體(#32A1抗體)抑制從正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞形成巨大破骨細(xì)胞的顯微照片。圖12的圖顯示了通過添加大鼠抗-小鼠Siglec-15單克隆抗體(#32A1抗體)抑制正常人破骨細(xì)胞的骨吸收活性(N=6)。圖13A的圖顯示了當(dāng)將大鼠抗-小鼠Siglec-15單克隆抗體施用給卵巢切除的大鼠4周時(shí)，增加腰椎骨礦物質(zhì)密度的效應(yīng)；且圖13B的圖顯示了當(dāng)將大鼠抗-小鼠Siglec-15單克隆抗體施用給卵巢切除的大鼠4周時(shí)，減少尿脫氧吡啶啉排泄的效應(yīng)。圖14是通過競爭ELISA顯示大鼠抗-小鼠Siglec-15單克隆抗體#32A1結(jié)合人 Siglec-15的V-組結(jié)構(gòu)域的圖。圖15是通過競爭ELISA顯示大鼠#32A1抗體及其人嵌合抗體具有基本上相同的對(duì)小鼠Siglec-15-Fc的親和力的圖。圖16顯示了用TRAP酶活性描繪的通過添加大鼠抗-小鼠Siglec-15單克隆抗體(#32A1抗體)及其嵌合抗體抑制小鼠破骨細(xì)胞形成的圖(N=3)。圖17顯示了通過TRAP染色描繪的通過添加大鼠抗-小鼠Siglec-15單克隆抗體#32A1的人嵌合抗體抑制從正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞形成巨大破骨細(xì)胞的顯微照片。圖18是這樣的圖，其中使用其上面固定化有小鼠Siglec-15-Fc的板通過ELISA 法證實(shí)了 6類人源化的大鼠抗-小鼠Siglec-15抗體以抗體濃度依賴性的方式結(jié)合小鼠 Siglec-15 蛋白。圖19是這樣的圖，其中使用其上面固定化有人Siglec-15-Fc的板通過ELISA 法證實(shí)了 6類人源化的大鼠抗-小鼠Siglec-15抗體以抗體濃度依賴性的方式結(jié)合人 Siglec-15 蛋白。圖20顯示了通過TRAP染色描繪的通過添加大鼠抗-小鼠Siglec-15單克隆抗體(#32A1抗體)或其嵌合抗體抑制在TNFa刺激下形成小鼠巨大破骨細(xì)胞的顯微照片。圖21顯示了用TRAP酶活性描繪的通過添加大鼠抗-小鼠Siglec-15單克隆抗體(#32A1抗體)或其嵌合抗體抑制在TNF α刺激下形成小鼠破骨細(xì)胞的圖(Ν=3)。圖22顯示了用TRAP酶活性描繪的通過添加大鼠抗-小鼠Siglec-15單克隆抗體(#8A1或#32A1抗體)抑制大鼠破骨細(xì)胞形成的圖(N=3)。圖23顯示了克隆的大鼠#32A1重鏈的核苷酸序列及其氨基酸序列。
圖24顯示了克隆的大鼠#32A1輕鏈的核苷酸序列及其氨基酸序列。
圖25顯示了#32A1人嵌合抗體重鏈的核苷酸序列及其氨基酸序列。
圖26顯示了#32A1人嵌合抗體輕鏈的核苷酸序列及其氨基酸序列。
圖27顯示了h#32Al-TlH 的核苷·脧序列及其氨基酉I序列。
圖28顯示了h#32Al-T2H 的核苷·脧序列及其氨基酉I序列。
圖29顯示了h#32Al-T3H 的核苷·脧序列及其氨基酉I序列。
圖30顯示了h#32Al-T5H 的核苷!脧序列及其氨基酉I序列。
圖31顯示了h#32Al-T6H 的核苷!脧序列及其氨基酉I序列。
圖32顯示了h#32Al-TlL 的核苷·脧序列及其氨基酉I序列。
圖33顯示了h#32Al-T2L 的核苷·脧序列及其氨基酉I序列。
圖34顯示了h#32Al-T3L 的核苷·脧序列及其氨基酉I序列。
圖35顯示了h#32Al-T4L 的核苷!脧序列及其氨基酉I序列。
圖36顯示了h#32Al-T5L 的核苷·脧序列及其氨基酉I序列。
圖37顯示了h#32Al-T6L 的核苷!脧序列及其氨基酉I序列。
圖38顯示了h#32Al-T7H、h#32Al_T8H 和 h#32Al_T9H 的氨基I酸序列。
圖39顯示了h#32Al-T10H、h#32Al_Tl IH 和 h#32Al_T12H 的氨基酸序列。
圖40顯示了 h#32Al-T7L、h#32Al-T8L、h#32Al-T9L、h#32Al-T10L 和 h#32Al的氨基酸序列。圖 41 顯示了 h#32Al-T12L、h#32Al-T13L、h#32Al-T14L、h#32Al-T15L 和 h#32Al-T16L的氨基酸序列。圖 42 顯示了 h#32Al-T17L、h#32Al-T18L、h#32Al-T19L、h#32Al-T20L 和 h#32Al-T21L的氨基酸序列。圖 43 顯示了 h#32Al-T22L、h#32Al-T23L、h#32Al-T24L 和 h#32Al_T25L 的氨基酸序列。圖44顯示了用TRAP酶活性描繪的通過添加人源化的大鼠抗-小鼠Siglec-15 抗體(h#32Al-Tl、h#32Al-T2或h#32Al-T;3)抑制小鼠破骨細(xì)胞形成的圖。此外，圖中大鼠 #32A1抗體是圖44和45共有的陽性對(duì)照。圖45顯示了用TRAP酶活性描繪的通過添加人源化的大鼠抗-小鼠Siglec-15抗體(h#32Al-T4、h#32Al-T5或h#32Al-T6)抑制小鼠破骨細(xì)胞形成的圖。圖46顯示了用TRAP酶活性描繪的通過添加人源化的大鼠抗-小鼠Siglec-15抗體(h#32Al-Hl-l/L5或h#32Al-H5/L5)抑制小鼠破骨細(xì)胞形成的圖。此外，圖中大鼠#32A1 抗體和#32A1人嵌合抗體是圖46和47共有的陽性對(duì)照。圖47顯示了用TRAP酶活性描繪的通過添加人源化的大鼠抗-小鼠Siglec-15抗體(h#32Al-Hl-l/L2-16或h#32Al-H-l/L2-15)抑制小鼠破骨細(xì)胞形成的圖。圖48顯示的圖描繪了通過添加人源化的大鼠抗-小鼠Siglec-15抗體 (h#32Al-Tl、h#32Al-T2、h#32Al-T3、h#32Al-T4、h#32Al-T5 或 h#32Al_T6)抑制正常人破骨細(xì)胞的骨吸收活性。此外，圖中大鼠#32A1抗體和#32A1人嵌合抗體是圖48和49共有的陽性對(duì)照。圖49顯示的圖描繪了通過添加人源化的大鼠抗-小鼠Siglec-15抗體 (h#32Al-Hl-l/L5、h#32Al-H5/L5、h#32Al-Hl-l/L2-16 或 h#32Al-Hl-l/L12_5)抑制正常人破骨細(xì)胞的骨吸收活性。圖50是為了測(cè)定h#32Al_H5/L5抗體的熱穩(wěn)定性而得到的熱分析圖。圖51是為了測(cè)定h#32Al-Hl_l/L5抗體的熱穩(wěn)定性而得到的熱分析圖。圖52是為了測(cè)定h#32Al-Hl-l/L12_5抗體的熱穩(wěn)定性而得到的熱分析圖。圖53是為了測(cè)定h#32Al-Hl-l/L2_16抗體的熱穩(wěn)定性而得到的熱分析圖。圖M顯示了 h#32Al-Hl_l的核苷酸序列及其氨基酸序列。圖55顯示了 h#32Al_H5的核苷酸序列及其氨基酸序列。圖56顯示了 h#32Al-L2_15的核苷酸序列及其氨基酸序列。圖57顯示了 h#32Al-L2_16的核苷酸序列及其氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式本文使用的術(shù)語“基因”不僅包括DNA，還包括mRNA、cDNA以及cRNA。本文使用的術(shù)語“多核苷酸”用于與核酸相同的含義，并且還包括DNA、RNA、探針、 寡核苷酸以及引物。 本文使用的術(shù)語“多肽”和“蛋白，，無區(qū)別使用。
本文使用的術(shù)語“RNA級(jí)分”是指包含RNA的級(jí)分。
本文使用的術(shù)語“細(xì)胞”也包括動(dòng)物個(gè)體內(nèi)的細(xì)胞和培養(yǎng)的細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“Siglec-15”以與“Siglec-15蛋白”相同的含義使用。本文使用的術(shù)語“破骨細(xì)胞形成”以與“破骨細(xì)胞分化”或“破骨細(xì)胞成熟”相同的含義使用。本文使用的術(shù)語“抗體功能片段”是指具有抗原結(jié)合活性的抗體的一部分片段，包括Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、雙特異抗體、線性抗體、從抗體片段形成的多特異性抗體等。該術(shù)語也包括Fab’，其為在還原條件下處理F(ab’)2得到的抗體的可變區(qū)的單價(jià)片段。但是，該術(shù)語不限于這些分子，只要所述片段具有與抗原的結(jié)合親和力。此外，這些功能片段不僅包括用適當(dāng)?shù)拿柑幚砜贵w蛋白的全長分子得到的片段，還包括使用遺傳修飾的抗體基因在適當(dāng)宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白。本文使用的術(shù)語“表位”是指特定的抗-Siglec-15抗體結(jié)合的Siglec-15的部分肽或部分三級(jí)結(jié)構(gòu)。通過諸如免疫測(cè)定法等本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法，可以確定作為 Siglec-15的部分肽的上述表位。但是，例如，可以采用以下的方法。制備Siglec-15的各種部分結(jié)構(gòu)。在制備部分結(jié)構(gòu)時(shí)，可使用已知的寡肽合成技術(shù)。例如，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的基因重組技術(shù)，制備從Siglec-15的C末端或N末端順次縮短所得到的具有適當(dāng)?shù)目s短長度的一系列多肽。此后，檢測(cè)這些多肽的抗體的反應(yīng)性，并粗略確定識(shí)別部位。然后， 合成長度更短的肽，并檢測(cè)與這些肽的反應(yīng)性，由此可確定表位。此外，通過χ-射線結(jié)構(gòu)分析描述鄰近抗體的Siglec-15的氨基酸殘基，可以確定作為Siglec-15的部分三級(jí)結(jié)構(gòu)的表位(其結(jié)合特定的Siglec-15抗體)。如果第二抗-Siglec-15抗體結(jié)合第一抗-Siglec-15 抗體所結(jié)合的部分肽或部分三級(jí)結(jié)構(gòu)，可以確定第一抗體與第二抗體具有相同的表位。此外，通過證實(shí)第二抗-Siglec-15抗體與第一抗-Siglec-15抗體競爭結(jié)合Siglec-15 (即第二抗體抑制Siglec-15和第一抗體之間的結(jié)合)，可以確定第一抗體和第二抗體具有相同的表位，即使尚未確定特定表位的序列或結(jié)構(gòu)。此外，當(dāng)?shù)谝豢贵w和第二抗體結(jié)合相同的表位，且第一抗體具有諸如抗原中和活性等特殊效應(yīng)時(shí)，可以預(yù)期第二抗體具有相同的活性。已知抗體分子的每個(gè)重鏈和輕鏈具有3個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(⑶R)?；パa(bǔ)性決定區(qū)也稱作超變結(jié)構(gòu)域，且存在于抗體的每個(gè)重鏈和輕鏈的可變區(qū)中。它是在它的一級(jí)結(jié)構(gòu)中具有非常高的可變性的位點(diǎn)，且在每個(gè)重和輕多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)中存在3個(gè)單獨(dú)的CDR。在本說明書中，關(guān)于抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)，重鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)由來自重鏈氨基酸序列的氨基端側(cè)的CDRH1、CDRH2和CDRH3表示，輕鏈的互補(bǔ)性決定區(qū)由來自輕鏈氨基酸序列的氨基端側(cè)的⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3表示。這些位點(diǎn)在三級(jí)結(jié)構(gòu)中彼此鄰近，決定了抗體結(jié)合的抗原的特異性。本文使用的短語“在嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交”是指在可實(shí)現(xiàn)鑒定的條件下進(jìn)行雜交， 其中在市售的的雜交溶液ExpressHyb雜交溶液(由Clontech，he.生產(chǎn))中，在68 °〇進(jìn)行雜交，或者使用其上固定有DNA的濾器，在0.7-1. OM NaCl存在下，在68°C進(jìn)行雜交，然后使用0. 1-2X的SSC溶液(1 χ SSC溶液由150 mM NaCl和15 mM檸檬酸鈉組成)在68°C 進(jìn)行洗滌，或在與其等同的條件下雜交。1. Siglec-15
本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Siglec-15基因在巨細(xì)胞瘤中特異性表達(dá)，還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)當(dāng)單核細(xì)胞-衍生的細(xì)胞系分化為破骨細(xì)胞時(shí)，Siglec-15基因的表達(dá)水平增加。
關(guān)于在本發(fā)明中所使用的Siglec-15，Siglec-15直接地從人、非人哺乳動(dòng)物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、兔、豬、綿羊、?；蚝?或雞的單核細(xì)胞或骨髓細(xì)胞純化和使用，或者制備上述細(xì)胞的細(xì)胞膜級(jí)分和使用。此外，通過體外合成Siglec-15或通過基因工程使其在宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，可以得到Siglec-15。具體地，在基因工程生產(chǎn)中，將Siglec-15 cDNA整合到能表達(dá)Siglec-15 cDNA的載體中，然后在含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的酶、底物和能量物質(zhì)的溶液中合成Siglec-15，或者轉(zhuǎn)化另一種原核或真核宿主細(xì)胞，以表達(dá)Siglec-15，由此可得到該蛋白。人Siglec-15 cDNA的核苷酸序列以登錄號(hào)NM_213602登記在GenBank中，并表示為序列表的SEQ ID NO: 1，其氨基酸序列以序列表的SEQ ID N0:2表示。小鼠Siglec-15 cDNA的核苷酸序列以登錄號(hào)XM_884636登記在GenBank中，并表示為序列表的SEQ ID N0:3，其氨基酸序列以序列表的SEQ ID N0:4表示。已經(jīng)去除了信號(hào)序列的成熟的人 Siglec-15對(duì)應(yīng)著包含由SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-3 的氨基酸序列。此外，已經(jīng)去除了信號(hào)序列的小鼠Siglec-15對(duì)應(yīng)著包含由SEQ ID NO: 4表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-341的氨基酸序列。此外，Siglec-15有時(shí)被稱為⑶33抗原-樣 3、⑶33分子-樣3、⑶33-樣3或⑶33L3，這些都表示相同的分子?？梢匀缦碌玫絊iglec-15 cDNA 通過例如所謂的PCR方法，其中使用表達(dá) Siglec-15 cDNA的cDNA文庫作為模板，并使用特異性擴(kuò)增Siglec-15 cDNA的引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(在下文中稱作“PCR”)(Saiki, R. K.,等人，kience，(1988) 239， 487-49)。此外，具有下述特征的多核苷酸也視作Siglec-15 cDNA 它在嚴(yán)格條件下與包含至少一個(gè)選自序列表中的SEQ ID NO: 1和3所表示的核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列的多核苷酸雜交，并且編碼具有與Siglec-15相當(dāng)?shù)纳锘钚缘牡鞍?。此外，具有下述特征的多核苷酸也視作Siglec-15 cDNA 它是從人或小鼠Siglec-15基因座轉(zhuǎn)錄的剪接變體，或與其互補(bǔ)序列在嚴(yán)格條件下雜交，且編碼具有與Siglec-15相當(dāng)?shù)纳锘钚缘牡鞍?。此外，具有下述特征的蛋白也視作Siglec-15 它包含這樣的氨基酸序列，所述序列包含在選自序列表的SEQ ID NO: 2和4表示的氨基酸序列的至少一個(gè)氨基酸序列中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的置換、刪除或添加，或通過從這些序列中的任一個(gè)去除信號(hào)序列所得到的氨基酸序列，且具有與Siglec-15相當(dāng)?shù)纳锘钚?。此外，具有下述特征的蛋白也視作Siglec-15 它包含由從人或小鼠Siglec-15基因座轉(zhuǎn)錄的剪接變體編碼的氨基酸序列， 或包含在其中的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的置換、刪除或添加的氨基酸序列，且具有與Siglec-15 相當(dāng)?shù)纳锘钚浴?.骨代謝異常的檢測(cè)
對(duì)來自各種人骨組織的測(cè)試樣品組中的Siglec-15基因表達(dá)水平的分析顯示該基因在巨細(xì)胞瘤(GCT)中的表達(dá)水平顯著增加，所述巨細(xì)胞瘤是破骨細(xì)胞樣多核巨大細(xì)胞大量出現(xiàn)的骨腫瘤，且其特征是在臨床上發(fā)現(xiàn)骨溶解性的骨破壞(Bullough等，Atlas of Orthopedic Pathology 第 2 版， 第 17. 6-17. 8 頁，Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1992))。還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)單核細(xì)胞-衍生的細(xì)胞系分化為破骨細(xì)胞時(shí)，Siglec-15基因的表達(dá)水平增加。
因此，認(rèn)為Siglec-15與諸如GCT等其中骨吸收增加的人病理學(xué)有關(guān)。換而言之， 通過測(cè)量Siglec-15基因和/或Siglec-15在各細(xì)胞和/或各組織中的表達(dá)水平，能夠確定伴隨Siglec-15的過表達(dá)的骨代謝異常狀態(tài)。本文使用的骨代謝異常是指特征在于凈骨流失的障礙，其具體實(shí)例包括但不限于骨質(zhì)疏松癥(絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用諸如類固醇或免疫抑制劑等治療劑導(dǎo)致的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥)、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤或癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞、巨細(xì)胞瘤、骨質(zhì)減少、牙周炎導(dǎo)致的牙缺失、人工關(guān)節(jié)周圍的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破壞、骨佩吉特病、腎性骨營養(yǎng)不良和成骨不全。在本發(fā)明中，用于檢測(cè)Siglec-15基因和/或Siglec-15的表達(dá)水平的“測(cè)試樣品”是指從測(cè)試受試者得到的下述組織的樣品骨髓、骨、前列腺、精巢、陰莖、膀胱、腎臟、 口腔、咽、唇、舌、牙齦、鼻咽、食道、胃、小腸、大腸、結(jié)腸、肝臟、膽囊、胰臟、鼻、肺、軟組織、皮膚、乳房、子宮、卵巢、腦、甲狀腺、淋巴結(jié)、肌肉、脂肪組織等，或從測(cè)試受試者得到的血液、 體液、排泄物等，臨床樣本等，但是，在本發(fā)明中，更優(yōu)選血液或骨髓。關(guān)于已知與破骨細(xì)胞分化有關(guān)的RANKL，已經(jīng)生產(chǎn)了敲除的小鼠，并已經(jīng)分析了當(dāng)已經(jīng)喪失RANKL功能時(shí)的表型 Woung-Yun Kong,等人，Nature (1999) 397，第315-323 頁)。通過以與上述相同的方式生產(chǎn)缺失Siglec-15的敲除的小鼠，可以分析當(dāng)已經(jīng)喪失 Siglec-15功能時(shí)的表型。3.抗-Siglec-15抗體的制備
可以如下獲得本發(fā)明的抗Siglec-15的抗體根據(jù)常規(guī)的方法，用Siglec-15或選自 Siglec-15的氨基酸序列的任意多肽免疫動(dòng)物，并采集和純化體內(nèi)產(chǎn)生的抗體。用作抗原的Siglec-15的生物物種不限于人，也可以用從諸如小鼠或大鼠等除人以外的動(dòng)物得到的Siglec-15免疫動(dòng)物。在這種情況下，通過測(cè)試抗體與得到的異源Siglec-15和人 Siglec-15的結(jié)合之間的交叉反應(yīng)性，可以選擇可適用于人疾病的抗體。此外，根據(jù)已知的方法(例如，Kohler和 Milstein, Nature, (1975) 256，第 495-497 頁；Kennet, R.編，Monoclonal Antibody,第 365-367 頁，Prenum Press, N. Y. (1980))，通過使生產(chǎn)抗Siglec-15抗體的抗體生產(chǎn)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，建立雜交瘤，可以得到單克隆抗體。此外，可以如下得到要用作抗原的Siglec-15 通過基因工程，使宿主細(xì)胞生產(chǎn) Siglec-15 基因。具體而言，制備能表達(dá)Siglec-15基因的載體，將得到的載體轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞中， 以表達(dá)所述基因，然后純化表達(dá)的Siglec-15。在下文中具體描述了獲得抗Siglec-15抗體的方法。(1)抗原的制備
用于制備抗-Siglec-15抗體的抗原的實(shí)例包括Siglec-15，包含含有Siglec-15的至少6個(gè)連續(xù)氨基酸的部分氨基酸序列的多肽，以及通過向其附加給定的氨基酸序列或載體而得到的衍生物。Siglec-15可從人腫瘤組織或腫瘤細(xì)胞中直接純化，并使用。此外，通過體外合成或通過基因工程造成宿主細(xì)胞生產(chǎn)Siglec-15，可以得到Siglec-15。關(guān)于基因工程，具體地，將Siglec-15 cDNA整合到能表達(dá)Siglec-15 cDNA的載體中，然后在含有轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的酶、底物和能量物質(zhì)的溶液中合成Siglec-15，或者轉(zhuǎn)化另一種原核或真核宿主細(xì)胞，以表達(dá)Siglec-15，由此可得到該抗原。此外，通過在適當(dāng)?shù)乃拗?載體系統(tǒng)中表達(dá)融合蛋白，所述融合蛋白通過將作為膜蛋白的Siglec-15的胞外結(jié)構(gòu)域連接到抗體的恒定區(qū)上而得到，也可以得到作為分泌蛋白的抗原。可以如下得到Siglec-15 cDNA 通過例如所謂的PCR方法，其中使用表達(dá) Siglec-15 cDNA的cDNA文庫作為模板，并使用特異性擴(kuò)增Siglec-15 cDNA的引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(在下文中稱作“PCR”)(參見&iiki，R. K.,等人，kience，(1988) 239，第 487-489 頁)。作為多肽的體外合成，例如可以例舉由Roche Diagnostics, Inc.生產(chǎn)的快速翻譯系統(tǒng)(RTS)，但不限于此。 原核宿主的實(shí)例包括大腸桿菌(fecAericAia coli )和枯草芽孢桿菌UaciBm subtilis)。為了用靶基因轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，使用含有復(fù)制子(即來自與所述宿主相容的物種的復(fù)制起點(diǎn))和調(diào)節(jié)序列的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。此外，所述載體優(yōu)選具有能賦予轉(zhuǎn)化細(xì)胞表型選擇性的序列。真核宿主細(xì)胞的實(shí)例包括脊椎動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和酵母細(xì)胞。作為脊椎動(dòng)物細(xì)胞經(jīng)常使用例如猿COS細(xì)胞(Gluzman，Y. , Cell, (1981) 23，第175-182頁， ATCC CRL-1650)的二氫葉酸還原酶-缺陷株(Urlaub, G.和 Chasin, L. A. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77，第 4U6-4220 頁)、鼠成纖維細(xì)胞 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658)和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞；ATCC: CCL-61)等，但是它們不限于此。根據(jù)常規(guī)方法，可以培養(yǎng)這樣得到的轉(zhuǎn)化體，并通過培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體，在細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞外生產(chǎn)靶多肽。根據(jù)使用的宿主細(xì)胞，可以從各種常用的培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)使用的合適培養(yǎng)基。 如果使用大腸桿菌，則可以使用例如根據(jù)需要在其中添加諸如氨芐西林或IPMG等抗生素的LB培養(yǎng)基。通過多種已知的分離方法中的任一種，利用蛋白的物理性質(zhì)或化學(xué)性質(zhì)，可以分離和純化通過這種培養(yǎng)由轉(zhuǎn)化體在細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞外生產(chǎn)的重組蛋白。所述方法的具體實(shí)例包括使用常規(guī)的蛋白沉淀劑進(jìn)行處理、超濾、諸如分子篩色譜法(凝膠過濾)、吸附色譜法、離子交換色譜法和親和色譜法等各類液相色譜法、透析法、 以及它們的組合。此外，通過將6組氨酸殘基標(biāo)簽連接到要表達(dá)的重組蛋白上，可以使用鎳親和柱有效地純化蛋白?；蛘?，通過將IgG Fc區(qū)連接到要表達(dá)的重組蛋白上，可以使用蛋白A柱有效地純化蛋白。通過組合上述方法，可以高產(chǎn)率、高純度地容易地制備大量靶多肽。(2)抗-Siglec-15單克隆抗體的制備
特異性地結(jié)合Siglec-15的抗體的實(shí)例包括特異性地結(jié)合Siglec-15的單克隆抗體， 該抗體的獲得方法如下所述。單克隆抗體的制備一般需要下述操作步驟 (a)純化要用作抗原的生物聚合物；(b)如下制備抗體生產(chǎn)細(xì)胞通過注射抗原來免疫動(dòng)物，采集血液，測(cè)定其抗體滴度，以確定脾摘除時(shí)間；
(C)制備骨髓瘤細(xì)胞(在下文中稱作“骨髓瘤”)；
(d)將抗體生產(chǎn)細(xì)胞和骨髓瘤融合；
(e)篩選生產(chǎn)靶抗體的雜交瘤群；
(f)將雜交瘤分成單細(xì)胞克隆(克隆化)；
(g)任選地，培養(yǎng)雜交瘤，或培育植入了雜交瘤的動(dòng)物，以制備大量單克隆抗體；
(h)檢測(cè)如此制備的單克隆抗體的生物活性及其結(jié)合特異性，或者測(cè)定它們作為標(biāo)記試劑的性質(zhì)等。在下文中，按照上述步驟對(duì)單克隆抗體的制備方法進(jìn)行詳述，但是所述方法不限于此，例如，可以使用除了脾細(xì)胞以外的抗體生產(chǎn)細(xì)胞和骨髓瘤。(a)抗原的純化
可以使用按照上述方法制備的Siglec-15或其部分肽作為抗原。此外，由表達(dá)Siglec-15的重組細(xì)胞制備的膜組分、或表達(dá)Siglec-15的重組細(xì)胞本身、以及通過本領(lǐng)城技術(shù)人員已知的方法化學(xué)合成的本發(fā)明蛋白的部分肽，也可以用作抗原。(b)抗體生產(chǎn)細(xì)胞的制備
將在步驟(a)中得到的抗原與佐劑(如弗氏完全或不完全佐劑、或硫酸鉀鋁)混合，將得到的混合物用作免疫原，免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。在已知的雜交瘤制備方法中所使用的任何動(dòng)物，可以無困難地用作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。具體而言，例如，可以使用小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。但是，從容易獲得與提取的抗體生產(chǎn)細(xì)胞融合的骨髓瘤細(xì)胞的角度考慮，優(yōu)選使用小鼠或大鼠作為被免疫的動(dòng)物。此外，要使用的小鼠和大鼠的品系沒有特別限制，在小鼠的情況下，可以使用諸如 A、AKR、BALB/c、BDP、ΒΑ、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HTU LP、NZB, NZW、RF、 R III、SJL, SWR、WB和129等不同的品系，在大鼠的情況下，可以使用例如Wistar、Low、 Lewis、Sprague> Dawley> ACI> BN> Fischer 等。這些小鼠和大鼠可從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物培育商/分銷商購得，例如，CLEA Japan, he.和 Charles River Laboratories Japan, Inc0在它們中，考慮到與下述的骨髓瘤細(xì)胞的融合相容性，特別優(yōu)選地作為被免疫的動(dòng)物的是在小鼠的情況下，BALB/c品系；在小鼠的情況下，Wistar和Low品系。此外，考慮到人和小鼠之間的抗原同源性，還優(yōu)選使用具有降低的生物功能(以除去自身抗體)的小鼠，即具有自身免疫疾病的小鼠。小鼠或大鼠在免疫時(shí)的年齡優(yōu)選為5-12周齡，更優(yōu)選6-8周齡。為了使用Siglec-15或其重組體免疫動(dòng)物，可以使用例如在下述文獻(xiàn)中詳述的已知方法例如，Weir, D. Μ. , Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987)， Kabat, Ε. A.禾口Mayer, Μ. Μ., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964)等。在這些免疫方法中，本發(fā)明優(yōu)選的具體方法例如如下所述。
即，首先，將作為抗原的膜蛋白級(jí)分或被造成表達(dá)抗原的細(xì)胞真皮內(nèi)地或腹膜內(nèi)地施用給動(dòng)物。但是，為提高免疫效率，優(yōu)選兩種施用途徑的組合，如果在前半階段進(jìn)行真皮內(nèi)施用，則在后半階段或只在最后一次給藥時(shí)進(jìn)行腹膜內(nèi)施用，可以特別提高免疫效率。抗原的施用計(jì)劃隨被免疫動(dòng)物的種類、個(gè)體差異等而異。但是，一般而言，優(yōu)選的施用計(jì)劃是這樣的，其中抗原的施用頻率是3-6次，且給藥間隔是2-6周；更優(yōu)選的施用計(jì)劃是這樣的，其中抗原的施用頻率是3-4次，且給藥間隔是2-4周。此外，抗原劑量隨被免疫動(dòng)物的種類、個(gè)體差異等而異。但是，劑量通常設(shè)定為 0. 05-5mg，優(yōu)選約 0. 1-0. 5mg。在如上所述施用抗原后1-6周、優(yōu)選2-4周、更優(yōu)選2-3周，進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在進(jìn)行加強(qiáng)免疫時(shí)抗原的劑量隨動(dòng)物的種類或大小等而異。但是，在小鼠的情況下，劑量通常設(shè)定為0. 05-5mg，優(yōu)選0. 1-0. 5mg，更優(yōu)選約0. 1-0. 2 mg。加強(qiáng)免疫后1-10天、優(yōu)選2-5天、更優(yōu)選2-3天，從被免疫的動(dòng)物無菌摘取包含抗體生產(chǎn)細(xì)胞的脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞。此時(shí)，測(cè)定抗體滴度，如果將抗體滴度足夠升高的動(dòng)物作為抗體生產(chǎn)細(xì)胞供給源， 可以更有效地進(jìn)行后續(xù)操作。這里采用的測(cè)定抗體滴度的方法的實(shí)例包括RIA法和ELISA法，但所述方法不限于此。例如，如果使用ELISA法，則可以根據(jù)如下所述的方法測(cè)定本發(fā)明中的抗體滴度。首先，將純化的或部分純化的抗原吸附于固相(諸如用于ELISA的96孔板)的表面，再用與抗原無關(guān)的蛋白(諸如牛血清白蛋白(在下文中稱作“BSA”))覆蓋未吸附抗原的固相表面。洗滌表面后，使表面接觸作為第一抗體的系列稀釋的樣品(例如小鼠血清)，使樣品中的抗體結(jié)合抗原。再加入作為第二抗體的用酶標(biāo)記的針對(duì)小鼠抗體的抗體，使之結(jié)合小鼠抗體。洗滌后，加入該酶的底物，測(cè)量吸光度的變化(其因底物降解等誘導(dǎo)的顯色而發(fā)生)，并基于測(cè)量結(jié)果，計(jì)算抗體滴度。根據(jù)已知的方法(例如，Kohler等人，Nature (1975)，256，第495頁；Kohler 等人，Eur. J. Immunol. (1977)，6，第511 頁；Milstein 等人，Nature (1977)，266, 第550頁；Walsh, Nature (1977)，266,第495頁)，可以從脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞分離抗體
生產(chǎn)細(xì)胞。例如，在脾細(xì)胞的情況下，可以采用常規(guī)方法，其中通過將脾勻漿化，用不銹鋼網(wǎng)過濾，得到細(xì)胞，然后使細(xì)胞懸浮于fegle氏最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM)中，從而分離抗體生產(chǎn)細(xì)胞。(C)骨髓瘤細(xì)胞(在下文中稱作“骨髓瘤”)的制備
細(xì)胞融合所使用的骨髓瘤細(xì)胞沒有特別限制，可從已知的細(xì)胞系中選擇適合的細(xì)胞。 但是，基于從融合的細(xì)胞中選擇雜交瘤時(shí)的便利性考慮，優(yōu)選使用其選擇方法已經(jīng)得到確立的HGPRT (次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)缺陷品系。更具體地，HGPRT-缺陷品系的實(shí)例包括源自小鼠的X63_Ag8 (X63)、 NSl-ANS/1 (NSl)、P3X63-Ag8. Ul (P3U1)、X63-Ag8. 653 (X63. 653)、SP2/0_Agl4 (SP2/0)、MPC11-45. 6TG1.7 05. 6TG)、F0、S149/5XX0 和 BU. 1 ；源自大鼠的 210. RSY3. Ag. 1.2. 3 (Y3)； 和源自人的似66AR(SK0-007)、GM1500 · GTG-A12 (GM1500) ,UC729-6aiCR-L0ff-HMy2 (HMy2) 和 82^AR/NIP4-1 (NP41)。這些HGPRT-缺陷株可從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)等得到。在諸如8-氮雜鳥嘌呤培養(yǎng)基[通過將8-氮雜鳥嘌呤加入添加了谷氨酰胺、2-巰基乙醇、慶大霉素和胎牛血清(在下文中稱作“FCS”)的RPMI-1640培養(yǎng)基中所得到的培養(yǎng)基]、Iscove氏改良的Dulbecco氏培養(yǎng)基(在下文中稱作“IMDM”)、或Dulbecco氏改良的fegle培養(yǎng)基(在下文中稱作“DMEM”)等適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，繼代培養(yǎng)這些細(xì)胞品系。在該情況下，在進(jìn)行細(xì)胞融合之前3-4天，在正常培養(yǎng)基[例如含有10 % FCS的ASF104培養(yǎng)基(Ajinomoto Co., Ltd.生產(chǎn)]中繼代培養(yǎng)細(xì)胞，以在細(xì)胞融合當(dāng)天得到不少于2 X IO7的細(xì)胞。(d)細(xì)胞融合
*艮據(jù)己知的方法(Weir, D. Μ. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III. , Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A.禾口 Mayer, Μ. Μ. , Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964)，等)，在不使細(xì)胞存活率過度降低的條件下，可以適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行抗體生產(chǎn)細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞之間的融合。 作為這樣的方法，可以使用在含有高濃度的諸如聚乙二醇等聚合物的溶液中，將抗體生產(chǎn)細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞混合的化學(xué)方法；利用電刺激的物理方法，等。在這些方法中，化學(xué)方法的具體實(shí)例如下所述。S卩，在將聚乙二醇用于含有高濃度聚合物的溶液中的情況下，在分子量為 1500-6000、更優(yōu)選2000-4000的聚乙二醇溶液中，在30_40°C、優(yōu)選35_38°C的溫度，使抗體生產(chǎn)細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞混合1-10分鐘、優(yōu)選5-8分鐘。(e)雜交瘤群的選擇
選擇通過上述細(xì)胞融合得到的雜交瘤的方法沒有特別限制。通常，采用HAT (次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)選擇方法(Kohler等人，Nature (1975)，256，第495頁；Milstein 等人，Nature (1977), 266,第 55O 頁)。當(dāng)使用在氨基蝶呤存在下無法存活的HGPRT-缺陷品系的骨髓瘤細(xì)胞獲得雜交瘤時(shí)，該方法是有效的。即，通過在HAT培養(yǎng)基中培養(yǎng)未融合的細(xì)胞和雜交瘤，選擇性地僅容許對(duì)氨基蝶呤有抗性的雜交瘤存活并增殖。(f)分成單細(xì)胞克隆(克隆化)
作為雜交瘤的克隆方法，可以使用已知的方法，例如甲基纖維素法、軟瓊脂糖法、或有限稀釋法等(參見，例如，Barbargi, B. M.和 Manley, M. S·: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman 和 Company, San Francisco (1980))。在這些方法中，特別地優(yōu)選有限稀釋法。在該方法中，在微量培養(yǎng)板上接種來自胎大鼠的成纖維細(xì)胞品系，或諸如正常小鼠脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞或腹水細(xì)胞等飼養(yǎng)細(xì)胞。同時(shí)，在培養(yǎng)基中稀釋雜交瘤，以得到0.2-0. 5個(gè)細(xì)胞/0.2ml的細(xì)胞密度。向每個(gè)孔中加入稀釋的雜交瘤懸浮液的0.1 ml等分試樣，繼續(xù)培養(yǎng)約2周，同時(shí)在預(yù)定的時(shí)間間隔(例如每3天)，將約1/3的培養(yǎng)液更換為新鮮培養(yǎng)基，由此可使雜交瘤克隆增殖。使已確定了抗體滴度的孔中的雜交瘤經(jīng)受克隆化，例如通過有限稀釋法，重復(fù)2-4 次。選擇已確定具有穩(wěn)定抗體滴度的雜交瘤，作為生產(chǎn)抗-Siglec-15單克隆抗體的雜交瘤品系。這樣克隆的雜交瘤品系的實(shí)例包括在WO 09/48072中所述的雜交瘤#32A1。于 2008年8月觀日，將雜交瘤#32A1保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物
中心(International Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology,位于:Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566，Japan),并已經(jīng)在抗-Siglec-15 雜交瘤 #32A1 (anti—Siglec-15 Hybridoma #32A1)的名稱下獲得登錄號(hào) FERM BP-10999。此外，在本說明書中，由雜交瘤#32A1生產(chǎn)的抗體稱作“#32A1抗體”，或簡稱“#32A1”。此外，在本說明書的實(shí)施例中得到的除了 #32Α1抗體以外的抗體，也以相同的方式用抗體名稱來表示。含有#32Α1抗體的重鏈可變區(qū)的部分片段具有這樣的氨基酸序列，其包含序列表中的SEQ ID Ν0: 28的氨基酸殘基20-167。此外，含有#32A1抗體的輕鏈可變區(qū)序列的部分片段具有這樣的氨基酸序列，其包含序列表中的SEQ ID N0: 30的氨基酸殘基21-139。(g)通過培養(yǎng)雜交瘤制備單克隆抗體
通過培養(yǎng)這樣選擇的雜交瘤，可以有效地獲得單克隆抗體。但是，在培養(yǎng)之前，優(yōu)選地對(duì)生產(chǎn)目標(biāo)單克隆抗體的雜交瘤進(jìn)行篩選。在這樣的篩選中，可采用已知的方法。通過例如在上述(b)項(xiàng)中解釋的ELISA法，可以測(cè)量本發(fā)明的抗體滴度。在液氮中或在-80°C或以下的冷凍箱中，可以以冷凍狀態(tài)保存由上述方法得到的雜交瘤。完成克隆化以后，將培養(yǎng)基由HT培養(yǎng)基更換為正常培養(yǎng)基，并培養(yǎng)雜交瘤。通過使用大型培養(yǎng)瓶的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)或通過旋動(dòng)培養(yǎng)，進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。從大規(guī)模培養(yǎng)得到的上清液中，通過使用諸如凝膠過濾等本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行純化，可以得到特異性地結(jié)合本發(fā)明的蛋白的單克隆抗體。此外，向與雜交瘤同品系的小鼠(例如上述的BALB/c)或Nu/Nu小鼠的腹腔內(nèi)注射雜交瘤，使雜交瘤增殖，由此可以獲得含有大量本發(fā)明的單克隆抗體的腹水。在腹腔內(nèi)施用雜交瘤的情況下，如果提前3-7天施用諸如2，6，10，14-四甲基十五烷(姥鮫烷)等的礦物油，則可得到更大量的腹水。例如，預(yù)先向與雜交瘤同品系的小鼠的腹腔內(nèi)注射免疫抑制劑，使T細(xì)胞失活。20 天后，使IO6-IO7個(gè)雜交瘤克隆細(xì)胞懸浮于不含血清的培養(yǎng)基中(0.5 ml)，然后向小鼠腹腔內(nèi)注射該懸浮液。一般而言，當(dāng)腹部膨脹、充滿腹水時(shí)，從小鼠采集腹水。通過該方法，可得到比培養(yǎng)液中的濃度高約100倍或更高濃度的單克隆抗體。通過在例如Weir, D. Μ. Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II， III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978)中描述的方法，可以純化由上述方法得到的單克隆抗體。也就是說，所述方法的實(shí)例包括硫酸胺沉淀法、凝膠過濾法、離子交換色譜法和親和色譜法。作為簡單的純化方法，也可以使用市售的單克隆抗體純化試劑盒(例如，由 Pharmacia, Inc.生產(chǎn)的 MAbTrap GII 試劑盒)等。這樣得到的單克隆抗體對(duì)于Siglec-15具有高抗原特異性。(h)單克隆抗體的測(cè)定
可以如下確定這樣得到的單克隆抗體的同種型和亞類。首先，鑒定方法的實(shí)例包括奧脫洛尼(Ouchterlony)法、ELISA法以及RIA法。奧脫洛尼法是簡便的，但是當(dāng)單克隆抗體濃度較低時(shí)，需要濃縮操作。另一方面，當(dāng)使用ELISA法或RIA法時(shí)，通過使培養(yǎng)上清液與吸附有抗原的固相直接反應(yīng)，并使用與各種免疫球蛋白同種型和亞類對(duì)應(yīng)的抗體作為第二抗體，可以鑒定單克隆抗體的同種型和亞類。 此外，作為更簡便的方法，也可以使用市售的鑒定試劑盒(例如，由Bio-Rad Laboratories, Inc.生產(chǎn)的小鼠分型試劑盒)等。此外，通過R)lin Lowry法，以及基于在^Onm的吸光度的計(jì)算方法[1.4 (0D 280) = 1 mg免疫球蛋白/ml]，可以進(jìn)行蛋白的定量測(cè)定。(3)其它抗體
本發(fā)明的抗體不僅包括上述抗Siglec-15的單克隆抗體，而且包括以降低對(duì)人的異種抗原性為目的而人工修飾得到的重組抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。使用已知的方法，可以制備這些抗體。作為嵌合抗體，可以例舉這樣的抗體，其中抗體可變區(qū)和恒定區(qū)源自不同的物種， 例如，其中使小鼠-或大鼠-衍生的抗體可變區(qū)與人-衍生的恒定區(qū)相連的嵌合抗體(參見 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81，6851-6855，(1984))。作為源自大鼠抗-小鼠抗體#32A1的嵌合抗體的一個(gè)實(shí)例，可以例舉這樣的抗體，其包含重鏈和輕鏈，所述重鏈具有包含序列表中的SEQ ID NO: 41的氨基酸殘基20-470的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含序列表中的SEQ ID N0: 43的氨基酸殘基21-237的氨基酸序列。作為人源化抗體，可以例舉通過只將互補(bǔ)性決定區(qū)(OTR)整合到人-衍生的抗體中所得到的抗體(參見Nature (1986) 321，第頁522-52 ；以及通過CDR-移植法，將構(gòu)架的氨基酸殘基的一部分和CDR序列移植到人抗體中所得到的抗體(W0 90/07861)。作為大鼠抗體#32A1的人源化抗體的一個(gè)實(shí)例，可以例舉含有下述重鏈可變區(qū)的重鏈和含有下述輕鏈可變區(qū)的輕鏈的任意組合，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其含有序列表中的SEQ ID N0: 51的氨基酸殘基20-140、SEQ ID N0: 53的氨基酸殘基20-140、SEQ ID N0: 55 的氨基酸殘基 20-140、SEQ ID NO: 57 的氨基酸殘基 20_140、SEQ ID NO: 59 的氨基酸殘基20-140、SEQ ID N0: 99的氨基酸殘基20-140、SEQ ID N0: 101的氨基酸殘基
20-140、或由SEQID N0: 72-77表示的任一個(gè)氨基酸序列的氨基酸殘基1-121，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其含有序列表中的SEQ ID N0: 61的氨基酸殘基21-133、SEQ ID NO: 63 的氨基酸殘基 21-133、SEQ ID NO: 65 的氨基酸殘基 21_133、SEQ ID NO: 67 的氨基酸殘基21-132、SEQ ID N0: 69的氨基酸殘基21-133、SEQ ID N0: 71的氨基酸殘基
21-133、SEQID N0: 103 的氨基酸殘基 21-133、SEQ ID N0: 105 的氨基酸殘基 21-133、或由SEQ ID N0: 78-96表示的任一個(gè)氨基酸序列的氨基酸殘基1-113。
作為一個(gè)優(yōu)選組合，可以例舉這樣的抗體，其包含含有下述重鏈可變區(qū)的重鏈和含有下述輕鏈可變區(qū)的輕鏈，所述重鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID NO: 51的氨基酸殘基
20-140的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區(qū)包含含有SEQID NO: 61的氨基酸殘基21-133的氨基酸序列，或者所述重鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID NO: 53的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID NO: 63的氨基酸殘基21-133的氨基酸序列，或者所述重鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID NO: 55的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID N0: 65的氨基酸殘基21-133的氨基酸序列，或者所述重鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID N0: 55的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID N0: 67的氨基酸殘基21-133的氨基酸序列，或者所述重鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID N0: 57的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID N0: 69的氨基酸殘基21-133的氨基酸序列，或者所述重鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID N0: 59的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID N0: 71的氨基酸殘基
21-133的氨基酸序列，或者所述重鏈可變區(qū)包含含有SEQID N0: 99的氨基酸殘基20-140 的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID N0: 69的氨基酸殘基21-133的氨基酸序列，或者所述重鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID N0: 101的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列， 且所述輕鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID N0: 69的氨基酸殘基21-133的氨基酸序列，或者所述重鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID N0: 99的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID N0: 103的氨基酸殘基21-133的氨基酸序列，或者所述重鏈可變區(qū)包含含有SEQ ID N0: 99的氨基酸殘基20-140的氨基酸序列，且所述輕鏈可變區(qū)包含含有 SEQ ID N0: 105的氨基酸殘基21-133的氨基酸序列。作為一個(gè)更優(yōu)選的組合，可以例舉包含重鏈和輕鏈的抗體，所述重鏈具有包含SEQ ID N0: 51的氨基酸殘基20-470的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID N0: 61的氨基酸殘基21-238的氨基酸序列，或者所述重鏈具有包含SEQ ID N0: 53的氨基酸殘基 20-470的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID N0: 63的氨基酸殘基21-238的氨基酸序列，或者所述重鏈具有包含SEQ ID N0: 55的氨基酸殘基20-470的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID N0: 65的氨基酸殘基21-238的氨基酸序列，或者所述重鏈具有包含 SEQ ID N0: 55的氨基酸殘基20-470的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID N0: 67 的氨基酸殘基21-237的氨基酸序列，或者所述重鏈具有包含SEQ ID N0: 57的氨基酸殘基 20-470的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID N0: 69的氨基酸殘基21-238的氨基酸序列，或者所述重鏈具有包含SEQ ID N0: 59的氨基酸殘基20-470的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID N0: 71的氨基酸殘基21-238的氨基酸序列，或者所述重鏈具有包含 SEQ ID N0: 99的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID N0: 69 的氨基酸殘基21-238的氨基酸序列，或者所述重鏈具有包含SEQ ID N0: 101的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID N0: 69的氨基酸殘基21-238的氨基酸序列，或者所述重鏈具有包含SEQ ID N0: 99的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID N0: 103的氨基酸殘基21-238的氨基酸序列，或者所述重鏈具有包含SEQ ID N0: 99的氨基酸殘基20-466的氨基酸序列，且所述輕鏈具有包含SEQ ID N0: 105的氨基酸殘基21-238的氨基酸序列。但是，源自#32A1抗體的人源化抗體不限于上述的人源化抗體，只要人源化抗體具有#32A1的所有6類⑶R序列，且具有抑制破骨細(xì)胞形成的活性。此外，#32A1抗體的重鏈可變區(qū)具有包含由SEQ ID NO: 44表示的氨基酸序列的⑶RHl (DYFMN)，包含由SEQ ID NO: 45 表示的氨基酸序列的 CDRH2 (QIRNKIYTYATFYAESLEG)和由 SEQ ID NO: 97 表示的CDRH2 (QIRNKIYTYATFYA)中的任一個(gè)，和包含由SEQ ID NO: 46表示的氨基酸序列的 CDRH3 (SLTGGDYFDY)。由 SEQ ID NO: 45 表示的 CDRH2 是根據(jù) Kabat 定義的(SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST VOL. I，第 5 版(1991))。與 Kabat 定義相比，由SEQ ID NO: 97表示的⑶RH2在C端處縮短了 5個(gè)殘基。在含有該⑶RH2的重鏈序列中，源自大鼠的CDR序列被制成更短，摻入更多的人框架序列，因此，當(dāng)將它施用給人時(shí)， 被識(shí)別為異種抗原的可能性更低。此外，#32A1抗體的輕鏈可變區(qū)具有包含由SEQ ID NO: 47表示的氨基酸序列的CDRLl (RASQSVTISGYSFIH)、包含由SEQ ID NO: 48表示的氨基酸序列的CDRL2 (RASNLAS)和包含由SEQ ID NO: 49表示的氨基酸序列的CDRL3 (QQSRKSPffT) 此外，本發(fā)明的抗體包括人抗體。人抗-Siglec-15抗體是指只具有源自人染色體的抗體基因序列的人抗體。通過使用生產(chǎn)人抗體的小鼠的方法可以獲得人抗-Siglec-15 抗體，所述小鼠具有含有人抗體的重鏈和輕鏈基因的人染色體片段(參見Tomizuka，K. 等人，Nature Genetics (1997) 16，第 133-143 頁；Kuroiwgi，Y.等人，Nucl. Acids Res. (1998) 26，第；3447_3448頁；Yoshida, H.等人，Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10,第 69-73 頁(Kitagawa, Y. , Matuda, Τ.禾口 Iijima, S. 編)，Kluwer Academic Publishers, 1999； Tomizuka, K.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97，第 722-727 頁，等)。具體地可以如下建立這種生產(chǎn)人抗體的小鼠。通過制備敲除的動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并使這些動(dòng)物交配，建立遺傳修飾的動(dòng)物，其中已經(jīng)破壞了內(nèi)源免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因基因座，并替代地，經(jīng)由酵母人工染色體(YAC)載體等已經(jīng)導(dǎo)入了人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因基因座。此外，根據(jù)基因工程技術(shù)，通過使用分別編碼這樣的人抗體的重鏈和輕鏈的cDNA， 并優(yōu)選使用包含該cDNA的載體，轉(zhuǎn)化真核細(xì)胞，培養(yǎng)生產(chǎn)重組人單克隆抗體的轉(zhuǎn)化體，由此也可從培養(yǎng)上清液獲得該抗體。在這里，例如，可以使用真核細(xì)胞、優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞，諸如CHO細(xì)胞、淋巴細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞作為宿主。此外，還已知獲得從人抗體文庫篩選出來的噬菌體展示-衍生的人抗體的方法 (參見 Wormstone, I. M. 等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (J),第 2301-2308 頁；Carmen, S.等人，Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2)，第 189—203 頁；Siriwardena, D.等人， Opthalmology (2002) 109 (3)，第 427-431 頁，等)。例如，可以使用噬菌體展示法，其中在噬菌體表面上表達(dá)人抗體的可變區(qū)作為單鏈抗體(scFv)，并選擇結(jié)合抗原的噬菌體(Nature Biotechnology (2005), 23，(9)，第 1105-1116 頁)。通過分析基于與抗原的結(jié)合所選擇的噬菌體的基因，可以確定編碼結(jié)合抗原的人抗體的可變區(qū)的DNA序列。如果確定了結(jié)合抗原的scFv的DNA序列，通過制備具有該序列的表達(dá)載體，并將該載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)乃拗髦幸员磉_(dá)它，可以獲得人抗體(W0 92/01047，WO 92/20791，WO 93/06213，WO 93/11236，WO 93/19172，WO 95/01438，WO 95/15388，Annu. Rev. Immunol (1994) 12，第 433-455 頁，Nature Biotechnology (2005) 23 (9)，第 1105-1116 頁)。通過在實(shí)施例25等中所述的方法，可以評(píng)價(jià)通過上述方法得到的抗體的結(jié)合抗原的性質(zhì)，并可以選擇優(yōu)選的抗體。作為對(duì)比抗體的性質(zhì)時(shí)的另一個(gè)指標(biāo)的一個(gè)實(shí)例，可以例舉抗體的穩(wěn)定性。在實(shí)施例33中顯示的示差掃描量熱法(DSC)是能夠快速且準(zhǔn)確地測(cè)量熱變性中點(diǎn)溫度(Tm)的儀器，所述熱變性中點(diǎn)溫度是蛋白的相對(duì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的有利指標(biāo)。通過使用DSC測(cè)量Tm值并對(duì)比該值，可以對(duì)比熱穩(wěn)定性的差異。已知，抗體的儲(chǔ)存穩(wěn)定性顯示出與抗體的熱穩(wěn)定性的某種關(guān)聯(lián)性(Lori Burton,等人，！Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12，第洸5-273頁)，使用熱穩(wěn)定性作為指標(biāo)，可以選擇出優(yōu)選的抗體。用于選擇抗體的其它指標(biāo)的實(shí)例包括下述在適當(dāng)宿主細(xì)胞中的產(chǎn)量較高，在水性溶液中的聚集性較低。例如，顯示出最高產(chǎn)量的抗體不總是顯示出高熱穩(wěn)定性，因此，通過基于上述指標(biāo)做出綜合性評(píng)價(jià)來選擇最適合施用給人的抗體是必要的。此外，還已知這樣的方法，其中使用適當(dāng)?shù)慕宇^，連接抗體的全長重鏈和輕鏈序列，由此得到單鏈免疫球蛋白(Lee, H-S,等人，Molecular Immunology (1999) 36，第 61-71 頁；Shirrmann，Τ.等人，mAbs (2010), 2，(1)第 1-4 頁)。通過二聚化這樣的單鏈免疫球蛋白，得到的二聚體可以具有與本身是四聚體的抗體類似的結(jié)構(gòu)和活性。此外， 本發(fā)明的抗體可以是具有單個(gè)重鏈可變區(qū)且不具有輕鏈序列的抗體。這樣的抗體被稱作單結(jié)構(gòu)域抗體(sdAb)或納米體(nanobody)，實(shí)際上，在駱駝和羊駝中觀察到它，且已經(jīng)報(bào)道具有抗原結(jié)合親和力(Muyldemans S.等人，Protein Eng. (1994) 7(9)，1129-35, Hamers- Casterman C.等人，Nature (1993) 363 (6428) 446-8)?？梢岳斫猓鲜龅目贵w是根據(jù)本發(fā)明的抗體的功能片段的類型。此外，通過控制糖基化(其中聚糖結(jié)合到本發(fā)明的抗體上)，可能增強(qiáng)抗體-依賴性的細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。關(guān)于控制抗體的糖基化的技術(shù)，已知WO 99/54342.W0 00/61739、 WO 02/31140等。但是，所述技術(shù)不限于此。在首先分離抗體基因、然后將該基因?qū)脒m當(dāng)宿主中來制備抗體的情況下，可以使用適當(dāng)宿主和適當(dāng)表達(dá)載體的組合?？贵w基因的具體實(shí)例包括編碼在本說明書中描述的抗體的重鏈序列的基因和編碼其輕鏈序列的基因的組合。當(dāng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞時(shí)，可能將重鏈序列基因和輕鏈序列基因插入相同的表達(dá)載體中，且也可能分別插入不同的表達(dá)載體中。 在使用真核細(xì)胞作為宿主的情況下，可使用動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞和真核微生物。作為動(dòng)物細(xì)胞，可以例舉(1)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如，猿COS細(xì)胞(Gluzman，Y., Cell, (1981) 23， 第 175-182 頁，ATCC CRL-1650)的二氫葉酸還原酶-缺陷株(Urlaub, G.和 Chasin, L. A.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77，第 4U6-4220 頁)，鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658)和中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞;ATCC CCL-61)。此外，在使用原核細(xì)胞的情況下，例如，可以例舉大腸桿菌和枯草芽孢桿菌。通過轉(zhuǎn)化，向這些細(xì)胞中導(dǎo)入靶抗體基因，并在體外培養(yǎng)這樣轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，可得到該抗體。在上述的培養(yǎng)方法中，產(chǎn)率有時(shí)可能隨抗體的序列而變化，因此，可能通過使用產(chǎn)量作為指標(biāo)，在具有相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合活性的抗體中選擇可以容易地生產(chǎn)作為藥物的抗體。本發(fā)明的抗體的同種型沒有限制，其實(shí)例包括IgG (IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA (IgAUIgA2) ,IgD和IgE，且其優(yōu)選的實(shí)例包括IgG和IgM，進(jìn)一步，其更優(yōu)選的實(shí)例包括 IgGl 和 IgG2。此外，本發(fā)明的抗體可以是具有抗體的抗原結(jié)合部位的抗體功能片段或其修飾的片段。通過用諸如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等蛋白酶處理抗體，或根據(jù)基因工程技術(shù)修飾抗體基因，并在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)修飾的基因，可以得到抗體的片段。在這些抗體片段中，具有全長抗體分子的全部或部分功能的片段可以稱為所述抗體的功能片段。作為抗體的功能，通常可以例舉抗原結(jié)合活性、中和抗原活性的活性、增強(qiáng)抗原活性的活性、抗體-依賴性的細(xì)胞毒性活性、補(bǔ)體-依賴性的細(xì)胞毒性活性以及補(bǔ)體-依賴性的細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性。根據(jù)本發(fā)明的抗體功能片段的功能是對(duì)Siglec-15的結(jié)合活性，優(yōu)選抑制破骨細(xì)胞形成的活性，更優(yōu)選抑制破骨細(xì)胞的細(xì)胞融合過程的活性?？贵w片段的實(shí)例包括Fab、F (ab，)2、Fv、單鏈Fv (scFv，其中重鏈和輕鏈的Fv分子通過適當(dāng)?shù)慕宇^相連)、雙特異抗體、線性抗體、以及由抗體片段組成的多特異性抗體。此外，F(xiàn)ab'(通過在還原條件下處理F (ab’)2而得到的抗體可變區(qū)中的單價(jià)片段)也視作抗體片段。此外，本發(fā)明的抗體可以是對(duì)至少兩種不同抗原具有特異性的多特異性抗體。通常，這樣的分子結(jié)合兩種抗原(即，雙特異性抗體)，但是，本文使用的“多特異性抗體”包括具有對(duì)兩種或更多種(例如，3種)抗原的特異性的抗體。本發(fā)明的多特異性抗體可以是全長抗體或這樣的抗體的片段(例如，F(xiàn)(ab’)2雙特異性抗體)。通過連接兩類抗體的重鏈和輕鏈(HL對(duì))，可以制備雙特異性抗體，或者通過融合生產(chǎn)不同單克隆抗體的雜交瘤，以制備生產(chǎn)雙特異性抗體的融合細(xì)胞，也可以制備雙特異性抗體(Millstein 等人，Nature (1983) 305，第 537-539 頁)。本發(fā)明的抗體可以是單鏈抗體(也稱為scFv)。通過經(jīng)由多肽接頭連接抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，可以獲得單鏈抗體(Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 ( Rosenburg 禾口 Moore 編，Springer Verlag, New York,第 269-315 頁 (1994),Nature Biotechnology (2005)，23，第 1U6-1136 頁)。此外，通過經(jīng)由多肽接頭連接兩個(gè)scFv分子生成的BiscFv片段，也可用作雙特異性抗體。制備單鏈抗體的方法是在本技術(shù)領(lǐng)域中已知的(參見，例如，美國專利號(hào) 4，946，778,5, 260，203,5,091, 513,5,455,030 等)。在該 scFv 中，通過不形成綴合物的接頭，優(yōu)選通過多肽接頭，連接重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)(Huston，J. S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988)，85，第 5879-5883 頁)。在 scFv 中，重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)可以源自相同抗體或不同抗體。作為用于連接可變區(qū)的多肽接頭，例如使用由12-19個(gè)殘基組成的給定單鏈肽?？扇缦芦@得編碼scFv的DNA 使用編碼全部氨基酸序列或所需的部分氨基酸序列 (選自上述抗體的重鏈或重鏈可變區(qū)及其輕鏈或輕鏈可變區(qū))的DNA作為模板，并使用限定其兩端的引物對(duì)，通過PCR法進(jìn)行擴(kuò)增，并通過組合編碼多肽接頭部分的DNA和限定其兩端的引物對(duì)，從而將其兩端分別連接重鏈和輕鏈，進(jìn)一步進(jìn)行擴(kuò)增。此外，制備編碼scFv的DNA以后，根據(jù)常規(guī)方法，可以獲得包含該DNA的表達(dá)載體以及用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主。此外，通過使用獲得的宿主，根據(jù)常規(guī)方法，可以獲得scFv。 通過以與上述相同的方式獲得基因并表達(dá)該基因，可以在宿主中生產(chǎn)其抗體片段。
可以使本發(fā)明的抗體多聚化，以增加對(duì)抗原的親和性。待多聚化的抗體可以是一類抗體，或識(shí)別相同抗原的多個(gè)表位的多個(gè)抗體。作為多聚化抗體的方法，可以例舉的是使 IgG CH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合兩個(gè)scFv分子，結(jié)合抗生蛋白鏈菌素，導(dǎo)入螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序等。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體，它是具有不同氨基酸序列的多類抗-Siglec-15 抗體的混合物。作為多克隆抗體的一個(gè)實(shí)例，可以例舉具有不同CDR的多類抗體的混合物。 培養(yǎng)生產(chǎn)不同抗體的細(xì)胞的混合物，并從得到的培養(yǎng)物純化抗體可用作這樣的多克隆抗體 (參見 WO 2004/061104)。也可使用與諸如聚乙二醇(PEG)等任意不同類型的分子結(jié)合的抗體作為修飾的抗體。此外，本發(fā)明的抗體可以是任一種這樣的抗體和另一種藥物之間形成的綴合物的形式(免疫綴合物)。這樣的抗體的實(shí)例包括其中抗體綴合到放射性物質(zhì)或具有藥理作用的化合物上的那些(Nature Biotechnology (2005) 23，第 1137-1146 頁)?？梢詫⑺每贵w純化至同質(zhì)。使用常規(guī)的蛋白分離和純化方法，可以進(jìn)行抗體的分離和純化。例如，通過適當(dāng)?shù)剡x擇和組合柱色譜法、過濾器過濾、超濾、鹽析、透析、制備聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳等，可以分離和純化抗體(Strategies for protein Purification and Charcterization:A Laboratoy Course Manual, Daniel R. Marshak 等人編，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ；Antibodies:A Laboratory Manual. Harlow and David Lane 編，Cold Spring Harbor Laboratory (1988)),但是方法不限于此。這些色譜法的實(shí)例包括親和色譜法、離子交換色譜法、疏水色譜法、凝膠過濾色譜法、反相色譜法和吸附色譜法。使用液相色譜法，諸如HPLC或FPLC，可以進(jìn)行這些色譜法。作為用于親和色譜法的柱子，可以例舉蛋白A柱和蛋白G柱。例如，作為使用蛋白A柱的柱子，可以例舉Hyper D、P0R0S,瓊脂糖FF (Pharmacia)等。此外，通過使用其上固定有抗原的載體，利用抗體對(duì)抗原的結(jié)合性質(zhì)，也可純化抗體。4.含有抗-Siglec-15抗體的藥物
從在上面的“3.抗-Siglec-15抗體的制備” 一項(xiàng)中所述的方法得到的抗-Siglec-15 抗體，可以獲得中和Siglec-15的生物活性的抗體。這些中和Siglec-15的生物活性的抗體會(huì)在體內(nèi)抑制Siglec-15的生物活性，即，破骨細(xì)胞的分化和/或成熟，因此可用作藥物，用作由破骨細(xì)胞的異常分化和/或成熟造成的骨代謝異常的治療劑和/或預(yù)防劑。骨代謝異?？梢允侨魏我詢艄橇魇?骨質(zhì)減少或骨質(zhì)溶解)為特征的障礙。一般而言，用抗-Siglec-15抗體的治療和/或預(yù)防應(yīng)用于需要抑制骨吸收的情況。可用抗-Siglec-15 抗體治療和/或預(yù)防的骨代謝異常的實(shí)例包括骨質(zhì)疏松癥(絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用諸如類固醇或免疫抑制劑等治療劑導(dǎo)致的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥)、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤或癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞、巨細(xì)胞瘤、骨質(zhì)減少、牙周炎導(dǎo)致的牙缺失、人工關(guān)節(jié)周圍的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破壞、骨佩吉特病、腎性骨營養(yǎng)不良和成骨不全，但是，骨代謝異常不限于此，只要它是伴有破骨細(xì)胞造成的凈骨流失的疾病即可。作為上述藥物使用的抗-Siglec-15抗體的實(shí)例包括通過在3. “ (3)其它抗體” 一項(xiàng)中所述的方法從#32A1 抗體制備的嵌合抗體和人源化抗體。此外，具有與#32A1抗體相同表位的嵌合抗體、人源化抗體和人抗體也可用作藥物。通過觀察這些抗體是否結(jié)合Siglec-15的相同的特定部分肽，可以證實(shí)某種抗-Siglec-15抗體是否具有與#32A1抗體相同的表位。此外，如果某種抗-Siglec-15抗體與#32A1抗體競爭結(jié)合Siglec-15，則也可判定這些抗體具有相同的表位。通過例如抑制過表達(dá)Siglec-15的細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞的活性，可以測(cè)定抗-Siglec-15抗體的中和Siglec-15的生物活性的體外活性。例如，在不同的濃度，向 RAff沈4. 7細(xì)胞或RAW 264細(xì)胞(小鼠單核細(xì)胞-衍生的細(xì)胞系)添加抗-Siglec-15抗體， 可以測(cè)定RANKL或TNF-α的刺激抑制向破骨細(xì)胞分化的活性。此外，在不同的濃度，向骨髓-衍生的原代培養(yǎng)細(xì)胞添加抗-Siglec-15抗體，可以測(cè)定RANKL、TNF- α或活性維生素 D3的刺激抑制向破骨細(xì)胞分化的活性。此外，在不同的濃度，向正常人破骨細(xì)胞前體細(xì)胞 (正常人天然破骨細(xì)胞前體細(xì)胞，可從Sanko Junyaku Co.，Ltd.，目錄號(hào)2T-110得到)添加抗-Siglec-15抗體，可以測(cè)定RANKL或M-CSF的刺激抑制向破骨細(xì)胞分化的活性。通過使用酒石酸鹽-抗性的酸性磷酸酶(TRAP)活性的抑制為指標(biāo)，可以測(cè)定這樣的對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制效應(yīng)。此外，通過使用TRAP-陽性的多核破骨細(xì)胞形成的抑制(即破骨細(xì)胞的細(xì)胞融合的抑制)為指標(biāo)，也可以測(cè)定對(duì)破骨細(xì)胞分化的抑制效應(yīng)。此外，在使用股骨-和/或脛骨-衍生的細(xì)胞的陷窩測(cè)定實(shí)驗(yàn)(Takada等人，Bone和Mineral，(1992) 17，347-359)中，通過以不同濃度向股骨-和/或脛骨-衍生的細(xì)胞添加抗-Siglec-15 抗體，并觀察牙質(zhì)切片上的陷窩形成，可以測(cè)定抑制破骨細(xì)胞的骨吸收的體外活性。作為用于測(cè)定抑制破骨細(xì)胞導(dǎo)致的骨吸收的體外活性的系統(tǒng)，也可以使用涂有綴合銪的人膠原的板?？梢匀缦麓_認(rèn)使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抗-Siglec-15抗體對(duì)骨代謝異常的體內(nèi)治療或預(yù)防效應(yīng)將抗-Siglec-15抗體施用給骨質(zhì)疏松癥動(dòng)物模型或過表達(dá)Siglec-15的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物， 并測(cè)量破骨細(xì)胞的任何變化。這樣得到的的中和Siglec-15的生物活性的抗體可用作藥物，特別是用作治療或預(yù)防骨代謝異常的藥物組合物，所述骨代謝異常例如骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、或伴隨癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞，或用作這樣的疾病的免疫學(xué)診斷的抗體。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的治療中，一個(gè)主要的難題是伴隨該疾病的發(fā)生的骨流失。業(yè)已報(bào)道在伴隨RA的這種骨流失中破骨細(xì)胞起主要作用。認(rèn)為RANKL和TNF-α對(duì)于破骨細(xì)胞誘導(dǎo)(分化和成熟)和活化而言是最重要的細(xì)胞因子，且是RA中骨破壞的原因 (Romas Ε.等人，Bone 30,第 340-346 頁，2002)。作為 RANKL 的誘館受體的 0CIF/0PG 可抑制由RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成，但是不抑制由TNF-α誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。另一方面，根據(jù)本發(fā)明的抗-Siglec-15抗體會(huì)有效地抑制由RANKL和TNF-α誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。因此，預(yù)期本發(fā)明的抗-Siglec-15抗體可以比RANKL阻滯劑(0CIF/0PG、抗-RANKL抗體等)更強(qiáng)烈地抑制RA等中的TNF-α誘導(dǎo)的骨流失和骨破壞。作為一個(gè)實(shí)例，對(duì)于骨代謝異常的治療或預(yù)防，抗-Siglec-15抗體可以單獨(dú)施用或與骨相關(guān)疾病的至少一種其它治療劑組合施用。作為另一個(gè)實(shí)例，抗-Siglec-15抗體可以與治療有效量的骨代謝異常的治療劑組合施用。可與抗-Siglec-15抗體組合施用的治療劑的實(shí)例包括但不限于二膦酸鹽(例如，阿侖膦酸鹽、依替膦酸鹽、伊班膦酸鹽、伊卡膦酸鹽、帕瑪二磷酸鹽、利塞膦酸鹽和唑來膦酸鹽)，活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺激素)、非留體類抗炎藥(例如，塞來考昔和羅非昔布)、可溶性TNF 受體(例如，依那西普)、抗-TNF-α抗體或所述抗體的功能片段(例如，英夫利昔單抗)、 抗-PTHrP (甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白)抗體或所述抗體的功能片段、IL-I受體拮抗劑(例如，阿那白滯素)、抗-IL-6受體抗體或所述抗體的功能片段(例如，托珠單抗)、抗-RANKL 抗體或所述抗體的功能片段(例如，denosumab)和OCIF (破骨細(xì)胞生成抑制因子)。根據(jù)骨代謝異常的狀態(tài)或希望的治療和/或預(yù)防程度，可以施用2或3或更多種藥物類型，通過封裝在同一制劑中，可以一起供應(yīng)這些藥物。通過將它們封裝在同一制劑中，也可以一起供應(yīng)這些藥物和抗-Siglec-15抗體。此外，通過將它們封裝為用于治療和/或預(yù)防的試劑盒，也可以一起供應(yīng)這些藥物。此外，可以分別供應(yīng)這些藥物和抗-Siglec-15抗體。在基因治療中施用的情況下，可以將蛋白性的骨疾病治療劑的基因和抗-Siglec-15抗體的基因插入到相同啟動(dòng)子區(qū)或不同啟動(dòng)子區(qū)的下游，且可以導(dǎo)入到相同載體或不同載體中。
通過使骨疾病治療劑與抗-Siglec-15抗體或其片段綴合，可以制備如在M. C. Garnet "Targeted drug conjugates: principles and progress，，，Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53，171-216中所述的靶向藥物綴合物。為達(dá)到該目的， 可使用除抗體分子外的任何抗體片段，只要其沒有完全失去識(shí)別破骨細(xì)胞的能力，其實(shí)例包括諸如Fab、F(ab’)2和Fv等片段。在本發(fā)明中，也可以以相同的方式使用抗體和片段?？?Siglec-15抗體或其片段與骨疾病治療劑形成的綴合物可以是在下述文獻(xiàn)中禾中？ 中的ft—禾中M. C. Garnet "Targeted drug conjugates: principles and progress，，，Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216，G. T. Hermanson "Bioconjugate Techniques，，Academic Press, California (1996), Putnam 禾口J. Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity" Advances in Polymer Science (1995) 122，55-123等。也就是說，可以例舉這樣的綴合物，其中抗-Siglec-15 抗體和骨疾病治療劑彼此化學(xué)地直接綴合，或經(jīng)由諸如寡肽等間隔物綴合，以及經(jīng)由適當(dāng)?shù)乃幬镙d體而形成的綴合物。藥物載體的實(shí)例包括脂質(zhì)體和水溶性聚合物。經(jīng)由這種藥物載體形成的綴合物的更具體實(shí)例包括這樣的綴合物，其中將抗體和骨疾病治療劑摻入脂質(zhì)體中，并將脂質(zhì)體與抗體彼此綴合；和這樣的綴合物，其中骨疾病治療劑與水溶性聚合物(分子量為約1000-100000的化合物)化學(xué)地直接綴合，或經(jīng)由諸如寡肽等間隔物綴合， 并將抗體與水溶性聚合物綴合。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法可以實(shí)現(xiàn)抗體(或其片段)與骨疾病治療劑或藥物載體(諸如脂質(zhì)體或水溶性聚合物)的綴合，所述方法例如描述在下述文獻(xiàn)中的方法G. Τ. Hermanson "Bioconjugate Techniques，，Academic Press, California (1996)， Putnam 禾口 J. Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity” Advances in Polymer Science (1995) 122，55-口3。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可以實(shí)現(xiàn)骨疾病治療劑在脂質(zhì)體中的摻入，所述方法例如描述在下述文獻(xiàn)中的方法:D. D. Lasic "Liposomes:From Physics to Applications，，Elsevier Science Publishers B. V. , Amsterdam (1993)等。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，可以實(shí)現(xiàn)骨疾病治療劑與水溶性聚合物的綴合，所述方法例如描述在下述文獻(xiàn)中的方法D. Putnam和J. Kopecek "Polymer Conjugates with Anticancer Activity"Advances in Polymer kience( 1995)122，55-123。除上述方法外，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，通過基因工程，可以制備抗體(或其片段)與蛋白性的骨疾病治療劑(或其片段)的綴合物。本發(fā)明也提供了藥物組合物，其含有治療和/或預(yù)防有效量的抗-Siglec-15抗體和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑。本發(fā)明也提供了藥物組合物，其含有治療和/或預(yù)防有效量的抗-Siglec-15抗體、治療和/或預(yù)防有效量的至少一種骨疾病治療劑和藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體、增溶劑、乳化劑、防腐劑和/或佐劑。骨疾病治療劑的實(shí)例包括但不限于二膦酸鹽(例如，阿屈膦酸鹽、依替膦酸鹽、伊班膦酸鹽、伊卡膦酸鹽、帕瑪二磷酸鹽、利塞膦酸鹽和唑來膦酸鹽)、 活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、 依普黃酮、維生素1(2 (四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺激素)、非甾體類抗炎藥(例如，塞來考昔和羅非昔布)、可溶性TNF受體(例如，依那西普)、抗-TNF-α抗體或所述抗體的功能片段(例如，英夫利昔單抗)、抗-PTHrP (甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白)抗體或所述抗體的功能片段、IL-I受體拮抗劑(例如，阿那白滯素)、抗-IL-6受體抗體或所述抗體的功能片段(例如，托珠單抗)、抗-RANKL抗體或所述抗體的功能片段(例如，denosumab) 和OCIF (破骨細(xì)胞生成抑制因子)。在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中可接受的、用于制劑中的物質(zhì)優(yōu)選地在其施用量和施用濃度對(duì)施用藥物組合物的人沒有毒性。本發(fā)明的藥物組合物可以包含能改變或維持pH、滲透壓、粘度、透明度、顏色、等張性、無菌狀態(tài)、穩(wěn)定性、溶解度、釋放速率、吸收速率及其滲透性的藥用物質(zhì)。這樣的藥用物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于氨基酸諸如甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和賴氨酸；抗微生物劑；抗氧化劑諸如抗壞血酸、硫酸鈉和亞硫酸氫鈉；緩沖劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、硼酸鹽緩沖劑、碳酸氫鈉和Tris-HCl溶液；填充劑諸如甘露醇和甘氨酸；螯合劑諸如四乙酸乙二胺(EDTA)；絡(luò)合劑諸如咖啡因、聚乙烯吡咯烷、β-環(huán)糊精和羥丙基-β-環(huán)糊精；增量劑諸如葡萄糖、甘露糖和糊精；其它碳水化合物諸如單糖類和二糖類；著色劑； 矯味劑；稀釋劑；乳化劑；親水聚合物諸如聚乙烯吡咯烷；防腐劑諸如低分子量多肽、成鹽抗衡離子、苯扎氯銨、苯甲酸、水楊酸、硫柳汞、苯乙醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和過氧化氫；溶劑諸如甘油、丙二醇和聚乙二醇；糖醇諸如甘露醇和山梨醇；助懸劑；表面活性劑諸如脫水山梨糖醇酯、包括聚山梨酯20和聚山梨酯80在內(nèi)的聚山梨酯、三硝基甲苯(Triton)、氨丁三醇、卵磷脂和膽固醇；穩(wěn)定性增強(qiáng)劑諸如蔗糖和山梨醇；彈性增強(qiáng)劑諸如氯化鈉、氯化鉀和甘露醇和山梨醇；轉(zhuǎn)運(yùn)劑；賦形劑；和/或藥物佐劑。這些為藥用加入的物質(zhì)的量優(yōu)選為抗-Siglec-15抗體重量的0. 01-100倍，特別優(yōu)選 0. 1-10倍。根據(jù)組合物應(yīng)用的疾病、應(yīng)用的施用途徑等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)卮_定制劑中藥物組合物的優(yōu)選組成。藥物組合物中的賦形劑和載體可以是液體或固體形式。適當(dāng)?shù)馁x形劑或載體可以是注射用水、生理鹽水、人工腦脊液或腸胃外施用中常用的其它物質(zhì)。此外，中性生理鹽水或含有血清白蛋白的生理鹽水也可以用作載體。藥物組合物可以含有PH7. 0-8. 5的Tris 緩沖液、PH4. 0-5. 5的乙酸鹽緩沖液或pH 3. 0-6. 2的檸檬酸鹽緩沖液。此外，這樣的緩沖液可以補(bǔ)充山梨醇或另一種化合物。本發(fā)明的藥物組合物的實(shí)例包括含有抗-Siglec-15抗體的藥物組合物、以及含有抗-Siglec-15抗體和至少一種骨疾病治療劑的藥物組合物。將本發(fā)明的藥物組合物制成凍干產(chǎn)品或液體形式，作為具有所選擇的組成和所需的純度的藥物。也可以使用適當(dāng)?shù)馁x形劑(如蔗糖)，使含有抗-Siglec-15抗體的藥物組合物以及含有抗-Siglec-15抗體和至少一種骨代謝異常治療劑的藥物組合物形成凍干產(chǎn)品。本發(fā)明的藥物組合物可以制成用于腸胃外施用或用于經(jīng)口服給藥的胃腸道吸收。 制劑的組成和濃度可根據(jù)施用方法確定。本發(fā)明的藥物組合物中所含的抗-Siglec-15抗體對(duì)Siglec-15的親和力越高，也就是說，其對(duì)Siglec-15的解離常數(shù)(Kd值)越低，則抗-Siglec-15抗體可以表現(xiàn)出的藥物效能越多(甚至在減少給人的劑量時(shí))。因此，基于該考慮，也可以確定本發(fā)明的藥物組合物對(duì)人的劑量。對(duì)于劑量，在給人施用人抗-Siglec-15 抗體的情況下，可以以約0. 1-100 mg/kg (每廣180天一次)的劑量施用抗體。本發(fā)明的藥物組合物的劑型的實(shí)例包括包括輸注在內(nèi)的注射劑、栓劑、經(jīng)鼻劑、 舌下劑和經(jīng)皮吸收劑。
實(shí)施例在下文中，參考實(shí)施例更具體地描述本發(fā)明，然而，本發(fā)明不限于此。應(yīng)當(dāng)指出，如無特別說明，在下述實(shí)施例中的與基因操作有關(guān)的各個(gè)操作均根據(jù)在“Molecular Cloning，，( Sambrook, J. , Fritsch, Ε. F.禾口 Maniatis, Τ.著，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989年出版)中所述的方法進(jìn)行，或在使用市售的試劑或試劑盒的情況下，根據(jù)附隨的說明書使用它們。實(shí)施例1可溶性小鼠Siglec-15蛋白表達(dá)構(gòu)建體的制備
編碼小鼠Siglec-15蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的部分核苷酸序列由序列表中的SEQ ID N0: 5 表示，其氨基酸序列由序列表中的SEQ ID N0: 6表示。通過利用這樣的部分序列，可以在動(dòng)物細(xì)胞等的培養(yǎng)上清液中生產(chǎn)可溶性小鼠Siglec-15蛋白。a)通過PCR擴(kuò)增可溶性小鼠Siglec-15基因
按照常規(guī)方法，合成具有序列 5，-ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAG GGGTCCCTCC AACTC-3，(mSiglec-15-ECD-F:序列表中的 SEQ ID N0: 7)的寡核苷酸和具有序列 5，-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc TCCGGGGGCG CCGTGGAAGC GGAAC-3， (mSiglec-15-ECD-R:序列表中的SEQ ID N0: 8)的寡核苷酸，作為通過PCR擴(kuò)增小鼠Siglec-15胞外結(jié)構(gòu)域cDNA的引物。此外，將這些引物設(shè)計(jì)成用于生產(chǎn)gateway進(jìn)入克隆(entry clone)的擴(kuò)增引物，使得在mSiglec-15-ECD_F中添加attBl序列，以及在mSiglec-15-E⑶-R中添加attB2序列。按照常規(guī)方法，使用該引物組合和含有小鼠 Siglec-15的開放讀碼框序列的多核苷酸作為模板，進(jìn)行PCR。熱循環(huán)儀的條件設(shè)定如下 在94°C加熱5分鐘后，重復(fù)“94°C 0.5分鐘、55°C 0.5分鐘以及68°C 1.5分鐘”的溫度循環(huán)15次，再在68°C加熱5分鐘，然后在4°C溫育。b)通過(Gateway BP反應(yīng)制備進(jìn)入克隆
采用以下方法制備進(jìn)入克隆，其中通過采用λ噬菌體位點(diǎn)特異性的重組系統(tǒng)的 Gateway技術(shù)(Invitrogen，Inc.)整合了小鼠Siglec-15胞外結(jié)構(gòu)域cDNA。首先，在兩端帶有在a)中制備的attB序列的PCR產(chǎn)物和pDN0R221 (由hvitrogen，he.生產(chǎn)，它是具有attP序列的供體載體)之間，使用BP Clonase進(jìn)行BP反應(yīng)。通過使用該反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，針對(duì)耐藥的克隆進(jìn)行菌落PCR，并確認(rèn)插入片段的大小。然后，對(duì)已確認(rèn)具有正確大小的插入片段的克隆，實(shí)施插入片段的總DNA序列的序列分析。結(jié)果，得到與編碼小鼠Siglec-15蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的靶核苷酸序列(序列表中的SEQ ID NO: 5)完全相同的進(jìn)入克隆。c)通過(Gateway LR反應(yīng)制備表達(dá)克隆
采用以下方法制備表達(dá)克隆，其中通過采用λ噬菌體位點(diǎn)特異性的重組系統(tǒng)的 Gateway技術(shù)(Invitrogen，Inc.)整合了小鼠Siglec-15胞外結(jié)構(gòu)域cDNA。在b)中制備的進(jìn)入克隆含有在兩端具有attL序列的插入片段。在該進(jìn)入克隆和具有attR序列的兩類目標(biāo)載體之間，使用LR Clonase進(jìn)行LR反應(yīng)。此外，作為目標(biāo)載體，使用兩類目標(biāo)載體設(shè)計(jì)成在插入片段的C端添加V5表位標(biāo)簽和6 XHis標(biāo)簽的pDONM，和設(shè)計(jì)成在插入片段的C 端添加人Fc標(biāo)簽的phlgFc。通過使用由LR反應(yīng)得到的反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHlOBJim 得耐藥的克隆進(jìn)行菌落PCR，并確認(rèn)插入片段的大小。然后，對(duì)已確認(rèn)具有正確大小的插入片段的克隆，進(jìn)行從插入片段側(cè)到載體側(cè)的兩端的序列分析。用于序列分析的引物序列
5' -tgcgtgaagg tgcagggcag-3' (mSiglec-15-ECD-seq-upstm:序歹[J表中白勺 SEQ ID NO: 9) 禾口
5' -cctcgcctgg tcgggtc-3' (mSiglec-15-ECD-seq-dnstm:序列表中的 SEQ ID NO:
10)。序列分析的結(jié)果是分別得到其中發(fā)生pDONM和phlgFc的正確重組的表達(dá)克隆 (可溶性小鼠Siglec-15/pDONM和可溶性小鼠Siglec-15/phIgFc)。通過將可溶性小鼠 Siglec-15/pDONM轉(zhuǎn)染進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞等中，具有序列表中的SEQ ID NO: 11表示的堿基序列的 mRNA被轉(zhuǎn)錄，并被翻譯成具有序列表中的SEQ ID N0:12表示的氨基酸序列的蛋白(小鼠 Siglec-15-His)。此外，通過將可溶性小鼠Siglec-15/phIgFc轉(zhuǎn)染進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞等中，具有序列表中的SEQ ID N0:13表示的堿基序列的mRNA被轉(zhuǎn)錄，并被翻譯成具有序列表中的SEQ ID N0:14表示的氨基酸序列的蛋白(小鼠Siglec-15-Fc)。實(shí)施例2使用293-F細(xì)胞大規(guī)模制備含有可溶性小鼠Siglec-15蛋白的培養(yǎng)液以約5mg的量，分別制備在實(shí)施例1中得到的兩類表達(dá)質(zhì)粒(可溶性小鼠Siglec-15/
pDONM和可溶性小鼠Siglec-15/phIgFc)。此外，在純化來自大規(guī)模培養(yǎng)的大腸桿菌的質(zhì)粒時(shí)，使用 Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep試劑盒(由 Invitrogen, Inc.生產(chǎn))。將如此制備的質(zhì)粒與Opti-MEM (由hvitrogen，Inc.生產(chǎn))混合，將得到的混合物過濾除菌，向其中加入10 ml轉(zhuǎn)染試劑四3作(^丨11 (由hvitrogen，Inc.生產(chǎn))，將得到的混合物在室溫溫育20分鐘。向在錐形瓶中培養(yǎng)的FreeMyle 293-F細(xì)胞(由hvitrogen， Inc.生產(chǎn))中加入該混合物，使在FreeMyle 293表達(dá)培養(yǎng)基(由hvitrogen，Inc.生產(chǎn))中的細(xì)胞密度達(dá)到個(gè)1. IX IO6個(gè)細(xì)胞/mlX5L (IL/燒瓶，5瓶)。在8. 0% CO2濃度、在 37°C、振蕩(125轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)細(xì)胞96小時(shí)(4日)后，收集培養(yǎng)液，并離心，以制備培養(yǎng)上清液。認(rèn)為在這樣制備的培養(yǎng)上清液中，分別表達(dá)其中在小鼠Siglec-15胞外結(jié)構(gòu)域的C端側(cè)已添加V5表位標(biāo)簽和6XHis標(biāo)簽的蛋白(小鼠Siglec-15-His)和其中在小鼠Siglec-15 胞外結(jié)構(gòu)域的C端側(cè)已添加人Fc標(biāo)簽的蛋白(小鼠Siglec-15-Fc)。
實(shí)施例3小鼠Siglec-15-His的純化
a) HisTrap HP柱色譜法
向2L在實(shí)施例2中制備的表達(dá)小鼠Siglec-15-His的細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入225 ml 10 χ 緩沖液(500 mM Tris, 1. 5 M NaCl, 200 mM 咪唑，pH 8.0)，攪拌均勻得到的混合物，并通過Sterivex-GV過濾器(Millipore Co.，Ltd.生產(chǎn))過濾。以2ml/min的流速，將此培養(yǎng)液加載至串聯(lián)的3根HisTrap HP 5 ml柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))，所述柱預(yù)先用熱原去除劑PyroCLEAN (ALerCHEK，Inc.生產(chǎn))處理，并用注射用蒸餾水洗滌。以1 ml/min的流速，使用60 ml含有300mM NaCl的50 mM Tris-HCl緩沖液(pH 8. 0)洗滌該柱，然后使用50 ml含有300 mM NaCl和500 mM咪唑的50 mM Tris-HCl緩沖液(pH 8. 0)，以lml/min的流速，洗脫吸附于柱上的蛋白。在1 ml/級(jí)分，將洗脫液分級(jí) (fractionate)到預(yù)先加入 10 μ 1 10% 吐溫 20 的 Mini-sorp 管(Nunc, Inc.生產(chǎn))中。使用離心膜濃縮器Amicon Ultra-15 (Millipore Co. , Ltd.生產(chǎn))，將約20ml通過合并級(jí)分 (級(jí)分14-20)得到的、含有洗脫蛋白的溶液濃縮至2. 5ml，然后將該濃縮液加載至預(yù)先用含有0. 01%吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水(T-PBQ平衡的PD-10脫鹽柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))，然后用T-PBS洗脫，由此得到3. 5ml樣品，其溶劑被替換為T-PBS。b) Resource Q 柱色譜法
向3. 5ml通過HisTrap HP柱色譜法純化的、其溶劑被替換為T-PBS的樣品中加入 22. 5 ml含有0. 1% CHAPS的50 mM Tris-HCl緩沖液(pH 7. 5)，并攪拌得到的混合物。 然后，將該混合物在4°C、3，000 rpm離心30分鐘，除去沉淀物。通過Millex-GV過濾器 (Millipore Co., Ltd.生產(chǎn))過濾得到的上清液后，將濾液以流速lml/min加載至用含有 0. 1% CHAPS 的 50 mM Tris-HCl 緩沖液(pH 7. 5)預(yù)先平衡的 Resource Q 6 ml 柱(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))上。此后，使用該緩沖液以流速lml/min洗滌柱，收集未吸附于柱上的蛋白級(jí)分。以流速lml/min，用含有0. 1% CHAPS禾Π 1 M NaCl的50 mM Tris-HCl緩沖液(pH 7. 5)洗脫吸附于柱上的蛋白。用離心膜濃縮器Amicon Ultra-15 (Millipore Co.， Ltd.生產(chǎn))將沈.5!111未吸附于柱上的級(jí)分濃縮至2.0!111，然后將該濃縮液在41、3，000 rpm離心10分鐘，并除去沉淀物。在-80°C冷凍保存離心后的上清液備用。重復(fù)上述純化操作(HisTrap HP柱色譜法和Resource Q柱色譜法)兩次。c)純化的小鼠Siglec-15-His的檢測(cè)和純度分析
使用通過上述純化操作(HisTrap HP柱色譜法和Resource Q柱色譜法)制備的樣品， 進(jìn)行在還原條件下的SDS-聚丙烯酰胺電泳和銀染色。也就是說，向5 μ 1經(jīng)各純化步驟純化的每個(gè)樣品中加入等量的SDS-處理液，在95°C熱處理得到的混合物10分鐘。將3 μ 1熱處理過的各樣品用于SDS-聚丙烯酰胺電泳。使用8-25%聚丙烯酰胺梯度凝膠(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))作為電泳凝膠，并使用 PhastSystem (Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))進(jìn)行電泳。此外，使用彩虹分子量標(biāo)志物(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn)) 作為分子量標(biāo)志物。電泳結(jié)束后，使用WiastGel Silver試劑盒(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))和WiastSystem進(jìn)行銀染色。結(jié)果如圖1所示。經(jīng)證實(shí)，在未吸附于Resource Q柱上的蛋白級(jí)分中，分子量為約35 kDa的蛋白(小鼠Siglec-15-His)被有效純化和濃縮。除使用 ECL DualVue 蛋白印跡標(biāo)志物(AmershamBiosciences, he.生產(chǎn))作為分子量標(biāo)志物以外，在相同的條件下進(jìn)行電泳。使用WiastTransfer半干轉(zhuǎn)移試劑盒(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))和PhastSystem，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移(印跡)到 PVDF 膜(Hybond-P, Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))上。將該 PVDF 膜在 IOml 含有 0.1% 吐溫 20 的封閉劑(BlockAce, Snow Brand Milk Products, Co. , Ltd.生產(chǎn))中在室溫輕輕振蕩1小時(shí)。向該封閉溶液中加入10 μ 1 S-蛋白HRP (Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))禾Π 10 μ 1 抗-V5-HRP 抗體(Pk-TAG-HRP 的單克隆抗體，Acris Antibodies 生產(chǎn))，將在溶液中的膜在室溫輕輕振蕩另外1小時(shí)。通過在50ml含有0. 01%吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中輕輕振蕩5分鐘，洗滌PVDF膜4次。洗滌后，按照ECL檢測(cè)試劑盒(Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))所附的方法，處理PVDF膜，以使蛋白條帶顯色，并用 ECL Mini-Camera (Amersham Biosciences, Inc.生產(chǎn))禾口偏光膠片(Polapan 3200B, Polaroid, Inc.生產(chǎn))檢測(cè)顯色。結(jié)果如圖2所示。從該結(jié)果也可確認(rèn)，在未吸附于Resource Q柱的蛋白級(jí)分中，分子量為約35kDa并與抗-V5-HRP抗體反應(yīng)的蛋白(小鼠 Siglec-15-His)被有效純化和濃縮。d)純化的小鼠Siglec-15-His的蛋白純度的測(cè)定
對(duì)于純化的小鼠Siglec-15-His (未吸附于Resource Q柱的蛋白級(jí)分)，使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，用DC蛋白測(cè)定試劑盒(Bio-Rad Laboratories, Inc.生產(chǎn))測(cè)定蛋白濃度。如表1所示，通過進(jìn)行2次純化操作，得到合計(jì)1. 66mg純化的小鼠Siglec-15-His蛋白。表 權(quán)利要求
1.一種抗體或所述抗體的功能片段，所述抗體結(jié)合包含由SEQ ID NO: 2表示的氨基酸序列的氨基酸殘基39-165的多肽，并抑制破骨細(xì)胞形成和/或破骨性骨吸收。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于重鏈序列含有具有⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3的可變區(qū)，且所述⑶RHl包含由SEQ ID NO: 44表示的氨基酸序列，所述⑶RH2包含由SEQ ID NO: 45和SEQ ID NO: 97表示的任一個(gè)氨基酸序列，所述⑶RH3包含由SEQ ID NO: 46表示的氨基酸序列；且輕鏈序列含有具有⑶RL1、⑶RL2和⑶RL3的可變區(qū)，且所述⑶RLl包含由SEQ ID NO: 47表示的氨基酸序列，所述⑶RL2包含由SEQ ID NO: 48表示的氨基酸序列，且所述⑶RL3 包含由SEQ ID NO: 49表示的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有包含由SEQ ID NO: 41表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140的重鏈可變區(qū)序列和包含由SEQ ID NO: 43表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-132的輕鏈可變區(qū)序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗體功能片段，其選自Fab、F(ab')2、Fab'和Fv0
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的抗體，其特征在于它是scFv。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于所述抗體是嵌合抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID NO: 41表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-470，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 43表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-237。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4和6中任一項(xiàng)所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于所述抗體是人源化的。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的抗體，其中所述重鏈具有人免疫球蛋白G2重鏈的恒定區(qū)，且所述輕鏈具有人免疫球蛋白κ輕鏈的恒定區(qū)。
10.一種抑制破骨細(xì)胞形成和/或破骨性骨吸收的抗體或所述抗體的功能片段，其中所述抗體含有(a)選自下述氨基酸序列的重鏈可變區(qū)al) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 51表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 20-140 ；a2) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 53表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 20-140 ；a3) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 55表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 20-140 ；a4) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 57表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 20-140 ；a5) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 59表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 20-140 ；a6) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 99表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 20-140 ；a7) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 101表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140；a8) 一種氨基酸序列，其與選自al)至a7)的任一個(gè)氨基酸序列具有至少95%同源性； a9) 一種氨基酸序列，其與選自al)至a7)的任一個(gè)氨基酸序列具有至少99%同源性；和alO) 一種氨基酸序列，其包含在選自al)至a7)的任一個(gè)氨基酸序列中的一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的置換、刪除或添加；和(b)選自下述氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)bl) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 61表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133；b2) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 63表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 21-133 ；b3) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 65表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 21-133 ；b4) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 67表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 21-132 ；b5) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 69表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 21-133 ；b6) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 71表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 21-133 ；b7) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 103表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 21-133 ；b8) 一種氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 105表示的氨基酸序列的氨基酸殘基 21-133 ；b9) 一種氨基酸序列，其與選自bl)至a8)的任一個(gè)氨基酸序列具有至少95%同源性； blO) 一種氨基酸序列，其與選自bl)至b8)的任一個(gè)氨基酸序列具有至少99%同源性；和bll) 一種氨基酸序列，其包含在選自bl)至b8)的任一個(gè)氨基酸序列中的一個(gè)至幾個(gè)氨基酸殘基的置換、刪除或添加。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 51表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 61表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 53表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 63表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 55表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 65表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 55表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 67表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID NO: 57表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 69表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 59表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 71表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。
17.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 99表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 69表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。
18.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 101表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 69表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。
19.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 99表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 103表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。
20.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列含有重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 99表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-140，且所述輕鏈序列含有輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包含這樣的氨基酸序列，其包含由SEQ ID N0: 105表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-133。
21.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID NO: 51表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-470，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID NO: 61表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。
22.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID NO: 53表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-470，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID NO: 63表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。
23.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID NO: 55表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-470，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 65表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。
24.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID N0: 55表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-470，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 67表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-237。
25.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID N0: 57表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-470，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 69表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。
26.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID N0: 59表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-470，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 71表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。
27.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID N0: 99表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 69表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。
28.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID N0: 101表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466， 且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 69表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。
29.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID N0: 99表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 103表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。
30.根據(jù)權(quán)利要求10所述的抗體或所述抗體的功能片段，其特征在于含有重鏈序列和輕鏈序列，所述重鏈序列包含由SEQ ID N0: 99表示的氨基酸序列的氨基酸殘基20-466，且所述輕鏈序列包含由SEQ ID N0: 105表示的氨基酸序列的氨基酸殘基21-238。
31.一種藥物組合物，其特征在于包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-30所述的抗體或所述抗體的功能片段。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的藥物組合物，其特征在于是骨代謝異常的治療劑和/或預(yù)防劑。
33.一種用于治療和/或預(yù)防骨代謝異常的藥物組合物，其特征在于包含至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-30所述的抗體或所述抗體的功能片段和至少一個(gè)選自下述的成員二膦酸鹽、活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺激素)、非甾體類抗炎藥、可溶性TNF受體、抗-TNF- α抗體或所述抗體的功能片段、抗-PTHrP (甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白)抗體或所述抗體的功能片段、IL-I受體拮抗劑、抗-IL-6受體抗體或所述抗體的功能片段、抗-RANKL抗體或所述抗體的功能片段以及OCIF (破骨細(xì)胞生成抑制因子)。
34.根據(jù)權(quán)利要求32或33所述的藥物組合物，其中所述骨代謝異常選自骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞、癌性高鈣血癥、伴隨多發(fā)性骨髓瘤或癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞、巨細(xì)胞瘤、骨質(zhì)減少、牙周炎導(dǎo)致的牙缺失、人工關(guān)節(jié)周圍的骨溶解、慢性骨髓炎中的骨破壞、骨佩吉特病、腎性骨營養(yǎng)不良和成骨不全。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的藥物組合物，其特征在于所述骨代謝異常是骨質(zhì)疏松癥、 伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞或伴隨癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的藥物組合物，其特征在于所述骨代謝異常是骨質(zhì)疏松癥。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的藥物組合物，其特征在于所述骨質(zhì)疏松癥是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用諸如類固醇或免疫抑制劑等治療劑導(dǎo)致的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。
38.一種治療和/或預(yù)防骨代謝異常的方法，其特征在于施用至少一種根據(jù)權(quán)利要求 1-30所述的抗體或所述抗體的功能片段。
39.一種治療和/或預(yù)防骨代謝異常的方法，其特征在于同時(shí)或相繼施用至少一種根據(jù)權(quán)利要求1-30所述的抗體或所述抗體的功能片段和至少一個(gè)選自下述的成員二膦酸鹽、活性維生素D3、降鈣素及其衍生物、激素例如雌二醇、SERM (選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑)、依普黃酮、維生素K2 (四烯甲萘醌)、鈣制劑、PTH (甲狀旁腺激素)、非甾體類抗炎藥、 可溶性TNF受體、抗-TNF- α抗體或所述抗體的功能片段、抗-PTHrP (甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白)抗體或所述抗體的功能片段、IL-I受體拮抗劑、抗-IL-6受體抗體或所述抗體的功能片段、抗-RANKL抗體或所述抗體的功能片段以及OCIF (破骨細(xì)胞生成抑制因子)。
40.根據(jù)權(quán)利要求38或39所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述骨代謝異常是骨質(zhì)疏松癥、伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨破壞或伴隨癌的骨轉(zhuǎn)移的骨破壞。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述骨代謝異常是骨質(zhì)疏松癥。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的治療和/或預(yù)防方法，其特征在于所述骨質(zhì)疏松癥是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥、老年性骨質(zhì)疏松癥、由使用諸如類固醇或免疫抑制劑等治療劑導(dǎo)致的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥或伴隨類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松癥。
43.一種多核苷酸，其編碼根據(jù)權(quán)利要求3、7和10-30中任一項(xiàng)所述的抗體。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的多核苷酸，其特征在于含有包含由SEQID NO: 40表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列，和包含由SEQ ID NO: 42表示的核苷酸序列的核苷酸61-396的核苷酸序列。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的多核苷酸，其特征在于含有包含由SEQID NO: 40表示的核苷酸序列的核苷酸58-1410的核苷酸序列，和包含由SEQ ID NO: 42表示的核苷酸序列的核苷酸61-711的核苷酸序列。
46.根據(jù)權(quán)利要求43所述的多核苷酸，其特征在于含有(a) 一種多核苷酸，其選自下述的核苷酸序列al) 一種核苷酸序列，其包含由SEQ ID NO: 50表示的核苷酸序列的核苷酸58-420 ；a2) 一種核苷酸序列，其包含由SEQ ID NO a3) 一種核苷酸序列，其包含由SEQ ID NO a4) 一種核苷酸序列，其包含由SEQ ID NO a5) 一種核苷酸序列，其包含由SEQ ID NO a6) 一種核苷酸序列，其包含由SEQ ID NO -種核苷酸序列，其包含由SEQ ID NO52表示的核苷酸序列的核苷酸58-420 54表示的核苷酸序列的核苷酸58-420 56表示的核苷酸序列的核苷酸58-420 58表示的核苷酸序列的核苷酸58-420 98表示的核苷酸序列的核苷酸58-420 100表示的核苷酸序列的核苷酸58-420 ；a7)a8)多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下與包含選自al)至a7)的任一個(gè)核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列的多核苷酸雜交；和a9) 一種核苷酸序列，其包含在選自al)至a7)的任一個(gè)核苷酸序列中的一個(gè)至幾個(gè)氨基酸的置換、刪除或添加；和(b) 一種多核苷酸，其選自下述的核苷酸序列bl)一種核苷酸序列，其包含由SEQ ID NOb2)一種核苷酸序列，其包含由SEQ ID NOb3)一種核苷酸序列，其包含由SEQ ID NOb4)一種核苷酸序列，其包含由SEQ ID NOb5)一種核苷酸序列，其包含由SEQ ID NOb6)一種核苷酸序列，其包含由SEQ ID NOb7)一種核苷酸序列，其包含由SEQ ID NO -種核苷酸序列，其包含由SEQ ID NO60表示的核苷酸序列的核苷酸61-399 62表示的核苷酸序列的核苷酸61-399 64表示的核苷酸序列的核苷酸61-399 66表示的核苷酸序列的核苷酸61-396 68表示的核苷酸序列的核苷酸61-399 70表示的核苷酸序列的核苷酸61-399 102表示的核苷酸序列的核苷酸61-399 ； 104表示的核苷酸序列的核苷酸61-399 ；b8)b9)多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下與包含選自bl)至b8)的任一個(gè)核苷酸序列的互補(bǔ)核苷酸序列的多核苷酸雜交；和blO) 一種核苷酸序列，其包含在選自bl)至b8)的任一個(gè)核苷酸序列中的一個(gè)至幾個(gè)核苷酸的置換、刪除或添加。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 50表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID NO: 60表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。
48.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 52表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID NO: 62表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。
49.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: M表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 64表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。
50.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: M表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 66表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。
51.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 56表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 68表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。
52.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 58表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID NO: 70表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。
53.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 98表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID NO: 68表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。
54.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 100表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 68表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。
55.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 98表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 102表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。
56.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 98表示的核苷酸序列的核苷酸58-420的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 104表示的核苷酸序列的核苷酸61-399的核苷酸序列。
57.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 50表示的核苷酸序列的核苷酸58-1410的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 60表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。
58.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 52表示的核苷酸序列的核苷酸58-1410的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 62表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。
59.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: M表示的核苷酸序列的核苷酸58-1410的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 64表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。
60.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: M表示的核苷酸序列的核苷酸58-1410的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 66表示的核苷酸序列的核苷酸61-711的核苷酸序列。
61.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 56表示的核苷酸序列的核苷酸58-1410的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 68表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。
62.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 58表示的核苷酸序列的核苷酸58-1410的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 70表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。
63.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 98表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID N0: 68表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。
64.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 100表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID N0: 68表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。
65.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 98表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID NO: 102表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。
66.根據(jù)權(quán)利要求46所述的多核苷酸，其特征在于含有這樣的多核苷酸，其含有包含由SEQ ID NO: 98表示的核苷酸序列的核苷酸58-1398的核苷酸序列；和這樣的多核苷酸， 其含有包含由SEQ ID NO: 104表示的核苷酸序列的核苷酸61-714的核苷酸序列。
67.一種載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求43-66所述的任一種多核苷酸。
68.一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求43-66所述的任一種多核苷酸。
69.一種轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求67所述的載體。
70.一種生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求3、7和10-30中任一項(xiàng)所述的抗體的方法，所述方法包括 培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求68或69所述的宿主細(xì)胞，并從得到的培養(yǎng)產(chǎn)物純化抗體。
全文摘要
公開了用于治療和/或預(yù)防骨代謝異常的藥物組合物，其靶向由在破骨細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)的基因編碼的蛋白。具體地，公開了含有抗體等的藥物組合物，所述抗體特異性地識(shí)別人Siglec-15且具有抑制破骨細(xì)胞形成的活性。
文檔編號(hào)A61P35/04GK102272306SQ201080004195
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2010年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月9日
發(fā)明者中山麻紀(jì)子, 晝間由晴, 瀧澤剛, 津田英資 申請(qǐng)人:第一三共株式會(huì)社