專利名稱：通過修飾細(xì)胞穿透肽提高給藥系統(tǒng)的靶向選擇性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞穿透肽的修飾以達(dá)到低毒的具有主動(dòng)靶向選擇功能的給藥系統(tǒng)，其所在的技術(shù)領(lǐng)域與生命科學(xué)和生物醫(yī)藥技術(shù)相關(guān)。
背景技術(shù)：
從蛋白中分離出來的具有細(xì)胞穿透活性的肽鏈叫細(xì)胞穿透肽，它一般是由小于30個(gè)氨基酸的肽鏈組成，在生理PH條件下帶正電。目前細(xì)胞穿透肽有蛋白衍生的肽鏈，模型肽鏈和設(shè)計(jì)肽鏈三種類型。其目前報(bào)道的具有穿透功能的氨基酸序列不下百種。目前，對細(xì)胞穿透肽入胞機(jī)制的研究主要包括轉(zhuǎn)導(dǎo)模式和內(nèi)吞模式。其中，轉(zhuǎn)導(dǎo)模式包括直接穿膜和跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)模式，在這種模式下，細(xì)胞穿透肽可通過打孔、地毯式或形成反轉(zhuǎn)微團(tuán)的形式進(jìn)入細(xì)胞；在內(nèi)吞模式下，細(xì)胞穿透肽通過不同的囊泡進(jìn)入細(xì)胞，然后釋放入胞漿和胞核。在生命科學(xué)和生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域里，細(xì)胞穿透肽主要是作為模型藥物、基因或成像基團(tuán)穿透細(xì)胞膜的功能基團(tuán)，目前有關(guān)細(xì)胞穿透肽在這個(gè)領(lǐng)域的研究主要有以下兩個(gè)方第一、直接與藥物、基因或示蹤劑連接。通過合理設(shè)計(jì)，在細(xì)胞穿透肽末端引入功能基團(tuán)，與藥物、基因或示蹤劑通過共價(jià)鍵相連，從而攜帶藥物、基因或示蹤劑穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。第二、細(xì)胞穿透肽用于修飾載體給藥系統(tǒng)，將載體輸送到細(xì)胞內(nèi)，通過載體在胞內(nèi)的作用釋放藥物、基因或示蹤劑。盡管與其他生物大分子轉(zhuǎn)運(yùn)方式相比，細(xì)胞穿透肽的運(yùn)載穿透潛能有很多獨(dú)特之處，但在應(yīng)用中仍然存在很多困擾。在抗腫瘤治療領(lǐng)域，其中一個(gè)比較突出的問題是細(xì)胞穿透肽攜帶藥物或給藥系統(tǒng)進(jìn)入機(jī)體后缺乏細(xì)胞選擇性，同時(shí)其自身攜帶的正電荷在一定程度上能夠引起細(xì)胞毒性，從而限制了其在臨床上的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)可激活的細(xì)胞穿透肽，使之能夠有效地提高細(xì)胞穿透肽的細(xì)胞選擇性，并將其與負(fù)載的藥物、基因、示蹤劑或藥物載體相連，組成主動(dòng)靶向給藥系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)細(xì)胞的靶向輸送并發(fā)揮藥效；同時(shí)降低其在運(yùn)輸過程中引起的細(xì)胞毒性。本發(fā)明通過對已知肽段的合理結(jié)合，使其成為可激活的、靶向性的、可載藥或載體的功能基團(tuán)，通過腫瘤部位過度表達(dá)的酶激活形成穿透肽序列，實(shí)現(xiàn)特異性對腫瘤細(xì)胞膜的穿透并在胞內(nèi)釋放藥物，從而產(chǎn)生腫瘤抑制作用。如附圖1所示。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的可激活細(xì)胞穿透肽共包括以下三部分1)帶有正電荷的細(xì)胞穿透肽段，發(fā)揮穿透細(xì)胞膜的作用；幻腫瘤部位高表達(dá)的酶可識別的底物肽段，在相應(yīng)酶作用下可斷裂；3)帶有負(fù)電荷的屏蔽肽段，屏蔽陽性的肽段在輸送過程中對機(jī)體的毒性。酶解底物肽序列位于屏蔽肽序列和穿膜肽序列的中間連接組成可激活細(xì)胞穿透肽。
本發(fā)明目的涉及的可激活細(xì)胞穿透肽中帶有負(fù)電荷的屏蔽肽段主要是由天冬氨酸O)，谷氨酸(E)為主的肽序列，或以D，E與其它氨基酸組成的肽序列。肽序列的長度為4到20個(gè)氨基酸范圍。肽段的凈電荷為負(fù)，有效地屏蔽穿透序列所帶的正電荷。本發(fā)明目的涉及的可激活細(xì)胞穿透肽中酶解底物肽序列能夠被腫瘤部位高表達(dá)的酶有效水解。這種酶主要包括基質(zhì)金屬蛋白酶，前列腺特異抗原酶，組織蛋白酶，彈性蛋白酶和尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑。針對上述酶可酶解的肽序列為下列序列中的任意一種?？杀换|(zhì)金屬蛋白酶酶解的 PLGLAG，PLGLAR, GPQGIAGQ, VPMSMRGG, IPVSLRSG, RPFSMIMG,VPLSLTMG, VPLSLYSG，IPESLRAG ；可被前列腺特異抗原酶酶解的 HSSKUIL，SSKYQ, HSSKYQ ；可被組織蛋白酶酶解的1 , GFLG，GFGG，ALAL ；可被彈性蛋白酶酶解的AAPV ；可被尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑酶解的GGGRR。本發(fā)明目的涉及的可激活細(xì)胞穿透肽中的所有氨基酸可以是天然的L型氨基酸，也可以是人工合成的D型氨基酸，根據(jù)需要可做出選擇。本發(fā)明目的涉及的可激活細(xì)胞穿透肽中帶有正電荷的細(xì)胞穿透肽段是由低于30個(gè)氨基酸序列組成的。肽段呈現(xiàn)兩親性、凈電荷為正，能穿過生物膜并攜帶多種生物分子，所述的細(xì)胞穿透肽段可選自源于人免疫缺陷病毒轉(zhuǎn)錄激活因子Tat，源于I型單純皰疹病毒(HSV-I)蛋白的VP22，源于果蠅同源觸角蛋白(Antp)的Penetratin，由促生長激素神經(jīng)肽和黃蜂毒素改造而成的"Transportan，人工合成的由大T抗原核定位序列與不同疏水肽段組成的兼性分子MPG，MAP, Pep-I，從4個(gè)到15 個(gè)不同長度的多聚精氨酸序列，SynBl, Polyomavirus Vpl, Bac, NF-κ B, SV40Tantigen,HATF3, hCT, pVEC, Integrin, DPV6, S413PV, Poly-P 中的一種。本發(fā)明目的涉及的可激活細(xì)胞穿透肽是從屏蔽肽序列、酶解底物肽序列和細(xì)胞穿膜肽序列中各自選取一個(gè)，根據(jù)不同的需要自由組合。例如，針對基質(zhì)金屬蛋白酶酶解的可激活細(xì)胞穿透肽序列有 DGGDG⑶GGDCRALGLPKRRRRRRRRR，DG⑶GGDG⑶GPLGLAGrrrrrrrrrC (r為人工合成精氨酸)，CEEEEEXIPESLRAGRRRRRRXKC, EEEEEXPLGLAGRRRRRRXKC 等；針對前列腺特異抗原酶酶解的可激活細(xì)胞穿透肽序列DGGDGGDGGDGHSSKLQrrrrrrrrr、DGGDG⑶GGDGSSKYQLLIILRRRIRKQAHAHSK 或 CEEEEEHSSKYQKLALKALKALKAALKLA 等；針對組織蛋白酶酶解的可激活細(xì)胞穿透肽序列DGGDGGDGGDGGFLGKFHTFPQTAIGVGAP或DGGDGGDGGDGALALKETffffETffffTEffSQPKKRKV等；針對彈性蛋白酶酶解的可激活細(xì)胞穿透肽序列CEEEEEAAPVGRKKRRQRRRPQ等；針對尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑酶解的可激活細(xì)胞穿透肽序列 CEEEEEGGGRRRRLSSYSSRRRF 等。本發(fā)明所設(shè)計(jì)的具有可激活細(xì)胞穿透肽的給藥系統(tǒng)主要包括以下兩種1)利用連接物，可激活細(xì)胞穿透肽的穿透肽末端直接與藥物共價(jià)或非共價(jià)連接；幻可激活細(xì)胞穿透肽與給藥載體連接。本發(fā)明目的涉及的具有可激活細(xì)胞穿透肽的給藥載體為可激活細(xì)胞穿透肽的穿膜肽末端與活性藥物和/或示蹤劑共價(jià)連接和/或非共價(jià)連接，可激活細(xì)胞穿透肽發(fā)揮主動(dòng)靶向和穿透細(xì)胞膜作用，活性藥物或示蹤劑進(jìn)入細(xì)胞后發(fā)揮抑制細(xì)胞生長或顯影作用。所述的具有抗癌活性的藥物包括阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、絲裂霉素、柔紅霉素、順鉬、卡鉬、喜樹堿、羥基喜樹堿、長春新堿、博萊霉素、5-氟尿嘧啶、環(huán)磷酰胺、吉西他濱、甲氨蝶呤、卡培他濱、洛莫司汀、依托泊苷，示蹤劑包括熒光物質(zhì)、放射性同位素，量子點(diǎn)，生物活性物質(zhì)包括DNA，RNA，蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)中的一種或多種。
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本發(fā)明目的涉及的具有可激活細(xì)胞穿透肽的給藥系統(tǒng)為可激活細(xì)胞穿透肽與載體材料組構(gòu)筑成的載體給藥系統(tǒng)，可激活細(xì)胞穿透肽發(fā)揮主動(dòng)靶向和穿透細(xì)胞膜作用，載體釋放包裹的藥物發(fā)揮抑制細(xì)胞生長作用。所述的載體可選自共聚物、脂質(zhì)體、膠束、聚電解質(zhì)共聚物、納米粒、納米囊、乳劑、微乳中的一種。本發(fā)明目的涉及的具有可激活細(xì)胞穿透肽給藥系統(tǒng)是利用細(xì)胞穿透肽攜帶藥物或載藥載體實(shí)現(xiàn)穿膜入胞作用和利用腫瘤細(xì)胞分泌的特異性酶酶解特殊肽段實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向作用。與細(xì)胞穿透肽給藥系統(tǒng)相比，可激活細(xì)胞穿透肽給藥系統(tǒng)能夠基本消除或減輕對正常細(xì)胞的穿膜作用，減少非特異性分布對正常細(xì)胞造成的損害，實(shí)現(xiàn)主動(dòng)靶向的目的。同時(shí)，由于屏蔽肽序列對正電荷屏蔽作用的應(yīng)用，能夠有效地降低可激活細(xì)胞穿透肽給藥系統(tǒng)在體內(nèi)傳遞過程中對正常細(xì)胞造成的毒性。


附圖1 具有可激活細(xì)胞穿透肽的給藥系統(tǒng)的入胞模擬圖。可激活細(xì)胞穿透肽攜帶的藥物或載藥載體，通過腫瘤部位高表達(dá)的特異性的酶將其對應(yīng)的底物肽段劈裂，暴露細(xì)胞穿透肽段，從而穿透細(xì)胞進(jìn)入胞內(nèi)。并且利用不同細(xì)胞所分泌的不同的酶對特異性的可酶解肽段的劈裂，實(shí)現(xiàn)靶向效應(yīng)。附圖2 可激活細(xì)胞穿透肽-阿霉素共聚物。圖中a為阿霉素，b為中間連接物，c為可激活細(xì)胞穿透肽。附圖3 可激活細(xì)胞穿透肽-阿霉素共聚物對腫瘤細(xì)胞的抗增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。附圖4:可激活細(xì)胞穿透肽-甲氨蝶呤共聚物。圖中a為甲氨蝶呤，b為可激活細(xì)胞穿透肽。附圖5 可激活細(xì)胞穿透肽與親和素形成的復(fù)合物對細(xì)胞入胞分析的流式細(xì)胞檢測結(jié)果圖。附圖6 可激活細(xì)胞穿透肽修飾的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 可激活細(xì)胞穿膜肽的酶解研究設(shè)計(jì)和合成可激活細(xì)胞穿膜肽，可激活細(xì)胞穿膜肽序列為EEEEEXPLGLAGRRRRRRXKC。對合成的可激活細(xì)胞穿膜肽進(jìn)行酶解研究。采用反相高效液相色譜監(jiān)測37°C條件下IV型膠原酶(含有MMP-2和9)對可激活細(xì)胞穿膜肽的酶解過程。收集酶解成分進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測，比對推測酶解碎片的序列。HPLC檢測可活化細(xì)胞穿透肽的峰位和酶解反應(yīng)后的圖譜變化情況，不同濃度的可活化細(xì)胞穿透肽溶液都在14. 8min左右處有吸收峰(MALDI-TOF-MS檢測分子量為2567. 24(M+H+)。可以確定14. Smin的峰即為試驗(yàn)HPLC條件下可活化細(xì)胞穿透肽的特征吸收峰)，峰高和峰面積隨可活化細(xì)胞穿透肽溶液濃度的升高而增大，峰面積與可活化細(xì)胞穿透肽濃度呈線性關(guān)系。隨著酶解時(shí)間的延長，出現(xiàn)降解產(chǎn)物的峰，可活化細(xì)胞穿透肽的峰面積逐漸減少。37°C時(shí)，可活化細(xì)胞穿透肽降解一半的時(shí)間(T1/2)約為4h。將分解峰收集，凍干，進(jìn)行MALDI-T0F-MS檢測。通過MALDI-T0F-MS解析及序列分析，酶解肽段包括G-R-R-R-R-R-R(理論m/z值為 1012. 27，試驗(yàn) m/z 值為 1012. 54) ；P-L-G-L-A-G-R-R-R-R (理論 m/z 值為 1151. 50，試驗(yàn) m/z 值為 1150. 67)，E-E-E-E-E-X-P (理論 m/z 值為 873. 98，試驗(yàn) m/z 值為 873. 49)，
E-E-E-E-E-X-P-L (理論 m/z 值為 987. 15，試驗(yàn) m/z 值為 986. 55)，E-E-E-E-X-P-L-G-L-A (理
論 m/z 值為 1099. ；35，試驗(yàn) m/z 值為 1099. 69)，E-E-E-E-E-X-P-L_G (理論 m/z 值為 1044. 22，
試驗(yàn)m/z值為1043. 6)?？杉せ罴?xì)胞穿膜肽可以被IV型膠原酶裂解，釋放出細(xì)胞穿膜肽，酶
解發(fā)生于目標(biāo)位點(diǎn)PLGLAG，酶解產(chǎn)物包括但不排除可活化細(xì)胞穿透肽裂解后肽段的再次斷m農(nóng)。實(shí)施例2 可激活細(xì)胞穿透肽-阿霉素共聚物對腫瘤細(xì)胞的抗增殖考察可激活細(xì)胞穿透肽，序列為DGGDGGDGGDGPLGLAGrrrrrrrrrC，與阿霉素通過中間連接物3-馬來酰亞胺丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(CAS :55750-62-4)化學(xué)鍵和形成共聚物(如附圖2所示)。其具體過程為二甲基甲酰胺分別溶解阿霉素和3-馬來酰亞胺丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯，加入三乙胺調(diào)節(jié)PH值，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)后倒入50ml乙醚中，析出的沉淀用無水乙醚洗2次，離心分離沉淀并真空干燥；取沉淀和可激活細(xì)胞穿透肽用二甲基甲酰胺溶解，并加入三乙胺，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2小時(shí)后倒入IOml乙醚中，析出的沉淀用無水乙醚洗2次，離心分離沉淀，真空干燥后得到目標(biāo)共聚物。人纖維肉瘤細(xì)胞HT-1080，MMP酶高表達(dá)，對肽段PLGLAG有特異性降解作用；人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，MMP酶表達(dá)較少。將兩種細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液中培養(yǎng)，利用兩種細(xì)胞做體外抗增殖實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如附圖3所示。游離藥阿霉素在兩種細(xì)胞中都具有很強(qiáng)的抗增殖能力，但對于可激活細(xì)胞穿透肽-阿霉素共聚物而言，由于人乳腺癌細(xì)胞MCF-7分泌的MMP酶較少，不能有效地酶解肽段PLGLAG，使得阿霉素入胞能力低，從而導(dǎo)致細(xì)胞抗增殖能力較弱；由于人纖維肉瘤細(xì)胞HT-1080中MMP酶的高表達(dá)，有效地降解肽段PLGLAG，釋放細(xì)胞穿透肽，使其攜帶阿霉素進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)抗增殖作用。實(shí)施例3 可激活細(xì)胞穿透肽-甲氨蝶呤共聚物對腫瘤細(xì)胞的抑制作用 可激活細(xì)胞穿透肽，序列為DGGDGGDGGDGPLGLAGrrrrrrrrrC，與甲氨蝶呤形成共聚物(如附圖4所示)。人纖維肉瘤細(xì)胞HT-1080，MMP酶高表達(dá)，對肽段PLGLAG有特異性降解作用；人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，MMP酶表達(dá)較少。將兩種細(xì)胞在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液中培養(yǎng)，考察可激活細(xì)胞穿透肽-甲氨蝶呤共聚物在HT-1080和MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。結(jié)果顯示，游離藥甲氨蝶呤在兩種細(xì)胞中都具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，抑制了細(xì)胞的生長；可激活細(xì)胞穿透肽-甲氨蝶呤共聚物在HT-1080細(xì)胞中，孵育池的細(xì)胞抑制率達(dá)到20%，孵育24h的細(xì)胞抑制率與游離甲氨蝶呤組相當(dāng)；可激活細(xì)胞穿透肽-甲氨蝶呤共聚物在MCF-7細(xì)胞中，孵育池的細(xì)胞抑制率< 2%，孵育24h的細(xì)胞抑制率為10%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于游離甲氨蝶呤組。由于人乳腺癌細(xì)胞MCF-7分泌的MMP酶較少，不能有效地酶解肽段PLGLAG，使得阿霉素入胞能力低，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒作用較弱；由于人纖維肉瘤細(xì)胞HT-1080中MMP酶的高表達(dá)，有效地降解肽段PLGLAG，釋放細(xì)胞穿透肽，使其攜帶甲氨蝶呤進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。實(shí)施例4 可激活細(xì)胞穿透肽攜帶蛋白特異性激活入胞的考察合成帶有熒光素標(biāo)記的生物素的可激活細(xì)胞穿透肽，序列為DGGDGGDGGDCRALGLPKRRRRRRRRR-biotin，與親和素以摩爾比為4 1在37°C下孵育15分鐘，形成復(fù)合物。對基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)高表達(dá)的人纖維肉瘤細(xì)胞HT-1080和MMP酶表達(dá)較少的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7進(jìn)行傳代培養(yǎng)，然后進(jìn)行下列操作1)加入復(fù)合物后孵育一段時(shí)間，利用臺盼藍(lán)在流式細(xì)胞儀檢測之前處理細(xì)胞5min以猝滅細(xì)胞膜吸附的熒光，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果如附圖5所示。從附圖5可以看出，在復(fù)合物入胞過程中，MMP酶起到了決定性的作用。在可活化細(xì)胞穿透肽未被活化之前，帶負(fù)電荷的屏蔽肽序列屏蔽了細(xì)胞穿膜肽的正電荷，細(xì)胞穿膜肽的活性被由具有負(fù)電荷的屏蔽肽序列掩蓋，暫時(shí)失去細(xì)胞膜穿透功能，但是當(dāng)人纖維肉瘤細(xì)胞HT-1080中高表達(dá)的MMP酶對肽段RALGLP有效酶解后，屏蔽肽序列與細(xì)胞穿膜肽序列分離釋放出細(xì)胞穿膜肽從而發(fā)揮功能，攜帶親和素進(jìn)入到胞內(nèi)。而在MMP酶表達(dá)較少的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞中，這種入胞行為非常的弱。同時(shí)，激活并穿膜入胞是具有一定的時(shí)間依賴性的，隨著時(shí)間的延長，有利于復(fù)合物的入胞行為。實(shí)施例5 可激活細(xì)胞穿透肽-脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)合成含有可激活細(xì)胞穿透肽(ABC)的脂材DSPE-PEG-ABC，ABC序列為DGGDGGDGGDG-HSSKLQ-rrrrrrrrr，將脂材(EPC Chol DSPE-PEG-ABC, 60 40 5，摩爾比)與規(guī)定量紫杉醇共溶于氯仿，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，真空干燥過夜得均勻脂膜。加入IOmMHEPES緩沖液(pH 7. 4)渦旋水化，脂質(zhì)體懸液擠出通過雙層聚碳酸酯膜(孔徑0. 2 μ m)，即得載紫杉醇可活化細(xì)胞穿透肽修飾的長循環(huán)脂質(zhì)體(附圖6)。過kpharose CL-4B葡聚糖凝膠柱分離脂質(zhì)體和游離藥物，收集洗脫液，利用HPLC法測算得載紫杉醇靶向脂質(zhì)體的平均包封率為91. 24% (n =幻。用激光散射粒徑儀測定載紫杉醇靶向脂質(zhì)體平均粒徑為(138士36. 9)nm(n = 3)。PC-3和LNCaP為常用的兩種前列腺癌細(xì)胞系，其中LNCaP分泌前列腺特異性抗原(PSA)，PC-3則不分泌PSA，PSA可特異性地裂解HSSKLQ肽段。本實(shí)驗(yàn)將兩種細(xì)胞在規(guī)定培養(yǎng)液中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用胰酶消化后接種于96孔板中，加入載紫杉醇可活化細(xì)胞穿透肽修飾的長循環(huán)脂質(zhì)體(紫杉醇終濃度100nmOl/L)，37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)7 后，每孔加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)，4h后，吸掉上清液，每孔加入DMSO 200 μ 1，以570nm波長檢測每孔吸光度㈧值，測算細(xì)胞抑制率，PC-3和LNCaP的平均抑制率分別為12. 53% (n = 3)和68. 32% (n = 3)，證明含有可激活細(xì)胞穿透肽的靶向脂質(zhì)體的抗腫瘤活性與前列腺特異性抗原(PSA)的分泌量相關(guān)。實(shí)施例6 可激活細(xì)胞穿透肽-脂質(zhì)體雙靶向給藥系統(tǒng)合成含有可激活細(xì)胞穿透肽(ABC)的脂材DSPE-PEG-ABC，ABC序列為DG⑶GGDG⑶G-HSSKLQ-rrrrrrrrr，將脂材(EPC Chol DSPE-PEG-ABC DSPE-PEG-folate,60 40 3 3，摩爾比)與規(guī)定量紫杉醇共溶于氯仿，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿，真空干燥過夜得均勻脂膜。加入IOmM HEPES緩沖液(pH 7.4)渦旋水化，脂質(zhì)體懸液擠出通過雙層聚碳酸酯膜(孔徑0. 2 μ m)，即得載紫杉醇可活化細(xì)胞穿透肽修飾的長循環(huán)雙靶向脂質(zhì)體。過kpharose CL-4B葡聚糖凝膠柱分離脂質(zhì)體和游離藥物，收集洗脫液，利用HPLC法測算得載紫杉醇雙靶向脂質(zhì)體的平均包封率為92. 13% (η = ； )。用激光散射粒徑儀測定載紫杉醇雙靶向脂質(zhì)體平均粒徑為(141. 25士沈.89)nm(n = 3)。將PC-3和LNCaP兩種細(xì)胞在規(guī)定培養(yǎng)液中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用胰酶消化后接種于96孔板中，加入載紫杉醇可活化細(xì)胞穿透肽修飾的長循環(huán)雙靶向脂質(zhì)體(紫杉醇終濃度100nmOl/L)，37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)7 后，每孔加入MTT繼續(xù)培養(yǎng)，4h后，吸掉上清液，每孔加入DMSO 200 μ 1，以570nm波長檢測每孔吸光度(A)值，測算細(xì)胞抑制率，PC-3和LNCaP的平均抑制率分別為9. 64% (η = 3)和89. 63% (n = 3),證明含有可激活細(xì)胞穿透肽的雙靶向脂質(zhì)體的抗腫瘤活性與前列腺特異性抗原(PSA)的分泌量相關(guān)。實(shí)施例7 可激活細(xì)胞穿透肽-膠束給藥系統(tǒng)合成含有可激活細(xì)胞穿透肽(ABC)的脂材DSPE-PEG-ABC，ABC序列為DG⑶GGDG⑶G-HSSKI^Q-rrrrrrrrr，將含有可激活細(xì)胞穿透肽的脂材(DSPE-PEG-ABC)與PEG-DSPE 二嵌段共聚物和多西紫杉醇混合，形成內(nèi)核疏水，外部親水的膠束載體系統(tǒng)，疏水性藥物包載于疏水內(nèi)核中。用激光散射粒徑儀測定載紫杉醇膠束的平均粒徑為15-lOOnm，利用HPLC法測算得載多西紫杉醇膠束的平均包封率大于60%。與PC-3和LNCaP細(xì)胞孵育，分泌前列腺特異性抗原(PSA)的LNCaP細(xì)胞顯示出高的細(xì)胞內(nèi)熒光，是PC-3細(xì)胞的5倍。MTT分析結(jié)果顯示對LNCaP細(xì)胞抑制率是對PC-3細(xì)胞的抑制率的3倍。實(shí)施例8 可激活細(xì)胞穿透肽-納米粒給藥系統(tǒng)阿霉素與PEG通過GFLG相連，形成納米復(fù)合物(PEG-GFLG-阿霉素)，其中PEG的分子量為2000-50000中的任意一種。GFLG可以被腫瘤組織特異分泌的組織蛋白酶(cathepsin B，主要存在于溶酶體內(nèi))水解斷裂，在腫瘤組織釋放阿霉素，殺傷腫瘤細(xì)胞。小鼠體內(nèi)結(jié)果顯示，PEG-GFLG-阿霉素納米粒的體內(nèi)消除半衰期是游離阿霉素的10倍以上，PEG的分子量為4萬或5萬的納米粒的體內(nèi)消除半衰期達(dá)到游離阿霉素的20倍，小鼠S180肉瘤模型的生命延長率為86. 2% -152. 3% (與治療方案有關(guān))。實(shí)施例9 可激活細(xì)胞穿透肽-膠束給藥系統(tǒng)設(shè)計(jì)和合成可激活細(xì)胞穿膜肽-膠束給藥系統(tǒng)，可激活細(xì)胞穿膜肽序列為DGGDGGDGGDGGFLGKFHTFPQTAIGVGAP，將其連接到甲基丙烯酸二甲胺乙酯(親水端)和聚己內(nèi)酯(疏水端)膠束的親水端上，在HAc-NaAc buffer (20mM, pH 5.0)的條件下形成膠束，將紫杉醇的DMSO溶液滴加到膠束溶液中，超聲形成載藥的膠束給藥系統(tǒng)。由于腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)的組織蛋白酶，有效地識別GFLG序列并使其水解，穿透序列KFHTFPQTAIGVGAP發(fā)揮作用攜帶載藥膠束進(jìn)入胞漿釋放藥物，發(fā)揮藥效。實(shí)施例10 可激活細(xì)胞穿透肽-聚合物給藥系統(tǒng)設(shè)計(jì)和合成可激活細(xì)胞穿膜肽-聚合物給藥系統(tǒng)，可激活細(xì)胞穿膜肽序列為CEEEEEGGGRRRRLSSYSSRRRF，將其與聚合物聚乙酰亞胺(PEI)通過中間物共價(jià)連接，利用PEI所帶的正電荷與siRNA結(jié)合，利用腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)的尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑酶，有效識別GGGRR序列并使其水解，穿透序列RRLSSYSSRRRF發(fā)揮作用攜帶聚合物進(jìn)入胞漿釋放siRNA，發(fā)揮治療作用。實(shí)施例11 可激活細(xì)胞穿透肽-聚合物給藥系統(tǒng)設(shè)計(jì)和合成可激活細(xì)胞穿膜肽-聚合物給藥系統(tǒng)，可激活細(xì)胞穿膜肽序列為CEEEEEAAPVGRKKRRQRRRPQ，將其與樹枝狀聚合物聚酰胺-胺(PAMAM)通過中間物共價(jià)連接，利用PAMAM的氨基與藥物阿霉素共價(jià)連接，利用腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)的彈性蛋白酶，有效識別AAPV序列并使其水解，穿透序列GRKKRRQRRRPQ發(fā)揮作用攜帶聚合物進(jìn)入胞漿釋放阿霉素，發(fā)揮治療作用。實(shí)施例12 可激活細(xì)胞穿透肽-脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)設(shè)計(jì)和合成可激活細(xì)胞穿膜肽-脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)，可激活細(xì)胞穿膜肽序列為CEEEEEHSSKYQKLALKALKALKAALKLA，利用含有可激活細(xì)胞穿膜肽序列的脂材和含有腙鍵的聚乙二醇6000脂材，在加入帶正電荷的3β [Ν-(Ν’，Ν’ - 二甲氨基乙基)-氨甲酰基]膽固醇(DC-Chol)或其他陽離子脂材，例如DOTMA、DODAB, DOTAP的條件下形成能夠包載siRNA的脂質(zhì)體，在腫瘤細(xì)胞外的酸性環(huán)境下斷裂腙鍵，露出可激活細(xì)胞穿膜肽(該法能有效避免可激活細(xì)胞穿膜肽序列在體循環(huán)中被非特異性酶酶解)，在前列腺特異抗原酶作用下斷裂HSSKYQ，穿透序列KLALKALKALKAALKLA發(fā)揮作用攜帶聚合物進(jìn)入胞漿釋放siRNA，發(fā)揮治療作用。實(shí)施例13 可激活細(xì)胞穿透肽-膠束成像系統(tǒng)利用以上實(shí)施例中的給藥系統(tǒng)，將所負(fù)載的疏水性藥物換成疏水性熒光物質(zhì)，利用相同的原理與方法實(shí)現(xiàn)對腫瘤組織的定位與成像。
10
權(quán)利要求
1.一種連有能夠提高細(xì)胞穿透肽靶向選擇性的給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的給藥系統(tǒng)由能夠提高靶向選擇性的可激活細(xì)胞穿透肽與具有抗癌和/或示蹤劑和/或生物活性物質(zhì)和/或載體連接組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可激活細(xì)胞穿透肽，其特征在于，所述的可激活細(xì)胞穿透肽包括屏蔽肽序列、酶解底物肽序列、穿膜肽序列，酶解底物肽序列介于屏蔽肽序列和穿膜肽序列之間。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可激活細(xì)胞穿透肽，其特征在于，所述的屏蔽肽序列為具有凈電荷為負(fù)的肽序列，主要包括以天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)為主的肽序列，或以D，E與其它氨基酸組成的肽序列。肽序列的長度為4到20個(gè)氨基酸范圍。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可激活細(xì)胞穿透肽，其特征在于，所述的酶解底物肽序列包括基質(zhì)金屬蛋白酶激活的底物肽序列，前列腺特異抗原酶激活的底物肽序列，組織蛋白酶激活的底物肽序列，彈性蛋白酶激活的底物肽序列，尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑激活的底物肽序列，其中，基質(zhì)金屬蛋白酶可激活的底物肽序列包括PLGLAG，PLGLAR，GPQGIAGQ，VPMSMRGG, IPVSLRSG, RPFSMIMG, VPLSLTMG, VPLSLYSG, IPESLRAG，所述的前列腺特異抗原酶可激活的底物肽序列包括HSSKLQL，SSKYQ，HSSKYQ，所述的組織蛋白酶可激活的底物肽序列包括Π(，GFLG，GFGG，ALAL，所述的彈性蛋白酶可激活的底物肽序列包括AAPV，所述的尿激酶型纖維蛋白酶原激活劑可激活的底物肽序列包括GGGRR。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可激活細(xì)胞穿透肽，其特征在于，所述的細(xì)胞穿透肽序列為一系列天然L型氨基酸和人工合成D型氨基酸組成的具有細(xì)胞穿透活性的肽鏈，具有兩親性、凈電荷為正，能穿過生物膜并攜帶多種生物分子和/或小粒子載體穿過細(xì)胞膜發(fā)揮作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的穿透肽序列，其特征在于，所述的穿透肽序列包括源于人免疫缺陷病毒轉(zhuǎn)錄激活因子Tat，源于I型單純皰疹病毒(HSV-I)蛋白的VP22，源于果蠅同源觸角蛋白(Antp)的Penetratin，由促生長激素神經(jīng)肽和黃蜂毒素改造而成的Transporter!，人工合成的由大T抗原核定位序列與不同疏水肽段組成的兼性分子MPG，MAP, P印-1，從4個(gè)至Ij 15個(gè)不同長度的多聚精氨酸序列，SynBl, Polyomavirus Vpl, Bac,NF-K B,SV40T antigen, HATF3, hCT, ρVEC,Integrin, DPV6,S413PV, Poly-P。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的可激活細(xì)胞穿透肽，其特征在于，可激活細(xì)胞穿透肽是從屏蔽肽序列、酶解底物肽序列和細(xì)胞穿膜肽序列中各自選取一個(gè)，根據(jù)不同的需要自由組合。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的給藥系統(tǒng)為可激活細(xì)胞穿透肽的細(xì)胞穿膜肽序列通過共價(jià)連接和/或非共價(jià)鍵的方式與抗癌藥物和/或示蹤劑和/或生物活性物質(zhì)連接形成的給藥系統(tǒng)，其中，抗癌藥物包括阿霉素、紫杉醇、多西紫杉醇、絲裂霉素、柔紅霉素、順鉬、卡鉬、喜樹堿、羥基喜樹堿、長春新堿、博萊霉素、5-氟尿嘧啶、環(huán)磷酰胺、吉西他濱、甲氨蝶呤、卡培他濱、洛莫司汀、依托泊苷，示蹤劑包括熒光物質(zhì)、放射性同位素，量子點(diǎn)，生物活性物質(zhì)包括DNA，RNA，蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的給藥系統(tǒng)為可激活細(xì)胞穿透肽的細(xì)胞穿膜肽序列通過共價(jià)連接或載體包埋或物理混合的方式與載體形成給藥系統(tǒng)，其中，載體包括共聚物，脂質(zhì)體、膠束、聚電解質(zhì)聚合物、納米粒、納米囊、乳劑、微乳。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的給藥系統(tǒng)，其特征在于，所述的給藥系統(tǒng)能夠利用特異性酶對可激活細(xì)胞穿透肽進(jìn)行激活，使其具有對病變細(xì)胞的主動(dòng)靶向作用和提高病變細(xì)胞對藥物攝取的能力，實(shí)現(xiàn)治療疾病和控制疾病進(jìn)程的目的，應(yīng)用于藥物治療領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)成像領(lǐng)域，體內(nèi)示蹤檢測領(lǐng)域。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞穿透肽的修飾以達(dá)到低毒的具有主動(dòng)靶向選擇功能的給藥系統(tǒng)。由屏蔽肽、酶解底物肽、穿膜肽順序連接形成可激活細(xì)胞穿透肽，藥物和/或示蹤劑和/或藥物載體連接或包埋或吸附于細(xì)胞穿透肽段構(gòu)筑成給藥系統(tǒng)。屏蔽肽序列可降低或完全中和給藥系統(tǒng)表面所帶的正電，屏蔽了穿膜肽的穿膜能力，減小給藥系統(tǒng)對機(jī)體正常細(xì)胞的毒性；酶解底物肽序列可被不同病變組織細(xì)胞特異性分泌的酶系識別并被該酶水解斷裂，釋放穿膜肽并使其攜帶藥物和/或藥物載體穿透細(xì)胞膜，實(shí)現(xiàn)藥物入胞并發(fā)揮作用。本發(fā)明的目的是利用具有可激活細(xì)胞穿透功能的給藥系統(tǒng)，將抗腫瘤藥物主動(dòng)靶向輸送至腫瘤組織并使其更大程度地進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)增大藥物抗腫瘤效果的同時(shí)降低其對非腫瘤部位的毒性。
文檔編號A61K48/00GK102552929SQ20101061384
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者向柏, 時(shí)念秋, 王鵬程, 董達(dá)文, 馬冬旭, 齊憲榮 申請人:北京大學(xué)