專利名稱：苦參堿類化合物在制備抗前列腺腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種苦參堿類化合物在制備抗前列腺腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
開發(fā)中藥及中藥中的藥效成分成為治療前列腺腫瘤的藥物，目前國內(nèi)外均有開 展?，F(xiàn)有批準用于臨床的中藥，均為復(fù)方藥，對前列腺腫瘤的治療為中藥的復(fù)合療效，既有 調(diào)理作用，又有治療作用。對中藥材中單一成分治療前列腺腫瘤藥物的研究，目前均處于腫 瘤細胞體外試驗階段，療效的確切性還比較模糊。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供苦參堿類化合物在制備抗前列腺腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述苦參堿類化 合物為如式I所示的苦參堿或如式II所示的苦參素
如式II所示的苦參素為苦參堿的氧化物，又稱氧化苦參堿。本發(fā)明采用前列腺特異性抗原(Prostate Specific Agtigen，縮寫為PSA)對苦參 堿或苦參素進行了篩選驗證，實驗結(jié)果表明苦參堿或苦參素對前列腺特異性抗原有明確抑 制作用，因此可以應(yīng)用于制備抗前列腺腫瘤藥物。篩選驗證實驗的原理是，前列腺特異性抗原是由前列腺產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白 酶，有一個多肽單鏈與一個糖鏈組成，自20世紀80年代中期開始已被國內(nèi)外廣泛用作前 列腺癌的標記物，因為PSA能裂解胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3 (Insulin-like Growth Factor-Binding Protein3，縮寫為IGF-BP3)，IGF-BP3是細胞生長調(diào)控與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的 蛋白質(zhì)。因而，有明確抑制PSA的植物成分就具有確切的抗前列腺腫瘤的療效，從而能較好 的開發(fā)成治療前列腺腫瘤的植物藥。較為具體的，抗前列腺腫瘤的植物成分按以下技術(shù)方法篩選得到
用緩沖液(pH 7. 6的50 mM三羥甲基氨基甲烷與200 mM NaCl緩沖液)配制PSA濃 度為2.4 mg/ml，配制胰蛋白酶濃度為0.6 mg/ml。取100 μ L PSA溶液加60 μ L胰蛋白 酶溶液在37°C的緩沖液中作用1.5 min，上述反應(yīng)加入5μ L預(yù)先洗滌過的芐脒瓊脂糖凝 膠-6Β (20 μ L芐脒瓊脂糖凝膠-6Β用40 μ L緩沖液洗滌，隨后用臺式離心機高速IOOOOrpm 離心2min，去除浮在離心管表面的物質(zhì)，洗滌和離心過程重復(fù)3次)終止。反應(yīng)終止后，在 室溫下持續(xù)5min。瓊脂糖凝膠用高速臺式離心機在室溫下離心分離5min。離心分離重復(fù) 直到在離心管表面液體中沒有明顯可見的凝膠殘留，得到經(jīng)胰蛋白酶作用有活性的PSA。取3 μ g IGFBP-3用pH 7. 6的50 mM三羥甲基氨基甲烷與200 mM NaCl緩沖液 配制成9yL，取2yL經(jīng)胰蛋白酶作用有活性的PSA (計3 μ g)，混合后在37°C的緩沖液 中作用1. 5h，得到IGFBP-3的分解物。IGFBP-3的分解物用5%濃縮膠(1. 34mL 30%的丙烯 酰胺-亞甲雙丙烯酰胺雙蒸水溶液，1. OmL pH6. 8的1. OM三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液， 0. 08mL 10%十二烷基硫酸鈉溶液，0. 08mL 10%過硫酸銨雙蒸水溶液，8 μ L四甲基乙二胺在 5. 50mL雙蒸水中混合均勻)-12%分離膠(6mL 30%的丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺雙蒸水溶 液，3. 75mL pH8.8的1.5M濃度三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液，0. 15mL 10%十二烷基硫酸鈉 溶液，0. 15mL 10%過硫酸銨雙蒸水溶液，6 μ L四甲基乙二胺在4. 95mL雙蒸水中混合均勻) 的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，用考馬斯亮藍染色。在pH 7. 6的50 mM三羥甲基氨基甲烷與200 mM NaCl緩沖液中配入純度在90% 以上待驗證的植物成分，使植物成分的濃度為30(Γ750μΜ，得到樣品溶液。向樣品溶液中 加入2 μ L經(jīng)胰蛋白酶作用有活性的PSA (計3 μ g)，在37°C反應(yīng)30min，反應(yīng)混合液加入 9 μ L用pH 7. 6的50 mM三羥甲基氨基甲烷與200 mM NaCl緩沖液配制成的IGFBP-3 (計 3^0，作用1.51!。反應(yīng)時間達到后將反應(yīng)液冰凍在_70°C的冰箱終止反應(yīng)。待驗證的植 物成分對PSA的抑制作用用5%濃縮膠-12%分離膠的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電 泳檢測。IGFBP-3的分解物在電泳檢測中越少，說明抑制作用越強，表明該植物成分抗前列 腺腫瘤的療效越明確。本發(fā)明通過篩選得到苦參堿和苦參素，具有明確的抑制前列腺特異性抗原的作 用，對人體前列腺腫瘤有確切的療效。與現(xiàn)有的治療前列腺腫瘤的植物藥比較，作用機理更 加明確，療效確切，并有進一步改造分子結(jié)構(gòu)，提高藥效的潛力，因此可應(yīng)用于制備抗前列腺腫瘤藥物。
具體實施例方式實施例1
植物成分苦參堿(杭州綠天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，高效液相色譜檢測含量為96. 5%) 的驗證。所用試劑IGF-BP3 (98%電泳純，30kDa)，Peprotech公司產(chǎn)；PSA (99%電泳純， 28 kDa) , Fitzgerald Industries International 公司產(chǎn)；節(jié)脈瓊月旨糖凝膠，Amersham Biosciences公司產(chǎn)；三羥甲基氨基甲烷，四甲基乙二胺，聚丙烯酰胺，考馬斯亮藍，過硫酸 銨均為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)；亞甲雙丙烯酰胺天津市化學試劑研究所產(chǎn)；十二 烷基硫酸鈉(99%):生工生物工程(上海)有限公司產(chǎn)；胰蛋白酶=Amresco公司產(chǎn)。用緩沖液(pH 7.6的50 mM三羥甲基氨基甲烷與200 mM NaCl緩沖液稱取 1. 2114g三羥甲基氨基甲烷和1. 1688g NaCl溶于30mL雙蒸水中，用2M HCl調(diào)pH至7. 6 后定容到IOOmL)配制PSA濃度為2. 4 mg/ml，配制胰蛋白酶濃度為0. 6 mg/ml。取100 μ L PSA溶液加60 μ L胰蛋白酶溶液在37°C的緩沖液中作用1. 5 min，上述反應(yīng)加入5 μ L預(yù)先 洗滌過的芐脒瓊脂糖凝膠-6Β (20 μ L芐脒瓊脂糖凝膠-6Β用40 μ L緩沖液洗滌，隨后用 臺式離心機高速IOOOOrpm離心2min，去除浮在離心管表面的物質(zhì)，洗滌和離心過程重復(fù)3 次)終止。反應(yīng)終止后，在室溫下持續(xù)5min。瓊脂糖凝膠用高速臺式離心機在室溫下離心 分離5min。離心分離重復(fù)直到在離心管表面液體中沒有明顯可見的凝膠殘留，得到經(jīng)胰蛋 白酶作用有活性的PSA。取3 μ g IGFBP-3用pH 7. 6的50 mM三羥甲基氨基甲烷與200 mM NaCl緩沖液 配制成9yL，取2yL經(jīng)胰蛋白酶作用有活性的PSA (計3 μ g)，混合后在37°C的緩沖液 中作用1. 5h，得到IGFBP-3的分解物。IGFBP-3的分解物用5%濃縮膠(1. 34mL 30%的丙烯 酰胺-亞甲雙丙烯酰胺雙蒸水溶液，1. OmL pH6. 8的1. OM三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液， 0. 08mL 10%十二烷基硫酸鈉溶液，0. 08mL 10%過硫酸銨雙蒸水溶液，8 μ L四甲基乙二胺在 5. 50mL雙蒸水中混合均勻)-12%分離膠(6mL 30%的丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺雙蒸水溶 液，3. 75mL pH8.8的1.5M濃度三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液，0. 15mL 10%十二烷基硫酸鈉 溶液，0. 15mL 10%過硫酸銨雙蒸水溶液，6 μ L四甲基乙二胺在4. 95mL雙蒸水中混合均勻) 的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，用考馬斯亮藍染色。在pH 7. 6的50 mM三羥甲基氨基甲烷與200 mM NaCl緩沖液中配入苦參堿，得到 濃度為300 μ M和750 μ M的兩種樣液。在兩種樣液中分別加入2 μ L經(jīng)胰蛋白酶作用有活 性的PSA (計3 μ g)，在37°C反應(yīng)30min，反應(yīng)混合液加入9 μ L用pH 7. 6的50 mM三羥甲 基氨基甲烷與200 mM NaCl緩沖液配制成的IGFBP-3 (計3 μ g)，作用1. 5h。反應(yīng)時間達 到后將反應(yīng)液冰凍在-70°C的冰箱終止反應(yīng)。兩種反應(yīng)液均用5%濃縮膠-12%分離膠的 十二烷基硫酸鈉_聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。電泳檢測結(jié)果表明，IGF-BP3與經(jīng)胰蛋白酶處理有活性的PSA作用1. 5h后明確被 水解，得到2種不同分子量的水解產(chǎn)物，無IGF-BP3條帶。苦參堿濃度為300 μ M和750 μ M 的兩種樣液與經(jīng)胰蛋白酶作用有活性的PSA作用后，均不見水解產(chǎn)物的電泳條帶，僅有 IGF-BP3條帶，說明PSA水解IGF-BP3的活性被苦參堿抑制。電泳檢測結(jié)果表明苦參堿有明 確的抗人體前列腺腫瘤的作用，且具有量效關(guān)系。
實施例2
植物成分苦參素(杭州綠天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，高效液相色譜檢測含量為96. 8%) 為苦參堿的氧化物，又稱氧化苦參堿，對苦參素開展篩選驗證。所用試劑IGF-BP3(98% 電泳純，301^^)，？印1~(^6吐公司產(chǎn)丨5六(99%電泳純，28 kDa) , Fitzgerald Industries International公司產(chǎn)；芐脒瓊脂糖凝膠，Amersham Biosciences公司產(chǎn)；三羥甲基氨基甲 烷，四甲基乙二胺，聚丙烯酰胺，考馬斯亮藍，過硫酸銨均為國藥集團化學試劑有限公司產(chǎn)； 亞甲雙丙烯酰胺天津市化學試劑研究所產(chǎn)；十二烷基硫酸鈉(99%):生工生物工程(上 海)有限公司產(chǎn)；胰蛋白酶=Amresc0公司產(chǎn)。用緩沖液(pH 7.6的50 mM三羥甲基氨基甲烷與200 mM NaCl緩沖液稱取 1. 2114g三羥甲基氨基甲烷和1. 1688g NaCl溶于30mL雙蒸水中，用2M HCl調(diào)pH至7. 6 后定容到IOOmL)配制PSA濃度為2. 4 mg/ml，配制胰蛋白酶濃度為0. 6 mg/ml。取100 μ L PSA溶液加60 μ L胰蛋白酶溶液在37°C的緩沖液中作用1. 5 min，上述反應(yīng)加入5 μ L預(yù)先 洗滌過的芐脒瓊脂糖凝膠-6Β (20 μ L芐脒瓊脂糖凝膠-6Β用40 μ L緩沖液洗滌，隨后用 臺式離心機高速IOOOOrpm離心2min，去除浮在離心管表面的物質(zhì)，洗滌和離心過程重復(fù)3 次)終止。反應(yīng)終止后，在室溫下持續(xù)5min。瓊脂糖凝膠用高速臺式離心機在室溫下離心 分離5min。離心分離重復(fù)直到在離心管表面液體中沒有明顯可見的凝膠殘留，得到經(jīng)胰蛋 白酶作用有活性的PSA。取3 μ g IGFBP-3用pH 7. 6的50 mM三羥甲基氨基甲烷與200 mM NaCl緩沖液 配制成9yL，取2yL經(jīng)胰蛋白酶作用有活性的PSA (計3 μ g)，混合后在37°C的緩沖液 中作用1. 5h，得到IGFBP-3的分解物。IGFBP-3的分解物用5%濃縮膠(1. 34mL 30%的丙烯 酰胺-亞甲雙丙烯酰胺雙蒸水溶液，1. OmL pH6. 8的1. OM三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液， 0. 08mL 10%十二烷基硫酸鈉溶液，0. 08mL 10%過硫酸銨雙蒸水溶液，8 μ L四甲基乙二胺在 5. 50mL雙蒸水中混合均勻)-12%分離膠(6mL 30%的丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺雙蒸水溶 液，3. 75mL pH8.8的1.5M濃度三羥甲基氨基甲烷-HCl緩沖液，0. 15mL 10%十二烷基硫酸鈉 溶液，0. 15mL 10%過硫酸銨雙蒸水溶液，6 μ L四甲基乙二胺在4. 95mL雙蒸水中混合均勻) 的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，用考馬斯亮藍染色。在pH 7. 6的50 mM三羥甲基氨基甲烷與200 mM NaCl緩沖液中配入苦參素，得到 濃度為300 μ M和750 μ M的兩種樣液。兩種樣液中分別加入2 μ L經(jīng)胰蛋白酶作用有活性 的PSA (計3 μ g)，在37°C反應(yīng)30min，反應(yīng)混合液加入9 μ L用pH 7. 6的50 mM三羥甲基 氨基甲烷與200 mM NaCl緩沖液配制成的IGFBP-3 (計3 μ g)，作用1. 5h。反應(yīng)時間達到 后將反應(yīng)液冰凍在_70°C的冰箱終止反應(yīng)。兩種反應(yīng)液均用5%濃縮膠-12%分離膠的十二 烷基硫酸鈉_聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。電泳檢測結(jié)果表明，IGF-BP3與經(jīng)胰蛋白酶處理有活性的PSA作用1. 5h后明確被 水解，得到2種不同分子量的水解產(chǎn)物，無IGF-BP3條帶。苦參素濃度為750 μ M的樣液與 經(jīng)胰蛋白酶處理有活性的PSA作用后，不見水解產(chǎn)物的電泳條帶，僅有IGF-BP3條帶；苦參 素濃度為300 μ M的樣液與經(jīng)胰蛋白酶處理有活性的PSA作用后，有水解產(chǎn)物的電泳條帶， 沒有IGF-BP3條帶，說明PSA水解IGF-BP3的活性被750 μ M濃度的苦參素抑制，而300 μ M 濃度的苦參素對PSA水解IGF-BP3的活性沒有抑制作用。表明苦參堿的衍生物苦參素(氧 化苦參堿)也具有抗人體前列腺腫瘤的作用。
權(quán)利要求
苦參堿類化合物在制備抗前列腺腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述苦參堿類化合物為如式I所示的苦參堿或如式II所示的苦參素 I II 。2010102470342100001dest_path_image001.jpg,208569dest_path_image002.jpg
全文摘要
本發(fā)明公開了一種苦參堿類化合物在制備抗前列腺腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述苦參堿類化合物為苦參堿或苦參素。本發(fā)明通過篩選得到苦參堿和苦參素，具有明確的抑制前列腺特異性抗原的作用，對人體前列腺腫瘤有確切的療效。與現(xiàn)有的治療前列腺腫瘤的植物藥比較，作用機理更加明確，療效確切，并有進一步改造分子結(jié)構(gòu)，提高藥效的潛力，因此可應(yīng)用于制備抗前列腺腫瘤藥物。
文檔編號A61K31/4375GK101919845SQ20101024703
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月6日
發(fā)明者張錚, 蔣盛藍, 郭輝, 錢俊青 申請人:浙江工業(yè)大學