專利名稱：用于通過調(diào)整bmp-6來調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)的治療、預(yù)防和改善。本發(fā)明更具體地涉及使用 BMP-6和BMP-6蛋白特異性試劑諸如抗體用于改變?nèi)说难彖F、血清血紅蛋白和/或血細(xì)胞比容水平的方法。此類抗體可用于預(yù)防和治療血色素沉著病和炎癥性貧血的藥物組合物中。
背景技術(shù)：
鐵是幾乎每一種生物體生長和生存所需要的必需元素。紅細(xì)胞(RBC)含有血紅蛋白(Hb)，其是一種紅色的富鐵蛋白，將氧從肺攜帶至身體的所有肌肉和器官，在此其反應(yīng)而為身體提供其正?；顒拥哪芰啃枨?。當(dāng)紅細(xì)胞的數(shù)目或它們含有的血紅蛋白的量降低至正常水平以下時，身體接收到的氧和產(chǎn)生的能量小于其正常發(fā)揮功能所需要的氧和能量。這種狀況通常稱為貧血。在嬰兒和兒童中貧血的常見病因是鐵缺乏。在美國中多達(dá)20%的兒童和發(fā)展中國家中多達(dá)80%的兒童在18歲前的某個時候?qū)l(fā)生貧血。Martin，P. L.等，The Anemias, Principles and Practices of Pediatrics (貧血，兒科學(xué)原理和實踐)，1657 (第二版，Lippincott 1994)。在哺乳動物中，鐵平衡主要在十二指腸吸收膳食鐵的水平上進(jìn)行調(diào)節(jié)。在人類中， 遺傳性血色素沉著病(HH)是由過多吸收膳食鐵引起血漿和多個器官(包括特別地胰腺、肝臟和皮膚)中的鐵過載并且由于鐵沉積引起這些器官和組織損害而導(dǎo)致的一種常見的常染色體隱性遺傳性疾病。青少年血色素沉著病是由編碼主要的鐵調(diào)節(jié)激素鐵調(diào)素(hepcidin) (HAMP)和血幼素(hemojuvelin) (HFE2)的基因中的突變導(dǎo)致的一種鐵過載失調(diào)(Roetto，A.，等.2003. Nut. Genet. 33 :21-22 ；Papanikolaou, G.，等 2004. Nut. Genet. 36 :77-82.)。已經(jīng)顯示血幼素是一種骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)共同受體，且血幼素-介導(dǎo)的BMP信號調(diào)節(jié)鐵調(diào)素表達(dá)和鐵代謝(Babitt，J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38 :531-539 ；Babitt, J. L.，等 2007. J Clin Invest. 117 1933-1939.)。然而，鐵調(diào)素的體內(nèi)內(nèi)源性BMP調(diào)節(jié)物還未知。BMP是TGF-β超家族的成員，該超家族由超過40種配體組成(Sii，Y.和 Massague, J. 2003. Cell 113 =685-700.)。這些生長因子介導(dǎo)多種多樣的生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡和圖形化(patterning)。BMP/TGF-β超家族配體通過與I型和II型絲氨酸-蘇氨酸激酶受體的復(fù)合物結(jié)合而啟動細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)放大?；罨氖荏w復(fù)合物磷酸化細(xì)胞內(nèi)Smad蛋白，然后后者轉(zhuǎn)位至核中以調(diào)整基因表達(dá)。近年來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 BMP信號傳導(dǎo)途徑在主要的鐵調(diào)節(jié)激素鐵調(diào)素的調(diào)節(jié)中的作用(Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38 :531-539 ；Babitt, J. L.，H 等 JClin Invest. 117 1933-1939 ；Wang，R. H.，等 2005. Cell Metab. 2 :399-409.)。被肝臟分泌后，鐵調(diào)素通過減少鐵運輸因子(exporter)膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白(ferroportin)的細(xì)胞表面表達(dá)來抑制腸的鐵吸收和巨噬細(xì)胞的鐵釋放(Nemeth, E.，等2004. Science. 306 =2090-2093)。通過施用鐵使鐵調(diào)素上調(diào)(Pigeon, C,等 2001. J. Biol. Chem. 276 :7811-7819, Nicolas, G.，等 2002. J.Clin. Invest. 110 :1037-1044 ；Nemeth, Ε.，等 2004.J. Clin. Invest. 113 :1271-1276.)， 而貧血抑制鐵調(diào)素(Nicolas, G.，等 2002. J. Clin. Invest. 110 :1037-1044)。鐵調(diào)素缺乏和不受抑制的膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白活性是遺傳性鐵過載失調(diào)遺傳性血色素沉著病的常見發(fā)病機制，其原因是HAMP本身、HFE2、HFE、TFR2 (編碼2型轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)的突變以及罕見的 SCLA0A1 (編碼膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白)突變(Pietrangelo, A. 2006. Biochim Biophys Acta 1763 700-710)。鐵調(diào)素還被炎性細(xì)胞因子諸如IL-6上調(diào)，并且鐵調(diào)素過量與炎癥性貧血的發(fā)病機制有關(guān)(Pigeon, C,等 2001. J. Biol. Chem. 276 :7811-7819，Nicolas，G.，等 2002. J. Clin. Invest. 110 :1037-1044 ；Nemeth,Ε.，等 2004. J. Clin. Invest. 113 :1271-1276 ；Nemeth,Ε.， 等 2003. Blood. 101 :2461-2463 ；Weiss, G.和 Goodnough, L. Τ. 2005. N. Engl. J. Med. 352 1011-1023 ；Andrews NC. 2008. Blood. 112219-30.)。通過肝臟特異性條件性敲除共用的BMP/TGF- β細(xì)胞內(nèi)介質(zhì)Smad4 (Wang, R. H.， 等2005. Cell Metab. 2 :399-409.)，或通過HFE2 (其編碼BMP共同受體血幼素)的突變 (Papanikolaou, G.，等 2004. Nut. Genet. 36 :77-82 ；Babitt, J. L.，等 2006. Nat. Genet. 38 531-539 ；Huang, F. W.，等 J. Clin. Invest. 115 :2187-2191 ；NiederkofIer, V.，Salie, R.， Arber, S. 2005. J Clin Invest. 115 :2180-6)，減少肝臟BMP信號傳導(dǎo)與不適宜的低鐵調(diào)素表達(dá)和鐵過載相關(guān)。BMP信號在體外轉(zhuǎn)錄水平上正向地增加鐵調(diào)素表達(dá)(Babitt，J.L.， 等 2006. Nat. Genet. 38 :531-539 ；Babitt, J. L.，H 等 J Clin Invest. 117 :1933-1939 ； Wang, R. H.，等 2005. Cell Metab. 2 :399-409 ；Truksa, J.，等 2006. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 :10289-10293 ；Verga Falzacappa, Μ. V.，等 2008. J Mol Med. 86 :531-40.)。在體內(nèi)施用鐵增加肝臟BMP信號傳導(dǎo)(Yu, P. B.，等2008. Nut Chem Biol. 4 :33-41)。在體內(nèi)施用BMP增加鐵調(diào)素表達(dá)并減少血清鐵(Babitt, J. L.，H等J Clin Invest. 117 :1933-1939)。 相反，在體內(nèi)施用與人免疫球蛋白Fc的Fc部分融合的可溶性血幼素(HJV. Fe)(其選擇性地抑制BMP-2、BMP-4、BMP-5和BMP-6，但不抑制BMP-7或BMP-9)，在體內(nèi)抑制鐵調(diào)素表達(dá)， 增加膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)，動員網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞鐵儲備，和增加血清鐵(Babitt，J. L.，等2007. J Clin Invest. 117 :1933-1939.)。施用非選擇性小分子BMP抑制劑Dorsomorphin也在體內(nèi)抑制鐵調(diào)素表達(dá)和增加血清鐵(Yu, P. B.，等2008. Nut Chem Biol. 4 :33-41)。血幼素(也稱為RGMc)是蛋白質(zhì)的排斥導(dǎo)向分子(Impulsive Guidance Molecule)家族的成員，包括RGMa和DRAGON (RGMb)，它們共享50-60 %氨基酸同一性 (Samad, Τ· A.，等 2004. J. Neurosci. 24 :2027-2036.)。象血幼素一樣，RGMa (Babitt, J. L.，等 2005. J. Biol. Chem. 280 :29820-29827)和 DRAGON(Samad, Τ· A.，等 2005. J. Biol. Chem. 280 :14122-14129)也起B(yǎng)MP信號傳導(dǎo)途徑的共同受體的作用。存在著對用于調(diào)節(jié)鐵調(diào)素表達(dá)和鐵代謝的低成本的有效方法的需求
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了調(diào)整BMP-6的新方法，所述方法用于治療由于鐵調(diào)素缺乏引起的鐵過載失調(diào)或由于鐵調(diào)素過量弓I起的炎癥性貧血。本發(fā)明涉及BMP信號傳導(dǎo)途徑的調(diào)節(jié)物，所述調(diào)節(jié)物在由于鐵調(diào)素缺乏引起的鐵過載失調(diào)或由于鐵調(diào)素過量引起的炎癥性貧血的治療中發(fā)揮作用。本發(fā)明涉及一種用于調(diào)節(jié)受試者中鐵穩(wěn)態(tài)的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的藥物組合物，所述有效量以足以改變所述受試者中的鐵穩(wěn)態(tài)、血紅蛋白水平和 /或血細(xì)胞比容水平的水平來調(diào)整BMP-6信號傳導(dǎo)。在一些方面，所述組合物的施用減少 BMP-6信號傳導(dǎo)。在一些方面，所述組合物包含能夠結(jié)合BMP-6的試劑。在一些實施方案中，所述試劑在殘基TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID NO 幻處結(jié)合BMP-6。在一些方面，所述試劑是抗體。在一些方面，所述抗體競爭性地抑制BMP-6與可溶性人血幼素蛋白的結(jié)合。在某些具體實施方案中，可溶性人血幼素蛋白為HJV. Fc或HJV. Hi s。在其他方面，所述抗體通過在與可溶性人血幼素蛋白結(jié)合BMP-6的結(jié)構(gòu)域無關(guān)的結(jié)構(gòu)域處結(jié)合BMP-6來抑制BMP-6 活性。在某些具體的實施方案中，可溶性人血幼素蛋白為HJV. Fc或HJV. His。本發(fā)明涉及其中化合物的施用減少血幼素-介導(dǎo)的對鐵調(diào)素表達(dá)的誘導(dǎo)的方法。 在一些方面，所述試劑以足以抑制血幼素和BMP-6之間的相互作用的量施用。在一些方面，所述試劑優(yōu)選地對人BMP-6的表達(dá)或活性的抑制超過對BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7或 BMP-9的抑制。在一些方面，所述試劑結(jié)合BMP-6的親和性比結(jié)合BMP-7的親和性大至少5 倍。本發(fā)明提供了施用本發(fā)明的組合物的方法，其導(dǎo)致受試者中的血清鐵水平增加或血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度增加。本發(fā)明還提供了施用本發(fā)明的組合物的方法，其導(dǎo)致血紅蛋白或血細(xì)胞比容水平增加。本發(fā)明提供了施用本發(fā)明的組合物的方法，其導(dǎo)致BMP-6信號傳導(dǎo)的增加。在一些方面，所述組合物包含能夠增加血清BMP-6水平的試劑。在一些方面，所述試劑增加 BMP-6表達(dá)水平。本發(fā)明提供了治療受試者的方法，所述受試者具有遺傳性血色素沉著病的一種或多種癥狀，所述癥狀選自增加的血清鐵水平、增加的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、減少的鐵調(diào)素表達(dá)、減少的脾鐵儲備、增加的膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)和組織鐵過載。本發(fā)明提供了施用該組合物的方法，其減小BMP-6的表達(dá)水平。在一些方面，所述組合物包含能夠抑制BMP-6基因表達(dá)的試劑，其中所述試劑為反義DNA、siRNA、干擾RNA、微小RNA(miRNA)或反義RNA，且其中BMP-6表達(dá)的減少足以增加所述受試者中的血清鐵水平或血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度。本發(fā)明提供了一種分離的單克隆抗體，其特異性地結(jié)合人BMP-6，其中所述人 BMP-6由SEQ ID NO=I中所示的氨基酸序列組成，并且所述結(jié)合抑制BMP-6的鐵調(diào)節(jié)活性， 并且提供了包含所述分離的單克隆抗體的組合物，所述組合物包含足以增加受試者中的血清鐵水平或血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度的量的抗體。在一些實施方案中，分離的單克隆抗體競爭性地抑制可溶性人血幼素蛋白與BMP-6的結(jié)合，從而將與BMP-6的結(jié)合減少25% -100%。 在某些具體實施方案中，可溶性人血幼素蛋白為HJV. Fc或HJV. His。在更具體的實施方案中，分離的單克隆抗體競爭性地抑制BMP-6與抗BMP-6抗體的結(jié)合達(dá)25% -100%，所述抗BMP-6抗體選自R&D Systems的針對人BMP-6的單克隆抗體，MAB507 (克隆74219) ；R&Dsystems的針對BMP-6的多克隆抗體，AF507 (lot CXL04A)；和Santa Cruz多克隆抗體。在其他實施方案中，分離的單克隆抗體在與結(jié)合HJV. Fc的結(jié)構(gòu)域不同的結(jié)構(gòu)域處結(jié)合BMP-6。本發(fā)明還提供了抗BMP-6抗體諸如人抗體，由嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體、 單鏈Fv片段、F(ab' )2片段、Fd、結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)、雙抗體、maxibody和納米抗體。在一些方面，分離的單克隆抗體結(jié)合人BMP-6和鼠BMP-6兩者。本發(fā)明還提供了分離的核酸分子和表達(dá)載體，所述核酸分子包含編碼抗BMP-6抗體的核苷酸序列，所述表達(dá)載體包含與調(diào)控序列可操作地連接的所述核酸分子。本發(fā)明還提供了一種使用包含要求保護(hù)的載體或核酸分子的宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法，所述方法包括在合適的條件下培養(yǎng)要求保護(hù)的宿主細(xì)胞使得表達(dá)所述核酸以產(chǎn)生所述抗體。本發(fā)明還提供了通過施用治療有效量的(a)足夠以足以改變鐵穩(wěn)態(tài)、血紅蛋白水平和/或血細(xì)胞比容水平的水平調(diào)整BMP-6信號傳導(dǎo)的藥物組合物和(b)紅細(xì)胞生成刺激物來治療受試者的方法，所述受試者具有遺傳性血色素沉著病的一種或多種癥狀。示例性的紅細(xì)胞生成刺激物包括促紅細(xì)胞生成素、促紅細(xì)胞生成素激動劑變體、以及結(jié)合和活化促紅細(xì)胞生成素受體的肽或抗體。紅細(xì)胞生成刺激物包括，但不限于，α依伯汀(印oetin alfa), β 依泊汀(epoetin beta), δ 依泊汀(epoetin delta), ω 依泊汀(epoetin omega), ι依泊汀(印oetin iota), ζ依泊汀(印oetin zeta)和它們的類似物，模擬肽 (mimetic ρ印tide)、模擬抗體(mimetic antibody)和HIF抑制劑(參見美國專利公布號2005/0020487，其全部公開內(nèi)容通過引用合并)。具體地，促紅細(xì)胞生成素包括，但不限于，如下列專利或?qū)＠暾堉泄_的促紅細(xì)胞生成素分子或其變體或類似物美國專利號 4，703，008 ；5，441，868 ；5，547，933 ；5，618，698 ；5，621，080 ；5，756，349 ；5，955，422 和 5,856,298 ；和 WO 91/05867 ；WO 95/05465 ；WO 00/24893 和 WO 01/81405，每一篇專利或?qū)＠暾埖娜績?nèi)容通過引用合并入本文中。在某些示例性實施方案中，紅細(xì)胞生成刺激物選自由人促紅細(xì)胞生成素和α達(dá)貝泊汀(darb印oetin)組成的組。本發(fā)明還提供了一種診斷與BMP-6相關(guān)的失調(diào)的方法，所述方法包括(a)使來自懷疑患有所述失調(diào)的人的生物樣品與特異性結(jié)合BMP-6的抗體在適合于所述抗體與人 BMP-6結(jié)合的條件下接觸；和(b)定量與所述抗體結(jié)合的BMP-6，其中如在(b)中所定量的在所述樣品中BMP-6的量在正常水平之上或之下指示存在與BMP-6相關(guān)的失調(diào)。本發(fā)明還提供了一種監(jiān)測其中施用BMP-6拮抗劑的治療的方法，所述方法包括
(a)使來自已經(jīng)施用了BMP-6拮抗劑的人的生物樣品與特異性結(jié)合BMP-6的抗體在適合于所述抗體與人BMP-6結(jié)合的條件下接觸；和(b)定量與所述抗體結(jié)合的BMP-6，其中如在
(b)中所定量的血清BMP-6水平的量的變化指示BMP-6拮抗劑的功效。在一些方面，所述拮抗劑是抗體或小分子。本發(fā)明還提供了一種治療具有升高的鐵水平或患有貧血的哺乳動物的方法，所述方法通過施用調(diào)整BMP-6信號傳導(dǎo)的藥物組合物進(jìn)行。本發(fā)明還提供了一種用于治療與鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)的失調(diào)的試劑盒，所述試劑盒包含制品，所述制品包括包含抗BMP-6抗體的小瓶或預(yù)充式注射器。本發(fā)明還提供了一種篩選與人BMP-6結(jié)合的化合物的方法，該方法包括使候選化合物與包含生物活性BMP-6的組合物接觸，和檢測所述候選化合物和所述組合物中的人BMP-6之間的復(fù)合物，其中檢測到復(fù)合物指示所述候選化合物與人BMP-6的結(jié)合，并且進(jìn)一步其中所述候選化合物將BMP-6與HJV. Fc的結(jié)合抑制至少25%。本發(fā)明還提供了一種生成針對人BMP-6的抗體的方法，該方法包括將免疫球蛋白生成細(xì)胞與包含SEQ ID NO :1的BMP-6序列或其變體的多肽接觸，并分離由所述細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白。本發(fā)明還提供了一種用于治療缺鐵性失調(diào)的組合物，其包含特異性結(jié)合BMP-6和 HJV. Fc的抗體。在一個實施方案中，抗體競爭性地抑制可溶性人血幼素綴合物(HJV. Fe)蛋白與BMP-6的結(jié)合。在另一個實施方案中，抗體競爭性地抑制可溶性人血幼素綴合物(HJV. Fe)蛋白與BMP-6的結(jié)合。在另一個實施方案中，抗體結(jié)合BMP-6上的與結(jié)合HJV. Fc的結(jié)構(gòu)域不同的結(jié)構(gòu)域。在另一個具體實施方案中，抗體的量足以將HJV. Fc與BMP-6的結(jié)合減小 25% -100%。優(yōu)選地，抗體選自由RandD系統(tǒng)單克隆抗體、RandD系統(tǒng)多克隆抗體和Santa Cruz多克隆抗體組成的組。在另一個具體實施方案中，抗體是人抗體。在其他實施方案中， 所述抗體選自由嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體、單鏈Fv片段、F(ab' )2片段、Fd、結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)、雙抗體(diabodyhmaxibody和納米抗體組成的組。本發(fā)明還提供了一種分離的核酸分子，其包含編碼特異性結(jié)合BMP-6的抗體的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了一種包含與調(diào)控序列可操作地連接的此核酸分子的表達(dá)載體。 本發(fā)明還提供了包含權(quán)利要求31所述的載體或權(quán)利要求30所述的核酸分子的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種使用權(quán)利要求32所述的宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法，其包括在合適的條件下培養(yǎng)該權(quán)利要求所述的宿主細(xì)胞使得所述核酸表達(dá)以產(chǎn)生所述抗體。本發(fā)明還提供了一種診斷與BMP-6相關(guān)的失調(diào)的方法，所述方法包括使來自懷疑患有所述失調(diào)的人的生物樣品與特異性結(jié)合BMP-6的抗體在適合于所述抗體與人BMP-6 結(jié)合的條件下接觸；和定量與所述抗體結(jié)合的BMP-6，其中如在(b)中所定量的所述樣品中 BMP-6的量在正常水平之上或之下指示存在與BMP-6相關(guān)的失調(diào)。本發(fā)明還提供了一種監(jiān)測其中施用BMP-6拮抗劑的治療的方法，所述方法包括 使來自已經(jīng)施用了 BMP-6拮抗劑的人的生物樣品與特異性結(jié)合BMP-6的抗體在適合于所述抗體與人BMP-6結(jié)合的條件下接觸；和定量與所述抗體結(jié)合的BMP-6，其中如在(b)中所定量的血清BMP-6水平的量的變化指示BMP-6拮抗劑的功效。在具體的實施方案中，所述拮抗劑是抗體。在另一個具體實施方案中，所述拮抗劑是小分子。本發(fā)明還提供了特異性結(jié)合人BMP-6的抗體，其中在一定濃度的包含 TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID NO 3)的氨基酸序列的肽的存在下，所述抗體被競爭不與人 BMP-6特異性結(jié)合。本發(fā)明還提供了一種特異性結(jié)合TQSQDVARVSSASDY (SEQ ID NO 3)的任何5個連續(xù)氨基酸的抗體。在具體的實施方案中，所述抗體特異性地結(jié)合TQSQDVARVSSASDY (SEQ ID NO 3)的6、7、8、9或10個連續(xù)氨基酸。在下面的發(fā)明詳述和附圖以及實施方案中，本發(fā)明和本發(fā)明的其他目的、特征和優(yōu)勢將變得進(jìn)一步顯而易見。


圖1A-1D顯示DRAGON. Fc選擇性地抑制BMP對鐵調(diào)素表達(dá)的誘導(dǎo)的證據(jù)；圖2A-2G顯示在小鼠中施用DRAGON. Fc不影響鐵調(diào)素表達(dá)或鐵代謝的證據(jù)；圖3A-3D顯示特異性中和BMP-6的抗體在體內(nèi)抑制肝臟鐵調(diào)素表達(dá)和增加血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度的證據(jù)；圖4A-4H顯示Bmp6敲除小鼠顯示減少的肝臟鐵調(diào)素表達(dá)、增加的脾膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)、增加的血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、增加的肝臟鐵含量和減少的脾鐵含量的證據(jù)；圖5A-5C顯示在小鼠中施用BMP-6增加鐵調(diào)素mRNA表達(dá)和減少血清鐵的證據(jù)；圖 6 是對 BMP-6 的 Western 印跡；圖7是對HJV的Western印跡；圖 8 是對 hBMP-6 的 Western 印跡。
具體實施例方式本發(fā)明人已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)BMP-6是鐵調(diào)素表達(dá)和鐵代謝的重要調(diào)節(jié)物。與可溶性血幼素(HJV. Fe)相比，同源的DRAGON. Fc融合蛋白在體外是對BMP-2和BMP-4產(chǎn)生的鐵調(diào)素啟動子活化的較為有效的抑制劑，但是為BMP-6的不太有效的抑制劑。在體內(nèi)， DRAGON. Fc對鐵調(diào)素表達(dá)和鐵代謝沒有作用，而HJV. Fc或特異性中和BMP-6的抗體抑制鐵調(diào)素表達(dá)并增加血清鐵。此外，Bmp6敲除小鼠具有類似遺傳性血色素沉著病的表型，其具有減少的鐵調(diào)素表達(dá)、增加的膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)、增加的血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、減少的脾鐵儲備和組織鐵過載。本發(fā)明人顯示在小鼠中施用BMP-6增加鐵調(diào)素表達(dá)并減少血清鐵。 總之，這些數(shù)據(jù)支持了 BMP-6作為體內(nèi)鐵調(diào)素表達(dá)和鐵代謝的內(nèi)源性調(diào)節(jié)物的關(guān)鍵作用。特異性中和BMP-6的抗體的施用導(dǎo)致增加的血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度，表明對鐵調(diào)素表達(dá)和鐵代謝的作用。通過siRNA或中和抗體抑制內(nèi)源性BMP-6抑制血幼素-介導(dǎo)的對鐵調(diào)素表達(dá)的誘導(dǎo)。BMP-6可能是血幼素的配體。此外，發(fā)現(xiàn)添加外源性BMP-6增加鐵調(diào)素表達(dá)并導(dǎo)致血清鐵和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度的劑量依賴性減少。pro-BMP-6的氨基酸序列顯示在下表1中
權(quán)利要求
1.一種用于調(diào)節(jié)受試者中鐵穩(wěn)態(tài)的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的藥物組合物，所述有效量足夠以足以改變所述受試者中的鐵穩(wěn)態(tài)的水平來調(diào)整BMP-6信號傳導(dǎo)。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物的施用減少BMP-6信號傳導(dǎo)。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物包含能夠結(jié)合BMP-6的試劑。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述試劑在殘基TQSQDVARVSSASDY(SEQID NO 3)內(nèi)結(jié)合BMP-6。
5.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述試劑是抗體。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述抗體競爭性地抑制BMP-6與可溶性人血幼素蛋白的結(jié)合。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述可溶性人血幼素蛋白為HJV.Fc或HJV. His。
8.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述抗體結(jié)合BMP-6上的與可溶性人血幼素蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域不同的結(jié)構(gòu)域。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述可溶性人血幼素蛋白為HJV.Fc或HJV. His。
10.權(quán)利要求2-9中任一項所述的方法，其中所述化合物的施用減少血幼素-介導(dǎo)的對鐵調(diào)素表達(dá)的誘導(dǎo)。
11.權(quán)利要求3-10中任一項所述的方法，其中所述試劑以足以抑制血幼素和BMP-6之間的相互作用的量施用。
12.權(quán)利要求2-11中任一項所述的方法，其中所述試劑優(yōu)選地對人BMP-6的抑制超過對 BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-7 或 BMP-9 的抑制。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述試劑結(jié)合BMP-6的親和性比結(jié)合BMP-7的親和性大至少5倍。
14.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物的施用導(dǎo)致所述受試者中的血清鐵水平增加。
15.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物的施用導(dǎo)致所述受試者中的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度增加。
16.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述組合物的施用增加BMP-6信號傳導(dǎo)。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述組合物包含能夠增加血清BMP-6水平的試劑。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述試劑增加BMP-6表達(dá)水平。
19.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述受試者具有遺傳性血色素沉著病的一種或多種癥狀，所述癥狀選自下列各項組成的組增加的血清鐵水平、增加的血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度、 減少的鐵調(diào)素表達(dá)、減少的脾鐵儲備、增加的膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)和組織鐵過載。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述試劑以足以減輕與遺傳性血色素沉著病相關(guān)的至少一種癥狀的量施用。
21.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述組合物的施用減小BMP-6的表達(dá)水平。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述組合物包含能夠抑制BMP-6基因表達(dá)的試劑。
23.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述試劑為siRNA、miRNA或反義RNA。
24.權(quán)利要求21-23中任一項所述的方法，其中BMP-6表達(dá)的減少足以增加所述受試者中的血清鐵水平或血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度。
25.一種用于治療缺鐵性失調(diào)的組合物，其包含特異性結(jié)合BMP-6的抗體。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述抗體在殘基TQSQDVARVSSASDY(SEQID NO 3)內(nèi)結(jié)合BMP-6。
27.權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述抗體競爭性地抑制BMP-6與可溶性人血幼素蛋白的結(jié)合。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述可溶性人血幼素蛋白為HJV.Fc或HJV. His。
29.權(quán)利要求25所述的組合物，所述抗體結(jié)合BMP-6上的與可溶性人血幼素蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域不同的結(jié)構(gòu)域。
30.權(quán)利要求四所述的方法，其中所述可溶性人血幼素蛋白為HJV.Fc或HJV. His。
31.權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述抗體的量足以將HJV.Fc與BMP-6的結(jié)合減少 25% -100%。
32.權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述抗體選自由RandD系統(tǒng)單克隆抗體mAb507、 RandD系統(tǒng)多克隆抗體和Santa Cruz多克隆抗體組成的組。
33.權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述抗體是人抗體。
34.權(quán)利要求25所述的組合物，其中所述抗體選自由嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體、單鏈Fv片段、F(ab' )2片段、Fd、結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)、雙抗體、maxibody和納米抗體組成的組。
35.一種分離的核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求25的抗體的核苷酸序列。
36.一種表達(dá)載體，其包含與調(diào)控序列可操作地連接的權(quán)利要求35所述的核酸分子。
37.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求30所述的載體或權(quán)利要求36所述的核酸分子。
38.一種使用權(quán)利要求37所述的宿主細(xì)胞產(chǎn)生抗體的方法，其包括在合適的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求37所述的宿主細(xì)胞，使得所述核酸表達(dá)以產(chǎn)生所述抗體。
39.權(quán)利要求25所述的組合物，其還包含藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
40.一種診斷與BMP-6相關(guān)的失調(diào)的方法，所述方法包括(a)使來自懷疑患有所述失調(diào)的人的生物樣品與特異性結(jié)合BMP-6的抗體在適合于所述抗體與人BMP-6結(jié)合的條件下接觸；和(b)定量與所述抗體結(jié)合的BMP-6，其中在(b)中所定量的所述樣品中BMP-6的量在正常水平之上或之下指示存在與BMP-6相關(guān)的失調(diào)。
41.一種監(jiān)測其中施用BMP-6拮抗劑的療法的方法，所述方法包括(a)使來自已經(jīng)施用了BMP-6拮抗劑的人的生物樣品與特異性結(jié)合BMP-6的抗體在適合于所述抗體與人BMP-6結(jié)合的條件下接觸；和(b)定量與所述抗體結(jié)合的BMP-6，其中在(b)中所定量的血清BMP-6水平的量的變化指示BMP-6拮抗劑的功效。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述拮抗劑是抗體。
43.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述拮抗劑是小分子。
44.一種治療需要治療鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)的受試者中的鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)的方法，其包括向所述受試者施用權(quán)利要求25的單克隆抗體。
45.權(quán)利要求44所述的方法，其中所述鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)是貧血。
46.一種篩選與人BMP-6結(jié)合的化合物的方法，其包括使候選化合物與包含生物活性BMP-6的組合物接觸，和檢測所述候選化合物和所述組合物中的人BMP-6之間的復(fù)合物，其中檢測到復(fù)合物指示所述候選化合物與人BMP-6的結(jié)合，并且進(jìn)一步其中所述候選化合物將BMP-6與HJV. Fc的結(jié)合抑制至少25%。
47.一種特異性結(jié)合人BMP-6的抗體，其中在一定濃度的包含TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID NO 3)的氨基酸序列的肽的存在下，所述抗體被競爭不與人BMP-6特異性結(jié)合。
48.一種特異性結(jié)合TQSQDVARVSSASDY(SEQ ID NO 3)的任何5個連續(xù)氨基酸的抗體。
49.權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合TQSQDVARVSSASDY(SEQID NO: 3)的任何6個連續(xù)氨基酸。
50.權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合TQSQDVARVSSASDY(SEQID NO: 3)的任何7個連續(xù)氨基酸。
51.權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合TQSQDVARVSSASDY(SEQID NO: 3)的任何8個連續(xù)氨基酸。
52.權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合TQSQDVARVSSASDY(SEQID NO: 3)的任何9個連續(xù)氨基酸。
53.權(quán)利要求48所述的抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合TQSQDVARVSSASDY(SEQID NO: 3)的任何10個連續(xù)氨基酸。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過調(diào)整BMP-6活性來調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)。提供了使用BMP-6和BMP-6蛋白特異性試劑諸如抗體用于改變?nèi)搜彖F水平的方法。此類抗體可用于預(yù)防和治療血色素沉著病和炎癥性貧血的藥物組合物中。
文檔編號A61K39/395GK102215869SQ200980145449
公開日2011年10月12日 申請日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月13日
發(fā)明者H·林, 朱迪·巴比特 申請人:通用醫(yī)療公司