專(zhuān)利名稱(chēng)：微針裝置以及利用微針裝置提高流感疫苗的功效性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用微針裝置的免疫原性增強(qiáng)方法。
背景技術(shù)：
皮膚由最外層的角質(zhì)層、表皮、真皮以及皮下結(jié)締組織組成。通常情況下，由死細(xì) 胞層以及脂雙層組成的角質(zhì)層對(duì)多種物質(zhì)具有超強(qiáng)屏障功能。在真皮層中存在具有免疫功 能的叫做朗格漢斯細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞。朗格漢斯細(xì)胞補(bǔ)充侵入皮膚內(nèi)部的蛋白質(zhì)抗原， 在內(nèi)部分解，并在MHC分子上表達(dá)肽片段。MHC-肽復(fù)合物從輸入淋巴管向所屬淋巴結(jié)的皮 質(zhì)下層移動(dòng)，通過(guò)T細(xì)胞和指突狀細(xì)胞相接觸。朗格漢斯細(xì)胞通過(guò)這樣的移動(dòng)，使抗原從皮 膚向存在于淋巴結(jié)內(nèi)的Th細(xì)胞傳遞。朗格漢斯細(xì)胞含有為了將抗原提呈給Th細(xì)胞所必需 的MHC-II類(lèi)分子。已知經(jīng)由這種皮膚角質(zhì)層的超強(qiáng)屏障功能進(jìn)入到真皮層的疫苗雖然是有效的，但 是向僅限于300 2000 μ m的真皮層通過(guò)注射針進(jìn)行的給藥從技術(shù)難度方面考慮，存在精 度上的問(wèn)題。作為解決此問(wèn)題的方法，研發(fā)了微針。其以穿刺最外層的角質(zhì)層為目的，設(shè)計(jì)了各 種大小和形狀(高度為數(shù)十 數(shù)百微米左右的非常小的突起物)，特別期待被用作非侵襲 性的疫苗給藥方法。另外，對(duì)使用具有微針的裝置時(shí)藥劑的使用方法也設(shè)計(jì)了各種各樣的方案，提出 了在顯微針表面涂布藥劑以給藥的方法、使針形成用于透過(guò)藥劑或生物成分的孔(中空 針)或槽的方法、將藥劑混合在針自身中的方法等。由于這些微針裝置全部具有高度為數(shù) 十 數(shù)百微米左右的非常小的突起物(微針)，因此，認(rèn)為根據(jù)藥劑的使用方法的不同，藥 劑的透皮吸收性及吸收效率也有很大的區(qū)別。例如，作為利用微針有效促進(jìn)抗原(疫苗)的透皮吸收性的方法，有在微針的一部 分表面涂布藥劑的方法，例如非專(zhuān)利文獻(xiàn)1中所公開(kāi)的方法。該方法在對(duì)微針的一部分(特 別是僅針部分)涂布抗原(疫苗)時(shí)，使用的抗原(疫苗)全部或大部分轉(zhuǎn)移到體內(nèi)，作為 準(zhǔn)確的向真皮給藥的方法是有效的。但是，最近才逐漸認(rèn)識(shí)到，有效而安全地給予診斷藥或藥劑等藥品的重要性。特別 是作為最近的新型流感的對(duì)策，正在開(kāi)發(fā)ft·印andemic疫苗(A/H5m亞型)(非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2)。該接種方法需要以3周的時(shí)間為間隔向皮下或肌肉內(nèi)接種2次，考慮到這種新型流感 大范圍流行的情況，期望開(kāi)發(fā)出如何利用少數(shù)疫苗使多數(shù)人產(chǎn)生免疫這樣的有效而簡(jiǎn)便的 疫苗給藥方法。另外，目前在日本被廣泛用作流感疫苗的日本藥典生物學(xué)制劑標(biāo)準(zhǔn)的“流感HA疫 苗”是A型(H1N1)、A型(H3N2)以及B型的3價(jià)混合，用法為皮下注射1次或是大約間隔 1 4周進(jìn)行2次皮下注射?？芍幢闶沁@樣偶爾也存在難以產(chǎn)生免疫的人，仍然需要有效 地給予疫苗。在專(zhuān)利文獻(xiàn)1中公開(kāi)了一種使用流感疫苗的微針制劑。公開(kāi)的微針制劑雖然包括流感疫苗的給藥方法、處方，但是關(guān)于利用微針的抗原的給藥量和效果(抗體效價(jià))的關(guān) 系，沒(méi)有對(duì)使用肌內(nèi)注射(IM)和皮下注射(SC)的給藥量進(jìn)行過(guò)以下的探討。另外，沒(méi)有提 到用于減少抗原給藥量及增強(qiáng)效果的對(duì)策。在專(zhuān)利文獻(xiàn)2中，公開(kāi)了通過(guò)口服給予、鼻腔內(nèi)給予或注射給予流感疫苗之后，從 皮膚表面應(yīng)用佐劑的透皮免疫激活方法，雖然例示了口服、骨骼肌肉內(nèi)、皮下等給藥方法， 但是沒(méi)有記載利用微針進(jìn)行的給藥。在專(zhuān)利文獻(xiàn)3中，雖然公開(kāi)了以降低治療用物質(zhì)的量而實(shí)現(xiàn)治療效果為目的的利 用具有中空針的微針進(jìn)行的給藥，但是沒(méi)有關(guān)于產(chǎn)生免疫的記載。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1 日本特表2007-530680號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)2 日本特表2004-5^906號(hào)公報(bào)專(zhuān)利文獻(xiàn)3 日本特表2006-506103號(hào)公報(bào)非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 =Pharma. Res. 19(1)，63-70 (2002)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2 日本疫苗學(xué)會(huì)通訊，vol. 12(2007. 1. 10)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題雖然通過(guò)如上所述將流感疫苗涂布在微針上并且正確地向真皮給藥，存在有效而 簡(jiǎn)便地給予流感疫苗的可能性，但是目前為止還沒(méi)有對(duì)通過(guò)微針給予流感疫苗和通過(guò)注射 給予流感疫苗進(jìn)行充分的比較研究。本發(fā)明的目的在于提供一種利用微針裝置增強(qiáng)流感疫苗的免疫原性的免疫原性 增強(qiáng)方法。解決課題的手段本發(fā)明人基于以上的技術(shù)背景進(jìn)行了反復(fù)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用涂布有包含 以A型(HlNl)株、A型(H3N2)株以及B型株為有效成分的抗原的流感疫苗的微針將流感 疫苗經(jīng)皮給藥，與皮下注射相比，有效地提高了流感疫苗的抗體性。再通過(guò)將涂布有流感疫 苗的微針經(jīng)皮給藥之后，在給藥部位涂布月桂醇，與皮下給藥相比，可以確認(rèn)3價(jià)的全部亞 型的抗體效價(jià)顯著提高。即，本發(fā)明的利用微針裝置的免疫原性增強(qiáng)方法為，將具備涂布有流感疫苗的由 聚乳酸形成的微針的微針裝置與皮膚抵接而經(jīng)皮給予所述流感疫苗，其中流感疫苗包含以 A型(HlNl)株、A型(H3^)株以及B型株作為有效成分的抗原。在此，經(jīng)皮給予所述流感 疫苗之后，在所述微針裝置與皮膚抵接的部位涂布具有佐劑效果的月桂醇能進(jìn)一步增強(qiáng)免 疫原性。此外，涂布其它能夠滲透皮膚的具有佐劑活性的物質(zhì)也可以期待免疫原性的增強(qiáng) 效果。本發(fā)明的微針裝置具備涂布有包含抗原的流感疫苗的由聚乳酸形成的微針，所述 抗原以A型(HlNl)株、A型(H3^)株以及B型株作為有效成分。在此，所述涂布優(yōu)選含有 支鏈淀粉作為涂布載體。另外，所述涂布可以含有月桂醇。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，與通過(guò)注射進(jìn)行的皮下給藥相比，能夠以有效而簡(jiǎn)便的操作給予包 含以A型(HlNl)株、A型(H3N2)株以及B型株作為有效成分的抗原的流感疫苗，可以提高 3價(jià)的全部亞型的免疫原性。通過(guò)使用透皮免疫活化用微針裝置，可以刺激由流感疫苗誘發(fā) 的免疫應(yīng)答，減少疫苗內(nèi)部抗原的有效用量。


圖1是表示本發(fā)明的微針裝置的一例的圖，(a)為立體圖，(b)為(a)的A_B剖面 圖。圖2是表示關(guān)于IgG抗體效價(jià)的微針給藥組和皮內(nèi)給藥組的比較圖。圖3是表示關(guān)于IgA抗體效價(jià)的對(duì)照組和微針給藥組的比較(鼻腔)圖。圖4是表示關(guān)于IgA抗體效價(jià)的對(duì)照組和微針給藥組的比較(肺)圖。圖5是表示給予流感疫苗后的經(jīng)時(shí)的各抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果的一例的圖。圖6是表示給予流感疫苗后的抗體效價(jià)的變化的一例的圖。圖7是表示HI抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果的一例的圖。
具體實(shí)施例方式圖1是表示本發(fā)明的微針裝置的一例的圖，(a)為立體圖，(b)為(a)的A_B剖面 圖。如圖1(a)所示，本發(fā)明的微針裝置(界面)5具有微針基板8和能夠穿透皮膚或粘膜 的配置成二維狀的多個(gè)微針6。微針基板8具備與各個(gè)微針6對(duì)應(yīng)配置的多個(gè)開(kāi)口部7。在 本例中，雖然微針6的形狀為圓錐形，但是本發(fā)明并不限定于此，可以是四角錐等多角錐， 也可以是其它的形狀。另外，雖然多個(gè)微針6和多個(gè)開(kāi)口部7交替分別配置成正方格子形 狀，但是本發(fā)明不限定于此。進(jìn)而，雖然微針6和開(kāi)口部7的個(gè)數(shù)在圖中為1 1，但是本發(fā) 明不限定于此，也包括不含開(kāi)口部7的情況。在本例中，對(duì)微針6的一部分或者全部涂布包含以A型(HlNl)株、A型(H3N2)株 以及B型株為有效成分的抗原的流感疫苗。例如如圖1(b)所示，涂布層(涂層)1配置在 各個(gè)微針6的表面。涂布層1可以配置于整個(gè)微針6上，也可以配置在其一部分上。使用 時(shí)，將圖1(a)所示的配置有微針6的微針基板面與皮膚抵接，從其相反面流入藥物的溶解 液，從各開(kāi)口部7流出液體并傳遞到各微針6，使所述流感疫苗透皮吸收。其中，開(kāi)口部7 不是必須的，液體可以不使用開(kāi)口部7而通過(guò)其它的方式向微針6供給。另外，對(duì)于涂布層 1來(lái)說(shuō)，也可以不從外部賦予液體，而利用微針穿孔皮膚時(shí)的體液使之溶解，由此，可以將流 感疫苗釋放到皮膚內(nèi)。微針裝置中的微針由穿刺皮膚或者粘膜的微針(針)和支撐該針部的基板組成， 在基板上排列多個(gè)微針。微針是微小的構(gòu)造，微針的高度(長(zhǎng)度)h優(yōu)選為50 μ m 700 μ m, 更優(yōu)選為ΙΟΟμ 600μπ ，進(jìn)一步優(yōu)選為200μπ 500μπ 。在此，將微針的長(zhǎng)度設(shè)為 50μπι以上是為了使流感疫苗的經(jīng)皮給藥確實(shí)地進(jìn)行，將微針的長(zhǎng)度設(shè)為700μπι以下是為 了避免微針與神經(jīng)接觸，能夠可靠地減少疼痛的可能性，同時(shí)可靠地避免出血的可能性。另 外，微針的長(zhǎng)度在700 μ m以下時(shí)，可以有效地給予注入皮內(nèi)的流感疫苗的量。本文中的“微針”是指凸?fàn)罱Y(jié)構(gòu)物，即廣義上的針狀或包括針狀的結(jié)構(gòu)物，在圓錐狀結(jié)構(gòu)的情況下，其基底的直徑通常為50 200 μ m左右。另外，微針不限于具有尖銳前端 的針狀，也包括前端不尖銳的形狀。微針優(yōu)選使用非金屬質(zhì)的合成或天然的樹(shù)脂材料制成。 另外，雖然在本例中微針的形狀是圓錐形，但是本發(fā)明不限定于此，其形狀既可以是四角錐 等多角錐、也可以是其它的形狀。微針基板是用于支撐微針的底座，其形態(tài)沒(méi)有限定，例如可以為如圖1所示的備 有貫通孔(開(kāi)口部)的基板，此時(shí)，可以從基板背面流入涂布在微針上的流感疫苗的溶解 液，此外，還可以經(jīng)由開(kāi)口部以及微針流入流感疫苗而給藥。作為微針或基板的材質(zhì)，可舉 出硅、二氧化硅、陶瓷、金屬(不銹鋼、鈦、鎳、鉬、鉻、鈷等)以及合成或天然的樹(shù)脂材料等， 考慮微針的抗原性以及材質(zhì)的單價(jià)時(shí)，特別優(yōu)選聚乳酸、聚乙交酯、聚丙交酯-乙交酯、支 鏈淀粉、己內(nèi)酯、聚氨酯、聚酐等生物降解性聚合物及作為非降解聚合物的聚碳酸酯、聚甲 基丙烯酸、乙烯-乙酸乙烯酯、聚四氟乙烯、聚甲醛等合成或天然的樹(shù)脂材料。另外，也優(yōu) 選作為多糖類(lèi)的透明質(zhì)酸、支鏈淀粉、葡聚糖、糊精或者硫酸軟骨素等。特別是聚乳酸為生 物降解性樹(shù)脂，有作為植入制劑使用的成績(jī)(日本特表2002-517300號(hào)公報(bào)或Journal of Controlled Release 104 (2005) 51-66)，從強(qiáng)度方面、安全方面考慮是最優(yōu)選的微針材料 之一。對(duì)于微針(針)的密度，典型的是，針的橫排以每1毫米(mm)提供約1 10個(gè)的 密度這樣的方式空出橫排間隙。通常，橫排中，相對(duì)于橫排內(nèi)的針的空間以基本上相等的距 離，具有100 10000根/cm2的針密度，優(yōu)選為100 5000根/cm2，更優(yōu)選為200 200根 /cm2，進(jìn)一步優(yōu)選為400 1000/cm2。有100根以上的針密度時(shí)，可以有效地穿孔皮膚，當(dāng) 超過(guò)10000根/cm2的針密度時(shí)，難以賦予微針可以穿孔皮膚的強(qiáng)度。作為微針的制法，可舉出利用硅基板的濕法蝕刻加工或干法蝕刻加工、利用金屬 或樹(shù)脂的精密機(jī)械加工(放電加工、激光加工、切割加工、熱模壓加工、注塑成型加工等)、 機(jī)械切削加工等。通過(guò)這些加工方法，使針部和支撐部成為一體。作為使針部中空的方法， 可舉出制作針部后，通過(guò)激光加工等進(jìn)行2次加工的方法。對(duì)微針進(jìn)行涂布時(shí)，為了使由涂布液的溶劑揮發(fā)引起的藥劑的濃度變化以及物性 變化最小化，可以將裝置的設(shè)置環(huán)境控制在一定的溫濕度。為了防止溶劑的蒸發(fā)，優(yōu)選使溫 度降低或使?jié)穸壬呋蛘邇烧咭黄鹂刂?。在不控制溫度的情況下，室溫下的濕度以相對(duì)濕 度計(jì)為50 100% RH，優(yōu)選為70. 0 100% RH。在50% RH以下時(shí)，存在引起溶劑的蒸發(fā) 從而涂布液的物性變化的情況。加濕方式只要可以確保目標(biāo)濕度狀態(tài)就沒(méi)有特別限制，有 氣化式、蒸汽式及水噴霧式等。流感疫苗并不限定于上述類(lèi)型，從季節(jié)性疫苗來(lái)看，如果為大流行流感疫苗，則也 可以包括作為A型、B型、C型分別存在的亞型。例如，日本藥典的生物學(xué)制劑標(biāo)準(zhǔn)“流感HA 疫苗”是包含以A型(HlNl)株、A型(H3N2)株以及B型株為有效成分的抗原的流感疫苗。涂布在微針上的涂布液除了含有流感疫苗以外，還可以含有涂布載體以及液體組 合物。另外，本發(fā)明的涂布層是指，優(yōu)選涂布液駐留固著在微針(針)上的狀態(tài)，因此有時(shí) 也對(duì)涂布液施加干燥工序使其固著。作為涂布載體，優(yōu)選與流感疫苗較具有相容性(均勻混合的性質(zhì))的多糖類(lèi)載體， 優(yōu)選聚羥甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚羥丙甲基纖維素、聚甲基纖維素、葡聚糖、聚乙二 醇、支鏈淀粉、羧甲基纖維素鈉、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、葡聚糖、阿拉伯膠等，更優(yōu)選羥丙基纖維素、支鏈淀粉，阿拉伯膠。另外，進(jìn)一步優(yōu)選羥丙基纖維素(HPC-SSL(分子量15,000 30，000)、HPC-SL(分子量30，000 50，000)、HPC_L(分子量55，000 70，000)、HPC_M(分 子量110, 000 150，000)、HPC-H(分子量250, 000 400，000))、支鏈淀粉、透明質(zhì)酸。
特別是從與流感疫苗的相容性方面考慮，最優(yōu)選支鏈淀粉。涂布液總量中的涂布載體的含量為1 70重量％，優(yōu)選為1 40重量％，特別優(yōu) 選為3 25重量％。另外，該涂布載體有時(shí)需要具有一定程度的粘度以免液體滴落，該粘 度需要為100 lOOOOOcps左右。更優(yōu)選的粘度為500 60000cps。通過(guò)使粘度在該范圍 內(nèi)，可以不依賴(lài)微針的材質(zhì)而一次性涂布所需量的涂布液。另外，通常，粘度越高，涂布液的 量越有增加的趨勢(shì)。涂布微針時(shí)使用的液體組合物是通過(guò)將生物適合性的載體、要傳遞的流感疫苗以 及根據(jù)情況添加的任意涂布輔助物質(zhì)與揮發(fā)性液體混合而制得。揮發(fā)性液體可以是水、二 甲亞砜、二甲基甲酰胺、乙醇、異丙醇以及它們的混合物等。其中最優(yōu)選水。液體的涂布液 或懸浮液典型地可以具有0. 1 65重量％的流感疫苗濃度、優(yōu)選為1 30重量％、更優(yōu)選
為3 20重量％。其它已知的制劑輔助物質(zhì)只要不對(duì)涂布層所需的溶解性和粘度特性以及干燥后 的涂布層的性狀和物性有不良影響，就可以添加在涂布層中。微針的涂布層厚度小于50 μ m,優(yōu)選小于25 μ m,更優(yōu)選為1 10 μ m。通常，涂布 層的厚度為干燥后測(cè)定的整個(gè)微針表面的平均厚度。一般，涂布層的厚度可以通過(guò)使用涂 布載體的多層覆膜而增大，即，可以在涂布載體被固著后，反復(fù)進(jìn)行涂布工序而增加厚度。微針的高度(長(zhǎng)度)h，如上所述，優(yōu)選為50μπι 700μπι。微針涂布層的高度H 隨著微針的高度h而改變，可以在0 μ m 700 μ m的范圍，通常在10 μ m 700 μ m的范圍， 優(yōu)選為30μπι 500μπι左右。為了使用本發(fā)明的微針裝置使流感疫苗激發(fā)的免疫更完全，例如，可以將具有佐 劑效果的脂肪族醇類(lèi)通過(guò)本發(fā)明的微針裝置涂布在給藥部位。這樣的脂肪族醇類(lèi)優(yōu)選為直 鏈或支鏈狀的脂肪族醇類(lèi)。這樣的脂肪族醇類(lèi)的碳原子數(shù)和分子量沒(méi)有特別限制，考慮到 透皮性時(shí)，更優(yōu)選碳原子數(shù)為8 20。另外，該脂肪族醇類(lèi)可以是飽和的或不飽和的。這些脂肪族醇類(lèi)中的大多數(shù)也能用作透皮吸收的吸收促進(jìn)劑，參見(jiàn) W02007/015441時(shí)，本發(fā)明的脂肪族醇類(lèi)不僅可以期待吸收促進(jìn)作用，而且可以期待佐劑效果。這樣的脂肪族醇類(lèi)例如為辛基十二醇、月桂醇、油醇、異硬脂醇、癸醇等，其中，特 別優(yōu)選月桂醇、辛基十二醇和異硬脂醇，最優(yōu)選月桂醇。與疫苗混合的時(shí)候，優(yōu)選配合本發(fā)明的脂肪族醇類(lèi)0. 1 99重量％，更優(yōu)選配合 5 90重量％，特別優(yōu)選配合10 80重量％。最優(yōu)選的組成中，脂肪族醇類(lèi)的含量為15
75重量％。另外，其后進(jìn)行涂布時(shí)，當(dāng)然可以涂布脂肪族醇類(lèi)本身，但也可以包含已知的制劑 輔助物質(zhì)，作為其組成，脂肪族醇類(lèi)優(yōu)選以0. 1 99重量％配合，更優(yōu)選以5 90重量％ 配合，特別優(yōu)選以10 80重量％配合。最優(yōu)選的組成中的脂肪族醇類(lèi)的含量為15 75
重量％。本發(fā)明的微針裝置的給藥時(shí)間認(rèn)為在4分鐘 600分鐘左右，但為了提高依從性，優(yōu)選給藥時(shí)間盡可能短。最佳的給藥時(shí)間是，幾乎全部涂布在微針裝置上的流感疫苗的給藥結(jié)束的時(shí)間 點(diǎn)，認(rèn)為給藥時(shí)間根據(jù)涂布層的組成及佐劑、以及微針的形狀而變化。微針裝置的優(yōu)選給藥時(shí)間為4分鐘 180分鐘。少于4分鐘時(shí)，由于溶解需要時(shí) 間，有時(shí)流感疫苗的給藥不充分，超過(guò)180分鐘時(shí)，依從性不良。另外，該給藥時(shí)間更優(yōu)選為 4分鐘 60分鐘，最優(yōu)選為4分鐘 10分鐘。本發(fā)明的微針裝置刺激皮膚內(nèi)的免疫應(yīng)答，使血清中的IgG抗體效價(jià)提高。而且， 即使不添加佐劑也能夠提高IgA抗體效價(jià)。IgA抗體效價(jià)特別是在肺、鼻粘膜等局部上升。
實(shí)施例(實(shí)驗(yàn)例1)使用810嫩乂_101((1^111 01^公司制造)，通過(guò)離心分離，濃縮如下制備的包含以八 型(HlNl)株、A型(H 3N2)株以及B型株為有效成分的抗原的流感HA疫苗，然后與高分子 聚合物(支鏈淀粉)混合，之后，利用加濕器將相對(duì)濕度維持在90 100% RH,同時(shí)，將其 涂布在聚乳酸制微針(高度約為300 μ m，密度為841根/cm2，四角錐形)上。涂布層含量 為各抗原0.3yg/patCh，將4周齡大的ddY小鼠(雌性)麻醉后腹部剃毛，然后使帶有涂布 層的微針穿刺皮膚給藥2小時(shí)。在給藥一部分后，向給藥部位滴加佐劑液體(月桂醇)，然 后，同樣地穿刺給藥2小時(shí)。皮下給藥組向背部皮下給藥1 μ g/50 μ L/只。在相同條件下 加強(qiáng)免疫1周，然后在1周后采血，測(cè)定3價(jià)的抗體效價(jià)。同樣，通過(guò)注射皮下給予上述微 針上的上述疫苗的涂布量的3倍的量，測(cè)定抗體效價(jià)。其結(jié)果如表1所示。(流感病毒HA抗原的制備)將精卵(受精卵)在孵卵機(jī)內(nèi)，保持溫度38 39°C放置大約11天，確認(rèn)胚胎產(chǎn)生 后，將卵殼打開(kāi)一個(gè)能夠通過(guò)注射針程度的孔，從該孔直接注入尿液中的作為疫苗制造株 的流感病毒(A/Hiroshima(H3N2)、A/New Caledonia(HlNl)以及 B/Malaysia)，將孔堵住， 再次放回到孵卵機(jī)內(nèi)，在32 36°C下保溫約3天。然后，將病毒接種卵放入冰箱中一晚，除 去卵殼，無(wú)菌地采集該尿液。除去采集液中的血液等雜質(zhì)，通過(guò)利用區(qū)帶離心機(jī)的蔗糖密度 梯度離心法將病毒粒子精制濃縮。將該流感病毒懸浮液進(jìn)行醚處理，之后加入福爾馬林。按照生物學(xué)制劑標(biāo)準(zhǔn)(日本厚生勞動(dòng)省)的流感HA疫苗中所記載的效價(jià)試驗(yàn)法 中的單向放射免疫擴(kuò)散試驗(yàn)法，測(cè)定如上制備的3株流感HA抗原量，將其混合稀釋?zhuān)鳛榱?感HA疫苗。(HI抗體效價(jià)的測(cè)定)按照如下所示的方法，分別對(duì)3株HA抗原(A型(HlNl)株、A型(H3N2)株以及B 型株)進(jìn)行小鼠血清中的HI抗體效價(jià)的測(cè)定。首先，通過(guò)小鼠血清100 μ L的預(yù)處理，除去非特異性紅細(xì)胞抑制活性以及紅細(xì)胞 天然凝集素。接著將預(yù)處理后稀釋10倍的小鼠血清在微量培養(yǎng)板上用PBS以每次稀釋2 倍的方式從10倍稀釋至640倍(25 μ L/孔)，向其中加入等量(25 μ L/孔)的事先調(diào)整為 4倍的紅細(xì)胞凝集活性的HA抗原液(流感HI試劑“生研”，電化生研株式會(huì)社)。用攪拌器 將其充分振蕩之后，在室溫下靜置1小時(shí)，向各孔中添加0. 5%雞血細(xì)胞懸浮液50μ L。在 室溫下靜置1小時(shí)之后，測(cè)定引起紅細(xì)胞凝集抑制的最大稀釋倍率，作為HI抗體效價(jià)。
表 1
給藥方式動(dòng)物編號(hào)HI抗體效價(jià)A (Η1Ν1 )A (Η3Ν2 )B14040102401010微針32020< 1041010< 1051010< 1011601604024020160如又今τ /日芮f、3408020I /I往呀)44080205404020110101021010< 103101020反Γ玲約44020105< 10102061010< 10如表1所示，表明通過(guò)使用本發(fā)明的微針裝置，給藥抗原量為1/3時(shí)即顯示與皮下 給藥幾乎相同的效果。據(jù)此可以確認(rèn)，通過(guò)利用本發(fā)明的微針裝置給藥，與通過(guò)注射的皮下 給藥相比，有效地使HI抗體效價(jià)上升約3倍。進(jìn)而表明，通過(guò)組合使用月桂醇作為佐劑，不僅A型HI抗體效價(jià)提高，而且對(duì)目前 為止HI抗體效價(jià)難以提高的B型(參照日本藥典生物學(xué)制劑流感HA疫苗)也顯示出顯著 效果。(實(shí)驗(yàn)例2)使用810嫩乂_101((1^111 01^公司制造)，通過(guò)離心分離，濃縮如下制備的包含以八 型(HlNl)株為有效成分的抗原的流感HA疫苗，然后與高分子聚合物(支鏈淀粉)混合，之 后，在相對(duì)濕度90 100% RH的條件下，將所述混合液以0. 3 μ g/patch的含量涂布在聚乳 酸制微針(高度約為300 μ m，密度為841根/cm2，四角錐形)上。將10周齡大的ddY小鼠(雌性)麻醉后腹部剃毛，然后使上述微針穿刺皮膚給藥 2小時(shí)，作為微針給藥組。一周后，再在一周后的相同條件下加強(qiáng)免疫共計(jì)2次，進(jìn)而在2周 后進(jìn)行采血以及鼻腔和肺清洗。另一方面，作為皮內(nèi)給藥組，向背部皮下給予流感HA疫苗/PBS (3 μ g/50 μ L/只)， 一周后，再在一周后的相同條件下加強(qiáng)免疫共計(jì)2次，進(jìn)而在2周后采血。由上述得到的血清通過(guò)下述方法測(cè)定IgG抗體效價(jià)，由清洗鼻腔和肺的清洗液， 通過(guò)下述方法測(cè)定IgA抗體效價(jià)(n = 4)。(實(shí)驗(yàn)例3)
使用810嫩乂_101((1^111 01^公司制造)，通過(guò)離心分離，濃縮如下制備的包含以八 型(HlNl)株為有效成分的抗原的流感HA疫苗，然后與高分子聚合物(支鏈淀粉)混合，之 后，在相對(duì)濕度90 100% RH的條件下，將所述混合液以0. 3 μ g/patch的含量涂布在聚乳 酸制微針(高度約為300 μ m，密度為841根/cm2，四角錐形)上。從未使用部分的微針中抽出抗原，將蛋白質(zhì)定量，以HA換算計(jì)算的結(jié)果為，第1次 給藥為2. 5 μ g，第2次給藥為1. 5 μ g，第3次給藥為3. 9 μ g，因此，對(duì)皮下給藥組給予同等 量的抗原。動(dòng)物給藥按如下方式進(jìn)行將小鼠(ddY/雌性/4周)的腹部在給藥前一天剃毛， 給藥當(dāng)天，用戊巴比妥麻醉后用酒精棉對(duì)穿刺部位進(jìn)行消毒，用手指按壓微針5秒，纏繞膠 帶5分鐘或120分鐘將微針固定。<組構(gòu)成⑴皮下給藥G只)，(2)微針給藥5分鐘(5 只)，⑶微針給藥120分鐘(5只)>給藥方案為初次給藥的2、4周之后的共計(jì)3次給藥，采血在2、4、5周Ow、#、5w) 后進(jìn)行。采血之后用ELISA測(cè)定流感抗原特異性抗體效價(jià)(IgG)。另外，對(duì)5周(5w)后的 血清測(cè)定HI抗體效價(jià)。圖5是表示給予流感疫苗后的經(jīng)時(shí)的各抗體效價(jià)的測(cè)定結(jié)果的一例的圖。圖6是 表示給予流感疫苗后的抗體效價(jià)的變化的一例的圖。如圖5和圖6所示，向小鼠微針(MN) 穿刺給藥5分鐘和120分鐘后的IgG抗體效價(jià)差別不大。進(jìn)而，為與皮下給藥(s. c.)基本 同等的效果。另外，如表2所示，向小鼠微針(MN)穿刺給藥5分鐘和120分鐘后的HI抗體 效價(jià)也基本相同，由于與皮下給藥(s. c.)組相比為同一水平，可以期待由5分鐘的穿刺給 藥能夠得到充分的HI抗體效價(jià)。表2最終采血時(shí)的各HI抗體效價(jià)
權(quán)利要求
1.一種微針裝置，其具備在基板上配置成二維狀的能夠穿孔皮膚的由聚乳酸形成的多 個(gè)微針，在該微針上涂布有含有A型株和B型株的流感病毒抗原。
2.如權(quán)利要求1所述的微針裝置，其中，所述微針為圓錐形或角錐形。
3.如權(quán)利要求1或2所述的微針裝置，其中，所述涂布層含有支鏈淀粉作為涂布載體。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的微針裝置，其中，所述涂布在室溫、相對(duì)濕度 70. 0 100% RH下進(jìn)行。
5.如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的微針裝置，其中，所述涂布層含有具有佐劑活性的 物質(zhì)。
6.如權(quán)利要求5所述的微針裝置，其中，所述具有佐劑活性的物質(zhì)為月桂醇。
7.如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的微針裝置，其中，所述微針裝置的基板具有能夠傳 遞流感病毒抗原液或流感病毒抗原溶解液的多個(gè)開(kāi)口部。
8.如權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的微針裝置，其中，所述微針的高度為200 500 μ m0
9.如權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的微針裝置，其中，所述微針以400 1000根/cm2 的密度配置。
10.一種利用微針裝置提高流感疫苗的功效性的方法，其中，所述微針裝置是對(duì)在基板 上配置成二維狀的能夠穿孔皮膚的由聚乳酸形成的多個(gè)微針涂布含有A型株和B型株的流 感病毒抗原而成的。
11.如權(quán)利要求10所述的利用微針裝置提高流感疫苗的功效性的方法，其中，所述微 針裝置的給藥時(shí)間為4分鐘 180分鐘。
12.如權(quán)利要求10或11所述的利用微針裝置提高流感疫苗的功效性的方法，其中，所 述微針為圓錐形或角錐形。
13.如權(quán)利要求10 12中任一項(xiàng)所述的利用微針裝置提高流感疫苗的功效性的方法， 其中，所述涂布層含有支鏈淀粉作為涂布載體。
14.如權(quán)利要求10 13中任一項(xiàng)所述的利用微針裝置提高流感疫苗的功效性的方法， 其中，所述涂布在室溫、相對(duì)濕度70. 0 100% RH下進(jìn)行。
15.如權(quán)利要求10 14中任一項(xiàng)所述的利用微針裝置提高流感疫苗的功效性的方法， 其中，所述涂布層含有具有佐劑活性的物質(zhì)。
16.如權(quán)利要求15所述的利用微針裝置提高流感疫苗的功效性的方法，其中，所述具 有佐劑活性的物質(zhì)為月桂醇。
17.如權(quán)利要求10 16中任一項(xiàng)所述的利用微針裝置提高流感疫苗的功效性的方法， 其中，所述微針裝置的基板具有能夠傳遞流感病毒抗原液或流感病毒抗原溶解液的多個(gè)開(kāi) 口部。
18.如權(quán)利要求10 17中任一項(xiàng)所述的利用微針裝置提高流感疫苗的功效性的方法， 其中，所述微針的高度為200 500 μ m。
19.如權(quán)利要求10 18中任一項(xiàng)所述的利用微針裝置提高流感疫苗的功效性的方法， 其中，所述微針以400 1000根/cm2的密度配置。
全文摘要
本發(fā)明提供一種利用微針裝置增強(qiáng)流感疫苗的免疫原性的免疫原性增強(qiáng)方法。該利用微針裝置的免疫原性增強(qiáng)方法為，將具備涂布有流感疫苗的由聚乳酸形成的微針的微針裝置與皮膚抵接而經(jīng)皮給予所述流感疫苗，其中流感疫苗包含以A型(H1N1)株、A型(H3N2)株以及B型株作為有效成分的抗原。經(jīng)皮給藥后，在微針裝置與皮膚抵接的部位涂布月桂醇。
文檔編號(hào)A61K47/34GK102076357SQ20098012498
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2009年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日
發(fā)明者上仲一義, 寺原孝明, 德本誠(chéng)治, 松田純一, 桑原哲治, 野崎周英 申請(qǐng)人:一般財(cái)團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所, 久光制藥株式會(huì)社