專利名稱：：多核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及治療受試者疾病的方法和組合物，疾病與一個或多個存在于受試者中或參與非生理狀態(tài)的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)。本發(fā)明也涉及預(yù)防受試者疾病的方法和組合物，疾病與一個或多個存在于受試者中或參與非生理狀態(tài)的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定在非生理狀態(tài)中存在和疾病相關(guān)的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽。本發(fā)明同樣涉及施用多核苷酸，多核苷酸編碼非生理狀態(tài)中存在和疾病相關(guān)的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽。本發(fā)明也涉及調(diào)節(jié)對自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的免疫應(yīng)答，自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽存在于動物中且參與非生理狀態(tài)并與疾病相關(guān)。發(fā)明更特定涉及治療或防止自身免疫疾病的方法和組合物，疾病與一個或多個存在于動物非生理狀態(tài)中的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)，如多發(fā)性硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴型糖尿病、自身免疫性色素層炎、原發(fā)性膽硬化、重癥肌無力、Sjogren綜合征、尋常性天皰瘡、硬皮病、惡性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和葛雷夫斯氏病。發(fā)明也特定涉及治療或防止神經(jīng)變性疾病的方法和組合物，此疾病與一個或多個存在于動物非生理狀態(tài)中的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)，如阿爾茨海默氏病、帕金森氏癥、亨廷頓癥和遺傳性海綿狀腦病(朊病毒疾病，最常見形式稱為克雅氏病)。發(fā)明進(jìn)一步特定涉及其它與一個或多個存在于動物非生理狀態(tài)中自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)的疾病，如骨關(guān)節(jié)炎、脊髓損傷、肥胖、高血壓、胃潰瘍病、低壓、痛風(fēng)、偏頭痛、高脂血和冠心病。發(fā)明更特定涉及疾病如彌漫性腦脊髓炎，與一個或多個來自例如天花疫苗施用的自身-蛋白質(zhì)、多肽相關(guān)。發(fā)明也涉及治療或防止疾病的方式和方法，疾病與存在于動物非生理狀態(tài)中的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)。發(fā)明進(jìn)一步涉及治療動物，包括施用多核苷酸，多核苷酸編碼非生理狀態(tài)存在或參與動物中非生理狀態(tài)的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽。
背景技術(shù)：
：2.自身免疫疾病和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答自身免疫疾病是適應(yīng)性免疫引起的任何疾病，誤導(dǎo)向身體健康細(xì)胞和/或組織。自身免疫疾病影響3。/。的美國人和可能類似百分比的工業(yè)國家人口(Jacobson等，ClinImmunolI匪unopathol84,223-43,1997)。自身免疫疾病特征是T和B淋巴細(xì)胞異常靶向自身-蛋白質(zhì)、多肽、肽和/或其它自身分子，引起體內(nèi)器官、組織或細(xì)胞類型的損傷或功能失常(例如胰腺、腦、甲狀腺或胃腸道)，導(dǎo)致疾病的臨床表現(xiàn)(Marrack等，NatMed7，899-905，2001)。自身免疫疾病包括影響特定組織的疾病以及能影響多種組織的疾病。對于一些疾病，這部分取決于自身免疫反應(yīng)是針對限于特定組織的抗原還是廣泛分布于體內(nèi)的抗原。組織-特異自身免疫的特征是選擇性靶向單個組織或單獨細(xì)胞類型。然而，一些靶向遍在自身蛋白質(zhì)的自身免疫疾病也可影響特定組織。例如，在多肌炎中，自身免疫反應(yīng)靶向遍在蛋白組氨酰-tRNA合成酶，而主要包括的臨床表現(xiàn)是自身免疫破壞肌肉。免疫系統(tǒng)使用高度復(fù)雜的機制，設(shè)計用于產(chǎn)生保護(hù)哺乳動物抗多種外源病原體的反應(yīng)而同時防止抗自身抗原的反應(yīng)。除了決定是否應(yīng)答(抗原特異性)，免疫系統(tǒng)也必須選擇適當(dāng)效應(yīng)子功能以處理各病原體(效應(yīng)子特異性)。調(diào)節(jié)和控制這些效應(yīng)子功能的關(guān)鍵細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞。此外，來自CD4+T細(xì)胞的特定細(xì)胞因子似乎是T細(xì)胞調(diào)節(jié)它們功能的主要機制。因此，確定CD4+T細(xì)胞所產(chǎn)生細(xì)胞因子類型的特征以及它們的分泌如何受控制對于理解免疫系統(tǒng)如何被調(diào)節(jié)很重要。從長期小鼠CD4+T細(xì)胞克隆產(chǎn)生的細(xì)胞因子特征在10年前出版(Mosmann等，J.Immunol.136:2348-2357，1986)。在這些研究中，顯示CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生兩種不同模式的細(xì)胞因子生成，命名為T輔助細(xì)胞l(Thl)和T輔助細(xì)胞2(Th2)。發(fā)現(xiàn)Thl細(xì)胞主要產(chǎn)生白介素-2(IL-2)、干擾素-y(IFN-y)和淋巴毒素(LT)，而Th2克隆主要產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6和IL-13(Cherwinski等，J.Exp.Med.169:1229-1244，1987)。稍后，另外的細(xì)胞因子IL-9和IL-10叢Th2克隆中分離(VanSnick等，丄Exp.Med.169:363-368，1989)(Fiorentino等，J.Exp.Med.170:2081-2095，1989)。最后，發(fā)現(xiàn)其它細(xì)胞因子如IL-3、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-剌激因子(GM-CSF)和腫瘤壞死因子-a(TNF-a)都由Thl和Th2細(xì)胞分泌。自身免疫疾病包括廣泛的疾病，能影響許多不同體內(nèi)器官和組織，如上表所概括(參見例如Paul,W.E.(1999)《基礎(chǔ)免疫學(xué)》(FundamentalImmunology),第四版，5Lippincott-Raven,NewYork.)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>凝血因子抗磷脂病皮膚盤狀紅斑狼瘡皮膚、關(guān)節(jié)、腎、腦、血細(xì)胞系統(tǒng)性紅斑狼拖(SLE)目前治療人自身免疫疾病包括糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒性劑和最近發(fā)展的生物治療。一般，控制人全身性自身免疫疾病根據(jù)經(jīng)驗且不令人滿意。對于大部分，廣泛的免疫抑制藥物如皮質(zhì)甾類用于多種嚴(yán)重自身免疫和炎癥紊亂。除了皮質(zhì)甾類，其它免疫抑制劑用于控制全身性自身免疫疾病。環(huán)磷酰胺是烷化劑，導(dǎo)致T和B淋巴細(xì)胞都深度耗盡并損傷細(xì)胞-調(diào)節(jié)免疫。環(huán)孢霉素、血流譜(tacrolimus)和霉酚酸raofetil是具特異抑制T淋巴細(xì)胞性質(zhì)的天然產(chǎn)物，它們用于治療SLE、RA和有限程度的血管炎和肌炎。這些藥物與顯著腎毒性相關(guān)。氨甲蝶呤也在RA中用作"第二道防線"(secondline)試劑，目的是減少疾病發(fā)展。它也用于多肌炎和其它結(jié)締組織疾病。其它嘗試方法包括單克隆抗體，旨在阻礙細(xì)胞因子作用或耗盡淋巴細(xì)胞(Fox，D.A.Am.J.Med.^:82-881995)。治療多發(fā)性硬化(MS)包括干擾素P和共聚物1，它們使復(fù)發(fā)速度降低20-30%且對疾病發(fā)展僅有適度作用。MS也用免疫抑制劑治療，包括甲強龍、其它類固醇、氨甲蝶呤、cladribine和環(huán)磷酰胺。這些免疫抑制劑在MS治療中功效最小。風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的當(dāng)前治療使用非特異抑制或調(diào)節(jié)免疫功能的試劑，如氨甲蝶呤、硫氮磺胺吡啶、羥化氯喹、leuflonamide、強的松以及最近發(fā)展的TNFa拮抗物etanerc印t和infliximab(Moreland等，JRheumatol28，1431—52,2001)。Etanerc印t禾Qinfliximab全面阻礙TNFa，使病人更易因膿毒病死亡、加重慢性分枝桿菌感染和發(fā)展脫髓鞘。在器官-特異自身免疫的情況中，嘗試了一些不同治療方法。全身施用可溶蛋白質(zhì)抗原以抑制隨后對此抗原的免疫應(yīng)答。這種治療包括傳遞髓鞘堿性蛋白、其主要肽或髓鞘蛋白混合物給患實驗性自身免疫腦脊髓炎的動物和患多發(fā)性硬化的人(Brocke等，Nature379，343-6,1996;Critchfield等，Science263,1139-43，1994;Weiner等，A畫RevImmunol12,809-37，1994)，施用II型膠原或膠原蛋白混合物給患膠原-誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的動物和患風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的人(Gumanovskaya等，Immunology97，466-73，1999);(McKown等，ArthritisRheum42，1204-8，1999);(Trentham等，Science261,1727-30,1993)，傳遞胰島素給患自身免疫糖尿病的動物禾口人(Pozzilli禾口GisellaCavallo，DiabetesMetabResRev16,306-7,2000)，傳遞S抗原給患自身免疫性色素層炎的動物和人(Nussenblatt等，AraJOphthalmol123,583-92,1997)。此方法相關(guān)問題是全身注射抗原引起的T細(xì)胞無應(yīng)答。另一種方法是嘗試設(shè)計合理治療策略用于全身施用肽抗原，以T細(xì)胞受體和結(jié)合MHC分子的肽間相互作用為基礎(chǔ)。一種研究在動物糖尿病模型中使用肽方法，導(dǎo)致發(fā)展對應(yīng)于肽的抗體生成(Hurtenbach,U等JExp.Med177:1499,1993)。另外一種方法是施用T細(xì)胞受體(TCR)肽免疫。參見例如(VandenbarkAA等，Nature341:541，1989)。而另一種方法是通過攝取肽或蛋白質(zhì)抗原來誘導(dǎo)口頭耐受。參見例如(WeinerHL,ImmunolToday,18:3351997)。目前改變免疫應(yīng)答是通過單獨傳遞蛋白質(zhì)、多肽或肽或結(jié)合佐劑(免疫刺激劑)。例如，乙肝病毒疫苗包含非自身抗原重組乙肝病毒表面抗原，在用作佐劑的氫氧化鋁中制成。此疫苗誘導(dǎo)抗乙肝病毒疫苗表面抗原的免疫應(yīng)答以保護(hù)抗感染。另一種方法包括傳遞減毒、復(fù)制缺陷和/或非致病形式的病毒或細(xì)菌以引起宿主抗病原體的保護(hù)性免疫應(yīng)答，這些都是非自身抗原。例如，口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗包括非自身抗原活減毒病毒，感染細(xì)胞并在接種個體中復(fù)制以誘導(dǎo)有效免疫抗脊髓灰質(zhì)炎病毒、外源或非自身抗原，而不引起臨床疾病。另外，滅活脊髓灰質(zhì)炎疫苗包含不能感染或復(fù)制的滅活或"死"病毒，皮下施用以誘導(dǎo)保護(hù)性免疫抗脊髓灰質(zhì)炎病毒。3.神經(jīng)變性疾病神經(jīng)變性疾病是廣范圍的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特征都是神經(jīng)細(xì)胞緩慢累積破壞或變性(Temlett，Curr0pinNeurol9，303-7,1996);(Dickson,Curr0pinNeurol14，423-32,2001);(Kaye,Neurology51，S45-52;discussionS65-7，1998);(Prusiner，ProcNatlAcadSciUSA95,13363-83，1998);(C誦ings等，Neurology51,S2-17;discussionS65-7,1998);(Lin等，Neuron24,499-502,1999);(Chesebro，Neuron24,503—6，1999);(Ross，Neuron19,1147—50,1997);(Yankner，Neuron16,921-32，1996);(Selkoe，Neuron6，487-98,1991)。腦或脊髓中神經(jīng)元變性導(dǎo)致永久破壞性的臨床癥狀，包括一些情況中的深度癡呆、異常移動、震顫、步法共濟失調(diào)或癲癇樣行為。幾乎所有神經(jīng)變性疾病普遍發(fā)展癡呆，可表明自身完全不能照顧自己和總體缺乏對朋友和家人的識別。這些疾病的另外普遍特征是缺乏有效治療。現(xiàn)在可用的大部分治療集中于支持性護(hù)理晚期癥狀，沒有一個針對這些疾病潛在的病理生理原因。例如，帕金森氏癥的藥物治療針對且通常有效暫時控制疾病相關(guān)的震顫，但沒有藥物有效停止癡呆發(fā)展和腦黑質(zhì)中神經(jīng)元的破壞(Jankovic，Neurology55,S2-6，2000)。另一個例子中，對于阿爾茨海默氏病，直到最近沒有治療可用于癡呆發(fā)展，這是此疾病的8特征。現(xiàn)在批準(zhǔn)一些膽堿脂酶抑制劑用于阿爾茨海默氏病(Farlow和Evans,Neurology51,S36-44;discussionS65-7，1998)(Hake,CleveClinJ"Med68,608-9,613-4,616,2001)。這些藥物可能增加腦中神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的量，導(dǎo)致使用乙酰膽堿作為遞質(zhì)的特定神經(jīng)元功能改進(jìn)。所有這些藥物總體在臨床試驗中僅顯示小功效，認(rèn)知測試中的主要終點是改進(jìn)。這些藥物也不針對阿爾茨海默氏病的主要病理生理學(xué)，即破壞腦中膽堿能神經(jīng)元。因此，目前沒有治療針對任何神經(jīng)變性疾病的主要病理原因。大部分神經(jīng)變性疾病也普遍發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域中物質(zhì)集合或積聚，大部分受變性過程影響。這些可胞外或胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的異常積聚引起相關(guān)神經(jīng)元的死亡和破壞。此外，積聚的特征和組成對特定疾病特異。例如，阿爾茨海默氏病中的集合由稱為淀粉樣P(AP)的蛋白質(zhì)組成，而帕金森氏癥中由稱為a-突觸核蛋白的蛋白質(zhì)組成(Dickson,CurrOpinNeurol14:423-432，2001);(C翻ings等，Neutology51，S2-17;discussionS65-7,1998)。特征是這些集合發(fā)展和積聚的神經(jīng)變性疾病包括阿爾茨海默氏病、帕金森氏癥、亨廷頓癥和朊病毒疾病(Yankner,Neuron16:921-32,1996);(Ross，Neuron19:1147-50，1997)(Chesebro，Neuron24:503-506,1999);(Dickson,CurrOpinNeurol14:423-432,2001)。4.多核苷酸治療基因治療。多核苷酸治療包括編碼肽和/或多肽的裸露DNA，DNA在沉淀-和轉(zhuǎn)染-促進(jìn)劑中制成，病毒載體用于"基因治療"。基因治療是傳遞多核苷酸以提供蛋白質(zhì)或肽的表達(dá)，用于取代宿主中的缺陷或缺乏蛋白質(zhì)或肽和/或增強所需生理功能?；蛑委煱ǖ姆椒ㄊ笵NA整合到個體基因組中用于治療目的?；蛑委煹睦影▊鬟fDNA，DNA編碼血友病的凝血因子、嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷的腺甙脫氨酶、家族高膽甾醇血的低密度脂蛋白受體、Gaucher病的葡糖腦苷脂酶、a1-抗胰蛋白酶缺陷的a1-抗胰蛋白酶、血紅蛋白病的a或P球蛋白基因以及囊腫性纖維化的氯化物通道(Verma和Somia，Nature389，239-42，1997)。DNA免疫以治療感染。在DNA免疫中，非復(fù)制轉(zhuǎn)錄單位可提供合成蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分的模板，蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)部分誘導(dǎo)或提供宿主中的特異免疫應(yīng)答。注射裸露DNA促進(jìn)抗多種微生物和腫瘤的疫苗接種(Robinson和Torres,SeminImmunol9,271-83,1997)。編碼特定蛋白質(zhì)的DNA疫苗存在于病毒(乙肝病毒、人免疫缺陷病毒、輪狀病毒和流感病毒)、細(xì)菌(結(jié)核分枝桿菌)和寄生蟲(瘧疾)、所有非自身抗原，發(fā)展DNA疫苗以防止和治療這些感染(Le等，Vaccine18,1893-901.，2000);(Robinson禾口Pertmer,AdvVirusRes55，1-74，2000)。治療瘤形成的DNA。正在發(fā)展編碼I類組織相容性抗原、細(xì)胞因子(IL-2、IL-12和IFN-Y)和腫瘤抗原的DNA疫苗以治療瘤形成(Wlazol和Ertl，ArchI畫unolTherExp49:1-11,2001)。例如，施用編碼B細(xì)胞免疫球蛋白個體基因型(抗原結(jié)合區(qū))的病毒DNA以去除和保護(hù)抗B細(xì)胞淋巴瘤(Timmerman等，Blood97:1370-1377，2001)。DNA免疫以治療自身免疫疾病。其他人描述了編碼免疫分子的DNA療法用于治療自身免疫疾病。這種DNA療法包括編碼T細(xì)胞受體抗原結(jié)合區(qū)的DNA以改變推動自身免疫反應(yīng)的自動反應(yīng)T細(xì)胞水平(Waisman等，NatMed2:899-905,1996)(美國專利5，939，400)。編碼自身抗原的DNA粘附于顆粒且通過基因槍傳遞到皮膚以防止多發(fā)性硬化和膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(專利WO97/46253;Ramshaw等，Immunol.和CellBio.75:409-413,1997)。編碼粘附分子、細(xì)胞因子(TNFa)、化學(xué)因子(C-C化學(xué)因子)和其它免疫分子(Fas-配基)的DNA用于自身免疫疾病的動物模型(Youssef等，JClinInvest106:361-371，2000);(Wildbaum等，JClinInvest106:671-679，2000);(Wildbaum等，JImmunol165:5860-5866,2000);(Wildba咖等，JImmunol161:6368-7634，1998);(Youssef等，JAutoimmun13:21-9，1999)。本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供方法治療或防止疾病，此疾病與動物非生理過程中存在的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是提供治療或防止自身免疫疾病的特定方法，一般不削弱免疫系統(tǒng)。而本發(fā)明的又一個目標(biāo)是提供治療或防止神經(jīng)變性疾病的特定方法。本發(fā)明的另外一個目標(biāo)是提供組合物治療或防止疾病，此疾病與動物非生理過程中存在的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)。本發(fā)明的另一個目標(biāo)是鑒定非生理存在和疾病相關(guān)的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽。這些和本發(fā)明的其它目標(biāo)總體通過說明書表現(xiàn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目標(biāo)伴隨著治療或防止動物疾病的新方法，疾病與一個或多個動物非生理存在的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)，方法包括施用含多核苷酸的自身載體給動物，多核苷酸編碼疾病相關(guān)的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽。施用含編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸的自身載體調(diào)節(jié)對自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的免疫應(yīng)答，自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽通過施用自身載體表達(dá)。組合物包括編碼一種或多個治療動物中非生理存在自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸，用于治療的疾病與動物非生理過程中存在和/或作為其靶的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)施用多核苷酸調(diào)節(jié)對自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的免疫應(yīng)答以治療疾病，多核苷酸編碼非生理存在或非生理過程靶向的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽，疾病與參與動物中非生理的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)。在發(fā)明的一方面，提供治療或防止自身免疫疾病的方法，如多發(fā)性硬化、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胰島素依賴型糖尿病、自身免疫性色素層炎、原發(fā)性膽硬化、重癥肌無力、Sjogren綜合征、尋常性天皰瘡、硬皮病、惡性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和葛雷夫斯氏病，包括施用含多核苷酸的自身載體給動物，多核苷酸編碼自身免疫疾病相關(guān)的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽。施用含編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸的自身載體調(diào)節(jié)對自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的免疫應(yīng)答，自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽通過施用自身載體表達(dá)。在發(fā)明的一方面，用于防止自身免疫疾病的自身載體施用途徑不同于粒子調(diào)節(jié)的基因槍傳遞給皮膚，自身載體含編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸。在發(fā)明的一方面，提供治療神經(jīng)變性疾病的方法，如阿爾茨海默氏病、帕金森氏癥、亨廷頓癥和遺傳性海綿狀腦病(朊病毒疾病，最常見形式稱為克雅氏病)，包括施用含多核苷酸的自身載體給動物，多核苷酸編碼神經(jīng)變性疾病相關(guān)的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽。施用含編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸的自身載體調(diào)節(jié)對自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的免疫應(yīng)答，自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽通過施用自身載體表達(dá)。本發(fā)明也提供方式和方法鑒定疾病相關(guān)的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽和調(diào)節(jié)對自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的免疫應(yīng)答。本發(fā)明同樣提供方式和方法診斷和監(jiān)控疾病，疾病與動物中非生理存在的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)。本發(fā)明也提供方式和方法監(jiān)控治療，包括施用多核苷酸，多核苷酸編碼動物中非生理存在的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽。圖1A.編碼來自自身蛋白蛋白脂蛋白(PLP)的肽的DNA降低T細(xì)胞增殖反應(yīng)。淋巴結(jié)細(xì)胞(NLC)對PLP139-151的增殖反應(yīng)在DNA免疫小鼠中減少。從急性期恢復(fù)后，殺死疾病動物并分離排水LNC，疾病動物用編碼PLP139-151的DNA(A)或?qū)φ蛰d體pTarget(B)注射。細(xì)胞在體外用不同濃度的肽PLP139-151(正方形)或?qū)φ?1肽PLP178-191(三角形)刺激。5只動物組的合并LNC的增殖反應(yīng)表示為三倍孔的平均CPM士SD。伴刀豆球蛋白A(0.001mg/ml)刺激LNC的A組CPM是102401，B組是76702。圖IB.在ELISA分析基礎(chǔ)上，細(xì)胞因子水平在來自DNA免疫動物DNA的LNC中降低。EAE急性期后，來自5只動物組的LNC用編碼PLP139-151的質(zhì)粒DNA或單獨載體(pTarget)免疫，體外用免疫肽PLP139-151刺激。上清中Y-干擾素(條紋柱)或IL-2(虛線柱)水平用ELISA測試并與已知標(biāo)準(zhǔn)對照相比。結(jié)果以ng/ml表示。圖1C.在RNA酶保護(hù)測定基礎(chǔ)上，細(xì)胞因子水平在來自DNA免疫動物DNA的LNC中降低。對于細(xì)胞因子mRNA檢測，來自實驗動物腦的RNA樣品用多探針RNA酶保護(hù)測定測試，反應(yīng)用5%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。跑膠結(jié)束后干膠并曝光到x-光膠片。圖2.編碼自身蛋白胰島素的DNA防止NOD小鼠中糖尿病的發(fā)展。4周大前驅(qū)糖尿病NOD小鼠組用編碼胰島素B鏈免疫優(yōu)勢肽(殘基9-23)(胰島素B)、胰島素A鏈肽(胰島素A)的DNA自身載體、單獨載體(pcDNA)處理或沒有處理。圖3.定量PCR測量來自NOD小鼠的LNC中細(xì)胞因子表達(dá)。定量PCR測量胰腺LNC的細(xì)胞因子表達(dá)，胰腺LNC來自用lOyg/ml胰島素B(9-23)肽培養(yǎng)的免疫NOD小鼠。NOD小鼠用pcDNA或InsB-pcDNA間隔10天免疫2次，來自NOD小鼠的胰腺LNC在第2次注射后5天收集。細(xì)胞在胰島素B(9-23)肽存在72時時培養(yǎng)，隨后沉淀以定量PCR分析細(xì)胞因子mRNA水平。pcDNA對照免疫水平(實心柱)用作標(biāo)準(zhǔn)，insB-pcDNA免疫值(陰影柱)與之比較。圖4.編碼淀粉樣e的DNA誘導(dǎo)保護(hù)性抗淀粉樣e抗體效價。小鼠用編碼淀粉樣日(A日)氨基酸1-42的DNA免疫，2周后加強。預(yù)處理和第2次免疫后4周，獲得血清且進(jìn)行elisa分析以確定抗淀粉樣e效價。各動物左邊的柱代表預(yù)處理效價，右邊的柱代表處理后效價。Bl-B4是磷酸緩沖鹽水(含0.9mM〔3++)處理的動物，具免疫刺激CpG序列。動物B5、Al和A2用trisEDTA(不含&++)中編碼淀粉樣P的DNA處理，具免疫刺激CpG序列。A3-A5僅用trisEDTA(不含Ca++)中自身載體DNA(pTARGET)處理，具免疫刺激CpG序列。圖5.用編碼自身蛋白骨橋蛋白的DNA處理降低EAE發(fā)生率和嚴(yán)重性。C57B6小鼠用編碼骨橋蛋白的DNA處理，然后用完全弗氏佐劑中的MOGp35-55誘導(dǎo)EAE。EAE的臨床分?jǐn)?shù)在垂直軸上表示。圖6.用抑制性IMS的多核苷酸治療抑制PLP^,調(diào)節(jié)的EAE。在0天，7周大雌性S幾/J小鼠用10ugPBS中的PLP臥15,皮下免疫，PLP139—,5,在CFA中乳化，CFA由IFA和0.5mg熱滅活結(jié)核分枝桿菌(ifycotecteri湖"Ze/r〃7a^'5")組成。從第7天開始每天給動物臨床打分。在第12天，小鼠四頭肌都注射總共0.lmlPBS中的0.25%布比卡因-HCL。2天后，肌肉注射所選小鼠的四頭肌，用編碼單獨pTARGET質(zhì)粒上各全長鼠PLP、MAG、M0G和MBP的DNA多核苷酸(各25ng)加50"g編碼全長鼠IL-4的pTARGET質(zhì)粒，它們在0.2mlTE的總體積中。DNA注射每隔一周進(jìn)行，注射6周。在起始DNA治療同時，200ulPBS體積中的50ugIMS腹膜內(nèi)單獨施用或與DNA多核苷酸治療一起。IMS每隔一周給予，進(jìn)行6周。圖7.細(xì)胞因子分布EAE處理組。誘導(dǎo)EAE疾病后57天，殺死小鼠，提取來自各小鼠的腹股溝和腋淋巴結(jié)且根據(jù)各組收集。分離細(xì)胞并用lOug/ml富集RPMI培養(yǎng)基中的PLPK,9-^和10。/oFCS刺激。3天后，細(xì)胞用人-rlL2再刺激另外3天。收集上清并通過三明治ELISA測試細(xì)胞因子分布，使用標(biāo)準(zhǔn)鼠(A)IFN-y、(B)IL-4和(C)來自BDPharraingen的IL-10ELISA試劑盒。圖8.DNA多核苷酸療法和IMS治療NOD小鼠的糖尿病。獲得7周大的N0D/Lt雌性小鼠且在一限制進(jìn)入室中居住。從10周大開始每周測試小鼠的血糖水平(BGL)提高，使用單觸超血糖監(jiān)控系統(tǒng)。當(dāng)BGL在200到250mg/dl間時開始治療。從15周大開始，可用小鼠相繼加入各組。小鼠四頭肌都注射總共0.2mlPBS中的0.25%布比卡因-HCL。2天后，肌肉注射小鼠的四頭肌，用l)編碼單獨pVAXl載體上各全長鼠前胰島素原-1和前胰島素原-2的DNA多核苷酸，以50yg/劑量；或2)50yg/劑量的編碼單獨pVAXl載體上各全長鼠前胰島素原-1和前胰島素原-2的DNA多核苷酸加編碼IL-4的pVAXl載體，它們在O.2mlPBS的總體積中。DNA注射每隔一周進(jìn)行，注射4周。在起始DNA治療同時，200"1PBS體積中的50ygIMS腹膜內(nèi)單獨施用或與DNA多核苷酸治療一起。IMS每隔一周給予，進(jìn)行4周。糖尿病百分比定義為BGL持續(xù)大于250mg/dl的小鼠。具體實施例方式為更充分理解本文所述發(fā)明，給出下列描述。本發(fā)明提供方法治療或防止動物疾病，此疾病與一個或多個動物中非生理存在或參與非生理狀態(tài)的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)，方法包括施用自身載體給動物，自身載體含編碼疾病相關(guān)自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸。施用含編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸的自身載體調(diào)節(jié)對自身載體表達(dá)的自身-蛋白質(zhì)、多13肽或肽的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的治療或防止方法可用于任何與動物中非生理存在和/或參與非生理狀態(tài)的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)的疾病。自身免疫疾病下表列出一些自身免疫疾病的例子并描述于下，疾病與動物中非生理存在的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)。表2自身免疫疾病耙向組織自身免疫疾病相關(guān)的自身-蛋白質(zhì)多發(fā)性硬化GuillianBarre綜合征胰島素依賴型糖尿病風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎自身免疫性色素層炎原發(fā)性膽硬化自身免疫肝炎尋常性天皰瘡重癥肌無力自身免疫胃炎惡性貧血中樞神經(jīng)系統(tǒng)周圍神經(jīng)系統(tǒng)胰島的e細(xì)胞滑膜關(guān)節(jié)眼、眼色素層肝的膽管肝皮膚神經(jīng)-肌肉連接胃/壁細(xì)胞髓鞘堿性蛋白、蛋白脂蛋白、髓鞘相關(guān)糖蛋白、環(huán)核苷酸磷酸二酯酶、髓鞘相關(guān)糖蛋白、髓鞘相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白、髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白、a-B-晶體蛋白周圍髓鞘蛋白I和其它酪氨酸磷酸酶IA2、IA2P;谷氨酸脫羧酶(65和67kDa形式)、羧肽酶H、胰島素、胰島素原、前胰島素原、熱激蛋白、glima38、島細(xì)胞69kDa、p52、島細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運子GLUT-2免疫球蛋白，血纖蛋白，聚絲蛋白、I、II、III、IV、V、IX和XI型膠原，GP-39，hnRNPsS-抗原、光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)、視紫質(zhì)、恢復(fù)蛋白丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(2-酮酸脫氫酶)肝細(xì)胞抗原、細(xì)胞色素P450橋粒芯蛋白-1、-3和其它乙酰膽堿受體H7K+ATP酶、內(nèi)部因子內(nèi)部因子肌肉組氨酰tRNA合成酶、其它合成酶、其它核抗原自身免疫性甲狀腺甲狀腺甲狀腺球蛋白、甲狀腺過氧物酶火葛雷夫斯氏病甲狀腺促甲狀腺素受體牛皮癬皮膚未知白癲風(fēng)皮膚酪氨酸酶、酪氨酸酶相關(guān)蛋白-2系統(tǒng)性紅斑狼瘡全身核抗原、DNA、組蛋白、核糖核蛋白乳糜瀉小腸轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶^^絲^眾多發(fā)性硬化(MS)是最普遍的CNS脫髓鞘疾病，影響350,000個美國人和全球100萬人。癥狀通常在20和40歲間開始發(fā)生，表現(xiàn)為急性或亞急性攻擊單側(cè)視覺缺陷、肌肉虛弱、感覺異常、共濟失調(diào)、眩暈、尿不便、構(gòu)音困難或智力干擾(以頻率減少的順序)。這種癥狀來自脫髓鞘的集中損傷，導(dǎo)致由軸突傳導(dǎo)緩慢引起的負(fù)傳導(dǎo)異常和由異位脈沖產(chǎn)生(如Lhermitte綜合征)引起的正傳導(dǎo)異常。MS診斷以歷史為基礎(chǔ)，包括至少兩種時間上分開的不同神經(jīng)功能紊亂攻擊，產(chǎn)生神經(jīng)功能紊亂的客觀證據(jù)，涉及CNS白質(zhì)的不同區(qū)域。實驗室研究提供另外客觀證據(jù)支持MS診斷，包括CNS白質(zhì)損傷的共振成像(MRI)、IgG的腦脊髓液(CSF)寡克隆帶和異常誘發(fā)反應(yīng)。盡管大部分病人經(jīng)歷逐步發(fā)展的復(fù)發(fā)-恢復(fù)疾病過程，MS的臨床過程在個體間變化很大且范圍可從被限制到終生的一些輕微攻擊從而爆發(fā)慢性發(fā)展的疾病。能分泌IFN-Y的髓鞘-自動反應(yīng)T細(xì)胞的定量增加與MS和EAE發(fā)病相關(guān)。自身免疫脫髓鞘疾病如多發(fā)性硬化和實驗性自身免疫腦脊髓炎(EAE)中自身免疫應(yīng)答的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽耙可包括的抗原表位來自蛋白脂蛋白(PLP);髓鞘堿性蛋白(MBP);髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG);環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(CNPase);髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG)和髓鞘相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白(MBOP);a-B-晶體蛋白(熱激蛋白)；病毒和細(xì)菌模擬肽，如流感、皰疹病毒、乙肝病毒等；OSP(少突膠質(zhì)細(xì)胞特異蛋白)；瓜氨酸-修飾的MBP(MBP的C8同工型，其中6個精氨酸已變成瓜氨酸)等。整合膜蛋白PLP是髓鞘的優(yōu)勢自身抗原。PLP抗原的決定簇在一些小鼠品系中鑒定，包括殘基139-151、103-116、215-232、43-64和178-91。至少報導(dǎo)了26種MBP抗原表位(Meinl等，JClinInvest92,2633-43,1993)。殘基1-11、59-76和87-99值得注意。一些小鼠品系中鑒定的免疫顯性MOG抗原表位包括殘基1-22、35-55、64-96。如本文所用，術(shù)語"抗原表位"理解為指自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽，其具有的特定形狀或結(jié)構(gòu)被動物免疫系統(tǒng)的B細(xì)胞或T細(xì)胞識別。在人MS病人中，下列髓鞘蛋白和抗原表位鑒定為自身免疫T和B細(xì)胞反應(yīng)。從MS腦空斑(brainplaque)洗脫的抗體識別髓鞘堿性蛋白(MBP)肽83-97(Wucherpfenning等，JClinInvest100:1114-1122,1997)。另一個研究發(fā)現(xiàn)約50%MS病人有抗髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)T細(xì)胞反應(yīng)性(6-10。/。對照)、20%抗MBP反應(yīng)(8-12°/。對照)、8%抗PLP反應(yīng)(0%對照)、0%反應(yīng)MAG(0。/。對照)。在此研究中，IO個MOG反應(yīng)病人中7個具有T細(xì)胞增殖反應(yīng)，集中在3種肽抗原表位之一，包括M0G1-22、MOG34-56、MOG64-96(KerlerodeRosbo等，EurJImmunol27,3059-69,1997)。T和B細(xì)胞(腦損傷-洗脫的抗體)反應(yīng)集中在MBP87-99(0ksenberg等，Nature362，68-70，1993)。在MBP87-99中，氨基酸基序HFFK是T和B細(xì)胞反應(yīng)的主要靶(Wucherpfennig等，JClinInvest100:1114-1122，1997)。另一個研究觀察到淋巴細(xì)胞抗髓鞘相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白(MBOP)的反應(yīng)性，包括殘基MBOP21-39和MBOP37-60(Holz等，JImmunol164，1103-9,2000)。使用MOG和MBP肽的免疫金綴合物以染色MS和對照腦，MBP和MOG都被MS空斑-結(jié)合抗體識別(Genain和Hauser，Methods10，420-34,1996)。A凝絲關(guān)，炎風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是慢性自身免疫發(fā)炎滑膜炎，，影響全球O.8%的人口。其特征是引起侵蝕性關(guān)節(jié)破壞的慢性發(fā)炎滑膜炎。RA由T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞調(diào)節(jié)。T細(xì)胞在RA中發(fā)揮關(guān)鍵作用的證據(jù)包括(l)滲透滑膜的CD4+T細(xì)胞占優(yōu)勢、(2)與用藥物如環(huán)孢霉素抑制T細(xì)胞功能相關(guān)的臨床改進(jìn)以及(3)RA與一些HLA-DR等位基因的相連。RA相關(guān)的HLA-DR等位基因包含0鏈第3個高變區(qū)中位置67-74的氨基酸類似序列，參與肽結(jié)合和呈遞給T細(xì)胞。RA由自動反應(yīng)的T細(xì)胞調(diào)節(jié)，T細(xì)胞識別滑膜關(guān)節(jié)中存在的自身-蛋白質(zhì)或修飾的自身-蛋白質(zhì)。本發(fā)明的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽也稱為自身抗原，是RA的靶且包括的抗原表位來自II型膠原；hnRNP;A2/RA33;Sa;聚絲蛋白；角蛋白；瓜氨酸；軟骨蛋白，包含gp39;I、III、IV、V、IX和XI型膠原；HSP-65/60;IgM(類風(fēng)濕因子);RNA聚合酶;hnRNP-Bl;hnRNP-D;心磷脂；醛縮酶A;瓜氨酸-修飾的聚絲蛋白和血纖蛋白。在高比例RA病人血清中鑒定的自身抗體識別含修飾精氨酸殘基(de-iminate以形成瓜氨酸)的聚絲蛋白肽。自動反應(yīng)T和B細(xì)胞反應(yīng)都針對一些病人中的相同免疫顯性II型膠16原(CII)肽257-270。人I型或胰島素依賴型糖尿病(ID腿)的特征是郎格罕氏胰島中e細(xì)胞的自身免疫破壞。e細(xì)胞耗盡導(dǎo)致不能調(diào)節(jié)血中葡萄糖水平。當(dāng)血中葡萄糖水平上升超過特定水平，通常約250rag/dl，產(chǎn)生明顯的糖尿病。在人中，糖尿病開始前有一個長癥狀前階段。在此階段中，逐步損失胰島P細(xì)胞功能。疾病發(fā)展通過自身抗體的存在暗示，自身抗體抗胰島素、谷氨酸脫羧酶和酪氨酸磷酸酶IA2(IA2)，各自是本發(fā)明自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的例子。癥狀前階段中可評估的標(biāo)記是胰腺中胰島炎的存在、胰島細(xì)胞抗體的水平和頻率、胰島細(xì)胞表面抗體、胰島e細(xì)胞上II型MHC分子的異常表達(dá)、血中葡萄糖濃度和胰島素血漿濃度。胰腺、島細(xì)胞抗體和血糖中T淋巴細(xì)胞數(shù)量增加指示疾病，胰島素濃度下降也如此。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠是一種動物模型，許多臨床、免疫和組織病理學(xué)特征與人IDDM相同。NOD小鼠同時發(fā)展島炎癥和e細(xì)胞破壞，引起高血糖癥和明顯糖尿病。CD4+和CD8+T細(xì)胞都需要用于糖尿病發(fā)展，盡管各自的作用還不清楚。在耐受條件下施用胰島素或GAD作為蛋白質(zhì)給NOD小鼠顯示防止疾病并下調(diào)對其它自身抗原的反應(yīng)。血清中存在具多種特異性的自身抗體組合對于人I型糖尿病高度敏感且特異。例如，存在抗GAD和/或IA-2的自身抗體對來自對照血清的I型糖尿病約98%敏感和99%特異。在I型糖尿病患者的非糖尿病第一程度親戚中，存在的自身抗體特異于3種自身抗原的2種，包括GAD、胰島素和IA-2，使5年內(nèi)發(fā)展I型DM的陽性預(yù)測值〉90%。人胰島素依賴型糖尿病中靶向的自身抗原可包括自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽酪氨酸磷酸酶IA-2;IA-2P;65和67kDa形式的谷氨酸脫羧酶(GAD);羧肽酶H;胰島素；胰島素原；熱激蛋白(HSP);glima38、島細(xì)胞抗原69kDa(ICA69);p52;兩種神經(jīng)節(jié)苷脂抗原(GT3和GM2-1);島細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運子(GLUT-2)。目前治療人IDDM通過監(jiān)控血糖水平以指導(dǎo)注射或以泵為基礎(chǔ)傳遞重組胰島素。飲食和鍛煉安排有助于獲得適當(dāng)血糖控制。自身免疫性色素層炎是眼的自身免疫疾病，估計影響400，000人，美國每年發(fā)生43,000起新病例。目前治療自身免疫性色素層炎用類固醇、免疫抑制劑如氨甲蝶呤和環(huán)孢霉素、靜脈內(nèi)免疫球蛋白和TNFa-拮抗物。實驗性自身免疫性色素層炎(EAU)是T細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫疾病，靶向眼中的神經(jīng)視網(wǎng)膜、眼色素層和相關(guān)組織。EAU與人自身免疫性色素層炎共享許多臨床和免疫特征，通過外周施用眼色素層產(chǎn)生(uveitogenic)肽誘導(dǎo)，肽在完全弗氏佐劑(CFA)中乳化。人自身免疫性色素層炎中自身免疫反應(yīng)靶向的自身-蛋白質(zhì)可包括S-抗原、光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)、視紫質(zhì)和恢復(fù)蛋白。嚴(yán)—發(fā)絲^^齊眾原發(fā)性膽硬化(PBC)是器官特異的自身免疫疾病，主要影響40-60歲的婦女。此組中報導(dǎo)的發(fā)生率接近每l，OOO人中l(wèi)個。PBC特征是發(fā)展肝內(nèi)膽汁上皮細(xì)胞(IBEC)的破壞，IBEC沿小肝內(nèi)膽管排列。這導(dǎo)致阻礙和干擾膽汁分泌，引起最終的硬化。報導(dǎo)了與其它自身免疫疾病的相連，其它自身免疫疾病特征是上皮排列/分泌系統(tǒng)損壞，包括Sjogren綜合征、CREST綜合征、自身免疫甲狀腺疾病和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。關(guān)于推動抗原的注意集中在線粒體上超過50年，發(fā)現(xiàn)抗線粒體抗體(AMA)(Gershwin等，ImmunolRev174:210-225,2000);(Mackay等，ImmunolRev174:226-237，2000)。AMA很快成為實驗室診斷PBC的基礎(chǔ)，PBC在臨床癥狀出現(xiàn)前存在于90-95%病人血清中。線粒體的自身抗原反應(yīng)性命名為Ml和M2。M2反應(yīng)性針對48-72kDa組成家族。M2代表2-氧化酸脫氫酶復(fù)合體(2-0ADC)酶的多種自身抗原亞基，是發(fā)明自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的另一個例子。研究鑒定PBC發(fā)病機理中丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDC)抗原的作用，研究支持PDC在疾病誘導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的觀點(Gershwin等，ImmunolRev174:226-237，2000)。95%PBC病例中最頻繁的反應(yīng)性是屬于PDC-E2的E274kDa亞基。存在相關(guān)但不同的復(fù)合體，包括2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體(0GDC)和分支(BC)2-0ADC。三種組成型酶(E1、2、3)有助于催化功能，將2-氧化酸底物轉(zhuǎn)化成乙酰-輔酶A(CoA)，NAD+還原成NADH。哺乳動物PDC包含另外的成分，命名為蛋白X或E-3結(jié)合蛋白(E3BP)。在PBC病人中，主要的抗原反應(yīng)針對PDC-E2和E3BP。E2多肽包含2個串列重復(fù)的硫辛酰結(jié)構(gòu)域，而E3BP有單硫辛酰結(jié)構(gòu)域。硫辛酰結(jié)構(gòu)域在一些PBC自身抗原耙中發(fā)現(xiàn)且在本文稱為"PBC硫辛酰結(jié)構(gòu)域"。PBC用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療，免疫抑制劑包括氨甲蝶呤和環(huán)孢霉素A。實驗性自身免疫膽管炎(EAC)的鼠模型使用哺乳動物PDC腹膜內(nèi)(i.p.)致敏雌性S幾/J小鼠，包括非化膿破壞性膽管炎(NSDC)和AMA生成(Jones,JCIinPathol53:813-21，2000)。#^7^^^^";^^////《關(guān)^身-蛋/^資、多ib^嚴(yán)。重癥肌無力的自身抗原可包括乙酰膽堿受體中的抗原表位。尋常性天皰疫中耙向的自身抗原可包括橋粒芯18蛋白-3。Sjogren綜合征抗原可包括SSA(Ro);SSB(La)和胞影蛋白。尋常性天皰瘡的優(yōu)勢自身抗原可包括橋粒芯蛋白-3。肌炎組可包括tRNA合成酶(如蘇氨酰、組氨酰、丙氨酰、異亮氨酰和甘氨酰)；Ku;Scl;SSA;UlSn核糖核蛋白；Mi-l;Mi-l;Jo-l;Ku和SRP。硬皮病組可包括Scl70;著絲粒；Ul核糖核蛋白和纖維蛋白。惡性貧血組可包括內(nèi)部因子和胃H/KATP酶的糖蛋白e亞基。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的抗原表位抗原可包括DNA;磷脂；核抗原；Ro;La;Ul核糖核蛋白；Ro60(SS-A);Ro52(SS-A);La(SS-B);鈣網(wǎng)蛋白；Grp78;Scl-70;組蛋白；Sm蛋白和染色質(zhì)等。Grave疾病的抗原表位可包括他+/-同向轉(zhuǎn)運子；促甲狀腺素受體；Tg禾口TP0。表中顯示一些神經(jīng)變性疾病的例子并描述于下，疾病與動物中非生理存在的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)。___表3_神經(jīng)變性疾病病理變形_非生理存在的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽阿爾茨海默氏病老年斑淀粉樣P蛋白帕金森氏癥路易小體a-突觸核蛋白亨廷頓癥核內(nèi)包涵體亨廷頓蛋白朊病毒疾病朊病毒蛋白包涵體朊病毒蛋白/^》欠,獰就氏諒阿爾茨海默氏病(AD)是人群中最普遍的神經(jīng)變性疾病(C翻ings等，Neurology51,S2-17;discussionS65-7，1998)。AD影響約10%大于65歲的人和幾乎50%大于85歲的人。估計到2005年，約2200萬人會受AD折磨。AD特征是緩慢發(fā)展的癡呆。如果mortern后發(fā)現(xiàn)三個一起的癡呆、神經(jīng)原纖維混亂和老年斑，確定診斷為AD。老年斑總是在阿爾茨海默氏病患者腦中發(fā)現(xiàn)。老年斑的主要構(gòu)成是淀粉樣P蛋白(AP)(lwtsubo等，Neuron13:45-53，1994)(Li卯a(chǎn)等，Lancet352:1117-1118，1998)，這是本發(fā)明自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的另一個例子。AP是獲得自淀粉樣前體蛋白(APP)的42個氨基酸肽，APP是具多種生理作用的跨膜糖蛋白，包括細(xì)胞增殖、粘附、細(xì)胞信號和神經(jīng)突生長(Sinha等，AnnNYAcadSci920:206-8,2000)。APP通常在AP結(jié)構(gòu)域中切割以產(chǎn)生分泌片段。然而，另外的加工導(dǎo)致APP切割以產(chǎn)生能在老年斑中積聚的可溶AP。目前AD治療受限于功效且不針對AP積聚?？捎盟幬锸侵袠心憠A脂酶抑制劑，用于增加腦中突觸后乙酰膽堿濃度(Farlow和Evans,Neurology51,S36-44;discussionS65-7，1998);(Hake，CleveClinJMed68，608-9:613-4，616，2001)。這些藥物僅在一些認(rèn)知參數(shù)中提供最小臨床益處。用于人A0的轉(zhuǎn)基因小鼠顯示許多特征與人AD相同(Games等，Nature375:523-527，1995);(Hsiao等，Science274:99-102，1996)。在這些轉(zhuǎn)基因小鼠中，用AP肽免疫證明在改進(jìn)認(rèn)知和降低組織病理中有效(Morgan等，Nature408:982-985,2000);(Schenk等，Nature400:173-177，1999)。研究也顯示在阿爾茨海默氏病動物模型中用肽疫苗產(chǎn)生抗AP的抗體反應(yīng)能反轉(zhuǎn)異常組織病理以及這些模型中觀察到的行為變化(Bard等，NatMed6:916-19，2000);(Demattos等，ProcNatlAcadSciUSA98:8850-8855,2001)。齡^^歷if帕金森氏癥是錐體外運動系統(tǒng)的神經(jīng)變性疾病，具有很高的普及率，每100，000人中128-168個(Schrag等，Bmj321:21-22，2000)主要臨床特征是靜止震顫、運動徐緩、僵化和姿勢不穩(wěn)定。癡呆也在大部分病例晚期發(fā)生。病理生理標(biāo)志是失去腦錐體外系統(tǒng)中的神經(jīng)元，特別是黑質(zhì)中。帕金森氏癥患者腦中許多神經(jīng)元具有稱為路易小體的胞內(nèi)包涵體(Forno和Norville,ActaNeuropathol(Berl)34:183-197,1976)。發(fā)現(xiàn)路易小體的主要構(gòu)成是稱為a-突觸核蛋白的蛋白質(zhì)，它是本發(fā)明自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的另一個例子(Dickson,CurrOpinNeurol14:423-432，2001)。發(fā)現(xiàn)含a-突觸核蛋白的路易小體積聚與疾病表型相關(guān)。目前帕金森氏癥治療針對所得疾病癥狀的控制，但不是潛在原因(Jankovic，Neurology55:S2-6,2000)。帕金森氏癥的可用藥物分類為多巴胺能劑(如卡比多巴/左旋多巴和司來吉蘭)、多巴胺激動劑(如培高利特和羅匹尼羅)和茶酚-o-甲基-轉(zhuǎn)移酶或C0MT抑制劑(如恩他卡朋和托卡朋)。所有這些治療針對提高受影響神經(jīng)元中多巴胺存在量?？傮w上，這些藥物在大部分病人中開始有效減少一些運動系統(tǒng)癥狀如震顫和僵化，但不有效緩解神經(jīng)變性過程發(fā)展，此過程導(dǎo)致黑質(zhì)神經(jīng)元破壞。夢逸^^"亨廷頓癥是以常染色體顯性方式遺傳的遺傳疾病并與稱為亨廷頓(huntingtin)的基因所含CAG三核苷酸重復(fù)長度中異常擴增相連(Cell72,971-983，1993)。主要臨床特征由稱為舞蹈病的異常無法控制移動和發(fā)展癡呆組成。病理生理上有紋狀體和大腦皮層中的選擇性神經(jīng)元死亡和變性。這些區(qū)域中的神經(jīng)元顯示積聚突變蛋白亨廷頓蛋白的胞內(nèi)集合，亨廷頓蛋白是本發(fā)明的另一個自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽，此積聚與疾病表型相關(guān)(DiFiglia等，Science277:1990-1993,1997);(Scherzinger等，Cell90:549-558，1997);(Davies等，Cell90:537-548，1997)。目前沒有治療用于亨廷頓癥癥狀或發(fā)病原因。結(jié)果，這些病人緩慢發(fā)展，平均在癥狀首次出現(xiàn)后17年必然死亡。^瘋毒疾瘃朊病毒疾病也稱為遺傳性海綿狀腦病，是影響動物和人的潛在傳染病，特征是腦的海綿樣變性(Prusiner，ProcNatlAcadSciUSA95,13363-833,1998)。此疾病最普遍形式也稱為克雅氏病。另-種疾病形式稱為新變異克雅氏病，對公眾健康有重要影響，因為認(rèn)為它通過跨種傳播發(fā)生，例如從牛到人。此疾病組的臨床特征包括迅速發(fā)展的癡呆、肌陣攣、虛弱和共濟失調(diào)。病理生理上，文獻(xiàn)報導(dǎo)正常朊病毒蛋白的構(gòu)象變化引起朊病毒聚集成e片層類型結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中所見的變性，朊病毒蛋白是本發(fā)明的一個自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽。目前沒有治療用于朊病毒疾病。臨床進(jìn)程迅速，通常在診斷2年內(nèi)必然死亡，沒有發(fā)明能改變此進(jìn)程。表中列出一些其它疾病的例子并描述于下，疾病與動物中非生理存在的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)。表4疾病異常疾病相關(guān)和非生理存在的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽肥胖能量攝入引起的重量增多配體聚糖-3、圍脂滴蛋白、食欲肽、甘丙肽、加〉消耗胰高血糖素-類似肽受體骨關(guān)節(jié)炎軟骨變性組織蛋白酶、纖溶酶、膠原酶、金屬蛋白酶脊髓損傷抑制再生Nogo-l高血壓持久性高血壓血管緊縮素-轉(zhuǎn)化酶胃潰瘍疾病過多胃酸H7K+ATP酶、胃泌激素老化超氧化物岐化酶低壓過多血清素血清素5HT2受體、ar腎上腺素受體痛風(fēng)過多尿酸黃嘌呤氧化酶偏頭痛血管痙攣血清素5HT2,B-5HT,。受體高脂血脂類提高HMGCoA-還原酶、阿樸脂蛋白A、B-100冠心病阻塞冠狀動脈限制血流血管緊縮素-轉(zhuǎn)化酶、阿樸脂蛋白A、B-10021,關(guān)，i^/,絲關(guān)夢^^瘋骨關(guān)節(jié)炎(0A)影響30%大于60歲的人，是最普遍的人關(guān)節(jié)疾病。骨關(guān)節(jié)炎代表滑膜關(guān)節(jié)變性和衰竭，包括關(guān)節(jié)軟骨分解。軟骨主要包括蛋白聚糖和膠原，蛋白聚糖提供硬度和抵擋負(fù)荷的能力，膠原提供張力和絕對強度(sheerstrength)抗性。軟骨細(xì)胞更新和重塑正常軟骨，通過產(chǎn)生和分泌潛在膠原酶、潛在溶基質(zhì)素、潛在白明膠酶、組織纖溶酶原激活物和其它相關(guān)酶，各自或組合是本發(fā)明的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽。一些抑制劑包括金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)和纖溶酶原激活物抑制劑(PAI-1)，也由軟骨細(xì)胞生成且限制中性金屬蛋白酶、組織纖溶酶原激活物和其它酶的降解活性。這些降解酶和抑制劑單獨或組合是本發(fā)明的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽。這些降解酶和抑制劑調(diào)整重塑和維持正常軟骨。在0A中，此過程失去調(diào)控導(dǎo)致軟骨退化和降解。在早期0A中，膠原纖維排列和大小有異常變化。金屬蛋白酶、組織蛋白酶和纖溶酶單獨或組合是本發(fā)明的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽，引起顯著軟骨基質(zhì)損失。軟骨細(xì)胞開始增加蛋白聚糖和軟骨生成導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨比正常厚。隨后關(guān)節(jié)軟骨由于降解酶作用而變薄和變軟，酶包括膠原酶、溶基質(zhì)素、白明膠酶、組織纖溶酶原激活物和其它相關(guān)酶，它們單獨或組合是本發(fā)明的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽。更軟和更薄的軟骨更易由于機械壓力損壞。這些因素導(dǎo)致軟骨表面分解和形成垂直裂縫(纖維性顫動)。軟骨表面形成侵蝕且延伸到疾病末期的骨中。軟骨細(xì)胞開始復(fù)制和形成簇，軟骨在末期細(xì)胞減少。骨重塑和肥大是OA的顯著特征。目前OA治療包括休息、理療以增強支持關(guān)節(jié)的肌肉、支柱和其它穩(wěn)定關(guān)節(jié)的支持裝置、非甾族抗炎癥劑、Tylenol和其它止痛劑。在末期骨上骨(bone-on-bone)0A中，對每日生活行動關(guān)鍵的關(guān)節(jié)如膝蓋或臀，進(jìn)行手術(shù)置換。肥胖是美國和其它工業(yè)國家面臨的主要健康問題。估計肥胖影響20%的美國人。肥胖是脂肪組織過多。當(dāng)長期能量攝入超過長期消耗時，過多卡路里被保存為導(dǎo)致肥胖的脂肪組織。因此肥胖可來自攝入增加和/或消耗減少。攝入取決于飲食行為，這是由大腦皮層控制的復(fù)雜過程。下丘腦不同區(qū)域包括攝食中樞和飽中樞，發(fā)出信號到大腦皮層以促進(jìn)攝食調(diào)節(jié)。血糖、胰島素、甘油和其它水平可通過下丘腦的攝食和飽中樞檢測以幫助調(diào)節(jié)攝食行為。人能通過一些機制部分適應(yīng)于過多卡路里射入。過多攝入碳水化合物和蛋白質(zhì)可通過增加靜止代謝速度部分補償，所用機制增加三碘甲狀腺氨酸的血漿水平和減少反向T3(rT3)水平。增加中樞和外周交感神經(jīng)流出也提高兒茶酚胺-誘導(dǎo)的卡22路里使用和熱生成。飲食生熱作用或身體對食物的熱反應(yīng)包括使熱和代謝消耗在攝入食物后增加到靜止代謝速度以上幾小時，且以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的食物大于以碳水化合物或脂肪為基礎(chǔ)的食物。攝食行為和脂肪生成受復(fù)雜機制控制。包括多配體聚糖-3的分子調(diào)節(jié)攝食和增加下丘腦中的攝食行為(Reizes等，Cell106:105-116,2001)。影響食物攝入和代謝的其它分子和受體包括食欲肽、甘丙肽、促腎上腺皮質(zhì)激素-釋放因子、黑色素-濃縮激素、瘦蛋白、縮膽囊素、生長激素抑制素、抑腸肽(enterostating)、胰高血糖素-類似肽1和2以及蛙皮素，它們都單獨或組合是本發(fā)明的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽(Chiesi等，TrendsPharmacologicalSciences,22:247-54，2001)。在肥胖的動物模型中，一些這種分子的拮抗物和激動劑證明對減肥有效(Chiesi等，TrendsPharmacologicalSciences,22:247-54,2001)。圍脂滴蛋白包被脂肪細(xì)胞的脂滴并調(diào)節(jié)三酰甘油水解，圍脂滴蛋白干擾使小鼠抗飲食-誘導(dǎo)的肥胖而正常耐受葡萄糖(Tansey等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98:6494-99)。當(dāng)肥胖次于二級代謝或其它疾病狀態(tài)時，治療二級原因。治療初級肥胖通過飲食安排和攝食行為修飾以減少熱量攝取以及鍛煉安排以增加消耗。食欲缺乏劑(苯異丙胺(amphetimine)-類似試劑)、甲狀腺激素藥物和人慢性促性腺激素用于治療肥胖。手術(shù)小腸旁路(jujunoileal分流)也用于治療病態(tài)肥胖的嚴(yán)重病例。估計美國每年有約11，0000起脊髓損傷新病例，美國目前總普及率為183,000到230,000個總病例(Stover等，ArchPhysMedRehabil80,1365-71,1999)。脊髓損傷恢復(fù)很差且導(dǎo)致破壞性不可逆的神經(jīng)無功能。目前治療急性脊髓損傷由機械穩(wěn)定損傷位置和施用腸胃外類固醇組成，機械穩(wěn)定例如通過手術(shù)干預(yù)。這些干預(yù)對于減少脊髓損傷后永久性癱瘓發(fā)生率作用很小。治療慢性脊髓損傷集中于維持生活質(zhì)量如控制疼痛、痙攣狀態(tài)和膀胱功能。目前沒有可用治療針對神經(jīng)功能恢復(fù)。造成脊髓損傷后恢復(fù)差的因素之一是髓鞘中存在軸突再生抑制劑。這些因子在損傷后不久釋放且防止軸突跨傷口生長以重建功能連接。這些軸突再生抑制劑之一是稱為Nogo-A的蛋白質(zhì)，這是本發(fā)明的一個自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽(Huber和Schwab,BiolChem381，407-19.,2000;Reilly,JNeurol247,239-40，2000;Chen等，Nature403,439-9,2000)。Nogo-A顯示在體外抑制神經(jīng)突生長，抗Nogo-A的中和抗體顯示反轉(zhuǎn)此生長抑制性質(zhì)。此外，抗Nogo-A的單克隆抗體顯示在脊髓損傷動物模型中體內(nèi)促進(jìn)軸突再生(Raineteau等，ProcNatlAcadSciUSA98,6929-34,2001;Merkler等，JNeurosci21，3665-73'2001;Blochlinger等，JCompNeurol433,426-36,2001;Brosamle等，JNeurosci20，8061-8，2000)。Nogo-A是跨膜蛋白，主要在大腦皮層和脊髓的少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。Nogo-A分子的兩個區(qū)域被鑒定為對此分子的抑制能力有潛在作用，即胞外66個氨基酸環(huán)和名為AS472的胞質(zhì)內(nèi)C-末端區(qū)。移/產(chǎn)^^貧^^ri人中組織和器官移植的一個最大限制是受體免疫系統(tǒng)對組織移植的排斥。很好確立了供體和受體間MHCI和II型(HLA-A、HLA-B和HLA-DR)等位基因匹配越高，移植存活越好。移植物抗宿主病(GVHD)在接受移植病人中引起顯著病態(tài)和死亡率，移植含異源造血細(xì)胞。造血細(xì)胞存在于骨髓移植、干細(xì)胞移植和其它移植中。約50%接受來自HLA-匹配兄弟姐妹移植的病人會從中等發(fā)展到嚴(yán)重GVHD，發(fā)病率比非HLA-匹配移植高許多。三分之一從中等發(fā)展到嚴(yán)重GVHD的病人會因此死亡。供體移植中的T淋巴細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞攻擊受體細(xì)胞，受體細(xì)胞表達(dá)氨基酸序列中的多肽變化，特定是人染色體6上主要組織相容性復(fù)合體(MHC)基因復(fù)合體中編碼蛋白的變化。在含異源造血細(xì)胞的移植中對GVHD有影響的大部分蛋白是高度多態(tài)(廣泛的人之間氨基酸變化)I型蛋白(HLA-A、-B和-C)和II型蛋白(DRB1、DQB1和DPB1)(Appelbaum，Nature411:385-389,2001)。即使當(dāng)供體和受體間腿CI型等位基因在血清學(xué)上'匹配'時，DNA測序顯示30。/。病例中有等位基因水平的錯配，甚至在匹配供體-受體對中提供I型-定向GVHD的基礎(chǔ)(A卯elbaum，Nature411:385-389，2001)。次要組織相容性自身抗原GVHD常引起皮膚、腸、肝、肺和胰腺損傷。GVHD用糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢霉素、氨甲蝶呤、fludarabine和0KT3治療。教一織^/產(chǎn)/##免疫排斥組織移植包括肺、心、肝、腎、胰腺和其它器官及組織，通過移植受體中針對移植器官的免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)。異源移植器官包含與移植受體相比氨基酸序列變化的蛋白質(zhì)。因為移植器官氨基酸序列不同于移植受體，它們常在受體中引起抗移植器官的免疫應(yīng)答。排斥移植器官是組織移植的主要并發(fā)癥和限制，可導(dǎo)致受體中移植器官的衰竭。排斥引起的慢性炎癥常導(dǎo)致移植器官功能紊亂。目前治療移植受體用多種免疫抑制劑以防止和抑制排斥。這些試劑包括糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢霉素A、Cellc印t、FK-506和0KT3。多核苷酸治療-材料和方法詳細(xì)描述本發(fā)明前，要理解本發(fā)明不限于特定制劑或加工參數(shù)，因為它們可以變化。也要理解本文所用術(shù)語僅用于描述發(fā)明特定實施方案，不想要限制。盡管一些與本文所述類似或相當(dāng)?shù)牟牧虾头椒捎糜趯嵺`本發(fā)明，本文描述優(yōu)選材料和方法。"自身載體"指一個或多個載體，它們一起包括編碼一種或多個自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸，可以是DNA或RNA。如本文所用，多核苷酸是一系列含DNA的脫氧核糖核酸或含RNA的核糖核酸以及它們的衍生物，編碼本發(fā)明的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽。自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽編碼序列插入適當(dāng)質(zhì)粒自身表達(dá)盒。一旦編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸插入自身表達(dá)盒，載體稱為"自身載體"。在待施用的多核苷酸編碼超過一個自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的情況中，單個自身載體可編碼多種不同自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽。在一個實施方案中，編碼一些自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的DNA在單個自身質(zhì)粒中連續(xù)編碼，使用內(nèi)部核糖體再進(jìn)入位點(IRES)或其它方法以從單個DNA分子中表達(dá)多種蛋白質(zhì)。編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的DNA表達(dá)自身載體用分離質(zhì)粒DNA的普通技術(shù)制備和分離，如商業(yè)購買自Qiagen公司的。無細(xì)菌內(nèi)毒素的純化DNA作為治療劑傳遞給人。另外，各自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽在單獨DNA表達(dá)載體上編碼。如本文所用，"自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽"指任何蛋白質(zhì)、多肽或肽或其衍生物片段在動物基因組中編碼；在動物中生成或產(chǎn)生；可在動物生命中某些時候翻譯后修飾；在動物中非生理存在。當(dāng)術(shù)語"非生理"或"非生理地"用于描述本發(fā)明自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽時，指來自或衍生自動物中自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的正常作用或過程。當(dāng)自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽稱為"與疾病相關(guān)"或"參與疾病"時，要理解是指自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽可修飾結(jié)構(gòu)形式并因而不能行使其生理作用或過程；或可參與情況或疾病的病理生理學(xué)，通過誘導(dǎo)病理生理、調(diào)節(jié)或促進(jìn)病理生理過程；和/或作為病理生理過程的靶。例如，在自身免疫疾病中，免疫系統(tǒng)異常攻擊自身-蛋白質(zhì)，引起細(xì)胞和組織損傷和功能紊亂，自身-蛋白質(zhì)在這些細(xì)胞和組織中表達(dá)和/或存在。另外，自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽可自己以非生理水平表達(dá)和/或非生理發(fā)揮功能。例如，自身-蛋白質(zhì)在神經(jīng)變性疾病中異常表達(dá)，積聚在腦損傷中，從而引起神經(jīng)功能紊亂。在其它情況中，自身-蛋白質(zhì)加重不需要的情況或過程。例如在骨關(guān)節(jié)炎中，含膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶的自身-蛋白質(zhì)異常降解覆蓋連接關(guān)節(jié)表面的軟骨。自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽翻譯后修飾的例子是糖基化、脂基加入、通過磷酸酶脫磷酸、二甲基精氨酸殘基加入、通過肽基精氨酸脫亞氨酶(PAD)瓜氨酸化聚絲蛋白(fillaggrin)和血纖蛋白；aB晶體蛋白磷酸化；瓜氨酸化MBP;通過胱冬酶和粒酶蛋白裂解SLE自身抗原。免疫學(xué)上，自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽都被認(rèn)為是宿主自身抗原且在正常生理條件下被宿主免疫系統(tǒng)忽略，這是通過去除、失活或缺乏活化免疫細(xì)胞，免疫細(xì)胞能經(jīng)名為"免疫耐受"的過程識別自身抗原?？乖溉魏文鼙幻庖呦到y(tǒng)即B細(xì)胞或T細(xì)胞或兩者都識別的分子。自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽不包括免疫蛋白質(zhì)、多肽或肽，它們是免疫系統(tǒng)細(xì)胞生理、特異和專一表達(dá)的分子，用于調(diào)節(jié)免疫功能。免疫系統(tǒng)是防御機制，提供方法產(chǎn)生迅速、高特異和保護(hù)性反應(yīng)抗動物世界存在的潛在致病微生物。免疫蛋白質(zhì)、多肽或肽的例子包括T細(xì)胞受體、免疫球蛋白、含I類白介素的細(xì)胞因子、含干擾素和IL-10的II類細(xì)胞因子、TNF、淋巴毒素和化學(xué)因子如巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1a和P、單核細(xì)胞-趨化蛋白和RANTES、其它直接參與免疫功能的分子如Fas-配基。有一些免疫蛋白質(zhì)、多肽或肽包括在本發(fā)明自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽中，它們是MHCI型膜糖蛋白、MHCII型糖蛋白和骨橋蛋白。自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽不包括受試者完全或幾乎沒有的蛋白質(zhì)、多肽和肽，由于遺傳或獲得性缺陷引起代謝或功能紊亂，它們通過施用所述蛋白質(zhì)、多肽或肽或施用編碼所述蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸(基因治療)取代。這種疾病的例子包括杜興氏肌營養(yǎng)不良、貝克型肌營養(yǎng)不良、囊腫性纖維化、苯丙酮尿癥、半乳糖血癥、槭糖尿病和高胱氨酸尿。自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽不包括細(xì)胞特異和專一表達(dá)的蛋白質(zhì)、多肽和肽，具有的特征使它們與它們正常對應(yīng)物區(qū)別，包括(l)克隆性(clonality)，代表具遺傳變化的單個細(xì)胞增殖以形成惡性細(xì)胞克隆，(2)自主性，表示生長不受適當(dāng)調(diào)節(jié)，(3)退行發(fā)育或缺乏正常協(xié)調(diào)的細(xì)胞分化。具有一個或多個上述三種標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞稱為贅生性、癌或惡性細(xì)胞。如本文所用，"調(diào)節(jié)、調(diào)整或改變免疫應(yīng)答"指任何對現(xiàn)有或潛在抗自身-蛋白質(zhì)免疫應(yīng)答的改變，包括但不限于核酸、脂類、磷脂、碳水化合物、自身-蛋白質(zhì)、多肽、肽、蛋白質(zhì)復(fù)合體、核糖核蛋白復(fù)合體或它們的衍生物，通過施用編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽、肽、核酸或片段或其衍生物的多核苷酸而產(chǎn)生。這種調(diào)節(jié)包括任何對任意免疫細(xì)胞存在、能力或功能的改變，免疫細(xì)胞參與或能參與免疫應(yīng)答。免疫細(xì)胞包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞、專門的抗原呈遞細(xì)胞、非專門抗原呈遞細(xì)胞、炎癥細(xì)胞、或任何其它能參與或影響免疫應(yīng)答的細(xì)胞。調(diào)節(jié)包括改變現(xiàn)有免疫應(yīng)答、發(fā)展免疫應(yīng)答、潛在免疫應(yīng)答、或者誘導(dǎo)、調(diào)控、影響或響應(yīng)免疫應(yīng)答的能力。調(diào)節(jié)包括免疫細(xì)胞中基因、蛋白質(zhì)和/或其它分子表達(dá)和/或功能的任何改變，免疫細(xì)胞作為免疫應(yīng)答的一部分。調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答包括但不限于去除、缺失或隔絕免疫細(xì)胞；誘導(dǎo)或產(chǎn)生能調(diào)節(jié)其它細(xì)胞功能的免疫細(xì)胞，其它細(xì)胞如自動反應(yīng)淋巴細(xì)胞、APCs或炎癥細(xì)胞；誘導(dǎo)免疫細(xì)胞中無應(yīng)答狀態(tài)，稱為無反應(yīng)力；增加、減少或改變免疫細(xì)胞活性或功能或這樣做的能力，包括但不限于改變這些細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)的模式。例子包括改變生成和/或分泌一些分子種類如細(xì)胞因子、化學(xué)因子、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、激酶、共同刺激分子或其它細(xì)胞表面受體；或任何這些調(diào)節(jié)事件的組合。例如，編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽、肽的多核苷酸可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，通過去除、隔絕或關(guān)閉免疫細(xì)胞，免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)或能調(diào)節(jié)不需要的免疫應(yīng)答；誘導(dǎo)、產(chǎn)生或打開免疫細(xì)胞，免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)或能調(diào)節(jié)保護(hù)性免疫應(yīng)答；改變免疫細(xì)胞物理和功能性質(zhì)；或這些效果的組合。測量免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的例子包括但不限于檢測免疫細(xì)胞群的存在或缺乏(用流式細(xì)胞儀、免疫組化、組織學(xué)、電鏡、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))；測量免疫細(xì)胞功能，包括對應(yīng)于信號而增殖或分裂的能力或抗性(如使用T細(xì)胞增殖測定和以3H-胸苷納入為基礎(chǔ)的肽掃描分析，分析前用抗CD3抗體、抗T細(xì)胞受體抗體、抗CD28抗體、鈣離子載體、PMA、負(fù)荷肽或蛋白抗原的抗原呈遞細(xì)胞刺激；B細(xì)胞增殖測定)；測量細(xì)胞因子、化學(xué)因子、細(xì)胞表面分子、抗體和其它細(xì)胞產(chǎn)物(用流式細(xì)胞儀、酶聯(lián)免疫吸收測定、蛋白質(zhì)印跡分析、蛋白質(zhì)微陣列分析、免疫沉淀分析)；測量免疫細(xì)胞或化或免疫細(xì)胞中信號途徑的生化標(biāo)記(蛋白質(zhì)印跡和免疫沉淀分析酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸磷酸化、多肽切割、焉白質(zhì)復(fù)合體形成或分離；蛋白質(zhì)微陣列分析；用DNA陣列或扣除雜交的DNA轉(zhuǎn)錄分布)；測量通過細(xì)胞凋亡、壞死或其它機制的細(xì)胞死亡(膜聯(lián)蛋白V染色、TUNEL測定、凝膠電泳以測量函A梯、組織學(xué)；熒光胱冬酶測定、蛋白質(zhì)印跡分析胱冬酶底物)；測量免疫細(xì)胞產(chǎn)生的基因、蛋白質(zhì)和其它分子(RNA印跡分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、DNA微陣列、蛋白質(zhì)微陣列、雙相(2-dimentional)凝膠電泳、蛋白質(zhì)印跡分析、酶聯(lián)免疫吸收測定、流式細(xì)胞儀)；測量臨床結(jié)果如自身免疫、神經(jīng)變性和其它含非生理自身蛋白質(zhì)的疾病的改進(jìn)(臨床分?jǐn)?shù)、用于另外治療的需求、功能狀態(tài)、成像研究)。如本文所用，"免疫調(diào)節(jié)序列(IMS)"所指化合物由脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其調(diào)節(jié)自身免疫或炎癥疾病的類似物。頂S可以是載體中結(jié)合的寡核苷酸或核苷酸序列。"寡核苷酸"指多種核苷酸。核苷酸包括與磷酸基團和可交換有機堿基相連的糖(優(yōu)選核糖或脫氧核糖)，堿基可以是取代的嘌呤(鳥嘌呤(G)、腺嘌呤(A)27或肌苷(I))或取代的嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U))。寡核苷酸指寡核糖核苷酸和寡脫氧核糖核苷酸，下文稱為0DNs。ODNs包括寡核苷酸和其它含聚合體的有機堿基。寡核苷酸包括任何長度的多種核苷酸，來自兩個或多個相連核苷酸的鏈，且包括含數(shù)百萬相連核苷酸的染色體物質(zhì)。一方面，發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)序列是合成的寡核苷酸，包括下列一級結(jié)構(gòu)5'-嘌呤-嘧啶-[幻-[Y]-嘧啶-嘧啶-3，或5'-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3，其中X和Y是任何天然產(chǎn)生或合成的核苷酸，除了X和Y不能是胞嘧啶-鳥嘌呤。IMS的核心六聚體5'和/或3'-側(cè)翼可以是任意組成或數(shù)量的核苷酸或核苷。IMS范圍優(yōu)選在6和100個堿基對長度間，最優(yōu)選16-50個堿基對長度。IMS也可作為部分較長DNA片段傳遞，范圍從100到100，000個堿基對。IMS可納入或已在DNA質(zhì)粒、病毒載體和基因組DNA中產(chǎn)生。IMS范圍也可最優(yōu)選從6(五側(cè)翼序列)到10，000個堿基對或更長尺寸。在六聚體核心側(cè)翼存在的序列能構(gòu)建成與任何己知免疫抑制序列(IIS)中存在的側(cè)翼序列大致匹配。例如，側(cè)翼序列TGACTGTG-Pu-Pu-X-Y-Pyr-Pyr-AGAGATGA，其中TGACTGTG和AGAGATGA是側(cè)翼序列。另一種優(yōu)選側(cè)翼序列包括一系列嘧啶(C、T和U)，作為單獨嘧啶重復(fù)2次或多次，或作為不同嘧啶的復(fù)合體，長度為2個或多個。不同側(cè)翼序列用于測試抑制調(diào)節(jié)序列。更多抑制寡核苷酸的側(cè)翼序列例子包含于下列參考文獻(xiàn)美國專利號6，225，292和6，339，068Zeuner等，ArthritisandRheumatism,46:2219-24，2002。發(fā)明的特定IMS所包括寡核苷酸含下列六聚體序列5'-嘌呤-嘧啶-[幻-[Y]-嘧啶-嘧啶-3，IMS,含GG二核苷酸核心GTGGTT、ATGGTT、GCGGTT、ACGGTT、GTGGCT、ATGGCT、GCGGCT、ACGGCT、GTGGTC、ATGGTC、GCGGTC、ACGGTC等。5，—嘌吟—嘧啶—[幻-[Y]-嘧啶-嘧啶-3，IMS,含GC二核苷酸核心GTGCTT、ATGCTT、GCGCTT、ACGCTT、GTGCCT、ATGCCT、GCGCCT、ACGCCT、GTGCTC、ATGCTC、GCGCTC、ACGCTC等。腺嘌呤的鳥嘌呤和肌苷取代物和/或胞嘧啶或胸腺啼啶的尿苷取代物和這些取代可在上述指南基礎(chǔ)上產(chǎn)生。上述免疫抑制序列或ns顯示抑制免疫刺激序列(iss)活性，此iss含美國專利號6，225,292的核心二核苷酸CpG。缺乏ISS時，本發(fā)明第一次顯示此IIS防止和治療自身免疫疾病，單獨或結(jié)合DNA多核苷酸治療。此IIS包含核心六聚體AAGGTT。該序列在本文稱為免疫調(diào)節(jié)序列或IMS。本發(fā)明IMS所含具類似基序的其它相關(guān)IISs是5，-嘌呤-嘌呤-[幻-[Y]-嘧啶-嘧啶-3，IMS，含GG二核苷酸核心GGGGTT、AGGGTT、GAGGTT、AAGGTT、GGGGCT、AGGGCT、GAGGCT、AAGGCT、GGGG丁C、AGGGTC、GAGGTC、AAGGTC等。5'-嘌呤-嘌呤-[幻-[Y]-嘧啶-嘧啶-3，IMS，含GC二核苷酸核心GGGCTT、AGGCTT、GAGCTT、AAGCTT、GGGCCT、AGGCCT、GAGCCT、AAGCCT、GGGCTC、AGGCTC、GAGCTC、AAGCTC等。腺嘌呤的鳥嘌呤和肌苷取代物和/或胞嘧啶或胸腺噴啶的尿苷取代物可在上述指南基礎(chǔ)上產(chǎn)生。寡核苷酸可獲得自現(xiàn)有核酸來源，包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、病毒DNA和cDNA，但優(yōu)選通過寡核苷酸合成產(chǎn)生的合成寡核苷酸。IMS可以是部分單鏈或雙鏈DNA、RNA和/或寡核苷酸。IMS優(yōu)選是寡核苷酸，包含未甲基化GpG寡核苷酸。另外的實施方案包括IMS，其中一個或多個腺嘌呤或胞嘧啶殘基被甲基化。在真核細(xì)胞中，通常胞嘧啶和腺嘌呤殘基可被甲基化。IMS可以是穩(wěn)定和/或未穩(wěn)定的寡核苷酸。穩(wěn)定寡核苷酸所指寡核苷酸相對抗體內(nèi)核酸外切酶、內(nèi)切酶和其它降解途徑的降解。優(yōu)選穩(wěn)定寡核苷酸具有修飾的磷酸主鏈，最優(yōu)選的寡核苷酸具有硫代磷酸(phophorothioate)修飾的磷酸主鏈，其中至少一個磷酸氧被硫取代。主鏈磷酸基團修飾包括甲基磷酸酯、硫代磷酸、磷酸酰胺(phophoroamidate)和二硫代磷酸核苷酸間鍵合，可提供IMS抗菌性質(zhì)。頂S優(yōu)選是穩(wěn)定寡核苷酸，優(yōu)選使用硫代磷酸穩(wěn)定的寡核苷酸。另外的穩(wěn)定寡核苷酸包括垸基磷酸三酯和磷酸二酯，其中帶電的氧被垸基化；芳基磷酸酯和烷基磷酸酯，它們是非離子DNA類似物，其中帶電的磷酸酯氧被芳基或垸基取代；或/和寡核苷酸，在任意或兩個末端含六乙二醇或四乙二醇或另一種二醇。另外的空間構(gòu)象可用于使糖部分附于IMS的核苷堿基。IMS的核苷堿基在調(diào)節(jié)二核苷酸側(cè)翼，可以是已知天然產(chǎn)生的堿基或合成的非天然堿基。寡核苷可結(jié)合到IMS-0N的內(nèi)部區(qū)域和/或末端，使用常規(guī)技術(shù)作為其它化合物的附著點，即粘附或連接其它分子的方法，包括自身脂類、自身蛋白質(zhì)、自身肽、自身多肽、自身糖脂、自身碳水化合物、自身糖蛋白和翻譯后修飾的自身蛋白質(zhì)、肽、多肽或糖蛋白，或者作為另外免疫調(diào)節(jié)治療的附著點。IMS-0N的堿基、糖部分、磷酸基團和末端也可以本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任何方式修飾以構(gòu)建具所需性質(zhì)的IMS-0N，除了IMS-0N的調(diào)節(jié)活性。例如，糖部分能以任意空間構(gòu)象附于IMS-0N的核苷酸堿基。對寡核苷酸進(jìn)行這些磷酸基團修飾的技術(shù)在本領(lǐng)域已知且不需要詳細(xì)解釋。回顧一個這種有用技術(shù)，制備靶寡核苷酸產(chǎn)物的中間磷酸三酯并用水合碘或其它試劑氧化成天然產(chǎn)生的磷酸三酯，其它試劑如無水胺。所得寡核苷酸氨基磷酸酯可用硫處理以產(chǎn)生硫代磷酸。相同的一般技術(shù)(除了硫處理步驟)可用于從甲基磷酸酯產(chǎn)生甲基磷酸酰胺。對于涉及磷酸基團修飾技術(shù)的更多細(xì)節(jié)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可參考美國專利號4，425，732;4,458,066;5,218,103和5,453,496以及TetrahedronLett.21:414925(1995)，7:5575(1986)，25:1437(1984)和JorunalAra.ChemSoc.，93:6657(1987)，所揭示的納入本文用于闡明本領(lǐng)域涉及IMS組成和制備的知識水平。特定有用的磷酸基團修飾是轉(zhuǎn)變成IMS-ON寡核苷酸的的硫代磷酸或二硫代磷酸形式。硫代磷酸和二硫代磷酸比它們未修飾的寡核苷酸對應(yīng)物更抗體內(nèi)降解，使發(fā)明的IMS-ON更能用于宿主。IMS-ON可用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)和核酸合成設(shè)備來合成。此方面的參考文獻(xiàn)參加例如Ausubel等，《分子生物的當(dāng)前操作》(CurrentProtocolsinMolecularBiology),第2和4章(WileyInterscience，1989);Maniatis等，《分子克隆實驗室手冊》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(ColdSpringHarborLab.，NewYork,1982);美國專利號4，458，066和美國專利號4,650，675。這些參考文獻(xiàn)納入本文供參考，用于證明本領(lǐng)域涉及合成寡核苷酸生成的知識水平。另外，獲得MS-ON可通過突變分離的微生物ISS-0DN，使競爭二核苷酸取代天然產(chǎn)生的CpG基序和側(cè)翼核苷酸。取決于核酸雜交的篩選過程能從任何生物體分離任意多核苷酸序列，只要存在適當(dāng)探針或抗體。寡核苷酸探針對應(yīng)于編碼討論蛋白質(zhì)的部分序列，可化學(xué)合成。這需要氨基酸序列的短、寡肽延伸必須已知。編碼蛋白質(zhì)的DNA序列也能從遺傳密碼中推出，然而必須考慮密碼子簡并性。例如，可篩選認(rèn)為含ISS-包含多核苷酸的cDNA文庫，通過將多種獲得自cDNA的mRNA注射到卵母細(xì)胞，可有足夠時間表達(dá)cDNA基因產(chǎn)物，測試所需cDNA基因產(chǎn)物的存在，例如通過使用特異于感興趣多核苷酸編碼肽的抗體或使用重復(fù)基序和組織表達(dá)模式的探針，組織表達(dá)模式是感興趣多核苷酸編碼的肽的特征。另外，可用特異于肽的抗體間接篩選CDNA文庫對感興趣肽的表達(dá)，肽具有至少一種抗原表位。這種抗體可以是多克隆或單克隆獲得并用于檢測指示感興趣cDNA存在的表達(dá)產(chǎn)物。一旦獲得含ISS的多核苷酸，它可縮短至所需長度，例如用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行酶消化。隨后突變ISS-ODN寡核苷酸產(chǎn)物中的CpG基序以使"抑制"二核苷酸-用本發(fā)明方法鑒定-取代CpG基序。在具已知序列的DNA特定位點進(jìn)行取代突變的技術(shù)熟知，例如經(jīng)PCR的M13引物突變。由于IMS是非編碼的，在取代突變中沒有涉及維持可讀框。然而為用于體內(nèi)，多核苷酸起始物質(zhì)ISS-ODN寡核苷酸中間物或IMS突變產(chǎn)物應(yīng)充分純化(即盡量沒有天然產(chǎn)生的污染物和LPS,用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知和選擇的技術(shù))。發(fā)明的頂S可單獨使用或者順式或反式結(jié)合到重組自身載體(質(zhì)粒、粘粒、病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒)，自身載體隨之編碼重組表達(dá)載體可傳遞的任何自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽。為了方便，IMS優(yōu)選沒有結(jié)合到表達(dá)載體施用。然而，如果需要結(jié)合到表達(dá)載體，這種結(jié)合可用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員己知的常規(guī)技術(shù)完成。對于綜述，普通技術(shù)人員可參考Ausubel《分子生物的當(dāng)前操作》，同上。簡要地，構(gòu)建重組表達(dá)載體使用標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。為分析以確認(rèn)構(gòu)建載體中的正確序列，連接混合物可用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞且成功的轉(zhuǎn)化子通過適當(dāng)抗生素抗性選擇。制備來自轉(zhuǎn)化子的載體，通過限制性分析和/或測序，例如通過Messing等，(NucleicAcidsRes.,9:309，1981)、Maxam等，(《酶學(xué)方法》(MethodsinEnzymology)，65:499，1980)的方法或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)方法。切割片段的大小分離用常規(guī)凝膠電泳進(jìn)行，例如Maniatis等，(《分子克隆》，133-134頁，1982)所述。宿主細(xì)胞能用本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化并在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基適當(dāng)修改用于誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴增基因。培養(yǎng)條件如溫度、pH等在前面用于選擇表達(dá)的宿主細(xì)胞，對于普通技術(shù)人員是顯然的。如果重組表達(dá)載體用作發(fā)明IMS-0N的載體，質(zhì)粒和粘粒由于缺乏病原性而特定優(yōu)選。然而，質(zhì)粒和粘粒在體內(nèi)比病毒降解更快，因此不傳遞合適劑量的IMS-0N以防止或治療炎癥或自身免疫疾病。大部分用于構(gòu)建載體、轉(zhuǎn)染和感染細(xì)胞的技術(shù)在本領(lǐng)域廣泛實踐，大部分實踐者熟悉描述特定條件和過程的標(biāo)準(zhǔn)資源材料。31"質(zhì)粒"和"載體"指定為小寫字母p，接著是字母和/或數(shù)字。起始質(zhì)?？缮虡I(yè)獲得、在不限制基礎(chǔ)上公開獲得或可根據(jù)發(fā)表的過程從可用質(zhì)粒構(gòu)建。此外，與所述相當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒在本領(lǐng)域已知且對于普通技術(shù)人員是顯然的。"載體"或"質(zhì)粒"指任何遺傳元件，存在于宿主細(xì)胞時能通過包括適當(dāng)控制和調(diào)節(jié)元件來復(fù)制。為了本發(fā)明目的，載體或質(zhì)粒的例子包括但不限于質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、粘粒、病毒等。構(gòu)建發(fā)明的載體使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)連接和限制性技術(shù)(參見Ausubel等，(1987)《分子生物的當(dāng)前操作》，Wiley-Interscience或Maniatis等，(1992)《分子克隆實驗室手冊》(ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.)。分離的質(zhì)粒、DNA序列或合成寡核苷酸被切割、適應(yīng)并歸入所需形式。所有含合成DNA的DNA構(gòu)建序列通過DNA序列分析確定(Sanger等，(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.74，5463-5467)。"消化"DNA指用限制性酶催化切割DNA，限制性酶僅作用于DNA中的一些序列、限制性位點。本文所用多種限制性酶可商業(yè)購買，它們的反應(yīng)條件、輔因子和其它需要對普通技術(shù)人員已知。為用于分析，通常在約20iil緩沖溶液中，lug質(zhì)?；駾NA片段使用2單位酶。另外，過量限制性酶用于確保DNA底物完全消化。在約37'C孵育約1小時或2小時可行，盡管可忍受變化。各孵育后，蛋白質(zhì)用酚/氯仿抽提，接著乙醚提取，核酸通過乙醇沉淀從含水部分回收。如果需要，切割片段的大小分離可通過聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行。大小分離的綜合描述發(fā)現(xiàn)于《酶學(xué)方法》65:499-560(1980)。限制性切割片段可以是鈍端，通過在4種脫氧核糖核苷三磷酸存在時用大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(Klenow)處理，在50mMTris(pH7.6)50mMNaCl、6mMMgCl2、6mMDTT和5-10yMdNTPs中20。C孵育約15到25分鐘的時間。Klenow片段填補5'粘端但后退去除突出的3'單鏈，盡管存在4種dNTPs。如果需要，在粘端性質(zhì)決定的限制中進(jìn)行選擇性修補可通過僅提供一種dNTPs或選擇的dNTPs。Klenow處理后，混合物用酚/氯仿抽提并乙醇沉淀。適當(dāng)條件下用Sl核酸酶或Bal-31處理導(dǎo)致任何單鏈部分水解。連接在下列標(biāo)準(zhǔn)條件和溫度下于15-50u1體積中進(jìn)行20mMTris-ClpH7.5、10mMMgCl2、10mMDTT、33mg/mlBSA、10mM-50mMNaCl，以及40uMATP、0,01-0.02(Weiss)單位T4DNA連接酶于0°C(用于"粘端"連接)或者lmMATP、0.3-0.6(Weiss)單位T4DNA連接酶于14°C(用于"鈍端"連接)。分子間"粘端"連接通常在33-100ug/ml總DNA濃度進(jìn)行。分子間鈍端連接用摩爾過量的接頭(linkersover)末端進(jìn)行。自身表達(dá)盒使用在宿主細(xì)胞中有功能的啟動子。一般，含啟動子和控制序列的載體與特定宿主細(xì)胞一起使用，序列獲得自與宿主細(xì)胞相容的種類。適用于原核宿主的啟動子包括P-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)和雜合啟動子如tac啟動子。然而，其它有功能的細(xì)菌啟動子適合。除了原核，真核微生物如酵母培養(yǎng)物也可使用。釀酒酵母或普通面包酵母是最常使用的真核微生物，盡管一些其它菌株可商業(yè)購買?？刂撇溉閯游锼拗骷?xì)胞中載體轉(zhuǎn)錄的啟動子可獲得自多種來源，例如病毒基因組如多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒和優(yōu)選的細(xì)胞巨化病毒，或者來自異源哺乳動物啟動子，如e-肌動蛋白。SV40病毒的早和晚期啟動子可作為SV40限制性片段方便獲得，片段也包含SV40病毒復(fù)制起點。人細(xì)胞巨化病毒的直接早期啟動子可作為HindIII限制性片段方便獲得。當(dāng)然，來自宿主細(xì)胞或相關(guān)種類的啟動子也用于本文。本文所用載體可包含選擇基因，選擇基因也稱為可選擇標(biāo)記。選擇基因編碼蛋白質(zhì)的是轉(zhuǎn)化載體的宿主細(xì)胞存活或生長所必需。用于哺乳動物細(xì)胞的適當(dāng)可選擇標(biāo)記例子包括二氫葉酸還原酶基因(DHFR)、鳥氨酸脫羧酶基因、多種藥物抗性基因(mdr)、腺苷脫氨酶基因和谷氨酸合酶基因。當(dāng)這種可選擇標(biāo)記成功轉(zhuǎn)入哺乳動物宿主細(xì)胞時，轉(zhuǎn)化的哺乳動物宿主細(xì)胞如果置于選擇壓力下能存活。有兩種廣泛使用的不同選擇方案種類。第一種類以細(xì)胞代謝和使用突變細(xì)胞系為基礎(chǔ)，突變細(xì)胞系缺乏不依賴添加培養(yǎng)基生長的能力。第二種類稱為顯性選擇，指選擇方案用于任何細(xì)胞類型且不需使用突變細(xì)胞系。這些方案通常使用藥物以抑制宿主細(xì)胞生長。這些具新基因的細(xì)胞表達(dá)傳遞藥物抗性的蛋白質(zhì)且在選擇時存活。這種顯性選擇的例子使用藥物新霉素(Southern和Berg(1982)J.Molec.Appl.Genet.1,327)、霉酚酸(Mulligan和Berg(1980)Science209,1422)或潮霉素(Sugden等，(腦)Mol.Cell.Bio.5，410-413)。上述三個例子使用真核控制下的細(xì)菌基因以分別傳遞對適當(dāng)藥物新霉素(G418或genticin)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。"轉(zhuǎn)染"指將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞，從而表達(dá)DNA，無論功能性表達(dá)或其它；DNA也可作為染色體外元件或通過染色體整合復(fù)制。除非另外提供，本文所用轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法是Graham和vanderEb(1973)Virology52,456-457的磷酸鈣共沉33淀方法。另外的轉(zhuǎn)染方法是電穿孔、DEAE-葡聚糖方法、脂轉(zhuǎn)染和生物射彈(Kriegler(1990)《基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)實驗室手冊》(GeneTransferandExpression:ALaboratoryManual)，StocktonPress)。本發(fā)明的自身載體可制成多核苷酸鹽用作藥物。多核苷酸鹽能用非毒性無機或有機堿基制備。無機堿基鹽包括鈉、鉀、鋅、鈣、鋁、鎂等。有機非毒性堿基包括一級、二級和三級胺的鹽等。這種DNA多核苷酸鹽可制成凍干形式以在傳遞前復(fù)水，如無菌水或鹽溶液。另外，自身DNA多核苷酸鹽可在溶液、懸浮液或乳劑中制成，包括以水或油為基礎(chǔ)的載體用于傳遞。在一個較佳實施方案中，DNA在具生理水平^(0.9mM)的磷酸緩沖鹽水中凍干，隨后在施用前用無菌水復(fù)水。另外，DNA在溶液中制成，溶液含lmM和2M間的高量〔&++。DNA也可在缺乏特定離子種類時制成。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知，存在多種方法將多核苷酸傳遞給受試者，如本文所定義。"受試者"指任何動物，例如人、非人的靈長類動物、馬、牛、狗、貓、小鼠、大鼠、豚鼠或兔。編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸可用陽離子聚合體制成，聚合體含陽離子脂質(zhì)體。其它脂質(zhì)體也代表有效制成和傳遞自身多核苷酸的方法。另外，自身DNA可結(jié)合到病毒載體、病毒顆?；蚣?xì)菌用于藥物傳遞。病毒載體可以是感染活性、減毒(突變降低誘導(dǎo)疾病的能力)或復(fù)制缺陷。用自身DNA防止致病自身蛋白質(zhì)沉積、積聚或活性的方法可用病毒載體或其它傳遞系統(tǒng)提高，傳遞系統(tǒng)增強體液反應(yīng)抗編碼自身蛋白質(zhì)。在其它實施方案中，DNA可結(jié)合固體支持物，包括金粒、以多糖為基礎(chǔ)的支持物或其它顆粒或珠，能通過顆粒轟擊(彈道傳遞)注射、吸入或傳遞。傳遞核酸制品的方法在本領(lǐng)域巳知。參見例如美國專利號5，399，346、5，580,859和5，589，466。發(fā)展一些以病毒為基礎(chǔ)的系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞。例如，描述了逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)(美國專利號5,219，740;Miller等，Biotech—es7:980-990，1989;MillerA.D.，HumanGeneTherapy1:5-14,1990;Scarpa等，Virology180:849-852，1991;Burns等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:8033-8037，1993;Boris-Lawrie和Termin，Cur.Opin,Genet.Develop.3:102—109，1993)。也描述了一些腺病毒載體，參見例如(Hai-Ahmad等，J.Virol.57:267-274,1986;Bett等，J.Virol.67:5911-5921,1993;Mittereder等，HumanGeneTherapy5:717-729，1994;Seth等，J.Virol.68:933-940，1994;Barr等，GeneTherapy1:51—58，1994;Berkner，K.L.，BioTechniques6:616—629，1988;Rich等，HumanGeneTherapy4:461-476,1993)。也發(fā)展了腺-相關(guān)病毒(AAV)載體系統(tǒng)用于核酸傳遞。AAV載體可用本領(lǐng)域熟知技術(shù)構(gòu)建。參見例如美國專利號5,173，414和5，139,941;國際出版號WO92/01070和WO93/03769;Lebkowski等，Molec.Cell.Biol.8:3988-3996，1988;Vincent等，Vaccines90(ColdSpringHarborLaboratoryPress)1990;Carter,B.了.，CurrentOpinioninBiotechnology3:533-539，1992;Muzyczka，N.，CurrentTopicsinMicrobiol.AndImmunol.158:97—129,1992;Kotin,R.M.，HumanGeneTherapy5:793-801,1994;Shelling等，GeneTherapy1:165-169，1994;Zhou等，J.Exp.Med.179:1867-1875，1994)。本發(fā)明的多核苷酸也可沒有病毒載體傳遞。例如，傳遞給受試者前分子可包入脂質(zhì)體。脂包裝一般用脂質(zhì)體完成，脂質(zhì)體能穩(wěn)定結(jié)合或截留和保持核酸。對于將脂質(zhì)體用作傳遞核酸載體的綜述，參見(Hug等，Biochim.Biophys.Acta1097:1-17，1991;Straubinger等，《酶學(xué)方法》，101巻，512-527頁，1983)。疾病或紊亂的"處理"、"治療"或"療法"指減緩、停止或反轉(zhuǎn)疾病發(fā)展，通過減少、停止或去除臨床或診斷癥狀所證明，施用編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸，單獨或結(jié)合本文所述另外的化合物。"處理"、"治療"或"療法"也指急性或慢性疾病或紊亂的癥狀嚴(yán)重性減少或復(fù)發(fā)速度降低，例如在復(fù)發(fā)或減輕疾病過程的情況中。在較佳實施方案中，治療疾病指反轉(zhuǎn)、停止疾病發(fā)展，理想到去除疾病本身。如本文所用，改善疾病和治療疾病相等。如本發(fā)明所用，疾病或紊亂的"防止"、"預(yù)防"或"防范"指施用編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸，單獨或結(jié)合本文所述另外的化合物，以防止疾病或紊亂的產(chǎn)生或開始或防止疾病或紊亂的一些或所有癥狀或者減少疾病或紊亂開始的可能性。自身載體包括編碼一種或多個自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸，"治療有效量"的自身載體根據(jù)本發(fā)明教授施用且足以治療或防止疾病，如改善或去除癥狀和/或疾病原因。例如，治療有效量處于廣泛范圍中并經(jīng)臨床試驗確定，對于特定病人，在普通熟練的臨床醫(yī)生已知的因素基礎(chǔ)上確定，包括疾病嚴(yán)重性、病人重量、年齡和其它因素。治療有效量的自身載體在約0.001微克到約1克的范圍中。治療有效量的自身載體優(yōu)選在約10微克到約5毫克的范圍中。治療有效量的自身載體最優(yōu)選在約0.025mg到約5mg的范圍中。多核苷酸治療每月傳遞，傳遞6-12個月，隨后每3-12個月傳遞作為維持劑量。可發(fā)展另外的治療方案且范圍可從每天到每周到每隔一月到每年到一次施用，取決于疾病嚴(yán)重性、病人年齡、施用的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽和其它因素如普通治療醫(yī)師會考慮的因素。在一個實施方案中，多核苷酸通過肌肉注射傳遞。在另一個實施方案中，多核苷酸鼻內(nèi)、口頭、皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、粘膜傳遞，經(jīng)皮膚壓，或附于金粒，金粒傳遞給或經(jīng)皮膚(參見例如WO97/46253)。另外，核酸可通過局部應(yīng)用傳遞給皮膚細(xì)胞，有或沒有脂質(zhì)體或帶電脂類(參見例如美國專利號6，087，341)。另一種選擇是核酸作為吸入劑傳遞。多核苷酸在具生理水平鈣(O.9mM)的磷酸緩沖鹽水中制成。另外，多核苷酸在溶液中制成，溶液含lmM和2M間的高量Ca++。多核苷酸可用其它離子制成，如鋅、鋁和其它。另外或此外，制成多核苷酸可用陽離子聚合體、陽離子脂質(zhì)體-形成化合物或在非陽離子脂質(zhì)體中。用于DNA傳遞的陽離子脂質(zhì)體例子包括用1，2-雙(油酰氧基)-3-(三甲基氨)丙烷(1，2-bis(oleoyloxy)-3-(trimethyla誦ionio)propane)(DOTAP)禾口其它這類分子產(chǎn)生的脂質(zhì)體。傳遞多核苷酸前，預(yù)處理傳遞位點用布比卡因(b叩ivicane)、心臟毒素或另-一種能提高隨后多核苷酸治療傳遞的試劑處理。這種預(yù)處理安排一般在傳遞治療多核苷酸前傳遞12到96小時，更常在傳遞治療DNA前傳遞24到48小時。另外，DNA治療前沒有預(yù)處理治療。除了編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的自身載體，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的佐劑由CpG寡核苷酸組成，可共施用佐劑以增強免疫應(yīng)答。CpG寡核苷酸顯示提高DNA疫苗的抗體反應(yīng)(Krieg等，Nature374:546-9,1995)。CpG寡核苷酸由純化的寡核苷酸主鏈組成，主鏈抗體內(nèi)降解如硫代磷酸主鏈。寡核苷酸中所含特定序列是嘌呤-嘌呤-C-G-嘧、啶-嘧啶或嘌呤-嘧啶-C-G-嘧啶-嘧啶。所有這些構(gòu)建施用的方式產(chǎn)生抗編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的免疫應(yīng)答。免疫應(yīng)答通常是抗體反應(yīng)，影響自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)的非生理作用或過程。自身載體包括編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸，能結(jié)合其它物質(zhì)施用如藥理劑、佐劑、細(xì)胞因子，或結(jié)合編碼細(xì)胞因子的載體傳遞。此外，使用細(xì)胞因子共傳遞時為防止引起不需要的抗自身細(xì)胞因子反應(yīng)的可能性，也可使用化學(xué)免疫調(diào)節(jié)劑如維生素D3的活性形式。在此方面，1，25-二羥基維生素D3顯示經(jīng)肌肉DNA免疫產(chǎn)生佐劑效果。多核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)、多肽或肽已知刺激、修飾或調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答，如細(xì)胞因子，多核苷酸序列能與自身載體共施用，自身載體包括編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸。因此，編碼一種或多個不同細(xì)胞因子(或其功能片段)的基因可用于本發(fā)明，細(xì)胞因子如白介素、干擾素和集落刺激因子。一些這種物質(zhì)的基因序列已知。例如，編碼IL-4和IL-IO的基因可與自身載體共施用，自身載體包括編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸。因此，在發(fā)明的一個實施方案中，自身載體包括編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸，傳遞自身載體與共施用一個或多個下列免疫反應(yīng)修飾物偶聯(lián)IL-4;IL-10;IL-13和IFN-Y。選擇用于本發(fā)明的核苷酸序列可獲得自己知來源，例如用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從含所需基因或核苷酸序列的細(xì)胞中分離核酸。類似的，核苷酸序列可用本領(lǐng)域熟知的多核苷酸合成標(biāo)準(zhǔn)模式合成產(chǎn)生。參見例如(Edge等，Nature292:756，1981);(Nambair等，Science223:12991984);(Jay等，J.Biol.Chem.259:63111984)。一般，合成寡核苷酸可用(Edge等，(同上)和(Duckworth等，NucleicAcidsRes.9:16911981)所述磷酸三酯方法或(Beaucage等，Tet.Letts.22:18591981)和(Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.103:31851981)所述亞磷酰胺方法制成。合成寡核苷酸也可用商業(yè)購買的自動寡核苷酸合成儀制成。因此核苷酸序列能用特定氨基酸序列的合適密碼子設(shè)計。一般，選擇在計劃宿主中表達(dá)的優(yōu)選密碼子。完整序列從標(biāo)準(zhǔn)方法制備的重疊寡核苷酸中聚集并裝配到完整編碼序列中。參見例如Edge等(同上)；Nambair等(同上)和Jay等，(同上)。另一種獲得本文所用核酸序列的方法是重組方法。因此，所需核酸序列可用標(biāo)準(zhǔn)限制性酶和過程從攜帶核酸的質(zhì)粒中切除。點特異DNA切割通過適當(dāng)限制性酶和過程處理進(jìn)行。點特異DNA切割通過適當(dāng)限制性酶在本領(lǐng)域一般理解的條件下進(jìn)行，細(xì)節(jié)由商業(yè)購買限制性酶的廠商詳細(xì)說明。如果需要，切割片段的大小分離可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)通過聚丙烯酰胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行。另外一種分離特定核酸分子的方便方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。(Mullis等，MethodsEnzymol.155:335-350，1987)。下列例子是完成本發(fā)明的特定實施方案。提供例子僅用于闡述目的，不想以任何方式限制本發(fā)明范圍。實施例1多核苷酸治療包括施用編碼自身蛋白質(zhì)PLP的DNA，用于防止多發(fā)性硬化的動物模型化尸^身薪沐構(gòu)建編碼PLP自身蛋白質(zhì)抗原表位的多核苷酸通過退火2個有16聚體重疊互補序列(下劃線)的寡核苷酸，用DNA聚合酶和dNTPs延伸PLP(139-151):PLP(139-151)L144/R147:這些寡核苷酸雙鏈設(shè)計成含和J&I限制性位點。產(chǎn)物克隆到pTATGET載體(Promega，Madison,WI)的多克隆區(qū)域，pTATGET是CMV啟動子驅(qū)動的哺乳動物表達(dá)載體。陽性克隆通過顏色篩選鑒定且正確方向的插入通過DNA自動測序確認(rèn)。純化質(zhì)粒DNA用WizardplusMaxipr印s(Promega)根據(jù)廠商說明進(jìn)行，在相同肌肉中注射0.05ml質(zhì)粒DNA(PBS中l(wèi)mg/ml)。多樣,麼洽^"凍/f實驗動物的左四頭肌(quadrac印s)注射0.1mlPBS中的0.25%布比卡因-HCl(Sig腿，St.Louis，MO)。2和10天后，小鼠的相同肌肉中注射0.05ml質(zhì)粒DNA(PBS中l(wèi)mg/ml)。誘孕PLP139-151肽溶于PBS至2mg/ml的濃度并用等體積不完全弗氏佐劑乳化，佐劑添加4mg/ml加熱殺死的結(jié)核分枝桿菌H37Ra(DifcoLaboratories,Detroit,MI)。小鼠皮下注射0.lml肽乳劑，同一天和48小時后，靜脈內(nèi)注射0.lmlPBS中的4yg/ml百日咳博德特氏菌毒素。實驗動物大分如下0=沒有臨床疾?。?=尾部虛弱或癱瘓；2=后肢虛弱；3二后肢癱瘓；4二前肢虛弱或癱瘓；5=垂死或死亡動物。為確定注射編碼PLP序列的DNA是否有效保護(hù)小鼠不受EAE誘導(dǎo)，PLP139-151自身載體每隔一周肌肉注射2次。最后一次注射后10天，小鼠用CFA中乳化的PLP139-151肽攻擊。與對照質(zhì)粒組相比，用PLP139-151自身載體治療的動物中觀察到急性臨床疾病改善。疾病開始相較對照質(zhì)粒組延遲(ll.5±0.5天，p<0.008)，平均峰值疾病嚴(yán)重性降低(P〈.005)，平均疾病分?jǐn)?shù)減小(p〈0.0005)。此外，其它組注射a)含多核苷酸的自身載體，多核苷酸編碼改變的肽配基PLPpl39-151(W144〉L,H147〉R)，b)含多核苷酸的自身載體，多核苷酸編碼PLP抗原表位pl78-191。疾病的開始延遲(11.6士0.5天，p〈0.009)，具自身載體的平均峰值疾病分?jǐn)?shù)降低(P〈.02)，自身載體編碼改變的自身肽配基(W144，H147)。同樣，疾病的開始延遲(11.5土0.4天，p<0.003)，平均峰值疾病嚴(yán)重性降低(p〈.007),具自身載體的平均疾病分?jǐn)?shù)減小(P〈0.0001)。自身載體包括編碼PLP自身肽pl78-191的多核苷酸。小鼠注射DNA并進(jìn)一步用致腦炎肽PLP139-151攻擊，在分辨臨床疾病急性階段后殺死。排出的LNC體外用PLP139-151自身肽再刺激且測試它們的增殖反應(yīng)和細(xì)胞因子生成。圖1A顯示來自注射DNA小鼠的LNC與來自對照動物的LNC相比增殖反應(yīng)低(P〈0.01)，DNA編碼PLP139-151自身肽。圖1(B)顯示當(dāng)用PLP139-151刺激時，來自自身載體處理小鼠的LNC分泌的IL-2和y-干擾素水平低于對照組，自身載體含編碼PLP139-151自身肽的DNA。核糖核酸酶保護(hù)測定分離自腦組織的mRNA用于評估發(fā)炎腦中細(xì)胞因子mRNA轉(zhuǎn)錄本水平。圖1(C)顯示自身載體處理的小鼠中y-干擾素和IL-5的mRNA水平降低，自身載體含編碼PLP139-151自身肽的DNA。因此，臨床疾病低發(fā)生率、細(xì)胞反應(yīng)減少與IL-2、IL-5和y-干擾素水平低之間的關(guān)系在PLP139-151DNA處理小鼠中明顯。圖1(C)所示細(xì)胞因子mRNA帶的相對表達(dá)水平通過光密度測定測量。為糾正上樣差異，值根據(jù)各樣品中管家基因GADPH的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化。小鼠用含編碼PLP139-151自身肽的DNA的自身載體處理，光密度測定分析確定此處理小鼠腦中測試細(xì)胞因子的表達(dá)水平小于pTargeT和含編碼PLP139-151(L/R)自身肽的DNA的自身載體。實施例2多核苷酸治療包括施用編碼多種自身蛋白質(zhì)的DNA，用于治療多發(fā)性硬化的動物模型實施例1所述相同的方法用于證明含編碼四種主要髓鞘自身蛋白腿P、MOG、MAG和PLP的DNA的載體甚至比編碼單個自身肽的DNA更有效治療確立的、發(fā)生中、復(fù)發(fā)EAE，EAE是用于人MS的最典型動物模型(表5和6)。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>含編碼多種自身蛋白質(zhì)的DNA的自身載體每周一次肌肉施用給小鼠，劑量為50yg各編碼MBP、M0G、MAG和PLP的四種載體。從EAE起始急性發(fā)作恢復(fù)后開始治療(如從疾病誘導(dǎo)后第一次臨床癱瘓事件恢復(fù)之后)。惡化速度表示第87天發(fā)生的臨床癱瘓數(shù)量。p值用斯氏兩端t檢驗計算。實施例3多核苷酸治療包括施用編碼自身肽或自身蛋白質(zhì)的DNA加編碼細(xì)胞因子的DNA,用于治療多發(fā)性硬化的動物模型遵循實施例l所述方法，修改是自身載體編碼PLP自身肽或多種髓鞘蛋白。編碼細(xì)胞因子IL-4的DNA表達(dá)構(gòu)建同時施用。DNA治療通過施用編碼髓鞘自身肽或髓鞘自身蛋白的自身載體，結(jié)合編碼細(xì)胞因子IL-4的DNA，進(jìn)一步提高保護(hù)效果(表6)。表6用編碼自身肽或自身蛋白的DNA加編碼IL-4的DNA共處理提髙DNA療法治療確立的發(fā)生中EAE的治療效果<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>DNA治療每周一次肌肉施用給小鼠，劑量為25ug各編碼MBP、M0G、MAG和PLP的四種DNA質(zhì)粒。所有其它DNA以50ng質(zhì)粒每只動物的劑量每周一次給予。從EAE起始急性發(fā)作恢復(fù)后開始治療(如從疾病誘導(dǎo)后第一次臨床癱瘓事件恢復(fù)之后)。臨床復(fù)發(fā)計算到第81天。p值用斯氏兩端t檢驗計算。實施例4多核苷酸治療包括施用編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽和肽的DNA,用于治療人多發(fā)性硬化治療人多發(fā)性硬化的多核苷酸治療如下進(jìn)行。構(gòu)建的自身載體包括細(xì)胞巨化病毒或另一種有效轉(zhuǎn)錄啟動子；獲得自SV40大T抗原的多腺苷酸信號、牛生長激素或另一種普通技術(shù)人員已知的有效多腺苷酸信號；卡那霉素或其它FDA-可接受抗性基因，能使質(zhì)粒有效生長。編碼一種或多個人髓鞘自身蛋白的DNA序列克隆到DNA自身載體。編碼這些髓鞘自身蛋白的DNA克隆到自身載體，髓鞘自身蛋白在MS病人中被自身免疫反應(yīng)靶向，包括髓鞘堿性蛋白(MBP)、蛋白脂蛋白(PLP)、髓鞘相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白(MOBP)。使用本發(fā)明的教授選擇特定自身抗原包含到多核苷酸治療是以多種因素為基礎(chǔ)，包括因素如受試者中致病自身抗體的存在。在一個實施方案中，各髓鞘自身蛋白在單獨或不同自身質(zhì)粒中編碼。在另一個實施方案中，編碼一些髓鞘自身蛋白的DNA在單個自身質(zhì)粒中連續(xù)編碼，使用內(nèi)部核糖體再進(jìn)入序列(IRESs)或其它方法以從單個質(zhì)粒DNA中表達(dá)多種蛋白質(zhì)。編碼髓鞘蛋白的DNA表達(dá)自身質(zhì)粒用分離質(zhì)粒DNA的普通技術(shù)制備和分離，如商業(yè)購買自QiagenCorporation的。無細(xì)菌內(nèi)毒素的純化DNA作為治療劑傳遞給人。在一個實施方案中，施用僅編碼MBP的自身載體DNA以治療多發(fā)性硬化患者。在另一個實施方案中，施用編碼兩種或多種髓鞘自身蛋白質(zhì)、多肽或肽的多種自身質(zhì)粒。治療有效量的自身載體根據(jù)本發(fā)明教授施用，自身載體包括編碼一種或多個自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸。例如，治療有效量的自身載體在約0.001微克到約1克的范圍中。自身載體的優(yōu)選治療量在約10微克到約5毫克的范圍中。自身載體的最優(yōu)選治療量在約0.025mg到約5mg的范圍中。多核苷酸治療每月傳遞，傳遞6-12個月，隨后每3-12個月傳遞作為維持劑量?？砂l(fā)展另外的治療方案且范圍可從每天到每周到每隔一月到每年到一次施用，取決于疾病嚴(yán)重性、病人年齡、施用的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽和其它因素如普通治療醫(yī)師會考慮的因素。在一個實施方案中，DNA通過肌肉注射傳遞。在另一個實施方案中，DNA作為吸入劑鼻內(nèi)、口頭、皮下、經(jīng)皮膚、靜脈內(nèi)傳遞，經(jīng)皮膚壓，或附于顆粒或珠，顆?；蛑閭鬟f給或經(jīng)皮膚。這種顆粒或珠可以是金、其它金屬、聚苯乙烯或其它顆粒。在一個實施方案中，DNA在具生理水平鈣(0，9raM)的磷酸緩沖鹽水中制成。另外，DNA在溶液中制成，溶液含lmM和21間的高量〔3++。在另一個實施方案中，DNA用其它陽離子制成，如鋅、鋁和其它。制成DNA也可用陽離子聚合體、陽離子脂質(zhì)體或在其它陽離子脂質(zhì)體中。DNA也可傳遞編碼于病毒載體、病毒顆粒或細(xì)菌。人MS病人用所示DNA療法治療，在臨床復(fù)發(fā)數(shù)量基礎(chǔ)上監(jiān)控疾病活性，MRI監(jiān)控新的釓-增強損傷數(shù)量和增強損傷的體積。實施例5多核苷酸治療包括施用編碼胰島素P鏈自身肽的DNA，用于防止胰島素依賴型糖尿病N0D小鼠同時發(fā)展自身免疫糖尿病，與人IDDM共享許多臨床、免疫和組織病理學(xué)特征。自身載體包括的DNA編碼胰島素B鏈氨基酸9-23的自身肽、胰島素的免疫顯性抗原表位，自身載體施用給NOD小鼠。對照是含DNA的載體，DNA編碼胰島素A鏈的對應(yīng)肽。編碼自身肽的重疊寡核苷酸引物插入自身表達(dá)盒pcDNA。用編碼自身肽胰島素B(9-23)(insB-pcDNA)的自身載體處理保護(hù)動物不發(fā)展糖尿病。疾病發(fā)作以顯著降低的速度發(fā)生，完全發(fā)展疾病的動物少很多。InsB-pcDNA引起胰腺中胰島素B-特異細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)轉(zhuǎn)變IL-10和IFN-Y表達(dá)在胰島素B(9-23)肽培養(yǎng)的胰腺淋巴結(jié)細(xì)胞中下調(diào)。胰島素A(+)鏈的核苷酸序列是TAQGAGC-3，；胰島素B(+)鏈的核苷酸序列是TCTAGAGC-3'這些多核苷酸設(shè)計成含EcoRI和Xbal限制性位點用于克隆。產(chǎn)物克隆到pcDNA3.l+自身表達(dá)盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)的多克隆區(qū)域。純化自身質(zhì)粒DNA用QiagenEndo-freeMega-prep試劑盒(Qiagen，Valencia,CA.)完成。3到4周大雌性N0D小鼠購買自TaconicFarms(Germantown,NY)。實驗動物在3到4周大時注射，四頭肌注射0.lmlPBS(每塊四頭肌0.05ml)中的0.25%布比卡因-HC1(Sigma,St.Louis，M0)。2天后，小鼠注射0.05ml質(zhì)粒DNA，每塊四頭肌10mg/ml。質(zhì)粒DNA以10天間隔再注射2次。每周用Chemstrip(BoehringerMannheimCo,，Indianapolis,IN)測試小鼠的糖尿，糖尿病用單觸II儀表(Johnson&Johnson,Milpitas，Ca)通過血漿葡萄糖測量確定。重復(fù)血漿葡萄糖水平高于250mg/dl的動物被認(rèn)為患糖尿病。胰腺從實驗和對照動物中取出，在10%甲醛中固定，石蠟包埋。切下分開50ym的三個水平薄切片，用于蘇木精和曙紅染色。滲透的嚴(yán)重性通過光學(xué)顯微鏡評估。來自各組的3和5只動物分別對于2個單獨實驗分析。每個胰腺檢測至少25個島。多核苷酸治療包括施用編碼自身肽胰島素B(9-23)的自身載體，治療在NOD小鼠模型中進(jìn)行。10只4周大的NOD小鼠組用50u10.25%布比卡因注射四頭肌肌肉，48小時后注射100wg自身質(zhì)粒DNA。自身質(zhì)粒DNA以10天間隔再注射2次(每塊四頭肌50yg)。每周監(jiān)控小鼠的糖尿病，監(jiān)控〉30周，通過糖尿和高血糖癥確定。結(jié)果代表2個單獨實驗。在未處理和質(zhì)粒對照(pcDNA)注射組中，70%的小鼠到34周大時發(fā)展糖尿病(圖2)。然而在insB-pcDNA注射組中，僅20%到相同年齡時發(fā)展糖尿病(P^.02，X2分析)。此外，疾病發(fā)作在此組中也顯著延遲，從未處理組中第一只變成糖尿病動物的〈14周到insB-pcDNA注射組的〉23周。pcDNA和未處理對照組的糖尿病發(fā)病速度是insB-pcDNA組速度的3倍(pcDNA和未處理組分別為0.035和0.036，與之相比，insB-pcDNA組為0.012)。在自身肽(insB-pcDNA)處理NOD小鼠的情況中，即使動物沒有顯示糖尿病臨床癥狀，觀察到胰島炎。胰腺從7周大的免疫和對照動物中取出，7周時島的起始滲透可通過組織染色NOD胰腺清楚看見。各組中5只動物最少25個島被打分用于胰島炎。染色來自較大(16周大)小鼠的胰腺產(chǎn)生類似結(jié)果。盡管動物注射含編碼自身肽的DNA的自身載體，沒有顯示糖尿病的臨床癥狀，滲透的可見水平能與生病的對照動物相比。因此，胰島素DNA處理不影響淋巴細(xì)胞運輸?shù)揭葝u。用胰島素B(9-23)DNA的多核苷酸治療在胰腺淋巴結(jié)中誘導(dǎo)抗原-特異反應(yīng)。為檢測體外抗原-特異反應(yīng)，我們使用定量PCR評估細(xì)胞因子m脂A生成水平(圖3)。在3個單獨實驗中，動物組用insB-pcDNA自身載體或pcDNA對照質(zhì)粒注射2次。第2次注射后5天，收集胰腺淋巴結(jié)且單細(xì)胞懸浮液用10yg/mL胰島素B(9-23)肽平板培養(yǎng)。72小時后沉淀細(xì)胞，定量PCR分析IL-4、TGF-P、IL-10和IFN-y信使水平。定量PCR比較胰腺淋巴結(jié)細(xì)胞中細(xì)胞因子信使水平，顯示insB-pcDNA處理動物中IFN-y和IL-10水平顯著低于pcDNA-處理的對照。對應(yīng)于胰島素B肽刺激，來自insB-pcDNA-處理淋巴結(jié)的IFN-y水平是pcDNA-處理淋巴結(jié)的38%(p<0.05)。此外，insB-pcDNA處理小鼠中IL-10水平是pcDNA對照水平的30%(p<0.01)。IL-4和TGF-P的m謹(jǐn)水平變化在這3個實驗中不顯著。實施例6多核苷酸治療包括施用編碼自身多肽胰島素和自身蛋白谷氨酸脫羧酶及酪氨酸磷酸酶IA-2的DNA，用于治療胰島素依賴型糖尿病NOD小鼠用多核苷酸治療處理，包括編碼全胰島素原多肽的DNA以及編碼谷氨酸脫羧酶(GAD)65kDa和島酪氨酸磷酸酶IA-2的DNA。編碼胰島素原、GAD-65和IA-2的cDNAs被分離并克隆到自身表達(dá)盒pTARGET載體。DNA用QiagenEndo-freeMega-pr印試劑盒(Qiagen，Valencia,CA,)純化。N0D小鼠3到4周大時注射，四頭肌注射0.lmlPBS(每塊四頭肌0.05ml)中的0.25%布比卡因-HCl(Sigma,St.Louis,M0)。2天后，小鼠各四頭肌中注射0.05ml各自身質(zhì)粒函A，質(zhì)粒DNA以1.0mg/ml在具0.9mM鈣的磷酸緩沖鹽水中。質(zhì)粒DNA以10天間隔再注射2次。每周用Chemstrip(BoehringerMannheimCo.，Indianapolis,IN)觀lj試小鼠的糖尿，糖尿病用單觸II儀表(Johnson&Johnson,Milpitas，Ca)通過血漿葡萄糖測量確定。重復(fù)血漿葡萄糖水平高于250mg/dl的動物被認(rèn)為患糖尿病。實施例7多核苷酸治療包括施用編碼自身多肽胰島素和/或自身蛋白谷氨酸脫羧酶及酪氨酸磷酸酶IA-2的DNA，用于治療和反轉(zhuǎn)確立胰島素依賴型糖尿病中的明顯髙血糖癥在糖尿基礎(chǔ)上鑒定NOD小鼠具有明顯臨床糖尿病，用Chemstrip(BoehringerMannheimCo.，Indianapolis,IN)分析尿檢測，用單角蟲II儀表(Johnson&Johnson,Milpitas，Ca)通過血漿葡萄糖測量確定。具明顯臨床糖尿病的NOD小鼠用多核苷酸治療處理，包括編碼上面例子所述自身肽胰島素B(9-23)(insB-pcDNA)的DNA。胰島素B(+)鏈序列是5，-CCGGAATTCGCCATGAGCCACCTAGTAGAAGCACTATACCTCGTATGCGGCGAACGAGGTTAGTCTAGAGC-3'，此多核苷酸設(shè)計成含EcoRI和Xbal限制性位點用于克隆。產(chǎn)物克隆到pcDNA3.1+自身表達(dá)盒(Irwitrogen，Carlsbad,CA)的多克隆區(qū)域。純化自身質(zhì)粒DNA用QiagenEndo-freeMega-prep試齊ll盒(Qiagen，Valencia,CA.)完成。在糖尿和血清葡萄糖提高基礎(chǔ)上具明顯臨床糖尿病的小鼠用編碼自身肽胰島素B(9-23)(insB-pcDNA)的DNA處理，反轉(zhuǎn)高血糖癥和糖尿，從而反轉(zhuǎn)確立的糖尿病。用編碼自身肽胰島素的DNA結(jié)合谷氨酸脫羧酶和酪氨酸磷酸酶處理動物顯著增加DNA治療功效，用于治療和反轉(zhuǎn)確立的自身免疫糖尿病。實施例8多核苷酸治療包括施用編碼自身蛋白質(zhì)的DNA，用于治療人胰島素依賴型糖尿癀修飾實施例5中構(gòu)建的自身質(zhì)粒DNA以施用給人且包括編碼人島細(xì)胞自身蛋白的DNA，自身蛋白包含酪氨酸磷酸酶IA-2;65kDa和67kDa形式的谷氨酸脫羧酶44(GAD);胰島素原；島細(xì)胞抗原69kDa(ICA69)。如上所述，DNA用PCR分離并克隆到自身表達(dá)盒。自身載體包括編碼一種或多個自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸，治療有效量的自身載體根據(jù)本發(fā)明教授施用。例如，治療有效量的自身載體在約0.001微克到約1克的范圍中。治療有效量的自身載體優(yōu)選在約10微克到約5毫克的范圍中。治療有效量的自身載體最優(yōu)選在約0.025mg到約5mg的范圍中。多核苷酸治療每月傳遞，傳遞6-12個月，隨后每3-12個月傳遞作為維持劑量?？砂l(fā)展另外的治療方案且范圍可從每天到每周到每隔一月到每年到一次施用，取決于疾病嚴(yán)重性、病人年齡、施用的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽和其它因素如普通治療醫(yī)師會考慮的因素。在一個實施方案中，DNA通過肌肉注射傳遞。另外，DNA自身載體作為吸入劑鼻內(nèi)、口頭、皮下、經(jīng)皮膚、靜脈內(nèi)傳遞，經(jīng)皮膚壓，在治療IDDM的情況中附于金粒，金粒通過基因槍或經(jīng)皮膚傳遞。DNA在具生理水平鈣(0.9函)的磷酸緩沖鹽水中制成。另外，DNA在溶液中制成，溶液含lmM和214間的高量〔3++。DNA用其它陽離子制成，如鋅、鋁和其它。人糖尿病患者用所示DNA療法治療，監(jiān)控疾病活性的基礎(chǔ)是對外源胰島素需求減少、血清自身抗體分布改變、糖尿減少和糖尿病并發(fā)癥減少如白內(nèi)障、血管不足、關(guān)節(jié)病和神經(jīng)病。實施例9多核苷酸治療包括施用編碼自身蛋白質(zhì)II型膠原的DNA，用于防止自身免疫滑膜炎和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎RA來自侵入促進(jìn)自身耐受機制的致病T細(xì)胞。小鼠中膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)是T細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫模型，與RA共享許多特征，包括與RA組織學(xué)相似的滑膜炎和骨侵蝕。CIA復(fù)發(fā)模型具有臨床復(fù)發(fā)和炎癥侵蝕性滑膜炎的減輕，方式與人RA患者中觀察到的相似(Malfait等，ProcNatlAcadSciUSA，97:9561-6，2000)。誘導(dǎo)CIA通過用II型膠原(CII)注射遺傳感性品系小鼠，CII在完全弗氏佐劑中。編碼鼠II型膠原的cDNA用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分離。另外的滑膜自身蛋白如IV和IX型膠原、熱激蛋白65，可包含在多核苷酸治療中。獲得編碼所述肽的DNA是用寡核苷酸引物通過PCR從鼠CIIcDNA中擴增相關(guān)DNA片段?？騼?nèi)起始翻譯位點的甲硫氨酸以及Wol和J&I限制性內(nèi)切酶位點納入寡核苷酸引物。PCR產(chǎn)生的DNA片段克隆到pTATGET載體(Promega,Madison，WI)自身表達(dá)盒的和限制性內(nèi)切酶位點，pTATGET是CMV啟動子驅(qū)動的哺乳動物表達(dá)載體。測序分離的克隆以確定產(chǎn)生了所需DNA序列。6-9周大的雄性DBA/lLacJ(H-2q)小鼠在實驗開始使用。100ug各純化自身載體每隔一周肌肉注射到脛腓骨前部肌肉，注射3次，自身載體包括編碼滑膜關(guān)節(jié)自身蛋白的DNA，這在誘導(dǎo)疾病用于防止CIA的實驗之前，或在復(fù)發(fā)CIA實驗治療中臨床CIA發(fā)作之后。DNA治療后，小鼠用100yg完全弗氏佐劑(CFA)中的純化牛CII蛋白在尾底部皮內(nèi)攻擊以誘導(dǎo)急性CIA。在視覺打分系統(tǒng)(Coligan等，JohnWileyandSons,Inc15.5.1-15.5.24，1994)基礎(chǔ)上每天跟蹤小鼠的臨床CIA表現(xiàn)，跟蹤12周0，沒有紅斑和膨脹表現(xiàn)；1，紅斑和限于足中部(跗骨)或踝關(guān)節(jié)的適度膨脹；2，紅斑和適度膨脹，膨脹從踝延伸到足中部；3，紅斑和中等膨脹，膨脹從踝延伸到跖骨關(guān)節(jié)；4，紅斑和嚴(yán)重膨脹，膨脹涵蓋踝、足和指。各動物的臨床分?jǐn)?shù)是其四只爪視覺分?jǐn)?shù)的總和。對來自發(fā)展臨床關(guān)節(jié)炎的小鼠的關(guān)節(jié)進(jìn)行組織分析。具最高視覺分?jǐn)?shù)的肢的第一個爪脫鈣、切片、用蘇木精和曙紅染色，如前所述(WilIiams等，ProcNatlAcadSciUSA91:2762-2766,1994)。檢測染色切片的淋巴滲透、滑膜增生和侵蝕，如前所述(Williams等，ProcNatlAcadSciUSA91:2762-2766，1994)。實施例10多核苷酸治療包括施用編碼自身蛋白質(zhì)II型膠原的DNA,用于治療確定的自身免疫滑膜炎確定正患CIA的動物用自身載體DNA處理以反轉(zhuǎn)確定發(fā)展中的CIA，DNA編碼CII、BiP和/或GP-39。在視覺打分系統(tǒng)(Coligan等，JohnWileyandSons,Inc15.5.1-15.5.24，1994)基礎(chǔ)上每天跟蹤小鼠的臨床CIA表現(xiàn)，跟蹤12周。用自身DNA處理可在視覺打分系統(tǒng)基礎(chǔ)上降低關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重性，DNA編碼CII、BiP、GP-39和/或滑膜關(guān)節(jié)中存在的另外蛋白質(zhì)。實施例11多核苷酸治療包括施用編碼自身滑膜蛋白的DNA，用于防止或治療人風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其它自身免疫疾病靶向關(guān)節(jié)修飾前2個例子中構(gòu)建的自身載體DNA以施用給人且包括編碼人自身蛋白質(zhì)的DNA，如滑膜關(guān)節(jié)中表達(dá)的蛋白質(zhì)，包括II型膠原、BiP、gp39、IV型膠原、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶和/或血纖蛋白。如上所述，DNA用PCR分離并克隆到自身表達(dá)盒。100ng質(zhì)粒DNA在具鈣的磷酸緩沖鹽水中每月肌肉內(nèi)施用。也可能施用的DNA以不同劑量方案、在不同緩沖液中制成或經(jīng)不同施用途徑，如上面實施例1所討論。CIA新發(fā)作或發(fā)展中的人在美國風(fēng)濕病學(xué)標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會基礎(chǔ)上診斷(4/7標(biāo)準(zhǔn)須用于診斷(i)對稱多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，(ii)涉及MCPs、PIPs或手腕，(iii)涉及超過3個不同關(guān)節(jié)區(qū)域，(iv)手或足X射線的關(guān)節(jié)侵蝕，(v)陽性類風(fēng)濕因子測試，(iv)早晨僵硬大于1小時和(vii)伸肌表面的節(jié)結(jié))，用自身多核苷酸治療，多核苷酸編碼II型膠原、BiP、gp39、IV型膠原、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶和/或血纖蛋白。監(jiān)控RA的DNA治療功效，以柔軟和腫脹關(guān)節(jié)數(shù)減少超過20%的病人部分為基礎(chǔ)(美國風(fēng)濕病學(xué)標(biāo)準(zhǔn)學(xué)會20。/。反應(yīng)(ACR20)、5(W(ACR50)和70%(ACR70)。另外測量人RA包括類固醇使用中的炎癥標(biāo)記(含ESR和CRP)減少、放射線發(fā)展減少(包括侵蝕和關(guān)節(jié)空間變窄)和無勞動能力分?jǐn)?shù)(如健康評估問巻-HAQ)改進(jìn)。也監(jiān)控自身抗體效價和分布的變化。相同方法用于相關(guān)關(guān)節(jié)炎，如牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、Reiter綜合征、強直性脊柱炎和多肌痛風(fēng)濕病。近來的研究表明一些具風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎高特異性的自身抗體(如Bip、抗瓜氨酸抗體、抗聚絲蛋白抗體)可先于臨床診斷幾個月，或甚至幾年。這提出了一種可能性，能在疾病發(fā)作前鑒定病人并用預(yù)防性多核苷酸治療有效處理。篩選健康、無癥狀病人中診斷自身抗體的存在，包括但不限于上述血清學(xué)測試之一。陽性測試的病人用上述和其它例子中的多核苷酸治療處理，嘗試防止疾病發(fā)作和嚴(yán)重性。隨后的診斷和反應(yīng)用上面標(biāo)準(zhǔn)監(jiān)控。實施例12多核苷酸治療包括施用編碼眼色素層自身蛋白的DNA，用于防止自身免疫性色素層炎實驗性自身免疫性色素層炎(EAU)是T細(xì)胞調(diào)節(jié)的自身免疫疾病，影響小鼠的眼色素層和視網(wǎng)膜，與人自身免疫性色素層炎共享許多臨床、免疫和組織病理學(xué)特征。編碼S抗原和光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)的DNA用PCR分離并克隆到pTATGET載體自身表達(dá)盒，如上所述，lOOyg各純化自身質(zhì)粒每隔一周注射到BIO.IIIR小鼠的脛腓骨前部肌肉，注射3次，然后誘導(dǎo)EAU。在注射位置施用布比卡因(bupivicane)、心臟毒素或另一種預(yù)處理劑或沒有這種試劑，接著開始DNA治療。DNA治療后，BIO.RIII小鼠用免疫顯性IRBP161-80肽攻擊用于EAU，肽在完全弗氏佐劑(CFA)中乳化。在fundoscopic檢測基礎(chǔ)上用標(biāo)準(zhǔn)打分系統(tǒng)(Coligan等)跟蹤小鼠臨床EAU表現(xiàn)8周:0，沒有疾病；0.5(痕量)，l-2很少外周集中損傷，血管炎/玻璃體炎最小；1，輕微血管炎，〈5集中損傷，〈l線性損傷；2，多個(〉5)脈絡(luò)視網(wǎng)膜損傷和/或滲透，嚴(yán)重血管炎，〈5線性損傷；3，線性損傷、大匯合損傷、亞視網(wǎng)膜新血管化的模式；4，大視網(wǎng)膜脫離，視網(wǎng)膜萎縮。小鼠組定期殺死，對各眼進(jìn)行組織分析和打分。實施例13多核苷酸治療包括施用編碼眼色素層自身蛋白的DNA，用于治療確立的自身免疫性色素層炎如上所述，編碼S抗原和光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)的DNA用PCR分離并克隆到pTATGET載體自身表達(dá)盒。用免疫顯性IRBP161-80肽誘導(dǎo)B10.RIII小鼠發(fā)展EAU，肽在完全弗氏佐劑(CFA)中乳化。確定正患EAU的動物可通過定期施用lOOng各純化自身質(zhì)粒來有效治療。發(fā)展臨床EAU后，自身多核苷酸可每周或以另外間隔施用到B10.IIIR小鼠的脛腓骨前部肌肉。功效在12周臨床監(jiān)控段的基礎(chǔ)上證明，用標(biāo)準(zhǔn)打分系統(tǒng)(Coligan等)監(jiān)控fundoscopic檢測基礎(chǔ)上的EAU疾病活性。實施例14多核苷酸治療包括施用編碼眼色素層自身蛋白的DNA，用于治療人自身免疫性色素層炎如實施例1所述，人S抗原、光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)、視紫質(zhì)和恢復(fù)蛋白用PCR分離并克隆到DNA自身表達(dá)盒。修飾實施例7構(gòu)建的自身載體可以包括編碼一種或多個自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸，自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽選自人S抗原、光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白、視紫質(zhì)和恢復(fù)蛋白。治療有效量的自身載體根據(jù)本發(fā)明教授施用，自身載體包括編碼一種或多個自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸。例如，治療有效量的自身載體在約0.001微克到約1克的范圍中。治療有效量的自身載體優(yōu)選在約10微克到約5毫克的范圍中。治療有效量的自身載體最優(yōu)選在約0.025mg到約5mg的范圍中。DNA治療每月傳遞，傳遞6-12個月，隨后每3-12個月傳遞作為維持劑量?？砂l(fā)展另外的治療方案且范圍可從每天到每周到每隔一月到每年到一次施用，取決于疾病嚴(yán)重性、病人年齡、施用的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽和其它因素如普通治療醫(yī)師會考慮的因素。在一個較佳實施方案中，DNA通過肌肉注射傳遞。另外，DNA自身載體作為吸入劑鼻內(nèi)、口頭、皮下、經(jīng)皮膚、靜脈內(nèi)傳遞，經(jīng)皮膚壓，在治療自身免疫性色素層炎的情況中附于金粒傳遞到或通過皮膚。在另一個實施方案中，DNA在具生理水平鈣(0.9mM)的磷酸緩沖鹽水中制成。另外，DNA可在溶液中制成，溶液含lmM和2M間的高量Ca+十。DNA能用其它陽離子制成，如鋅、鋁和其它。實施例15多核苷酸治療包括施用編碼線粒體酶自身蛋白質(zhì)的DNA，用于防止原發(fā)性膽硬化原發(fā)性膽硬化(PBC)的鼠模型是實驗性自身免疫膽管炎(EAC)并用哺乳動物丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDC)或合成PDC肽在雌性S幾/J小鼠中i.p.致敏(Jones，JClinPathol53:813-21,2000)?？咕€粒體抗體在許多品系中觀察到，但NSDC在單個小鼠品系(S幾/J)中觀察到，表明誘導(dǎo)IBEC損壞需要另外的反應(yīng)因子。小鼠用純化的牛PDC(500ug在100u1鹽水中，與不完全弗氏佐劑(IFA)1:1(v/v)混合，濃度為10mg/mL)i.p.致敏。所有致敏在8-12周大時進(jìn)行。尾部靜脈放血在抗原攻擊前和致敏后4、8、12、16、20及30周進(jìn)行。肝功能測試包括膽紅素、堿性磷酸酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)，在相同時間間隔進(jìn)行。致敏后30周殺死動物(各組10只)。肝組織學(xué)用蘇木素&曙紅染色和定期酸性希夫(Schiff)評估。也檢測膽管異常、門管(portaltract)的壞死-發(fā)炎變化和肉芽腫性滲透。編碼PDC-E2和-E3的DNA用PCR分離并克隆到pTATGET(Promega，Madison，WI)自身表達(dá)盒，在大腸桿菌中擴增并用無內(nèi)毒素的質(zhì)粒純化試劑盒(QiagenTM)根據(jù)廠商說明純化，如前所述。多核苷酸治療在誘導(dǎo)疾病前施用給動物，治療包括編碼自身蛋白質(zhì)PDC-E2和-E3的DNA。選擇待施用的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽在上述一系列實驗基礎(chǔ)上確定，包含總共約1到8個抗原自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽，優(yōu)選2到6個，最優(yōu)選3到5個抗原。載體所含DNA編碼細(xì)胞因子，如IL-4，可用自身載體施用。實施例16多核苷酸治療包括施用編碼線粒體酶自身蛋白質(zhì)的DNA，用于防止原發(fā)性膽硬49化和治療確立的原發(fā)性膽硬化編碼人PDC-E2禾口-E3的DNA用PCR分離并克隆到適當(dāng)哺乳動物表達(dá)載體的自身表達(dá)盒，在大腸桿菌中擴增并用無內(nèi)毒素的質(zhì)粒純化方法純化。多核苷酸治療施用給患確立PBC的人，治療包括編碼自身蛋白質(zhì)PDOE2和-E3的DNA。載體所含DNA編碼細(xì)胞因子，如IL-4，可用自身載體施用。DNA治療人中PBC的功效通過測量連續(xù)肝功能測試確定，包括膽紅素、堿性磷酸酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)以及發(fā)展肝衰竭的時間延遲。經(jīng)皮膚的肝活組織切片后，肝組織學(xué)用蘇木素&曙紅染色和定期酸性希夫評估。也檢測膽管異常、門管的壞死-發(fā)炎變化和肉芽腫性滲透用于證明疾病活性。患PBC或有發(fā)展PBC風(fēng)險的病人可通過鑒定血清自身抗體有效診斷，抗體針對線粒體蛋白如丙酮酸脫氫酶復(fù)合體。無癥狀的的人類患者用有效血清學(xué)試驗如ELISA、蛋白質(zhì)印跡、或蛋白質(zhì)陣列測試診斷自身抗體的存在。血清學(xué)測試陽性的病人用上述多核苷酸治療預(yù)防處理以防止疾病發(fā)作。DNA治療人中PBCs的功效通過測量連續(xù)肝功能測試確定，包括膽紅素、堿性磷酸酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)以及發(fā)展肝衰竭的時間延遲。經(jīng)皮膚的肝活組織切片后，肝組織學(xué)用蘇木素&曙紅染色和定期酸性希夫評估。也檢測膽管異常、門管的壞死-發(fā)炎變化和肉芽腫性滲透用于證明疾病活性。同樣分析血清自身抗體的分布。實施例17多核苷酸治療包括施用編碼淀粉樣P自身蛋白的DNA,用于治療阿爾茨海默氏複構(gòu)建的自身載體包括編碼人淀粉樣e(構(gòu)建AP多肽)的DNA。如上所述，盒具有轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列用于在受體細(xì)胞中表達(dá)DNA。此自身載體包括編碼自身肽Ae的DNA，通過肌肉注射施用給小鼠。施用自身載體48小時前，50u10.25%布比卡因肌肉注射給兩塊四頭肌肌肉。自身載體包括編碼AP自身肽的DNA，載體用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化，包括去除內(nèi)毒素的步驟。DNA重懸浮和保存于無內(nèi)毒素、無熱原的水。注射前，自身載體在PBS中以lmg/ml終濃度制成，載體包括編碼AP自身肽的DNA。隨后50y1的此DNA制劑通過肌肉注射施用給兩塊四頭肌肌肉。另外，免疫刺激CpG寡核苷酸以10yg每只動物的劑量肌肉內(nèi)施用。初次免疫后2周進(jìn)行第二次加強布比卡因和具CpG寡核苷酸的DNA。然后從起始DNA施用后4到6周的小鼠中取出血清，以測試抗AP肽的抗體存在?？贵w水平通過標(biāo)準(zhǔn)ELISA技術(shù)測量(圖4)。根據(jù)上面操作處理的正常小鼠發(fā)展出抗AP肽的顯著抗體效價。用此操作在人Af3轉(zhuǎn)基因小鼠中進(jìn)行實驗，使用的自身載體包括編碼AP的脂A。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠通過用人AP基因構(gòu)建注射單個細(xì)胞胚胎，隨后將這些胚胎重導(dǎo)入適當(dāng)宿主小鼠品系中(Games等，Nature373:523—527，1995);(Hsiao等，Science274:99-102,1996)。然后篩選所得子代的基因組中AP基因構(gòu)建的存在。這些小鼠表現(xiàn)出特征性的病理生理和行為異常，模擬人阿爾茨海默氏病。年輕的癥狀前小鼠和年長的癥狀小鼠用自身載體處理，載體包括編碼構(gòu)建的DNA。測量的功效參數(shù)包括認(rèn)知行為測試和組織病理學(xué)的改進(jìn)。年輕的癥狀前小鼠在DNA處理后12-18個月檢測以確定認(rèn)知缺陷和組織學(xué)上淀粉樣斑的發(fā)生率。年長的癥狀小鼠在DNA處理后3-6個月檢測，檢測臨床測試的絕對臨床分?jǐn)?shù)改進(jìn)和組織學(xué)上淀粉樣斑總數(shù)的減少。實施例18多核苷酸治療包括施用編碼淀粉樣P自身蛋白的DNA，用于防止和治療人阿爾茨海默氏病自身載體包括編碼人淀粉樣e(構(gòu)建A日多肽)的DNA。如上所述，盒具有轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列用于在受體細(xì)胞中表達(dá)DNA。被治療受試者包括的人類患者發(fā)展阿爾茨海默氏病的臨床可能性很高或者證明有早期認(rèn)知損傷或其它進(jìn)一步發(fā)展阿爾茨海默氏病的的證據(jù)，或者患臨床確定阿爾茨海默氏病的的患者。此自身載體包括編碼自身肽Ae的DNA，通過肌肉注射施用。自身載體包括編碼AP自身肽的DNA，載體用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化，包括去除內(nèi)毒素的步驟。DNA重懸浮和保存于無內(nèi)毒素、無熱原的水。注射前，自身載體在PBS中以lmg/ml終濃度制成，載體包括編碼A3自身肽的DNA。隨后lml的此DNA制劑通過肌肉注射施用給四頭肌肌肉。另外，自身載體構(gòu)建可包含AP多聚體，AP編碼由間插序列連接的DNA，從而編碼多聚體AP多肽。這樣，不僅一級肽結(jié)構(gòu)作為免疫原被靶向，而且二級肽結(jié)構(gòu)(如多個A3肽形成的P折疊片層)也作為免疫原被靶向。初次免疫后2到4周加強自身多核苷酸，重復(fù)直到獲得足夠的抗淀粉樣e抗體，水平與臨床疾病減少相關(guān)。然后每3-4個月從人中取出血清以監(jiān)控抗A日抗體的存在和效價。這通過標(biāo)準(zhǔn)ELISA技術(shù)測量。傳遞其它A0自身多核苷酸強化劑以維持抗AP抗體的治療效價。人中的功效通過認(rèn)知缺陷發(fā)展變慢和/或認(rèn)知功能改進(jìn)來證明。51實施例19一種用編碼a-突觸核蛋白的DNA療法治療帕金森氏癥的方法構(gòu)建的DNA自身載體編碼人a-突觸核蛋白多肽，包括適當(dāng)控制和調(diào)節(jié)元件。盒、所用載體和施用類似于實施例6所述。測量抗a-突觸核蛋白的抗體生成。隨后DNA構(gòu)建施用給年輕的癥狀前小鼠和年長的癥狀小鼠，小鼠是人a-突觸核蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠?，F(xiàn)在有一些a-突觸核蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。這些轉(zhuǎn)基因系之一發(fā)展胞內(nèi)內(nèi)含體且運動原受損(Masliah等，Science287:1265-1269，2000)。然后評估這些處理動物在疾病臨床和病理生理參數(shù)中的改進(jìn)。年輕的癥狀前小鼠在DNA自身載體處理后9-12個月檢測以確定運動原損傷和組織學(xué)上胞內(nèi)內(nèi)含體的發(fā)生率。年長的癥狀小鼠在DNA自身載體處理后3-6個月檢測，檢測運動原測試的絕對臨床分?jǐn)?shù)改進(jìn)和組織學(xué)上胞內(nèi)內(nèi)含體總數(shù)的減少。實施例20一種用編碼亨廷頓蛋白的DNA療法治療亨廷頓癥的方法構(gòu)建的DNA自身載體編碼不同長度的CAG三核苷酸重復(fù)且通過實施例6所述途徑和方案施用。測量抗亨廷頓蛋白的抗體生成。DNA構(gòu)建施用給年輕的癥狀前小鼠和年長的癥狀小鼠，小鼠是突變?nèi)撕嗤㈩D基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，其CAG三核苷酸重復(fù)數(shù)增加。突變亨廷頓基因的轉(zhuǎn)基因小鼠具有的臨床和病理生理特征幾乎與人類疾病相同。這些小鼠發(fā)展由突變亨廷頓蛋白組成的胞內(nèi)內(nèi)含體并具有人類疾病中的運動原異常。最近的研究證明如果突變基因的表達(dá)終止，疾病組織病理學(xué)被反轉(zhuǎn)且臨床癥狀改進(jìn)(Yamamoto等，Cell101:57-66,2000)。評估DNA處理動物在疾病臨床和病理生理參數(shù)中的改進(jìn)。年輕的癥狀前小鼠在DNA處理后9-12個月檢測以確定運動原缺陷和組織學(xué)上亨廷頓蛋白內(nèi)含體的發(fā)生率。年長的癥狀小鼠在DNA處理后3-6個月檢測，檢測運動原測試的絕對臨床分?jǐn)?shù)改進(jìn)和組織學(xué)上核內(nèi)內(nèi)含體總數(shù)的減少。實施例21一種用編碼亨廷頓蛋白的DNA療法防止和治療亨廷頓癥的方法確立亨廷頓癥的人或突變?nèi)撕嗤㈩D基因測試陽性并因而易發(fā)展亨廷頓癥的人可用編碼亨廷頓蛋白的自身多核苷酸治療，以防止確立的亨廷頓癥發(fā)展或治療此病。構(gòu)建的DNA自身載體編碼不同長度的CAG三核苷酸重復(fù)且肌肉內(nèi)施用，4-8周后加強。它能用免疫刺激DNA序列和/或融合C3d施用以增加自身多核苷酸治療功效。測量抗亨廷頓蛋白的抗體生成，傳遞其它DNA自身載體強化以獲得治療水平相關(guān)的抗亨廷頓蛋白抗體效價。功效在亨廷頓癥神經(jīng)特征的臨床改進(jìn)基礎(chǔ)上監(jiān)控。實施例22一種用編碼朊病毒自身蛋白的DNA療法治療朊病毒疾病的方法構(gòu)建的DNA自身載體編碼參與0片層形成的朊病毒蛋白結(jié)構(gòu)域。質(zhì)粒載體如實施例6所述施用。測量抗朊病毒蛋白的抗體生成。DNA構(gòu)建施用給年輕的癥狀前小鼠和年長的癥狀小鼠，小鼠是用于朊病毒疾病的轉(zhuǎn)基因模型。這些小鼠轉(zhuǎn)朊病毒基因，此基因所含突變使這些小鼠發(fā)展神經(jīng)變性疾病緩慢，該疾病模擬人朊病毒疾病的行為和病理生理異常(Chiesa等，Neuron21:1339-1351,1998)。年輕的癥狀前小鼠在DNA處理后9-12個月檢測以確定認(rèn)知和與異常組織學(xué)一起的運動原缺陷的發(fā)生率。年長的癥狀小鼠在DNA處理后3-6個月檢測，檢測認(rèn)知和運動原測試的絕對臨床分?jǐn)?shù)改進(jìn)和組織學(xué)檢測上異常嚴(yán)重性的減少。實施例23一種用編碼自身蛋白質(zhì)的DNA治療肥胖的方法，自身蛋白質(zhì)參與調(diào)節(jié)攝食行為、脂肪形成和/或代謝自身載體包括編碼一種或多個自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸，自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽選自多配體聚糖-3、圍脂滴蛋白、食欲肽、甘丙肽、胰高血糖素-類似肽受體以及其它本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的蛋白質(zhì)，使用本發(fā)明的教授，它們參與調(diào)節(jié)攝食行為、脂肪形成和/或代謝，載體在如上所述用PCR獲得編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的DNA后構(gòu)建。這些DNA自身載體通過肌肉注射施用給小鼠。施用DNA48小時前，50ul0.25%布比卡因肌肉注射給兩塊四頭肌肌肉。質(zhì)粒DNA用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化，包括去除內(nèi)毒素的步驟。DNA自身載體重懸浮和保存于無內(nèi)毒素、無熱原的水。注射前，DNA自身載體在具0.9mM鈣的PBS中以lmg/ml終濃度制成。隨后50wl的此DNA自身載體制劑通過肌肉注射施用給兩塊四頭肌肌肉。在一個實施方案中，DNA自身載體沒有佐劑施用，在另一個實施方案中，施用DNA，免疫刺激CpG寡核苷酸以10ug每只動物的劑量肌肉內(nèi)施用，或用另一種試劑。初次免疫后2周進(jìn)行第二次加強布比卡因和具CpG寡核苷酸的DNA。然后從起始DNA施用后4到6周的小鼠中取出血清，以測試抗編碼自身蛋白的抗體存在。這通過標(biāo)準(zhǔn)ELISA技術(shù)測量。單獨評估此畫A自身載體治療以及結(jié)合其在C57BL/6小鼠中減少重量增加和促進(jìn)重量減少的能力，小鼠用促進(jìn)肥胖的高脂肪飲食喂養(yǎng)(55%脂肪來自卡路里[貨號tt93075，HarlanTaklad，Madison，WI]，與僅9%卡路里來自脂肪的常規(guī)小鼠chow相反)。實施例24一種用編碼自身蛋白質(zhì)的DNA防止骨關(guān)節(jié)炎的方法，自身蛋白質(zhì)參與調(diào)節(jié)軟骨重塑、降解和生長編碼組織蛋白酶、纖溶酶、膠原酶、金屬蛋白酶的DNA用PCR分離并克隆到質(zhì)粒DNA表達(dá)載體，與實施例1所述類似。攜帶6拷貝proa1(II)膠原轉(zhuǎn)基因的Dell小鼠在3個月大時出現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎，轉(zhuǎn)基因具有短的缺失突變(Salminen等，ArthritisRheum44:947-955，2001);(Rintala等，JAnat190:201-208,1997)。從4周大開始，這些小鼠每隔一周接受DNA自身載體注射，載體單獨或組合編碼組織蛋白酶、纖溶酶、膠原酶、金屬蛋白酶。小鼠組以每月間隔殺死，用于組織分析它們的膝軟骨。實施例25一種用編碼自身蛋白質(zhì)Nogo-A的DNA療法防止脊髓損傷的方法脊髓損傷的治療靶是名為Nogo-A的蛋白質(zhì)。抗Nogo-A的抗體顯示在脊髓損傷動物模型中促進(jìn)軸突再生。構(gòu)建的自身載體所含DNA編碼小鼠、大鼠和人序列的兩個Nogo-A分子區(qū)，此區(qū)域被鑒定為可能對此分子抑制能力有作用，即胞外66氨基酸環(huán)和名為AS472的胞質(zhì)內(nèi)C-末端區(qū)。DNA克隆到適當(dāng)DNA表達(dá)載體，形成本發(fā)明的自身載體并施用以產(chǎn)生中和抗體反應(yīng)抗這些Nogo-A區(qū)。為測試所產(chǎn)生抗體的中和效果，體外測定用于評估重組Nogo蛋白存在時的3T3成纖維細(xì)胞擴散、背根神經(jīng)中樞(雞E12DRG培養(yǎng)物)神經(jīng)突生長以及小鼠P4小腦粒神經(jīng)元萌生。在被證明的動物模型中測試DNA構(gòu)建的脊髓損傷。這些模型包括大鼠脊髓粉碎和脊髓切片模型。遵循三種不同的實驗處理操作即預(yù)防性DNA自身載體處理(施用DNA自身載體，接著損傷脊髓)、急性處理(損傷后立即施用DNA自身載體)和慢性處理(延長DNA自身載體施用以評估慢性損傷神經(jīng)元中恢復(fù)生長的潛能)。軸突恢復(fù)用標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)技術(shù)和軸突標(biāo)記的免疫組化來測量。測試運動軸突再生使用生物素葡聚糖胺順行性追蹤用于皮層脊髓束和免疫組化用于血清素能(脊髓縫(raphespinal))及去甲腎上腺素能(coerulospinal)神經(jīng)元。評估功能性恢復(fù)用臨床評定的標(biāo)準(zhǔn)方法。使用運動原恢復(fù)測試如21-點BBB運動等級、格子步(gridwalk)、窄光速交叉(beamcrossing)和爬行測試(Ramon-Cueto等，Neuron25:425-435,2000);(Merkler等，JNeurosci21:3665-3673，2001)。腿肌肉的肌電圖記錄用于評估后肢運動原恢復(fù)。測試靈敏性使用對光接觸(接觸放置)的反應(yīng)、關(guān)節(jié)彎曲(本體感受)和尾部輕打(疼痛)測試。實施例26一種用編碼主要組織相容性自身蛋白質(zhì)和另外自身蛋白質(zhì)的DNA療法防止和治療移植物抗宿主病的方法移植物抗宿主病(GVHD)在接受異源造血細(xì)胞移植的病人中引起顯著病態(tài)和死亡率。GVHD通過移植免疫細(xì)胞攻擊受體細(xì)胞表達(dá)的自身蛋白質(zhì)來調(diào)節(jié)。使用的骨髓細(xì)胞從Balb/c(H-20轉(zhuǎn)移到Balb/k(H-2》小鼠，編碼H-2dI和II型MHC自身蛋白的DNA顯示減少GVHD。對于造血干細(xì)胞移植，骨髓獲得自Balb/c小鼠的大腿骨，選擇c-Kit表達(dá)陽性細(xì)胞，使用MiniMACS/MidiMACS分離系統(tǒng)(MiltenyiBiotech,Aburn，CA)。分開劑量的800cGy致命輻照以2部分傳遞后，c-Kit選擇的細(xì)胞注射到Balb/k受體尾部靜脈。受體小鼠用每周一次、3周劑量的自身載體預(yù)處理，自身載體包括的DNA編碼H-2dI和II型腿C自身蛋白質(zhì)以減少GVHD。監(jiān)控GVHD以測量肝臟酶(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、膽紅素)和組織分析GVHD中普遍影響的器官(皮膚、胃腸道、肝等)為基礎(chǔ)，用于證明炎癥和壞死(急性GVHD)以及慢性炎癥、纖維化和萎縮(慢性GVHD)。進(jìn)行淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)以評估忍受誘導(dǎo)的程度，在移植淋巴細(xì)胞對受輻照的宿主抗原呈遞細(xì)胞反應(yīng)減少的基礎(chǔ)上。編碼人MHCI和II型等位基因的DNA自身載體如上所述制備。測試造血干細(xì)胞移植受體以確定它們表達(dá)的特異MHCI和II型等位基因。用編碼受體I和II型等位基因的DNA治療，體外預(yù)處理待移植的細(xì)胞以防止GVHD。編碼這些自身腿C分子的DNA用于治療正患GVHD的移植后受體。DNA治療可減少GVHD相關(guān)的移植后死亡率并降低GVHD臨床表現(xiàn)，包括皮疹、涉及胃腸和涉及含肝的其它器官(通過檢測肝損傷的血清標(biāo)記監(jiān)控，包括天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、膽紅素)。實施例27一種用編碼骨橋蛋白的DNA治療多發(fā)性硬化和其它自身免疫疾病的方法骨橋蛋白是最近鑒定的多效分子，在多發(fā)性硬化和其動物模型EAE中起致病作用。骨橋蛋白也可在炎癥關(guān)節(jié)炎和其它人自身免疫疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。用編碼自身蛋白骨橋蛋白的DNA處理小鼠在宿主中誘導(dǎo)抗骨橋蛋白的免疫球蛋白反應(yīng)，抑制骨橋蛋白使疾病連續(xù)的有害作用。編碼骨橋蛋白的自身載體DNA通過克隆編碼骨橋蛋白的DNA到pCDNA3哺乳動物表達(dá)載體中產(chǎn)生。pCDNA3包含CMV啟動子和SV-40大T抗原多腺苷酸信號。此編碼骨橋蛋白的自身載體在大腸桿菌中生成并用QiagenEndo-freeMega-pr印試劑盒(Qiagen，Valencia,CA.)純化無內(nèi)毒素的DNA。小鼠四頭肌注射O.lralPBS(每塊四頭肌0.05ml)中的0.25%布比卡因-HCl(Sigma,St.Louis，MO)。2天后，小鼠各四頭肌中注射0.05ml各自身質(zhì)粒DNA，質(zhì)粒DNA以l.Omg/ml在具0.9mM鈣的磷酸緩沖鹽水中。質(zhì)粒DNA以2到4周間隔再注射2次。編碼骨橋蛋白的自身載體誘導(dǎo)抗骨橋蛋白抗體的功效可提高，通過共傳遞CpG免疫刺激寡核苷酸(如下所述)和/或用編碼骨橋蛋白的DNA融合一個或多個C3d成分處理(如下所述)。酶聯(lián)免疫吸收測定用于監(jiān)控抗骨橋蛋白抗體的水平，誘導(dǎo)抗骨橋蛋白抗體代表治療功效。隨后用完全弗氏佐劑中的髓鞘肽(通常PLPpl39-151)攻擊小鼠以發(fā)展EAE，用編碼骨橋蛋白的自身載體預(yù)處理的小鼠EAE發(fā)生率和嚴(yán)重性降低，如圖5所證明。另外，可誘導(dǎo)易慢性復(fù)發(fā)EAE的小鼠品系(例如S幾小鼠)發(fā)展EAE(例如用完全弗氏佐劑中的PLPpl39-151)，在確立EAE的小鼠中以雙周間隔開始骨橋蛋白-自身載體治療，用于誘導(dǎo)抗骨橋蛋白抗體以治療疾病。測量功效以總體疾病嚴(yán)重性和臨床癱瘓新事件數(shù)量的減少為基礎(chǔ)，使用標(biāo)準(zhǔn)打分系統(tǒng)(如上所述)。在患多發(fā)性硬化的人中，診斷后開始骨橋蛋白-自身載體治療。監(jiān)控功效以患多發(fā)性硬化病人中抗骨橋蛋白抗體的誘導(dǎo)為基礎(chǔ)，如ELISA分析所測。進(jìn)一步證明功效的基礎(chǔ)是腦MRI掃描上損傷數(shù)量和尺寸的減少、疾病復(fù)發(fā)(臨床癱瘓事件)數(shù)量的減少和殘疾發(fā)展變慢。實施例28一種用編碼自身組織移植蛋白的DNA防止和治療組織移植排斥的方法目前組織和器官移植(腎、肝、心臟、肺、輸血、胰腺、島細(xì)胞、造血細(xì)胞等)的最大限制之一是受體免疫排斥組織移植。免疫排斥由受體免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)，免疫系統(tǒng)識別組織移植蛋白中的等位基因變化。這些組織移植變成自身的，以這些組織移植基因組中編碼的相關(guān)自身蛋白等位基因變化為基礎(chǔ)。將組織和其基因組移植到受體使這些蛋白質(zhì)成為受體自身蛋白。組織移植排斥由受體免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)，免疫反應(yīng)抗組織移植中的MHCI和II型蛋白、抗組織移植中其它組織相容性和另外抗原，它們與受體相比具有等位基因變化。用Balb/c(H-2d)和Balb/k(H-2k)小鼠間的組織移植，編碼H-2dI和II型MHC分子的DNA自身載體施用給移植受體，減少固定器官組織移植的排斥。用標(biāo)準(zhǔn)操作將心臟從H-2"」、鼠移植到H-2k小鼠的異位腹部位置(異位移植能通過簡單觸診緊密監(jiān)控移植心臟)。受體小鼠用每周一次、3周劑量的pTARGET預(yù)處理(移植前)，pTARGET包含編碼H-2dI和II型MHC分子的DNA，禾口/或移植后用編碼H-2dI或II型分子的DNA每周或雙周或每月處理。如觸診移植心臟所監(jiān)控，用DNA自身載體預(yù)處理和/或移植后處理延長受體小鼠中的移植存活，自身載體編碼組織移植的自身MHC和其它自身蛋白。編碼人MHCI和II型等位基因的DNA自身載體如上所述產(chǎn)生。測試移植供體和受體以確定它們表達(dá)的特異腿CI和II型等位基因。使用DNA自身載體治療包括施用編碼組織移植供體I和II型MHC等位基因的自身載體，預(yù)處理移植器官的受體以防止組織移植排斥。施用編碼自身MHC分子的DNA以在移植后受體中治療組織移植排斥。包括施用自身載體的DNA治療減少免疫器官移植排斥和延長組織移植存活。實施例29一種天花疫苗接種后防止和治療免疫-調(diào)節(jié)腦脊髓炎的方法接種天花疫苗的主要限制之一是接種后急性散播的腦脊髓炎，在接受目前所用天花疫苗的病人中以約1:1000發(fā)生。此接種后急性散播的腦脊髓炎由疫苗誘導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)，自身免疫反應(yīng)針對髓鞘和其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)蛋白。本發(fā)明的多核苷酸療法治療人天花疫苗接種誘導(dǎo)的免疫-調(diào)節(jié)腦脊髓炎，如下進(jìn)行。編碼一種或多個人髓鞘自身蛋白的DNA序列克隆到pTARGET或另一種適當(dāng)DNA自身載體中。編碼這些髓鞘自身蛋白的DNA被這類自身免疫反應(yīng)靶向，包括髓鞘堿性蛋白、蛋白脂蛋白、髓鞘相關(guān)糖蛋白、環(huán)核苷酸磷酸二酯酶、髓鞘相關(guān)糖蛋白、髓鞘相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白和a-B-晶體蛋白。純化沒有細(xì)菌內(nèi)毒素的DNA作為治療劑傳遞給人，如前所述。DNA自身載體治療每月或雙月傳遞，傳遞6-12個月，隨后每3-12個月傳遞作為維持劑量?？砂l(fā)展另外的治療方案且范圍可從每天到每周到每隔一月。所述DNA治療靶向的人類患者在臨床癥狀(包括運動原動力、感覺和認(rèn)知測量)和MRI監(jiān)控基礎(chǔ)上監(jiān)測疾病活性，MRI監(jiān)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的數(shù)量和程度。實施例30一種使用免疫刺激DNA序列增加抗自身多肽免疫球蛋白效價的方法，結(jié)合編碼自身多肽的DNA治療用編碼自身多肽的DNA單獨處理小鼠一般誘導(dǎo)弱免疫反應(yīng)，具抗編碼自身多肽的低抗體效價，這是由于自身耐受所施加的阻礙。為誘導(dǎo)高抗體效價抗自身多肽以治療致病自身蛋白引起或促進(jìn)的疾病，佐劑加入自身載體DNA以加強其免疫能力。一個這種佐劑是已知免疫刺激的核苷酸序列。報導(dǎo)所謂的CpG序列能加強免疫反應(yīng)抗DNA中編碼的抗原(Krieg等，Nature374:546-549,1995;Klin阻n等，PNAS(USA)93:2879-2883，1996;Sato等，JRheumatol.26:294-301，1999)。CpG序列結(jié)合到DNA自身載體制劑中，通過內(nèi)源增加質(zhì)粒中存在的CpG序列數(shù)量或加入含寡核苷酸的外源CpG。任意情況中的CpG序列具有基序嘌呤-嘌呤-C-G-嘧啶-嘧啶。多種內(nèi)源CpG序列用定點突變結(jié)合到質(zhì)粒非編碼區(qū)。外源CpG寡核苷酸包含1到10個CpG序列的任意位置且長度從10到100個核苷酸。另外，修飾這些寡核苷酸主鏈以減少降解可能，例如用硫代磷酸主鏈。免疫刺激的CpG寡核苷酸以10到100ug每只動物的劑量肌肉內(nèi)施用。當(dāng)需要增加抗體效價時，此策略應(yīng)用于任何編碼自身多肽的多核苷酸。如實施例12所述，外源CpG寡核苷酸用于加強抗體反應(yīng)抗通過DNA施用的自身蛋白AP(AP)。自身載體包括編碼自身肽Ae的DNA，載體通過肌肉注射施用給小鼠。50"10.25%布比卡因肌肉注射到兩塊四頭肌肌肉，48小時后施用自身載體。另外，DNA治療包括有效施用自身載體，沒有預(yù)處理安排。自身載體包括編碼AP的DNA，載體用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化，包括去除內(nèi)毒素的步驟。DNA重懸浮和保存于無內(nèi)毒素、無熱原的水。注射前，自身載體在PBS中以lmg/ml終濃度制成，載體包括編碼Ae的DNA。隨后50"1的此DNA制劑通過肌肉注射施用給兩塊四頭肌肌肉。另外，免疫刺激CpG寡核苷酸以lOug每只動物的劑量肌肉內(nèi)施用。初次免疫后2周進(jìn)行第二次加強布比卡因和具CpG寡核苷酸的DNA自身載體。然后從起始DNA施用后4到6周的小鼠中取出血清，以測試抗AP肽的抗體存在。這通過標(biāo)58抗AP肽的顯著抗體效價。當(dāng)CpG寡核苷酸用作佐劑時，效價顯著增加。實施例31多核苷酸治療包括施用編碼自身蛋白質(zhì)文庫的DNA，自身蛋白質(zhì)在自身免疫反應(yīng)靶向的器官和組織中表達(dá)另-一種治療自身免疫的策略是在免疫攻擊下施用編碼組織或器官中存在的許多或所有自身蛋白質(zhì)的DNA。cDNA表達(dá)文庫包含編碼許多或絕大部分自身蛋白質(zhì)的cDNA，自身蛋白質(zhì)在特定組織、器官或細(xì)胞類型中表達(dá)。這種cDNA表達(dá)文庫在自身載體中產(chǎn)生以在施用給宿主時能表達(dá)它們編碼的多肽。確立多發(fā)性硬化的動物和人用編碼cDNA文庫的自身載體治療，cDNA在腦的少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)?；硷L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動物和人用編碼cDNA文庫的自身載體治療，cDNA在滑膜關(guān)節(jié)中表達(dá)，滑膜關(guān)節(jié)是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中自身免疫反應(yīng)的靶?；甲陨砻庖咛悄虿〉膭游锖腿擞镁幋acDNA文庫的自身載體治療，cDNA在胰腺的e細(xì)胞中表達(dá)。編碼胰腺3細(xì)胞中所表達(dá)cDNA的自身載體也可用于防止個體發(fā)展臨床糖尿病，個體被鑒定為發(fā)展自身免疫糖尿病的風(fēng)險很高。另外，自身載體中編碼的cDNA文庫大亞群可用于治療自身免疫，而不用完整cDNA文庫，。實施例32多核苷酸治療包括施用編碼一種或多個自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的DNA以及免疫調(diào)節(jié)分子用于不同疾病實施例l、2和9到23所述方法描述了自身蛋白質(zhì)、多肽或肽的鑒定、自身載體的制備和用于治療不同疾病的施用。遵循這些例子中的方法，修改是自身載體與免疫調(diào)節(jié)分子一起施用，包括例如免疫調(diào)節(jié)序列(ISS)、C3d、IL-4、IL-10和IL-13。多核苷酸治療包括施用編碼一種或多個自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的DNA以及另外的免疫調(diào)節(jié)分子用于治療和防止表7所列自身免疫疾病。多核苷酸治療包括施用編碼一種或多個自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的DNA以及另外的免疫調(diào)節(jié)分子用于治療和防止表8所列神經(jīng)變性疾病。多核苷酸治療包括施用編碼一種或多個自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的DNA以及另外的免疫調(diào)節(jié)分子用于治療和防止表9所列多種疾病。碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的DNA以及另外編碼免_疫調(diào)節(jié)蛋白、肽或多肽的DNA_多發(fā)性硬化髓鞘堿性蛋白(MBP)+IL-4;MBP+IL-10;MBP+IL-13;蛋白脂蛋白(PLP)+IL-4;PLP+IL-10;PLP+IL-13;髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG);MAG+IL-4;MAG+IL-10;MAG+IL-13;環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(CNP酶)+IL-4;CNP酶+IL-10;a-B-晶體蛋白+IL-4;a-B-晶體蛋白+IL-10;a-B-晶體蛋白+IL-13;MBP+PLP+MAG+IL-4;MBP+PLP+MAG+IL-10;MBP+PLP+MAG+CNP酶+a-B-晶體蛋白+IL-4;少突膠質(zhì)細(xì)胞cDNA文庫；少突膠質(zhì)細(xì)胞cDNA文庫+IL-4;少突膠質(zhì)細(xì)胞cDNA文庫+IL-10;少突膠質(zhì)細(xì)胞cDNA文庫+IL-13周圍髓鞘蛋白1(Pl)+IL-4;P1+IL-10;P1+IL-13;周圍髓鞘蛋白II(P2)+IL-4;P2+IL-10;P2+IL-13;施萬細(xì)胞cDNA文庫+IL-4;施萬細(xì)胞cDNA文庫+IL-10;施萬細(xì)胞cDNA文庫+IL-13酪氨酸磷酸酶IA2+IL-4;IA2+IL-10;IA2+IL-13;IA-2P;IA-2P+IL-4;IA2-b+IL-10;IA2-b+IL-13;谷氨酸脫羧酶(65和67kDa形式)(GAD)+IL-4;GAD+IL-10;GAD+IL-13;羧肽酶H(CH)+IL-4;CH+IL-10;CH+IL-13;胰島素+IL-4;胰島素+IL-10;胰島素+IL-13;胰島素原+IL-4;胰島素原+IL-10;胰島素原+IL-13;熱激蛋白(HSPs)+IL-4;HSPs+IL-10;HSPs+IL-13;glima38+IL-4;島細(xì)胞抗原69kDa+IL-4;p52+IL-4;神經(jīng)節(jié)苷脂抗原+IL-4;島細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運子GLUT-2+IA2+IL-4;GLUT-2+IA2+IL-10;GLUT-2+IA2+IL陽13;GLUT+IA2+GAD+IL-4;GLUT2+IA2+GAD+IL-10;GLUT2+IA2+GAD+IL-13;GLUT2+IA2+GAD+羧肽酶H+胰島素原+HSPs+glima38+胰島素；胰島素+IA2+GAD+IL-13;胰島素+IA2+GAD十羧肽酶H+胰島素原十HSPs+glima38+GLUT2+IL-4;胰島素+1八2+0八0+IL-13;胰島素+IA2+GAD+羧肽酶H+胰島素原+HSPs+glima38+GLUT2+IL墨13;胰腺PcDNA文庫+IL-4;胰腺PcDNA文庫+IL-10;胰腺PcDNA文庫+IL-13風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎免疫球蛋白(Ig)+IL-4;Ig+IL-10;Ig+IL-13;血纖蛋白+IL-4;血纖蛋白+IL-10;血纖蛋白+IL-13;血纖蛋白+肽基精氨酸脫亞氨酶(PAD)+IL-4;60GuillianBarre綜合征胰島素依賴型糖尿病自身免疫性色素層炎原發(fā)性膽硬化自身免疫肝炎尋常性天皰瘡重癥肌無力自身免疫胃炎惡性貧血多肌炎和皮肌炎自身免疫性甲狀腺炎葛雷夫斯氏病牛皮癬II型膠原(CII)+IL-4;CII+IL-10;CII+IL-13;Bip+IL-4;Bip+IL扁10;Bip+IL-13;葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(G6PI)+IL-4;G6PI+IL-10;G6PI+IL-13;GP-39+IL-4;GP-39+IL-10;GP-39+IL-13;血纖蛋白+CII+BIP十G6PI+GP-39+IL-4;血纖蛋白+CII+BIP+G6PI+GP-39+IL-10;血纖蛋白+CII+BIP屮G6PI+GP-39+IL-13;少突膠質(zhì)細(xì)胞cDNA文庫+IL-4;少突膠質(zhì)細(xì)胞cDNA文庫+IL-10;少突膠質(zhì)細(xì)胞cDNA文庫+IL-13;滑膜細(xì)胞cDNA文庫+IL-4;滑膜細(xì)胞cDNA文庫+IL-13;少突膠質(zhì)細(xì)胞和滑膜細(xì)胞cDNA文庫+IL-4S-抗原(SAg)+IL-4;SAg+IL-10;SAg+IL-13;光感受器間類維生素A結(jié)合蛋白(IRBP)+IL-4;IRBP+IL-10;IRBP+IL-13;視紫質(zhì)+IL-4;視紫質(zhì)+IL-13;恢復(fù)蛋白+IL-4;恢復(fù)蛋白+IL-13;SAg+IRBP+IL-4;SAg+IRBP十IL-13;SAg+IRBP+視紫質(zhì)+恢復(fù)蛋白+IL-4;SAg+IRBP+視紫質(zhì)+恢復(fù)蛋白+IL-13;眼色素層cDNA文庫；眼色素層cDNA文庫+IL-4;眼色素層cDNA文庫+IL-10;眼色素層cDNA文庫+IL-13丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(2-氧化酸脫氫酶復(fù)合體蛋白)(PDs)+IL-4;PDs+IL-10;PDs+IL-13;膽管cDNA文庫+IL-4細(xì)胞色素P450+IL-4;細(xì)胞色素P450+IL-10;細(xì)胞色素P450+IL-13;肝細(xì)胞cDNA文庫+IL-4;肝細(xì)胞cDNA文庫+IL-13橋粒芯蛋白(DG-l)+IL-4;DG-1+IL-13;橋粒芯蛋白-3(DG-3)+IL-4;DG-3+IL-10;DG-3+IL-13;DG-l+DG-3;DG-l+DG-3+IL-4;角化細(xì)胞cDNA文庫+IL-4乙酰膽堿受體(AChR)+IL-4;AChR+IL-10;AChR+IL-13H+/K+ATP酶+IL-4;內(nèi)部因子+IL-4內(nèi)部因子+IL-4組氨酰tRNA合成酶+IL-4;組氨酰tRNA合成酶+IL-13;肌細(xì)胞cDNA文庫+IL-4;肌細(xì)胞cDNA文庫+IL-13甲狀腺球蛋白+IL-4;甲狀腺球蛋白+IL-10;甲狀腺球蛋白+IL-13;甲狀腺過氧物酶+IL-4;甲狀腺過氧物酶+IL-13;甲狀腺球蛋白+甲狀腺過氧物酶+IL-4;甲狀腺過氧物cDNA文庫+IL-4促甲狀腺素受體+IL-4皮膚cDNA文庫+IL-4;皮膚cDNA文庫+IL-10;皮膚cDNA文庫+IL-13<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>血糖素-類似肽受體+C3d骨關(guān)節(jié)炎組織蛋白酶+ISS;組織蛋白酶+ISS+C3d;纖溶酶+ISS;纖溶酶+C3d;纖溶酶+ISS+C3d;膠原酶+ISS;膠原酶+C3d;膠原酶+ISS+C3d;金屬蛋白酶+ISS;金屬蛋白酶+C3d;金屬蛋白酶+ISS+C3d脊髓損傷Nogo-1十ISS;Nogo-1+C3d;Nogo-l+ISS十C3d高血壓血管緊縮素-轉(zhuǎn)化酶(ACE)+ISS;ACE+C3d;ACE+ISS+C3d胃潰瘍疾病H7K+ATP酶+工SS;H7K+ATP酶+C3d;H+/K+ATP酶+ISS+C3d、胃泌激素+ISS;胃泌激素+C3d;胃泌激素+ISS+C3d自身免疫骨橋蛋白+ISS;骨橋蛋白+C3d;骨橋蛋白+ISS+C3d老化超氧化物岐化酶+ISS+C3d;超氧化物岐化酶+ISS;超氧化物岐化酶+C3d低壓血清素5HT2受體+ISS;血清素5HT2受體+C3d;血清素5HT2受體+ISS+C3d;a腎上腺素受體+C3d;a,-腎上腺素受體+ISS+C3d;a'-腎上腺素受體+C3d+ISS痛風(fēng)黃嘌呤氧化酶+ISS;黃嘌呤氧化酶+C3d;黃嘌呤氧化酶+ISS+C3d偏頭痛血清素5HTIB+ISS;血清素5HT,B+C3d;血清素5HTVISS十C3d;血清素5HTID受體十ISS;血清素5HT。受體+ISS十C3d高脂血HMGCoA-還原酶+ISS;HMGCoA-還原酶+ISS+C3d;HMGCoA-還原酶+C3d;阿樸脂蛋白A+ISS;阿樸脂蛋白A+C3d;阿樸脂蛋白A+ISS+C3d;阿樸脂蛋白B100+ISS;阿樸脂蛋白B100+C3d;阿樸脂蛋白B100+ISS+C3d冠心病血管緊縮素-轉(zhuǎn)化酶(ACE)+ISS;ACE+C3d;ACE+ISS+C3d;阿樸脂蛋白A+ISS;阿樸脂蛋白A+C3d;阿樸脂蛋白A+ISS+C3d;阿樸脂蛋白B100+ISS;阿樸脂蛋白B100+C3d;阿樸脂蛋白B10(KISS+C3d實施例33多核苷酸治療包括施用編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的DNA，結(jié)合編碼共刺激分子、能調(diào)節(jié)共剌激的分子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的DNA檢測共刺激分子阻礙的研究包括CD40/CD40L阻礙(抗CD40/CD40L抗體)和B7-CD28阻礙(CTLA4-Ig)，證明在治療自身免疫的動物模型和人臨床試驗中都有顯著功效，可和自身免疫疾病的DNA多核苷酸治療一起使用。B7-1和B7-2結(jié)合T細(xì)胞表面的CD28和CTLA4。經(jīng)CD28傳遞的信號刺激T細(xì)胞，而CTLA4的參與是抑制性的。我們產(chǎn)生和使用的DNA編碼CTLA4-特異免疫球蛋白(Ig)的跨膜形式，結(jié)合DNA多核苷酸療法以治療CIA。生成編碼共刺激分子CTLA4-特異Ig膜結(jié)合形式的DNA，用RT-PCR將編碼Ig跨膜區(qū)的DNA移植到CTLA4-特異Ig重鏈cDNA上(從雜交瘤擴增，從ATCC產(chǎn)生CTLA4-特異Mab)。本發(fā)明的DNA多核苷酸治療結(jié)合編碼共刺激分子或其它免疫調(diào)節(jié)分子的DNA，例如CD153和Fas，可用于治療自身免疫疾病。實施例34用IMS結(jié)合編碼多種自身蛋白的DNA治療多發(fā)性硬化的動物模型DNA多核苷酸治療包括的全長cDNAs編碼4種主要髓鞘成分MBP、MAG、M0G和PLP，當(dāng)在疾病發(fā)作后給予時治療EAE動物模型中的疾病復(fù)發(fā)。此外，將編碼IL-4的DNA加入髓鞘DNA多核苷酸治療，治療功效進(jìn)一步通過復(fù)發(fā)速度減小而提高。然而，盡管復(fù)發(fā)減少，總體疾病嚴(yán)重性仍可與對照組相比。雌性S幾/J小鼠用100ugPBS中的PLPu9,皮下免疫，PLPi:t9—15,在CFA中乳化，CFA由IFA和O.5mg熱滅活結(jié)核分枝桿菌組成。免疫后12天，在疾病發(fā)作時，小鼠四頭肌都注射總共0.lmlPBS中的0.25%布比卡因-HCL。2天后，肌肉注射所選小鼠的四頭肌，所用DNA混合物含25ug編碼全長鼠PLP、MAG、MOG和MBP的4個單獨pTARGET(PromegaCorp.Wisconsin)質(zhì)粒加50wg編碼全長鼠IL-4的pTARGET質(zhì)粒，總體積0.2ml。DNA注射每隔一周進(jìn)行，注射6周。在起始DNA接種疫苗同時，200ulPBS體積中的50wgIMS腹膜內(nèi)單獨施用或與DNA疫苗接種一起。IMS每隔一周給予，進(jìn)行6周。與未處理和DNA多核苷酸治療+編碼IL-4的質(zhì)粒處理的小鼠相比，IMS單獨處理的小鼠在整個疾病過程中總體平均疾病嚴(yán)重性下降(圖6)。當(dāng)小鼠用DNA混合物加IL-4結(jié)合IMS處理時，總體平均疾病嚴(yán)重性下降明顯更劇烈(圖6)。誘導(dǎo)EAE疾病后57天，殺死小鼠，提取來自小鼠的腹股溝和腋淋巴結(jié)且根據(jù)各組收集。分離細(xì)胞并用,g/ml富集RPMI培養(yǎng)基中的PLP139—151和腳CS刺激。3天后，細(xì)胞用人-rlL2再刺激。再刺激3天后，收集上清并通過三明治ELISA篩選IFN-Y、IL-4和IL-10。未處理和IMS單獨處理或用DNA多核苷酸治療加IL-4處理小鼠的細(xì)胞因子分布都有Thl偏向的IFN-Y生成增加(圖7)。用DNA多核苷酸治療加IL-4結(jié)合IMS處理的組具有Th2偏向的IL-4和IL-10生成增加。實施例3564用IMS結(jié)合編碼自身蛋白胰島素的DNA治療胰島素依賴型糖尿病非肥胖糖尿病(NOD)小鼠同時發(fā)展自身免疫糖尿病，許多臨床、免疫和組織病理學(xué)特征與人胰島素依賴型糖尿病(IDDM)相同。疾病特征是胰島炎癥和日細(xì)胞破壞，引起高血糖癥和明顯糖尿病。CD4+和CD8+T細(xì)胞都需要用于糖尿病發(fā)展。鑒定了對于一些自身抗原的反應(yīng)性，包括胰島素、IA-2和谷氨酸脫羧酶。頂S治療結(jié)合編碼自身蛋白胰島素的DNA的功效在入侵胰島炎中開始，但在IDDM完全發(fā)作前。獲得7周大的N0D/Lt雌性小鼠且在一限制進(jìn)入室中居住。從10周大開始每周測試小鼠的血糖水平(BGL)提高，使用單觸超血糖監(jiān)控系統(tǒng)。當(dāng)BGL在200到250mg/dl間時開始治療。從15周大開始，可用小鼠相繼加入各組。小鼠四頭肌都注射總共0.2mlPBS中的0.25%布比卡因-HCl。2天后，肌肉注射小鼠的四頭肌，用50ug/劑量的pVAXl載體或DNA混合物，DNA混合物含50ng編碼全長鼠前胰島素原-1、前胰島素原-2和IL-4的3個單獨pVAXl質(zhì)粒，總體積0.2mlPBS。注射每隔一周進(jìn)行，注射4周。在起始DNA疫苗接種同時，200w1PBS體積中的50ugIMS腹膜內(nèi)單獨施用或與DNA疫苗接種一起。IMS每隔一周給予，進(jìn)行4周。糖尿病百分比定義為BGL持續(xù)大于250mg/dl的小鼠。4次治療注射后，單獨接受IMS的小鼠到第24周糖尿病發(fā)生率為87.5%(圖8)。接受空pVAXl(Invitrogen，CA)質(zhì)粒的小鼠糖尿病發(fā)生率為50%。用編碼自身抗原和細(xì)胞因子IL-4的DNA多核苷酸結(jié)合免疫調(diào)節(jié)序列處理小鼠，到第24周糖尿病發(fā)生率僅為20%，與此相比，未處理小鼠中糖尿病發(fā)生率為100%(圖8)。在此實驗中，DNA質(zhì)粒IM注射，而IMSIP注射，強烈暗示DNA質(zhì)粒(ISSs)和IMS耙向不同細(xì)胞群。此外，在此硏究中，NOD小鼠不暴露于ISSs。結(jié)合到一起，此令人驚訝和未預(yù)料到的結(jié)果證明IMS有效治療天然產(chǎn)生的自身免疫疾病。對上述系統(tǒng)可作出許多修改而不離開其基本教授。盡管本發(fā)明關(guān)于一個或多個特定實施方案詳細(xì)描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到可對本專利申請所示特定實施方案進(jìn)行改變，而這些修改和改進(jìn)在發(fā)明的范圍和精神內(nèi)，如下列權(quán)利要求所列。此說明書所引用的全部出版物或?qū)＠墨I(xiàn)納入本文供參考，各出版物或文獻(xiàn)特定和單獨指出納入本文供參考。引用上面的出版物或文獻(xiàn)不作為允許任何前述內(nèi)容與現(xiàn)有領(lǐng)域相關(guān)，也不允許這些出版物或文獻(xiàn)的內(nèi)容或日期與現(xiàn)有領(lǐng)域相關(guān)。權(quán)利要求1.下述(a)和(b)所述物質(zhì)在制備用于降低患有多發(fā)性硬化的對象的多發(fā)性硬化的嚴(yán)重性的藥劑中的用途(a)治療有效量的DNA自身載體，該載體含有編碼多發(fā)性硬化中靶向的自身抗原的一種或多種免疫顯性表位的多核苷酸；和(b)選自5’-嘌呤-嘧啶-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’或5’-嘌呤-嘌呤-[X]-[Y]-嘧啶-嘧啶-3’的免疫調(diào)節(jié)序列，其中X和Y是任何天然產(chǎn)生或合成的核苷酸，但X和Y不能是胞嘧啶-鳥嘌呤；其中，所述DNA自身載體肌肉內(nèi)給予。2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述對象中多發(fā)性硬化嚴(yán)重性的降低表現(xiàn)為以下一種或多種臨床復(fù)發(fā)減少、MRI上釓增強的損傷減少和MRI上增強損傷的減少。3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述自身抗原選自蛋白脂蛋白(PLP);髓鞘堿性蛋白(MBP);髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG);環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(CNPase);髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG);髓鞘相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白(MB0P);a-B-晶體蛋白(熱激蛋白)；OSP(少突膠質(zhì)細(xì)胞特異蛋白)；和瓜氨酸修飾的MBP。4.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述自身抗原是髓鞘蛋白。5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述髓鞘蛋白選自髓鞘堿性蛋白(MBP);髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG);髓鞘相關(guān)糖蛋白(MAG);髓鞘相關(guān)少突膠質(zhì)細(xì)胞堿性蛋白(MBOP);和瓜氨酸修飾的MBP。6.如權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于，所述髓鞘蛋白是髓鞘堿性蛋白(MBP)。7.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述對象是人。8.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述免疫調(diào)節(jié)序列結(jié)合在所述DNA自身載體中。9.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述自身抗原是自身蛋白。10.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述自身抗原是多肽。11.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述自身抗原是肽。12.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述DNA自身載體含有編碼多發(fā)性硬化中耙向的第二自身抗原的多核苷酸。13.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述DNA自身載體的治療有效量為約O.001微克到約1克。14.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述DNA自身載體的治療有效量為約10微克到約5毫克。15.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述DNA自身載體的治療有效量為約O.025毫克到約5毫克。16.如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述DNA自身載體以一次給藥或多次給藥的方式給予。17.如權(quán)利要求16所述的用途，其特征在于，所述多次給藥選自每天、每周、每月、每年或隔月給藥。18.如權(quán)利要求17所述的用途，其特征在于，所述多次給藥為在選自下組的期間中給予給予6個月，接著每3—12個月給予維持劑量；或給予12個月，接著每3—12個月給予維持劑量。全文摘要本發(fā)明提供了治療或防止動物疾病的方法，所述疾病與一個或多個存在于或參與非生理過程的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)，所述方法包括施用自身載體給動物，自身載體含編碼疾病相關(guān)自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸。施用含編碼自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸的自身載體調(diào)節(jié)對自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的免疫應(yīng)答，自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽通過施用自身載體表達(dá)。發(fā)明也提供組合物，它包括編碼一種或多個非生理存在自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽的多核苷酸，用于治療或防止的疾病與動物非生理過程中存在和/或作為其靶的自身-蛋白質(zhì)、多肽或肽相關(guān)。文檔編號A61P25/28GK101670119SQ20091016052公開日2010年3月17日申請日期2002年11月21日優(yōu)先權(quán)日2001年11月21日發(fā)明者H·加倫,L·斯坦恩曼,P·J·尤茨,P·J·魯伊茲,P·方托拉,W·H·羅賓遜申請人:利蘭·斯坦福青年大學(xué)托管委員會