專利名稱：桑皮苷在制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及二苯乙烯苷類單體化合物桑皮苷(MulberrosideA，簡(jiǎn)稱MA)的新用途，具 體涉及桑皮苷在制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物中的新用途，以及以該化合物為活性成分的 用于制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物的組合物。
背景技術(shù)：
近年來，國(guó)內(nèi)外大量流行病學(xué)研究表明高尿酸血癥/痛風(fēng)的患病率正逐年升卨-，卨尿酸血 癥不僅誘發(fā)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、尿石癥、尿酸性腎病，而且血尿酸水平升高與脂質(zhì)代謝異常、肥 胖等疾病密切相關(guān)，高尿酸血癥/痛風(fēng)已成為威脅人類健康的重要疾病。尿酸排泄減少和/或生 成增加是原發(fā)性高尿酸血癥的主要病因。嘌呤代謝過程中關(guān)鍵酶的缺陷所導(dǎo)致的嘌呤利用障 礙和/或嘌呤氧化酶的活性增強(qiáng)是尿酸生成增加的主要原因，腎近端小管對(duì)尿酸的重吸收增加 和/或分泌減少是尿酸排泄減少的主要原閔。尿酸排出減少或生成增加，可導(dǎo)致血液中尿液濃 度增高，直接或問接引起相關(guān)疾病。尿酸的排泄是一復(fù)雜過程，尿酸隨血液循環(huán)流入腎小球
時(shí)，游離型的尿酸將全部濾過，在近端腎小管約99%尿酸鹽被重吸收。
研究表明尿酸排泄過程受多種基因和表達(dá)產(chǎn)物共同調(diào)控，是一個(gè)復(fù)雜過程。由于尿酸帶 負(fù)電荷，不能fi由通過細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層，因此腎小管對(duì)尿酸的排泄依賴于離子通道。有學(xué)者 發(fā)現(xiàn)，有一些尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與了近曲腎小管對(duì)尿酸鹽的重吸收和主動(dòng)分泌。而且有研究 發(fā)現(xiàn)，通過腎皮質(zhì)細(xì)胞膜的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)有兩種方式:一種是通過電中性的陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體與一系列 有機(jī)和無機(jī)陰離子的交換來轉(zhuǎn)運(yùn)尿酸鹽；另一種是通過產(chǎn)電的尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體，它是一種單向 轉(zhuǎn)運(yùn)體。近年來,己從分子水平證實(shí)4種蛋白質(zhì)參與了尿酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)電的尿酸鹽單向轉(zhuǎn)運(yùn) 體(UAT);有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(OAT)家族的兩種蛋白OATl(Ichida K, Hosoyamada M, Kimura H, etal. Urate transport via human PAH trans porter hOATl and its gene structure [ J ]. Kid ney Int， 2003, 63: 143-155)和OAT3(Cha SH, Sekine T, Fukushima J I, et al. Identification and characterization of human organic anion transporter 3 exp ressing predominantly in the kidney[ J ]. Mol Pharmacol, 2001， 59: 1277-1286)參與了尿酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)；與OAT4有部分同源性的蛋白質(zhì), 命名為人尿酸鹽陰離子交換器(URAT1),已證實(shí)它主要參與尿酸的重吸收(Enomoto A, Kimura H, Chairoungdua A, et al. Molecular identification of a renal urate anion exchanger that regulates blood urate levels[ J ]. Nature, 2002, 417: 4472452.)。
桑皮苷結(jié)構(gòu)式、分子式和美國(guó)化學(xué)文摘收錄號(hào)(CASNo.)如下C26H32014 102841-42-9
桑皮苷可由天然產(chǎn)物中分離得到，許多文獻(xiàn)報(bào)道了利用柱層析從天然植物、中藥材或中 藥飲片(例如桑白皮、桑根皮、桑樹皮、桑枝以及藜蘆的地上部分或種子中)分離得到桑皮 苷(Hirakura， Kazuhiro; Kimura, Yoshiyuki; Qiu, Feng; Kanchanapoom, Tripetch; Li, Haitao; Piao, Shujuan)。也有報(bào)道由化學(xué)結(jié)構(gòu)/合成得到桑皮苷(Shimazaki, M.; Hano， Y.; Nomura, T. Faculty of Pharmaceutical Sciences, Toho University, Funabashi， Chiba, Japan. Naturwissenschaften (2000), 87(12), 546-548)。
桑皮苷有抑制黑色素，增白作用，是一種酪氨酸酶抑制劑(Li, Haitao; Cheng, Ka-Wing; Cho， Chi-Hin; He, Zhendan; Wang, Mingfu. Department of Botany, The University of Hong Kong, Hong Kong, Peop. Rep. China. Journal of Agricultural and Food Chemistry (2007), 55(7), 2604-2610.)桑皮苷還有抗氧化、抗炎作用(Chung, Kyung-Ook; Kim, Bo-Young; Lee, Myung-Hee; Kim, Yeo-Ryun; Chung, Hae-Young; Park, Jong-Hee; Moon, Jeon-Ok. College of Pharmacy, Pusan National University, Pusan, S. Korea. Journal of Pharmacy and Pharmacology (2003), 55(12), 1695-1700.)以及止咳平喘的作用(闡啟明)。但化合物單體桑 皮苷在用于制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物方面未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
木發(fā)明的目的是提供單體化合物桑皮苷用于制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物的新用途， 具體地說，是提供一種桑皮苷在用于制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物的新用途；同時(shí)提供一
種制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物的組合物。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是，提供了對(duì)尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子具有抑制調(diào)節(jié)作用的桑皮苷，用于制備抑 制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物，可用于制備與尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子異常高表達(dá)相關(guān)的疾病。本發(fā)明
提供的單體化合物桑皮苷在制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物應(yīng)用中具有以下優(yōu)點(diǎn)1、藥效成 分確切(單體化合物)；2、作用機(jī)制明確(通過尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子)；3、調(diào)節(jié)作用明確(抑
制調(diào)節(jié))。
4本發(fā)明利用高尿酸血癥動(dòng)物模型在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平上科學(xué)地評(píng)價(jià)并確定了 單體化合物桑皮苷對(duì)尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子的抑制調(diào)節(jié)作用。
本發(fā)明所涉及的單體化合物桑皮苷對(duì)模型動(dòng)物表達(dá)異常增高的尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子具有確 切的抑制作用；而對(duì)正常動(dòng)物的正常水平尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子表達(dá)無顯著抑制作用，具有很好 的安全性。
本發(fā)明用于制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物的組合物，含有制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子
藥物的有效量的桑皮苷化合物為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體；用該
化合物作為藥效成分來制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物的制劑，可單獨(dú)或與制藥可接受的賦
形劑等結(jié)合，按照常規(guī)方法制成口服液、膠囊劑、片劑、顆粒劑等劑型，優(yōu)選的是靶向劑型。 本發(fā)明的化合物的藥物組合物可用于制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物。
上文所述藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體，例如稀釋劑、賦形劑如水 等，填充劑如淀粉、蔗糖等；粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明膠和聚乙烯吡咯烷酮；濕 潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉；吸收促進(jìn)劑如季銨化合物；表面活性劑如 十六烷醇；吸附載體如高嶺土和皂粘土；潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、聚乙二醇 等。另外還可以組合物中加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。
本發(fā)明化合物可以組合物的形式通過口服、鼻吸入、直腸或腸胃外給藥的方式施用于需 要這種治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成常規(guī)的固體制劑如片劑、顆粒劑、膠囊劑等， 制成液體制劑如水或油懸浮劑或其它液體制劑如糖漿、酏劑等；用于腸胃外給藥時(shí)，可將其 制成注射用的溶液、水或油性懸浮劑等。優(yōu)選的形式是片劑、膠囊劑、栓劑、鼻噴霧劑和注 射劑，特別優(yōu)選在腸道的特定部位釋放的制劑。
本發(fā)明藥物組合物的各種劑型可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)生產(chǎn)方法制備。例如使活性成分 與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。
本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選含有重量比為98%~100 %的活性成分，最優(yōu)選含有重量比為 99%~100%的活性成分。
本發(fā)明化合物的使用量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療疾病的類型和嚴(yán)重 程度等變化，確定其閂劑量，可以一次或多次施用。


圖1為MA對(duì)小鼠高尿酸血癥血清尿酸水平的影響結(jié)果圖2為MA對(duì)小鼠高尿酸血癥血清肌酐水平的影響結(jié)果圖； 圖3為MA對(duì)小鼠高尿酸血癥尿液尿酸水平的影響結(jié)果圖； 圖4為MA對(duì)小鼠高尿酸血癥肝臟尿酸水平的影響結(jié)果圖；圖5為蛋白質(zhì)印跡法Western-blotting測(cè)定腎臟mURATl蛋白水平結(jié)果圖6為逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測(cè)定腎臟mURATlmRNA水平結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
下面的實(shí)施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
單體化合物桑皮苷對(duì)尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子URAT1的抑制調(diào)節(jié)作用。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，24士2g克，雄性。 藥物配制含有重量比為98%~100%的的天然產(chǎn)物桑皮苷均勻分散于生理鹽水中，用于灌胃 給藥，給藥低劑量10mg/kg、高劑量為40mg/kg。
實(shí)驗(yàn)材料HPD—600型大孔吸附樹脂，TrizolReagment(Invigen),氯仿，異丙醇，無水 乙醇，DEPC, M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，PCR試劑盒，RIPA裂解液，尿酸試劑盒，肌酐試劑盒。
實(shí)驗(yàn)儀器高速冷凍離心機(jī)，高速勻漿機(jī)，Bio-rad垂直電泳槽，MBI-PCR儀、水平電 泳槽等。
實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ托∈蟾吣蛩嵫Y模型。 實(shí)驗(yàn)方法
1. 模型的建立動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周后，灌胃給予氧嗪酸鉀鹽250mg/kg;空白對(duì)照給予等體 積生理鹽水，造模周期7天。
2. 給藥造模期間同時(shí)給藥，在給予氧嗪酸鉀鹽造模/生理鹽水對(duì)照lh后，灌胃給予桑皮苷 單體化合物兩個(gè)劑量10mg/kg、 40mg/kg，別嘌呤醇(Apu) 5 mg/fcg,對(duì)照組給予生理鹽 水。
3. 小鼠處死及組織的保存小鼠灌胃給予桑皮苷/生理鹽水lh后處死，取血，另外注意收集 小鼠的尿液，冰臺(tái)上分離肝臟、腎臟組織，組織經(jīng)液氮冷凍后保存于-8(TC，待測(cè)。
4. 蛋白質(zhì)印跡法(Western-blotting):提取腎臟組織刷狀緣膜蛋白，考馬氏亮藍(lán)法法測(cè)蛋白濃 度，提取蛋白經(jīng)12%的SDS-PAGE膠電泳分離后，PVDF轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1小時(shí)后加 入mURATl抗體(根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)mURATl蛋白序列制備，使用濃度為1:4000) 4'C 孵育過夜，二抗(1:4000)室溫?fù)u床孵育1小時(shí)，HRP-ECL發(fā)光，暗室曝光顯影。膠片 掃描后對(duì)圖片灰度分析。
5. 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR):提取小鼠腎臟組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄到cDNA模板，根 據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)mURATl基因設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行mURATl目的基因擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂 糖凝膠電泳后UV成像，對(duì)圖片進(jìn)行灰度分析。
6. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
(1) MA對(duì)小鼠高尿酸血癥血清尿酸水平的影響，結(jié)果見圖l。，< 0.001, ++P < 0.01, +P < 0.05與空白組比較；***P < 0.001，**P < 0.01, *P < 0.05與模型
組比較
(2) MA對(duì)小鼠高尿酸血癥血清肌酐水平的影響，結(jié)果見圖2。
+++P < 0.001, ++P < 0.01， +P < 0.05與空白組比較；***P < 0.001,**P < 0.01, *P < 0.05與模型
組比較
(3) MA對(duì)小鼠高尿酸血癥尿液尿酸水平的影響，結(jié)果見圖3。
彬P〈0扁,++P<0.01， +P<0.05與空白組比較;***P <0.001，**P< 0.01， *P< 0.05與模型
組比較
(4) MA對(duì)小鼠高尿酸血癥肝臟尿酸水平的影響，結(jié)果見圖4。
掛P〈0細(xì)，++P<0.01， +P<0.05與空白組比較;***P <0.001，**P< 0.01， *P< 0.05與模型
組比較
(5) 蛋白質(zhì)印跡法Western-blotting測(cè)定腎臟mURATl蛋白水平，結(jié)果見圖5。
+++P < 0.001， ++P < 0.01， +P < 0.05與空白組比較；***P < O扁,"P < 0.01，叩< 0.05與模型
組比較
(6) 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測(cè)定腎臟mURATlmRNA水平，結(jié)果見圖6。 +++P<0.001， ,<0.01， +P<0.05與空白組比較;***P< 0.001，**P< 0.01, *P< 0.05與模型
組比較
小結(jié)單體化合物桑皮苷可顯著降低高尿酸血癥模型下動(dòng)物血清尿酸水平、肝臟尿酸水 平和血清肌酐水平，顯著增加模型動(dòng)物尿液尿酸水平，而對(duì)正常動(dòng)物血清尿酸、肝臟尿酸、 血清肌酐、尿液尿酸水平無顯著影響，表明桑皮苷具有降低高尿酸血癥動(dòng)物尿酸和腎保護(hù)作 用損傷，可安全有效地治療和預(yù)防高尿酸血癥和痛風(fēng)。桑皮苷可顯著抑制模型小鼠腎臟 mURATl mRNA和蛋白水平表達(dá)，表明桑皮苷的降尿酸作用與其抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子 mURATl mRNA和蛋白表達(dá)有關(guān)，以增加高尿酸血癥動(dòng)物腎臟尿酸排泄。表明桑皮苷可用來制 備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子mURATl藥物。
權(quán)利要求
1. 桑皮苷在制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的桑皮苷在制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述桑皮苷的重量比含量在98%-100%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的桑皮苷在制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物組合物中的應(yīng)用，其特征 在于所述桑皮苷的重量比含量在99%-100%。
4. 用于制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物的組合物，其中含有制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物 的有效量的桑皮苷化合物和藥學(xué)上可接受的載體；用該化合物作為藥效成分來制備抑制尿 酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物，可單獨(dú)或與制藥可接受的賦形劑等結(jié)合，按照常規(guī)方法制成口服液、 膠囊劑、片劑、顆粒劑、耙向制劑等劑型。
全文摘要
本發(fā)明公開了化合物桑皮苷用于制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物中的新用途，以及該化合物為活性成分的用于制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物組合物。使化學(xué)結(jié)構(gòu)為3-[2-[4-(β-D-葡萄吡喃糖基-氧-2-羥苯基)]-(E)-乙烯基]-5-羥苯基-β-D-葡萄吡喃糖苷的化合物桑皮苷可以在制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物中應(yīng)用。所述的桑皮苷，可從含有該成分的植物、中藥材及中藥飲片中提取出來的，也可通過化學(xué)合成得到。用該化合物作為藥效成分來制備抑制尿酸重吸收轉(zhuǎn)運(yùn)子藥物制劑，可單獨(dú)或與制藥可接受的賦形劑結(jié)合，用常規(guī)的制劑方法制成桑皮苷口服液、膠囊劑、片劑、顆粒劑、靶向制劑等劑型。
文檔編號(hào)A61P43/00GK101502527SQ20091009583
公開日2009年8月12日 申請(qǐng)日期2009年2月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月12日
發(fā)明者葉劍鋒, 孔令東, 憲 張, 星 王, 王彩萍, 胡季強(qiáng), 胡林水, 黃正標(biāo) 申請(qǐng)人:浙江康恩貝制藥股份有限公司;南京大學(xué)