專利名稱：全蝎的活性成分及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到兩種全蝎抗凝血和溶栓的活性成分及其提取分離方法，特別地，涉及仿生酶解的提取方法和凝膠過濾層析分離純化方法。
背景技術(shù)：
全蝎(Bathus ma rtensii kansch)系鉗蝎科節(jié)肢動物干燥物，性辛，味平，有毒， 歸肝經(jīng)。具有通絡(luò)止痛、熄風(fēng)止痙、攻毒散瘀等作用，為臨床常用的抗腫瘤藥，已有研究表明 活體全蝎的主要有效成分為蝎毒，藥材中有效成分仍不清楚，因此目前多以全粉末入藥，存 在著劑量大，易造成微生物污染等弊病。鑒于動物類蛋白質(zhì)、粘多糖等大分子物質(zhì)只有到達(dá) 胃腸道后受消化酶、酸、堿等作用，方可被酶解或者水解成小分子的肽、低聚糖和其他小分 子物質(zhì)，吸收入血而發(fā)生藥效，故生物酶仿生提取方法模擬體內(nèi)消化過程，提取的有效成分 治療效果更佳。凝膠過濾層析又稱為大小排阻、凝膠排阻、分子篩或凝膠過濾層析，根據(jù)蛋白質(zhì)分 子大小不同而達(dá)到分離效果，凝膠過濾填料中含有大量微孔，只允許緩沖液及小分子量蛋 白質(zhì)或肽類通過，而大分子蛋白質(zhì)及一些蛋白復(fù)合物則被阻擋在外；高分子量的肽類在填 料顆粒間隙中流動，比低分子量肽類更早地被洗脫下來，達(dá)到分級分離的目的，且可降低因 不可逆結(jié)合所致的蛋白質(zhì)損失或失活。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供兩種全蝎抗凝血和溶栓的活性成分和其提取分離方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了兩種全蝎抗凝血和溶栓的活性成分，一種活性成分是經(jīng)胃蛋白酶解 得到的產(chǎn)物，另一種活性成分是先經(jīng)胃蛋白酶解，然后再經(jīng)胰蛋白酶解得到的產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述胃蛋白酶解產(chǎn)物中抗凝血的活性成分為小分子肽類。更優(yōu)選地，所述小分子肽類是分子量為850-5300的小分子肽類。本發(fā)明還提供了兩種活性成分的提取方法，它是由以下步驟組成的(1)全蝎藥材細(xì)粉加入人工胃液，密閉，于37°C恒溫水浴作用30分鐘后，加入 3. 0%胃蛋白酶水解3小時，將酶解液置于85°C恒溫水浴作用15分鐘，冷卻至室溫，以 4200r/min離心15分鐘，取上清液，干燥得全蝎胃蛋白酶酶解物；(2)將步驟⑴所得沉淀干燥，繼加入20倍量人工腸液，密閉，于37°C恒溫水浴作 用30分鐘后，加入5%胰蛋白酶水解4小時，將酶解液于85°C恒溫水浴作用15分鐘，冷卻 至室溫，以4200r/min離心15分鐘，取上清液，干燥得全蝎胰蛋白酶酶解物。優(yōu)選地，所述步驟(1)中全蝎細(xì)粉和人工胃液的固液重量體積份比例為1 20。本發(fā)明還提供了全蝎胃蛋白酶解成分的分離純化方法，它是由以下步驟組成的(1)填料的預(yù)處理分別稱取適量葡聚糖凝膠，加大體積水煮沸1小時，自然冷卻 至室溫，反復(fù)傾倒上清液以除去懸浮破碎顆粒；
(2)安裝層析柱層析柱規(guī)格為10mmX30cm，清洗所有組件，垂直安裝在鐵架臺 上，關(guān)閉底部活塞；(3)填裝懸浮填料，使用玻璃棒沿壁連續(xù)緩緩注入填料，并用水灌滿層析柱，打 開底部活塞，沖柱至柱體積恒定，用3倍柱體積磷酸緩沖溶液沖柱；(4)上樣全蝎藥材細(xì)粉加入人工胃液，密閉，于37°C恒溫水浴作用30分鐘后，力口 入3. 0%胃蛋白酶水解3小時，將酶解液置于85°C恒溫水浴作用15分鐘，冷卻至室溫，以 4200r/min離心15分鐘，取上清液，調(diào)整濃度至20mg/mL，上樣2mL，不超過柱體積的10% ；(5)洗脫用磷酸緩沖溶液洗柱，流速1. OmL/min，分管收集； (6)樣品檢測①280納米光吸收法在紫外280nm波長處測定蛋白質(zhì)含量；②考 馬斯亮蘭G-250法在檢測波長595nm處測定蛋白質(zhì)含量。全蝎仿生酶解產(chǎn)物抗凝血和溶栓活性評價本發(fā)明采用活化部分凝血酶時間法(APTT法)和纖維蛋白原平板法對活性成分的 抗凝血和溶栓效果進(jìn)行評價，評價方法如下1 材料1. 1 藥材全蝎為全蟲干燥體(河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司提供)，置干燥箱60°C以下干 燥，粉碎成細(xì)粉，備用。1. 2 試齊[J牛纖維蛋白原(Sigma F8630，購自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；胰蛋 白酶1 250(AmreSCO0458，購自北京華美轉(zhuǎn)導(dǎo)科技有限公司)；胃蛋白酶1 10000(Sigma P7000，購自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；醫(yī)用注射性尿激酶(購自北京市望京 醫(yī)院)；凝血酶(Sigma T4648，購自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；活化部分凝血 酶時間(APTT)試劑10*1. 5ml(購自上海太陽生物試劑公司)；三氯乙酸(分析純，國藥集 團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙醇(分析純)。生理鹽水(稱取氯化鈉9g，加蒸餾水定容至1000ml，搖勻，即得)；人工胃液(取 鹽酸9ml，加蒸餾水稀釋成1000ml，即得)；人工腸液(取0. 2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml， 加0. 2mol/L氫氧化鈉溶液118ml，用水稀釋至1000ml，搖勻，即得)。1. 3 動物健康日本大耳白兔(雄性)，體重約2Kg(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提 供)，符合國家健康一級動物標(biāo)準(zhǔn)。1. 4 儀器UV-2000型分光光度計；800B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；ES-120型電子分 析天平(長沙湘平科技發(fā)展有限公司)；恒溫水浴鍋(余姚市東方電工儀器廠)；DZ-IBC型 真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。2 方法2.1本發(fā)明仿生酶解法(1)全蝎藥材細(xì)粉加入人工胃液(固液重量體積比1 20)，密閉，于37°C恒溫水 浴作用30min后，加入3. 0%胃蛋白酶水解3h，將酶解液置于85°C恒溫水浴作用15min，冷 卻至室溫，以4200r/min離心15min，取上清液，干燥得全蝎胃蛋白酶酶解物；
(2)將步驟(1)中沉淀干燥，繼加入20倍量人工腸液，密閉，于37°C恒溫水浴作用 30min后，加入5%胰蛋白酶水解4h，將酶解液于85°C恒溫水浴作用15min，冷卻至室溫，以 4200r/min離心15min，取上清液，干燥得全蝎胰蛋白酶酶解物。2. 2水提醇沉法 稱取2g全蝎藥材細(xì)粉于50ml圓底燒瓶，加入8倍量蒸餾水，煎煮lh，紗布濾出煎 煮液；藥渣再加6倍量蒸餾水，煎煮兩次，每次30min，合并3次濾出液，水浴濃縮至藥液比 為1 1，攪拌加入95%乙醇至含醇量為70%，置冰箱中放置過夜后4200r/min離心20min， 取上清液揮干，60°C真空干燥稱重，得全蝎水提醇沉物。2. 3生理鹽水浸提法稱取2g全蝎藥材細(xì)粉于50ml圓底燒瓶，加入40ml生理鹽水，于37°C恒溫水浴鍋 浸提4h，4200r/min離心15min，取上清液，60°C真空干燥稱重，得全蝎生理鹽水浸提物。2. 4復(fù)合酶解法稱取2g全蝎藥材細(xì)粉于50ml圓底燒瓶，加入40ml人工胃液，密閉于37°C水浴鍋 30min后加入60mg胃蛋白酶水解，3h后用Imol/mlNaOH溶液調(diào)節(jié)酶解液的pH = 6. 8，加入 IOOmg胰蛋白酶酶解4h，于85°C水浴滅酶15min，4200r/min離心15min，取上清液，60°C真 空干燥稱重，得干燥復(fù)合酶解物。3實驗結(jié)果3. 1樣品液的制備精密稱取各種提取方法所得提取物適量，加入320 μ 1生理鹽水，制成濃度為 250mg(生藥量)/320μ 1 的樣品(即 0. 7813mg/μ 1)。3. 2ΑΡΤΤ 法3. 2. 1血漿的制備選用雄性日本大耳白兔，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉，頸動脈取血，加入3. 8% 枸櫞酸鈉抗凝(1 9)，混勻后以3000r/min，離心15min，取上清液，分離出貧血小板血漿 (PPP)。3. 2. 2測定步驟取PPP100 μ 1于測試槽中，加樣品液10 μ 1預(yù)溫5min和已預(yù)溫IOmin的APTT試 劑100 μ 1，孵育5min后加入預(yù)溫15min的CaCl2IOO μ 1，同時計時，用針尖撥動溶液，當(dāng)有 絲狀凝結(jié)物被針挑起時，記錄時間?？瞻讓φ战M按上述方法取PPP 100 μ 1，加入10 μ 1生理鹽水和100 μ 1 APTT試 齊U，孵育5min后加入預(yù)溫15min的CaCl2IOOy 1，同時計時，記錄凝結(jié)時間。每個樣品平行 做6份。結(jié)果見表1。表1各種提取液APTT抗凝藥效考察(x±S, n=6) 與水提醇沉組比較，*P< 0.05通過全蝎5種提取物的抗凝實驗效果比較，結(jié)果表明酶解組優(yōu)于傳統(tǒng)溶劑提取 組，其中仿生酶解組抗凝效果最優(yōu)，證明方法可行，并且提取的有效成分抗凝血效果最好。3. 3纖維蛋白原平板法纖維蛋白原在凝血酶加入后形成了凝固的纖維蛋白平板。當(dāng)加入含有纖溶酶原激 活劑的樣品后，纖溶酶原激活劑激活平板中的纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，纖溶酶再水解纖維 蛋白，從而在凝固的纖維蛋白中形成液狀的溶解圈。3. 3. 1試液的配制磷酸緩沖液(PBS)稱取3. 12g磷酸二氫鈉，加蒸餾水定容到100ml，即得A液； 稱取磷酸氫二鈉7. 1632g，加蒸餾水定容到100ml，即得B液；使用時，取A液760 yl、B液 3240 u 1加入76ml生理鹽水，即得磷酸緩沖液。纖維蛋白原溶液稱取纖維蛋白原0. 3g加入60mlPBS，振搖，溶解，即得。3. 3. 2纖維蛋白平板的制備在平皿內(nèi)加入9mL 5g L—1的纖維蛋白原溶液，再加入2X 10、 L—1的凝血酶溶 液lmL，立即打旋混勻大約10s，即形成1mm厚的纖維蛋白凝塊，在平皿上蓋加濾紙，在水平 處放4h后即形成纖維蛋白平板。3. 3. 3加熱纖維蛋白平板的制備取已制的纖維蛋白平板，置于85°C烘箱內(nèi)烘30min，冷卻后即為加熱纖維蛋白平 板。3. 3. 4測定步驟將樣品液、尿激酶(6X10、-L-1)和生理鹽水各10 PL分別點在纖維蛋白平板上， 各點間距大于1. 5cm。置纖維蛋白平板于濕盒內(nèi)，放入37°C烘箱中，4h后觀察有無溶解圈， 并測量溶解圈的直徑，計算溶解圈面積，以溶解圈面積大小衡量纖溶活性的大小。見表2和 表3o溶解圈面積(mm2)=[(長徑+短徑)/4]2 X ji。表2纖維蛋白平溶栓實驗結(jié)果(n = 4) 上表可以看出，全蝎酶解法優(yōu)于傳統(tǒng)提取方法，其中仿生酶解法所得的胃酶酶解 部分和胰酶酶解部分有明顯溶解圈，進(jìn)一步證明仿生酶解法可行。表3全蝎仿生酶解物纖維蛋白平板溶栓實驗結(jié)果(n = 4) 可以看出，胃蛋白酶酶解物及其原液、胰酶酶解物的溶解圈明顯；將胃蛋白酶解物 PH從1. 96調(diào)至5左右時，無明顯溶栓作用，表明仿生酶解模擬體內(nèi)消化過程的必要性。4 結(jié)論4. 1APTT試驗結(jié)果表明全蝎的各種提取方法所得提取物均能在一定程度上延長APTT作用時間，其中仿 生酶解法所得的胃酶酶解部分和胰酶酶解部分APTT時間最長，故仿生酶解法可行。4. 2纖維蛋白原平板試驗結(jié)果表明仿生酶解法所得的胃酶酶解部分和胰酶酶解部分較其他提取物的溶解圈明顯增 大，證明仿生酶解的工藝方案可行。其原因是仿生酶解法模擬了動物藥口服后體內(nèi)消化過 程，將動物體大分子蛋白經(jīng)胃腸環(huán)境降解為小分子物質(zhì)，使有效部分顯露其活性效應(yīng)。胃酶 酶解原液部分還有活性，表明進(jìn)一步用胰酶酶解的必要性。凝膠過濾層析分離得到的活性成分抗凝血活性評價1 材料
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1. 1 藥材全蝎胃蛋白酶酶解液1.2試劑與材料牛血清白蛋白(Sigma A7906，購自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)；APTT 試劑10X1. 5ml (購自上海太陽生物試劑公司)；乙醇(分析純)；屈臣氏純凈水(廣州屈臣 氏食品飲料有限公司)；葡聚糖凝膠G-100(購自北京環(huán)亞泰克生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司)。生理鹽水(稱取氯化鈉9g，加蒸餾水定容至1000ml，搖勻，即得)；磷酸緩沖 液(PBS)稱取3. 12g磷酸二氫鈉，加蒸餾水定容到100ml，即得A液；稱取磷酸氫二鈉 7. 1632g，加蒸餾水定容到100ml，即得B液；使用時，取A液22. 8ml,B液97. 2ml加入2280ml 生理鹽水，即得磷酸緩沖液2. 4L，層析柱10mmX30cm(購自北京匯?？苾x科技有限公司)。1. 3 動物健康日本大耳白兔(雄性)，體重約2Kg，均由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公 司提供，符合國家健康一級動物標(biāo)準(zhǔn)。1. 4 儀器UV-2000型分光光度計；800B型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；ES-120型電子分 析天平(長沙湘平科技發(fā)展有限公司)；恒溫水浴鍋(余姚市東方電工儀器廠)；DZ-1BC型 真空干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，MALDI-T0F-MASS質(zhì)譜儀(于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部 測定)。2.方法與結(jié)果2. 1葡聚糖凝膠層析2. 1. 1填料的預(yù)處理分別稱取適量葡聚糖凝膠G-100，加大體積水煮沸l(wèi)h。自然冷卻至室溫，反復(fù)傾倒 上清液以除去懸浮破碎顆粒。2. 1. 2安裝層析柱選擇lOmmX 30cm層析柱，清洗所有組件。垂直安裝在鐵架臺上，關(guān)閉底部活塞2. 1. 3 填裝懸浮填料，使用玻璃棒沿壁連續(xù)緩緩注入填料，并用水灌滿層析柱，打開底部活 塞，沖柱至柱體積恒定，用3倍柱體積磷酸緩沖溶液沖柱。2. 1. 4 上樣全蝎藥材細(xì)粉加入人工胃液，密閉，于37°C恒溫水浴作用30分鐘后，加入3. 0%胃 蛋白酶水解3小時，將酶解液置于85°C恒溫水浴作用15分鐘，冷卻至室溫，以4200r/min離 心15分鐘，取上清液，調(diào)整濃度至20mg/mL，上樣2mL，不超過柱體積的10% ；2. 1.5 洗脫用磷酸緩沖液洗柱，流速1. Oml/min，分管收集。2. 1.6樣品檢測2. 1. 6. 1280 納米(A280)光吸收法由于蛋白質(zhì)分子中常含酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在紫外280nm波長 處有最大吸收峰，其吸收值與蛋白質(zhì)濃度成正比，故以此法來測定蛋白質(zhì)含量2. 1. 6. 2考馬斯亮蘭G-250法
基于考馬斯亮蘭G-250有紅、藍(lán)兩種不同顏色的形式。在一定濃度的乙醇及酸性 條件下，可配成淡紅色的溶液，當(dāng)與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反應(yīng)迅速而穩(wěn)定。反應(yīng) 化合物在465 595mn處有最大的光吸收值，化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比 關(guān)系，因此可檢測595nm的光吸收值的大小來測定蛋白質(zhì)含量。2. 1.6. 3結(jié)果與結(jié)論葡聚糖凝膠G-100層析圖譜有2個峰，峰1呈黃色，峰2為無色色。第一洗脫峰為 分子量大的部分，峰略低，含量較少；第二洗脫峰為分子量中等的部分，峰高且寬，含量多， 具體見圖1。葡聚糖凝膠G-100的分離范圍是200-12X 105。2. 2APTT抗凝血藥效實驗2. 2.1樣品的制備洗脫流分按紫外測定結(jié)果合并富集，真空干燥，精密稱取各樣品干燥物適量，加入 相應(yīng)生理鹽水，制成濃度為250mg(生藥量)/320iU的樣品(即0. 781 3mg/u 1)。2. 2. 2血漿的制備選用雄性日本大耳白兔，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉，頸動脈取血，加入3. 8 % 枸櫞酸鈉抗凝(1 9)，混勻后以3000r/min，離心15min，取上清液，分離出貧血小板血漿 (PPP)。2. 2. 3測定步驟取PPPlOOiil于測試槽中，加樣品液lOiil預(yù)溫5min和已預(yù)溫lOmin的APTT試 劑lOOiil，孵育5min后加入預(yù)溫15min的CaCl2100 yl，同時計時，用針尖撥動溶液，當(dāng)有 絲狀凝結(jié)物被針挑起時，記錄時間。空白對照組按上述方法取PPP 100 u 1，加入10 u 1生理鹽水和100 u 1 APTT試 劑，孵育5min后加入預(yù)溫15min的CaCl2100iil，同時計時，記錄凝結(jié)時間。每個樣品平行 做6份。2. 2. 4實驗結(jié)果抗凝藥效實驗結(jié)果見表4。表4全蝎蛋白純化APTT抗凝藥效考察(n = 6) 與生理鹽水組比較，*P< 0.05。通過以上抗凝實驗藥效的比較，可以看出全蝎胃蛋白酶酶解物凝膠層析所收集的 兩部分與胃酶酶解部分抗凝效果相當(dāng)，確定為活性部位。2. 3葡聚糖凝膠G-100所得組分的質(zhì)譜分析結(jié)果采用MALDI-T0F-MASS (基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜)對全蝎蛋白活性部位進(jìn)行檢測，以確定其活性部位的分子量分布范圍，通過分析質(zhì)譜圖，結(jié)果表明活性部位分 子量分布在850 5300之間，且為小分子肽類。3 結(jié)論3. 1可以看出全蝎胃蛋白酶酶解物凝膠層析所收集的兩部分與胃酶酶解部分抗凝 血效果相當(dāng)，確定為活性部位。3. 2MAILDIA-T0F-MASS質(zhì)譜結(jié)果表明，全蝎抗凝血活性部位分子量分布在850 5300，為小分子肽類，且抗凝血效果明顯(P < 0. 05)。


圖1 :S印hadex G-100層析圖譜有2個峰，峰1呈黃色，峰2為無色色。第一洗脫 峰為分子量大的部分，峰略低，含量較少；第二洗脫峰為分子量中等的部分，峰高且寬，含量
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具體實施例實施例1、全蝎抗凝血和溶栓有效成分提取方法(1)全蝎藥材細(xì)粉加入人工胃液(固液重量體積比1 20)，密閉，于37°C恒溫水 浴作用30min后，加入3. 0%胃蛋白酶水解3h，將酶解液置于85°C恒溫水浴作用15min，冷 卻至室溫，以4200r/min離心15min，取上清液，干燥得全蝎胃蛋白酶酶解物；(2)將步驟(1)中沉淀干燥，繼加入20倍量人工腸液，密閉，于37°C恒溫水浴作用 30min后，加入5%胰蛋白酶水解4h，將酶解液于85°C恒溫水浴作用15min，冷卻至室溫，以 4200r/min離心15min，取上清液，干燥得全蝎胰蛋白酶酶解物。2、凝膠過濾層析法分離純化全蝎抗凝血活性成分(1)填料的預(yù)處理稱取適量葡聚糖凝膠G-100，加大體積水煮沸1小時。自然冷 卻至室溫，反復(fù)傾倒上清液以除去懸浮破碎顆粒。(2)安裝層析柱選擇lOmmX 30cm層析柱，清洗所有組件，垂直安裝在鐵架臺上， 關(guān)閉底部活塞(3)填裝懸浮填料，使用玻璃棒沿壁連續(xù)緩緩注入填料，并用水灌滿層析柱，打 開底部活塞，沖柱至柱體積恒定，用3倍柱體積磷酸緩沖溶液沖柱。(4)上樣全蝎藥材細(xì)粉加入人工胃液(固液重量體積比1 20)，密閉，于37°C 恒溫水浴作用30min后，加入3. 0%胃蛋白酶水解3h，將酶解液置于85°C恒溫水浴作用 15min，冷卻至室溫，以4200r/min離心15min，取上清液，調(diào)整濃度至20mg/mL，上樣2mL，不 超過柱體積的10%。(5)洗脫用磷酸緩沖液洗柱，流速1. Oml/min，分管收集。(6)樣品檢測①280納米光吸收法在紫外280nm波長處測定蛋白質(zhì)含量；②考 馬斯亮蘭G-250法在檢測波長595nm處測定蛋白質(zhì)含量。評價結(jié)果(1)、相比其他傳統(tǒng)提取工藝，仿生酶解法所得的胃酶酶解部分和胰酶酶解部分中 的有效成分，抗凝血和溶栓效果具有顯著性差異。(2)、凝膠過濾層析法分離純化全蝎抗凝血活性成分可行，其活性部位分子量分布在850 5300，為小分子肽類，且抗凝血效果明顯。
權(quán)利要求
兩種全蝎抗凝血和溶栓的活性成分，其特征在于一種活性成分是經(jīng)胃蛋白酶解得到的產(chǎn)物，另一種活性成分是先經(jīng)胃蛋白酶解，然后再經(jīng)胰蛋白酶解得到的產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩種活性成分，其特征在于，它們的提取方法是由以下步驟 組成的(1)全蝎藥材細(xì)粉加入人工胃液，密閉，于37°C恒溫水浴作用30分鐘后，加入3.0%胃 蛋白酶水解3小時，將酶解液置于85°C恒溫水浴作用15分鐘，冷卻至室溫，以4200r/min離 心15分鐘，取上清液，干燥得全蝎胃蛋白酶酶解物；(2)將步驟(1)所得沉淀干燥，繼加入20倍量人工腸液，密閉，于37°C恒溫水浴作用 30分鐘后，加入5%胰蛋白酶水解4小時，將酶解液于85°C恒溫水浴作用15分鐘，冷卻至室 溫，以4200r/min離心15分鐘，取上清液，干燥得全蝎胰蛋白酶酶解物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的兩種活性成分，其特征在于，所述提取方法步驟(1)中全蝎細(xì) 粉和人工胃液的固液重量體積比為1 20。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩種活性成分，其特征在于，它們的分離純化方法是由以下 步驟組成的(1)填料的預(yù)處理分別稱取適量葡聚糖凝膠，加大體積水煮沸1小時，自然冷卻至室 溫，反復(fù)傾倒上清液以除去懸浮破碎顆粒；(2)安裝層析柱層析柱規(guī)格為10mmX30cm，清洗所有組件，垂直安裝在鐵架臺上，關(guān) 閉底部活塞；(3)填裝懸浮填料，使用玻璃棒沿壁連續(xù)緩緩注入填料，并用水灌滿層析柱，打開底 部活塞，沖柱至柱體積恒定，用3倍柱體積磷酸緩沖溶液沖柱；(4)上樣全蝎藥材細(xì)粉加入人工胃液，密閉，于37°C恒溫水浴作用30分鐘后，加 入3. 0%胃蛋白酶水解3小時，將酶解液置于85°C恒溫水浴作用15分鐘，冷卻至室溫，以 4200r/min離心15分鐘，取上清液，調(diào)整濃度至20mg/mL，上樣2mL，不超過柱體積的10% ；(5)洗脫用磷酸緩沖溶液洗柱，流速1.OmL/min，分管收集；(6)樣品檢測①280納米光吸收法在紫外280nm波長處測定蛋白質(zhì)含量；②考馬斯 亮蘭G-250法在檢測波長595nm處測定蛋白質(zhì)含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性成分，其特征在于，所述胃蛋白酶解產(chǎn)物中抗凝血的活 性成分為小分子肽類。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的活性成分，其特征在于，所述小分子肽類是分子量為 850-5300的小分子肽類。
全文摘要
本發(fā)明公開了兩種全蝎的活性成分及其應(yīng)用。本發(fā)明通過特殊的仿生酶解法對全蝎進(jìn)行了提取，并且用凝膠過濾層析法對胃蛋白酶解成分進(jìn)行了分離。實驗證實，相對于傳統(tǒng)的提取工藝，本發(fā)明所用仿生酶解法，得到的活性成分抗凝血和溶栓的效果更加明顯，凝膠過濾層析法分離全蝎胃蛋白酶解成分，得到的抗凝血活性成分為小分子肽類。
文檔編號A61P7/02GK101862350SQ20091007413
公開日2010年10月20日 申請日期2009年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月14日
發(fā)明者張玉杰, 王玉蓉, 許文博, 趙韶華, 黃能聽 申請人:河北以嶺醫(yī)藥研究院有限公司