專利名稱：：一種抗人IL-13Rα2單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種單克隆抗體，特別涉及一種抗人IL-13Roc2單克隆抗體(FMMU-IL-13Rot2-7)的重鏈和輕鏈可變區(qū)，包括其氨基酸序列及其核苷酸序列。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是危害人類健康的重大疾病，針對(duì)其的治療手段目前仍處于研究和探索階段。繼傳統(tǒng)的手術(shù)治療、放療、化療和免疫治療之后，以結(jié)合基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)為代表的靶向抗體藥物治療正成為治療腫瘤的新興研究領(lǐng)域，受到基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域科研工作者的廣泛關(guān)注。人IL-13Ra2是特異性高表達(dá)于人神經(jīng)膠質(zhì)瘤、頭頸部腫瘤、卵巢癌和腎癌等惡性腫瘤細(xì)胞表面的腫瘤特異性標(biāo)志物，在惡性腫瘤的靶向治療中發(fā)揮重要作用。人IL-13Rct2作為人神經(jīng)膠質(zhì)瘤、頭頸部腫瘤、卵巢癌和腎癌等惡性腫瘤細(xì)胞的治療耙點(diǎn)早在1988年已引起美國FDA的注意，該組織先后制備了針對(duì)人IL-13Ra2治療靶點(diǎn)的藥物IL-13-PE38和針對(duì)人IL-13Ra2的單鏈抗體ScFv-PE融合分子。盡管IL-13-PE38已在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、頭頸部腫瘤、卵巢癌和腎癌等惡性腫瘤細(xì)胞的治療中取得了療效并已被美國FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床I/II期治療，但由于在治療腫瘤過程中，IL-13-PE38不僅與腫瘤細(xì)胞表面特異性表達(dá)的人IL-13Ra2結(jié)合，它還可以與表達(dá)于正常組織細(xì)胞表面的IL-13Rocl結(jié)合，損傷正常組織和細(xì)胞。由于缺乏嚴(yán)格的耙向性，限制了IL-13-PE38的進(jìn)一步應(yīng)用。為解決針對(duì)人IL-13Roc2的特異性靶向問題，美國FDA應(yīng)用噬菌體展示庫技術(shù)獲得針對(duì)人IL-13Roc2的單鏈抗體，進(jìn)而構(gòu)建IL-13Rot2(ScFv)-PE38真核表達(dá)載體并表達(dá)獲得了人源化的IL-13Roc2(ScFv)-PE38抗體制劑，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)該分子與人IL-13Ra2親和力較低，需要大劑量使用才能達(dá)到有效的殺傷腫瘤細(xì)胞的效果?？贵w單體分子是由兩條相同的重鏈(H鏈)和兩條相同的輕鏈(L鏈)，通過鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結(jié)構(gòu)。H鏈和L鏈包括氨基(N)端和羧基(C)端，靠近N端的可變區(qū)(V區(qū))由高變區(qū)/互補(bǔ)決定區(qū)(HVR/CDR)和骨架區(qū)(FR)組成；靠近C端為恒定區(qū)(C區(qū))。重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)形成的蛋白質(zhì)折疊是抗原結(jié)合部位，其中的CDR/HVR是抗體與抗原決定基互補(bǔ)結(jié)合的部位，C區(qū)引發(fā)抗原抗體識(shí)別后的反應(yīng)?？贵w根據(jù)FR/C區(qū)不同可分為人源、鼠源等，鼠源性抗體在人體內(nèi)使用時(shí)具有免疫原性，易引起人體的免疫反應(yīng)，這些免疫反應(yīng)可引起對(duì)鼠源性抗體的清除以及免疫復(fù)合物介導(dǎo)的超敏反應(yīng)。為了克服鼠源性抗體的缺陷，需要構(gòu)建高親和力的特異性的嵌合抗體、單鏈抗體或人源化抗體。在構(gòu)建人源化抗體過程中，采用噬菌體抗體庫等技術(shù)獲得的人源化抗體親和力不高，使用劑量大。為提高抗體的親和力，最為重要的是獲得具有良好特異性和親和力的鼠源性親本抗體，克隆其輕鏈和重鏈可變區(qū)基因，然后將可變區(qū)基因克隆入相應(yīng)載體構(gòu)建相應(yīng)的基因工程抗體重組DNA，表達(dá)基因工程抗體來實(shí)現(xiàn)人源化。因此，篩選出特異性分泌高親和力鼠源性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞克隆，從中克隆出高親和力抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，分析其氨基酸序列對(duì)進(jìn)一步構(gòu)建高親和力和特異性的人源化基因工程抗體具有決定性的意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于，提供一種高親和力的抗人IL-13Ra2單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)，包括其基因及其氨基酸序列，為構(gòu)建高親和力的抗人IL-13Ra2嵌合或人源化基因工程抗體提供支持。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是(1)制備一組小鼠抗人IL-13Ra2單克隆抗體，從中篩選出具有高親和力的抗人IL-13Ra2單克隆抗體FMMU-IL-13Ra2-7;實(shí)驗(yàn)證實(shí)該單克隆抗體能夠特異性地結(jié)合人IL-13Ra2，所述的證實(shí)實(shí)驗(yàn)包括ELISA檢測、流式細(xì)胞儀檢測及病理切片免疫組織化學(xué)檢測；(2)克隆該單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因；所述的單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因序列分別如SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示；(3)獲得該單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因序列和氨基酸序列，確認(rèn)該基因序列和相應(yīng)蛋白序列的惟一性；所述的單克隆抗體可變區(qū)氨基酸序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示，并分析出其CDR區(qū)；輕鏈的3個(gè)CDR序列分別為，CDR1:Gln-Ser-Leu-Val-His-Ser-Asp-Gly-Asn-Thr-Tyr，CDR2:Thr-Val-Ser，CDR3:Ser-Gln-Cys-Thr-His-Val-Pro-Phe-Thr;重鏈的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列分別為，CDR1:Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asn-Tyr-Trp，CDR2:lie-Tyr-Pro—Gly—Asn-Asp-Asp-Ser，CDR3:Ala-Thr-Gly-Thr-Glu-Phe-Thr-Tyro(4)設(shè)計(jì)構(gòu)建以人IL-13Ra2為靶點(diǎn)的基因工程抗體或疫苗。本發(fā)明的技術(shù)效果本發(fā)明篩選出高親和力抗人IL-13Roc2的單克隆抗體FMMU-IL-13Rcc2-7，并克隆出其輕鏈和重鏈可變區(qū)，測序后得到其獨(dú)特的核苷酸序列，為構(gòu)建具有良好藥用價(jià)值的抗人IL-13Roc2嵌合抗體、單鏈抗體或人源化抗體奠定了基礎(chǔ)。圖1是抗人IL-13Ra2單克隆抗體FMMU-IL-13Ra2-7與膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251表面人IL-13Ra2結(jié)合的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果圖(FITC:異硫氰酸熒光素，橫軸為細(xì)胞數(shù)，縱軸為熒光強(qiáng)度)；圖la為抗葡萄球菌腸毒素D(SED)單克隆抗體對(duì)照?qǐng)D，圖lb為FMMU-IL-13Ra2-7單抗結(jié)果圖。圖2是抗人IL-13Roc2單克隆抗體FMMU-IL-13Ra2-7與膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87表面人IL-13Ra2結(jié)合的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果圖；圖2a為SED對(duì)照?qǐng)D，圖2b為FMMU-IL-13Ra2-7單抗結(jié)果圖。圖3是抗人IL-13Ra2單克隆抗體(FMMU-IL-13Ra2-7)檢測膠質(zhì)瘤石蠟切片中人IL-13Ra2表達(dá)的免疫組織化學(xué)染色圖。具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明?？勺儏^(qū)基因的完整核苷酸序列，尤其是其功能性片段的核苷酸序列(如CDR等)以及抗體可變區(qū)的氨基酸序列，是嵌合抗體、單鏈抗體或人源化抗體構(gòu)建的基礎(chǔ)。為此，申請(qǐng)人用重組人IL-13Ra2免疫BALB/c小鼠，制備了一組小鼠抗人IL-13Roc2單克隆抗體，克隆并從中篩選出能分泌高親和力人IL-13Ra2單克隆抗體FMMU-IL-13Ra2-7的雜交瘤細(xì)胞株，該株雜交瘤細(xì)胞具有穩(wěn)定分泌抗體的能力?？寺≡搯慰寺】贵w輕鏈和重鏈可變區(qū)基因；所述的單克隆抗體可變區(qū)基因序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；獲得該單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因序列和氨基酸序列，確認(rèn)該基因序列和相應(yīng)蛋白序列的惟一性及其CDR序列；所述的單克隆抗體可變區(qū)氨基酸序列如SEQIDNO.l和SEQIDNO.2所示.本發(fā)明具體按以下步驟實(shí)施1小鼠抗人IL-13Ra2高親和力抗體的制備1.1單克隆抗體的制備、純化重組人IL-13R(x2分子委托武漢三鷹生物技術(shù)有限公司制備。按單克隆抗體制備方法(細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第一版,P9-P17)，用重組人IL-13Ra2免疫BALB/c小鼠(購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，制備一組小鼠抗人IL-13Ra2單克隆抗體，從雜交瘤細(xì)胞株FMMU-IL-13Ra2-l14中選擇能分泌高親和力的抗人IL-13Ra2單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)FMMU-IL-13Ra2-7雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗體具有較高的親和力及與細(xì)胞表面天然表達(dá)的人IL-13Ra2分子結(jié)合的能力。按小鼠腹水制備方法制備腹水(細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)第一版,P9-P17)。腹水經(jīng)硫酸銨沉淀后，采用ProteinA親和層析法純化。用SDS-PAGE鑒定純化抗體的純度，純化的抗體FMMU-IL-13Ra2-7純度達(dá)到95%。1.2抗人IL-13Ra2單克隆抗體效價(jià)測定實(shí)驗(yàn)用IgG亞類檢測試劑盒(美國Sigma公司)分別檢測制備的FMMU-IL-13Ra2-l~14單克隆抗體的IgG亞類，間接ELISA法(細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，第一版，P44-46)檢測FMMU-IL-13Ra2-l14雜交瘤細(xì)胞株的腹水效價(jià)。以重組人IL-13Rct2為抗原，檢測FMMU-IL-13Roc2-l14單克隆抗體在免疫印跡法(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，P888-P897)中結(jié)合抗原的能力。用流式細(xì)胞術(shù)(細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，第一版，P78-P89)檢測FMMU-IL-13Roc2-l14單克隆抗體識(shí)別高表達(dá)人IL-13Rot2的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞上天然IL-13Ra2的能力。腹水效價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，第7、14雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的腹水效價(jià)最高，為l(T7，表明其與抗原親和力很高；將上述兩株單克隆抗體用于免疫印跡實(shí)驗(yàn)均得到陽性結(jié)果。但第14株雜交瘤細(xì)胞株不能在流式細(xì)胞術(shù)檢測中獲得陽性結(jié)果，表明其可能不能識(shí)別細(xì)胞表面的天然IL-13Ra2分子。而第7株雜交瘤細(xì)胞株則能夠識(shí)別細(xì)胞表面的天然IL-13Roc2分子，利用其可變區(qū)制備的基因工程抗體更有可能與細(xì)胞表面的天然IL-13Rot2結(jié)合并進(jìn)一步發(fā)揮生物學(xué)作用。表1人IL-13Roc2單抗的效價(jià)鑒定<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>1.3抗人IL-13Rot2單克隆抗體FMMU-IL-13Ra2-7與膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87表面人IL-13R(x2結(jié)合采用間接免疫熒光染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測FMMU-IL-13Roc2-7單抗與膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87表面天然IL-13Roc2分子的結(jié)合能力(細(xì)胞和分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，第一版，P78-80)，以FMMU-IL-13Roc2-7為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記羊抗小鼠抗體為二抗，流式細(xì)胞儀分析。如圖l、2所示，與SED對(duì)照相比，F(xiàn)MMU-IL-13Ra2-7單抗與高表達(dá)人IL-13Roc2的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系結(jié)合能力明顯增強(qiáng)，說明FMMU-IL-13Roc2-7單抗特異性識(shí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面的IL-13Ra2分子。1.4抗人IL-13Ra2單克隆抗體FMMU-IL-13Ra2-7檢測膠質(zhì)瘤切片中人IL-13Ra2的表達(dá)以FMMU-IL-13Ra2-7單克隆抗體為一抗，用免疫組織化學(xué)方法(病理學(xué)技術(shù)，第一版，P367-372)檢測FMMU-IL-13Ra2-7識(shí)別膠質(zhì)瘤石蠟切片中人IL-13Ra2的能力。如圖3所示，可見FMMU-IL-13Ra2-7單克隆抗體可特異性識(shí)別膠質(zhì)瘤腫瘤細(xì)胞表面的人IL-13Ra2分子。2人IL-13Ra2mAb輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的克隆2.1FMMU-IL-13Ra2-7雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)按常規(guī)方法復(fù)蘇(細(xì)胞培養(yǎng)，第一版，P88)FMMU-IL-13Ra2-7細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基于37°C，5%C02孵箱中培養(yǎng)。2.2總RNA的提取和cDNA第一鏈的合成用TRIZOLReagent(購自美國GIBCO公司)，按說明書提取總RNA。cDNA第一鏈合成試劑盒購自Fermentas公司(美國)，按產(chǎn)品說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。2.3PCR法擴(kuò)增FMMU-IL-13Ra2-7VL和FMMU-IL-13Rcx2-7Vh基因PCR法擴(kuò)增試劑盒購自Takara公司，以cDNA第一鏈為模板進(jìn)行PCR。反應(yīng)體積50pl，反應(yīng)條件為95°C30s,58'Clmin，循環(huán)35次；VL、Vh的正、反向引物核苷酸序列為VLF:ggggatatccaccatgaagttgcctgttaggctgttgVLB:gcgccgtctagaattaacactcattcctgttgaaVHF:tgaggagacggtgaccgtggtcccttggccccagVhB:aggtsmarctgcagsagtcwgg(IUB標(biāo)準(zhǔn)兼并堿基代碼s:c/g;m:a/c;r:a/g;w:aA)2.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和篩選PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，用小量膠回收試劑盒(購自美國Axygen公司)回收抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)片段，用pMD18T試劑盒(購自日本Takara公司)將該片段按說明書插入pMD18T載體中。轉(zhuǎn)化E.coliXL-10(購自北京中國普通微生物菌種保藏中心)，用五co/I和I限制性核酸內(nèi)切酶(購自Takara公司)消化法篩選重組陽性克隆(酶切得到400bp片段)。用雙脫氧核酸末端終止法測定基因序列，由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成，測定結(jié)果如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示。3FMMU-IL-13Rct2-7輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列及同源性分析3.1確定測序無誤后，在GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行核苷酸序列同源性分析(Blastn)。分析結(jié)果表明，F(xiàn)MMU-IL-13Rot2-7單抗輕鏈可變區(qū)基因與小鼠抗血紅蛋白3C4單克隆抗體免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)同源性最高，同源性為319/336，同源性百分比為94%，(見BLASTNl，說明書第13頁)；FMMU-IL-13Roc2-7單抗重鏈可變區(qū)基因與小鼠IgP鏈B2基因V-D-J1區(qū)同源性最高，同源性為319/355，同源性百分比為89%,(見BLASTN2,說明書第14頁)。3.2將可變區(qū)基因翻譯成氨基酸序列，如SEQIDNO.l和SEQIDN0.2所示。在non-redundantGenbankCDStranslations+PDB+SwissProt+PIR+PRF蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中,進(jìn)行氨基酸序列同源性分析(Blastp)。分析結(jié)果表明，F(xiàn)MMU-IL-13Rot2-7單抗輕鏈氨基酸序列與免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(gb|AAA85498.1|)同源性最高，同源性為107/112，同源性百分比為95%，(見BLASTP3,說明書第15頁)；FMMU-IL-13Ra2-7單抗重鏈氨基酸序列與小鼠抗獨(dú)特性抗體重鏈同源性最高，同源性為105/117，同源性百分比為89%(見BLASTP4,說明書第16頁)。編碼FMMU-IL-13Ra2-7mAb的輕鏈和重鏈可變區(qū)的基因的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析結(jié)果表明未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明相同的基因序列。3.3利用IMGT/V-QUEST分析可變區(qū)結(jié)構(gòu)，確定CDR區(qū)。將測序所得FMMU-IL-13Ra2-7抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)序列，在IMGT/V-QUEST網(wǎng)站(http:〃imgt.cines.fr/IMGT—vquest/vquest)分析，得出其CDR區(qū)。FMMU-IL-13Rot2-7抗體輕鏈CDR區(qū)CDR1:Gln-Ser-Leu-Val-His-Ser-Asp-Gly-Asn-Thr-TyrCDR2:Thr-Val-SerCDR3:Ser-Gln-Cys-Thr-His-Val-Pro-Phe-ThrFMMU-IL-13Ra2-7抗體重鏈CDR區(qū)CDR1:Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asn-Tyr-TrpCDR2:Ile-Tyr-Pro隱Gly-Asn-Asp-Asp畫SerCDR3:Ala-Thr畫Gly-Thr陽Glu-Phe-Thr-Tyr4.基因工程抗體設(shè)計(jì)基于抗人IL-13Ra2單克隆抗體FMMU-IL-13Ra2-7的表達(dá)、純化以及序列分析，設(shè)計(jì)構(gòu)建以下生物制品(1)抗人IL-13Ra2單鏈抗體的構(gòu)建將本發(fā)明的單克隆抗體FMMU-IL-13Ra2-7的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因插入表達(dá)載體pCONTAB5E中，獲得的單鏈抗體基因轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株，通過誘導(dǎo)該基因的表達(dá)，制備對(duì)惡性腫瘤有潛在治療作用的單鏈抗體。(2)人源化抗體的構(gòu)建將本發(fā)明的單克隆抗體FMMU-IL-13Ra2-7輕鏈和重鏈可變區(qū)的CDR區(qū)移植到人源可變區(qū)的FR中，形成CDR移植抗體(CDR-graftedantibody)也稱重構(gòu)抗體(reshapingantibody)或人源化抗體(humanizedantibody)。禾'J用CDR移植技術(shù)改造抗體，可以獲得保持鼠源性親本mAb的特異性，同時(shí)更加接近人抗體的新型抗體，用于制備對(duì)惡性腫瘤有潛在治療作用的人源化抗體。(3)根據(jù)本發(fā)明的基因序列及其編碼的氨基酸序列，制備針對(duì)人IL-13Rot2功能表位的如人鼠嵌合抗體、Fab抗體、疫苗或其他生物制品。抗人IL-13Ra2單克隆抗體FMMU-IL-13Rct2-7氨基酸序列及基因序列aio〉中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)G20〉一種抗人IL-13Ra2單克隆抗體的可變區(qū)〈160>4〈210>1〈211>112〈212〉PRT〈213〉人工合成〈400〉1AspValLeuMetThrGinThrProLeuSerLeuThrValSerLeuGlyA印GinAlaSer15101520lieSerCysArgSerGlyGinSerLeuValHisSerAspGlyAsnThrTyrLeuHisTrp2125303540PheLeuGinLysProGlyLeuSerProLysLeuLeulieTyrThrValSerAsnArgPhe4145505560SerGlyValProAspArgPheSerGlySerGlySerGlyThrAspPheThrLeuLyslie6165707580SerArgValGluAlaGluAspLeuGlylieTyrPheCysSerGinCysThrHisValPro81859095100PheThrPheGlyAlaGlyThrLysLeuGluLeuLys101105110<210>1〈211>114〈212>PRT<213>人工合成〈400>2ValGinLeuGinGluSerGlyAlaGluLeuAlaArgProGlyAlaSerVallysLeuSer1215101520CysLysAlaSerGlyTyr丁hrPheThrAsnTyrTrpLeuGinTrpValLysGinArgPro2125303540GlyGinGlyLeuGluTrplieGlyAlalieTyrProGlyAsnAspAspSerArgTyrAla4145505560GinLysPheAsnValLysAlaThrLeuThrAlaAspLysSerSerSerThrAlaTyrMet6165707580GinLeuSerAsnLeuAlaSerGluAspSerAlaValTyrTyrCysAlaThrGlyThrGlu81859095100PheThrTysTrpGlyGinGlyThrThrValThrValSerSer101105110〈210>3〈211>336〈212>DNA〈213>人工合成<400>3gatgttctgatgacccaaactccactctccctgactgtcagtcttggggatcaagcctcc60atctcttgcagatctggtcagagccttgtacacagtgatggaaacacctatttacattgg120tttttgcagaagccaggcctgtctccaaagctcctcatctacacagtttccaaccgattt180tctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcsagatc240agcagagtggaggctgaggatctgggaatttatttctgttctcaatgtacacatgttcct300ttcacgttcggtgctgggaccaagctggaactgaaa336〈210〉4<211>342<212>DNA〈213〉人工合成<■>4ggtgcaactgcaggagtctggggctgaactggca卿cctggggcttcagtgaagttgtc60ctgcaaggcttctggctacacctttactaactactggttgcagtgggtaaaacagaggcc120tggacagggtctggagtggattggggccatttatcctggaaatgatgattctaggtacgc180tcaaaagttcaatgtcaaggccacattgactgcagatasatcgtccagcacagccacatg240tcaactcagcaatttggcatctgaggactctgcggtctattactgtgcaactgggacgga300gtttacttactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctc342FMMU-IL-13Ra2-7輕鏈和重鏈可變區(qū)的基因序列及氨基酸序列同源性分析BLASTN1QueryID:lcl|28345Database:AllGenBank+EMBL+DDBJ+PDBsequences(butnoEST,STS，GSS，environmentalsamplesorphase0,1or2HTGSsequences)7,567,972sequences;25,029,697,616totallettersLength=336gbIFJ265539.11Musmusculusanti-hemoglobin3C4monoclonalantibodyimmunoglobulinlightchainvariableregionmRNA,partialcdsLength=338Score=527bits(285),Expect=le-146Identities=319/336(94%)，Gaps二0/336(0%)Strand=Plus/PlusQuery1GATGTTCTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGACTGTCAGTCTTGGGGATCMGCCTCC60Sbjct1GATGTTGTGATGACCCAAACTCCACTCTCCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCC60Query61ATCTCTTGCAGATCTGGTCAGAGCCTTGTACACAGTGATGGAAACACCTATTTACATTGG120Sbjct61ATCTCTTGCAGATCTAGTCAGAGCCTTGTACACAGTAATGGAAACACCTATTTACATTGG120Query121TTTTTGCAGAAGCCAGGCCTGTCTCCAAAGCTCCTCATCTACACAGTTTCCAACCGATTT180Sbjct121TACCTGCAGAAGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTT180Query181TCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATC240Sbjct181TCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATC240Query241AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAATTTATTTCTGTTCTCAATGTACACATGTTCCT300Sbjct241AGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTTCTGCTCTCAAAGTACACATGTTCCT300Query301TTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAACTGAM336Sbjct301CCCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA336BLASTN2腿DP6ZPU5Z013Database:AllGenBank+EMBL+DDBJ+PDBsequences(butnoEST,STS,GSS,environmentalsamplesorphase0，1or2HTGSsequences)7,538,883sequences;24,955,484,671totallettersLength=342gb|M25110.llMUSIGHZZBMouseIgmu-chainB2geneV-D-JH1region,partialcdsLength=630Score=444bits(240)，Expect=le-121Identities=319/355(89%),G鄰s=14/355(3%)Strand=Plus/PlusQuery:1GGTGCAACTGCAGGAGTCTGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTC60Sbjct:276GGTTCAGCTCCAGCAGTCTGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTGTC335Query:61CTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAACTACTGGTTGCAGTGGGTAAAACAGAGGCC120Sbjct:336CTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGCTACTGGATGCAGTGGGTAAAACAGAGGCC395Query:121TGGACAGGGTCTGGAGTGGATTGGGGCCATTTATCCTGGMATGATGATTCTAGGTACGC180Sbjct:396TGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTATTTATCCTGGAGATGGTGATACTAGGTACAC455Query:181TCAAAAGTTCMTGTCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCGTCCAGCACAGCCTACAT240Sbjct:456TCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGCACAGCCTACAT515Query:241GCAACTCAGCAATTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAC-TGGG-ACG298Sbjct:516GCMCTCAGCAGCTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATGGGGAAG575Query:299GAG-T—T--TACTT--A-—CTGGGGC-CAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTC342Sbjet:576TAGCTACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCGCA-GGGACCACGGTCACCGTCTCCTC629BLASTP3QueryIDlcl|66680QueryLength112DescriptionAllnon-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+PIR+PRFexcludingenvironmentalsamplesfromWGSprojectsgb1AAA85498.11immunoglobulinlightchainvariableregionLength=112Score=213bits(542),Expect=4e_54,Method:Compositionalmatrixadjust.Identities=102/112(91%),Positives=107/112(95%)，Gaps=0/112(0%)Query1DVLMTQTPLSLTVSLG叫ASISCRSGQSLVHSDGNTYLHWFLQKPGLSPKLLIYTVSNRF60DV+MTQTPLSLVSLGDQASISCRSQSLVHS+GNTYLHWFLQKPGSPKLLIYVSNRFSbjct1DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSLVHSNGNTYLHWFLQKPGQSPKLLIYKVSNRF60Query61SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSQCTHVPFTFGAGTKLELK112SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLG+YFCSQTHVPFTFG+GTKLE+KSbjct61SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPFTFGSGTKLEIK112BLASTP4RID:DP6腿9901NLength=113Database:Allnon-redundantGenBankCDStranslations+PDB+SwissProt+PIR+PRFexcludingenvironmentalsamplesfromWGSprojects7,045,708sequences;2,434,317,241totallettersdbjIBAA19800.11anti-idiotypicantibodyheavychain[Mussp.]lvength=119Score=197bits(500),Expect=2e_49,Method:Compositionalmatrixadjust.Identities=98/117(83%),Positives=105/117(89%),G即s=4/117(3%)Query:1VQLQESGAELARPGASVKLSCKASGYTFTNYWLQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGNDDSRYA60VQLQ+SGAELARPGASVKLSCKASGYTFTNYW+QWVKQRPGQGL+WIGAIYPG+++RYSbjet:2VQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFTNYWMQWVKQRPGQGLDWIGAIYPGDGNTRYT61Query:61QKFNVKATLTADKSSSTAYMQLSNLASEDSAVYYCATGTE——FTYWGQGTTVTVS113QKFKATLTADKSSSTAYMQLS+LASEDSAVYYCAGFYWGQGTTVTVSSbjet:62QKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLASEDSAVYYCARGEGNYAWFAYWGQGTTVTVS118權(quán)利要求1、一種抗人IL-13Rα2單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，其特征在于，輕鏈的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列分別為，CDR1Gln-Ser-Leu-Val-His-Ser-Asp-Gly-Asn-Thr-Tyr，CDR2Thr-Val-Ser，CDR3Ser-Gln-Cys-Thr-His-Val-Pro-Phe-Thr；重鏈的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)序列分別為，CDR1Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asn-Tyr-Trp，CDR2Ile-Tyr-Pro-Gly-Asn-Asp-Asp-Ser，CDR3Ala-Thr-Gly-Thr-Glu-Phe-Thr-Tyr。2、如權(quán)利要求1所述的抗人IL-13Roc2單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，其特征在于，所述的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQIDNO.l所示，所述的重鏈可變區(qū)氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。3、權(quán)利要求1所述的抗人IL-13Rot2單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，其特征在于，輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQIDN0.3所示，重鏈可變區(qū)核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。4、權(quán)利要求1或3所述的抗人IL-13Ra2單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，其特征在于，應(yīng)用于構(gòu)建以人IL-13Ra2為靶點(diǎn)的基因工程抗體或疫苗的制備。全文摘要一種抗人IL-13Rα2單克隆抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)，用重組人IL-13Rα2免疫BALB/c小鼠，制備一組小鼠抗人IL-13Rα2單克隆抗體，并篩選出具有高親和力的抗人IL-13Rα2單克隆抗體FMMU-IL-13Rα2-7?？寺≡搯慰寺】贵w輕鏈和重鏈可變區(qū)基因，獲得該單克隆抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因序列和氨基酸序列，確認(rèn)這些基因序列與蛋白序列的惟一性?？勺儏^(qū)的氨基酸序列以及編碼這些可變區(qū)的基因序列在構(gòu)建針對(duì)人IL-13Rα2為靶點(diǎn)的對(duì)惡性腫瘤有治療作用的單鏈抗體、嵌合抗體、人源化抗體或疫苗方面有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)A61K39/395GK101585880SQ20091002256公開日2009年11月25日申請(qǐng)日期2009年5月15日優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日發(fā)明者宋朝君,徐竹蔚,琨楊,金伯泉,陳麗華,龔玖瑜申請(qǐng)人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)