專(zhuān)利名稱(chēng)：：自補(bǔ)aav介導(dǎo)的干擾rna分子遞送以治療或預(yù)防眼病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過(guò)自補(bǔ)(self-complementary)腺伴隨病毒(scAAV)載體向患者的眼遞送干擾RNA分子的方法。本發(fā)明亦涉及向有此需要的患者施用本發(fā)明的干擾RNA分子-scAAV載體以治療眼病(oculardisorder)的方法。
背景技術(shù)：
：RNA干擾(RNAi)是用雙鏈RNA(dsRNA)來(lái)使基因表達(dá)沉默的過(guò)程。RNAi由短(即<30個(gè)核苷酸)雙鏈RNA(“dsRNA”)分子誘發(fā)，所述分子存在于細(xì)胞內(nèi)(Fire等人，1998，Nature391806~811)。這些被稱(chēng)為“短干擾RNA”或“siRNA”的短dsRNA分子導(dǎo)致與所述siRNA享有序列同源性的信使RNA(“mRNA”)降解至單個(gè)核苷酸水平(resolution)(Elbashir等人，2001，GenesDev,15188-200)人們相信siRNA的一條鏈并入已知為RNA-誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)的核糖核蛋白中。RISC用這條siRNA鏈來(lái)鑒定與所并入的siRNA鏈至少部分互補(bǔ)的mRNA分子，然后切割這些靶mRNA或抑制它們的翻譯。siRNA看來(lái)像多周轉(zhuǎn)(multiple-turnover)酶一樣被回收利用，1個(gè)siRNA分子能夠引起大約1000個(gè)mRNA分子的切割。因此，siRNA介導(dǎo)的RNAi降解比現(xiàn)有的抑制靶基因表達(dá)的技術(shù)更有效。RNAi提供了一種非常讓人興奮的治療以及/或者預(yù)防疾病的手段。與各種傳統(tǒng)療法相比，RNAi的一些主要好處包括，RNAi高特異性地靶向與疾病過(guò)程相關(guān)的非常特異的基因，從而減少或者消除靶效應(yīng)的能力；RNAi是正常的細(xì)胞過(guò)程，它導(dǎo)致高度特異的RNA降解及其基因沉默效應(yīng)的細(xì)胞間擴(kuò)散；并且，RNAi不像很多基于抗體的療法那樣觸發(fā)宿主免疫應(yīng)答。用siRNA來(lái)特異性體內(nèi)靶向和敲除眼疾病靶基因與遞送siRNA至小梁網(wǎng)(TM)靶組織中的某些物理限制有關(guān)。另外，由于核酸通常具有短的玻璃體內(nèi)半衰期，為了實(shí)現(xiàn)干擾RNA的連續(xù)存在，可能需要反復(fù)的眼內(nèi)注射?；谶@些原因，需要長(zhǎng)期遞送的方法。已有一些干擾RNA遞送的方法正在被測(cè)試/開(kāi)發(fā)用于體內(nèi)使用。例如，可將siRNA在鹽溶液中“裸露地”遞送；與聚陽(yáng)離子、陽(yáng)離子脂質(zhì)/脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑或陽(yáng)離子肽絡(luò)合遞送；作為特定分子綴合物(例如膽固醇修飾的siRNA、TAT-DRBD/siRNA復(fù)合體)的組分遞送；作為脂質(zhì)體的組分遞送；以及作為納米顆粒的組分遞送。用玻璃體內(nèi)或前眼房(intracameral)遞送的腺病毒shRNA的TM的病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)是一種可能的手段，但是這有來(lái)自在人中使用的一些不利后果，包括由抗腺病毒應(yīng)答消除而導(dǎo)致的瞬時(shí)表達(dá)。腺伴隨病毒(AAV)由單鏈DNA基因組組成，它們毒性有限，已經(jīng)被用作基因療法的病毒載體。遺憾的是，AAV無(wú)法有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)TM細(xì)胞。由于這些方法已經(jīng)示出不同程度的成功，仍然需要新的改良的方法來(lái)體內(nèi)遞送siRNA分子以實(shí)現(xiàn)并增強(qiáng)RNAi的治療潛力。發(fā)明概述本發(fā)明提供了在患者的眼中減弱靶mRNA表達(dá)的方法，包括(a)提供含有干擾RNA分子的自補(bǔ)腺伴隨病毒(scAAV)載體；及(b)將該scAAV載體施用至患者眼，其中干擾RNA分子能減弱眼中靶mRNA的表達(dá)。一方面，患者有眼病，諸如眼血管生成、干眼、眼炎癥狀況(ocularinflammatoryconditions)、眼高血壓(ocularhypertension)或青光眼。另一方面，干擾RNA分子靶向與眼病相關(guān)的基因，所述眼病諸如眼血管生成、干眼、眼炎癥狀況、眼高血壓或青光眼。例如通過(guò)眼內(nèi)注射、眼局部應(yīng)用(oculartopicalapplication)、靜脈內(nèi)注射、口服施用、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、經(jīng)皮用(transdermalapplication)或經(jīng)黏膜用(transmucosalapplication)來(lái)施用載體。本發(fā)明也提供了含有自補(bǔ)腺伴隨病毒(scAAV)載體的藥物組合物，所述載體攜帶有治療有效量的干擾RNA分子和眼科可接受的載體，其中干擾RNA分子能減弱與眼病相關(guān)基因的表達(dá)。scAAV載體可以被包裝(package)進(jìn)scAAV病毒粒體中。本發(fā)明的具體的優(yōu)選實(shí)施方案將從下面對(duì)某些優(yōu)選實(shí)施方案的更詳細(xì)描述和權(quán)利要求中顯而易見(jiàn)。發(fā)明詳述在此所述詳細(xì)情況采取舉例方式，僅用于本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的說(shuō)明性討論，其目的是為了提供本發(fā)明的各種實(shí)施方案之原理及概念方面被認(rèn)為是最有用、最易懂的描述。在這點(diǎn)上，未試圖顯示比本發(fā)明的基本理解所需的那些更詳細(xì)的本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，與附圖和/或?qū)嵤├嚓P(guān)的描述使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚知道本發(fā)明的多種形式如何具體到實(shí)踐中。以下的定義及解釋?zhuān)窃诮酉聛?lái)的實(shí)例中清楚無(wú)疑地被更改、或者該意義的使用導(dǎo)致任何的釋義無(wú)意義或基本無(wú)意義，否則便意味且意圖以任何將來(lái)的釋義限定。在某術(shù)語(yǔ)的釋義會(huì)導(dǎo)致該術(shù)語(yǔ)無(wú)意義或基本無(wú)意義的情況下，該定義應(yīng)從第三版韋氏詞典(Webster'sDictionary)或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的詞典，諸如牛津生物化學(xué)及分子生物學(xué)i司典(OxfordDictionaryofBiochemistryandMolecularBiology)(AnthonySmith編輯，牛津大學(xué)出版社(OxfordUniversityPress)，牛津，2004)中得出。本文中用的所有百分比，除非另外說(shuō)明，皆指以重量計(jì)的百分比。本文所用的術(shù)語(yǔ)單數(shù)形式(“a”和“an”)，除非另外說(shuō)明，否則意為“一個(gè)(one)”，“至少一個(gè)(atleastone)”或者“一個(gè)或更多(oneormore)”。除非上下文另有需要，否則本文所用的單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)形式，而復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包含單數(shù)形式。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供減弱患者眼內(nèi)靶mRNA表達(dá)的方法，其包括(a)提供自補(bǔ)腺伴隨病毒(scAAV)載體，該載體含有靶向在眼內(nèi)表達(dá)的基因的干擾RNA分子；以及(b)施用該scAAV載體至患者眼，其中干擾RNA分子可以減弱眼中靶mRNA的表達(dá)。在特定的實(shí)施方案中，該scAAV載體被包裝(package)于scAAV病毒粒體中。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供預(yù)防或治療患者眼病的方法，所述方法包括(a)提供自補(bǔ)腺伴隨病毒(scAAV)載體，該載體含有靶向與眼病相關(guān)基因的干擾RNA分子；以及(b)施用該scAAV載體至患者眼，其中干擾RNA分子可以減弱與眼病相關(guān)基因的表達(dá)。scAAV載體可被包裝(package)于scAAV病毒粒體中。在特定的實(shí)施方案中，眼病與升高的眼內(nèi)壓(IOP)，比如眼高血壓或青光眼有關(guān)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)“患者”是指患有眼病或處于患上眼病風(fēng)險(xiǎn)的人或其他哺乳動(dòng)物。與此類(lèi)病相關(guān)的眼部結(jié)構(gòu)可以包括例如眼(eye)、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜、晶狀體、角膜、小梁網(wǎng)、虹膜、視神經(jīng)、視神經(jīng)頭、鞏膜、前段或后段、或睫狀體。在一些實(shí)施方案中，患者患有與小梁網(wǎng)(TM)細(xì)胞、睫狀上皮細(xì)胞或眼的其它細(xì)胞類(lèi)型相關(guān)的眼病。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“眼病”包括與眼血管生成、干眼、炎癥狀況、眼高血壓相關(guān)的狀況，以及與升高的眼內(nèi)壓(IOP)如青光眼相關(guān)的眼疾病。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“眼血管生成”包括例如，眼血管生成前狀況(ocularpre-angiogenicconditions)及目艮血管生成狀況(ocularangiogeniccondition)，并包括眼血管生成、眼新血管形成、視網(wǎng)膜水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、與視網(wǎng)膜缺血相關(guān)的后遺癥、后段新血管形成(PSNV)以及新生血管性青光眼。例如，本發(fā)明的方法中使用的干擾RNA在治療下述患者中有用，所述患者患有眼血管生成、眼新血管形成、視網(wǎng)膜水腫、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、與視網(wǎng)膜缺血相關(guān)的后遺癥、后段新血管形成(PSNV)以及新生血管性青光眼，或者所述患者處于發(fā)展此類(lèi)狀況的風(fēng)險(xiǎn)。術(shù)語(yǔ)“眼新血管形成”包括年齡相關(guān)性黃斑變性、白內(nèi)障、急性缺血性視神經(jīng)病變(AION)、視網(wǎng)膜震蕩、視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜撕裂或視網(wǎng)膜裂孔、醫(yī)源性視網(wǎng)膜病變及其他缺血性視網(wǎng)膜病變或視神經(jīng)病變、近視、色素性視網(wǎng)膜炎和/或諸如此類(lèi)。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“炎癥狀況”包括例如眼部炎癥及過(guò)敏性結(jié)膜炎等狀況。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“重組AAV(rAAV)載體”是指來(lái)自重組AAV的含有至少一個(gè)末端重復(fù)序列的核酸。自補(bǔ)AAV(scAAV)載體含有雙鏈載體基因組，該基因組通過(guò)從一個(gè)rAAVTR刪除末端解離位點(diǎn)(terminalresolutionsite,TR)而形成，防止了在被突變端的復(fù)制起始。這些構(gòu)建體生成單鏈、反向重復(fù)序列基因組，該基因組在每一端有野生型(wt)TR，在中間有突變的TR。已知數(shù)種天然存在及雜種的AAV血清型，包括AAV-1、AAV-2、AAV-3A、AAV-3B、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10和AAV-11(Choi等人，2005，Curr.GeneTher.5:299_310)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)知道scAAV載體可以基于以上任意或其他AAV血清型來(lái)產(chǎn)生。本文中所用的短語(yǔ)“scAAV病毒粒體”是指含有scAAV載體和蛋白外殼的完整病毒顆粒，根據(jù)本文所述發(fā)明，它能夠感染宿主細(xì)胞并將干擾RNA分子遞送到宿主細(xì)胞中。Xu等人(2005，MolTherll:523_530)和Borras等人(2006，JGeneMed8589-602)進(jìn)一步論述了含有干擾RNA分子(比如本文所提供的那些)的scAAV載體及scAAV病毒粒體的產(chǎn)生。Xu等人用scAAV載體將siRNA遞送到抗多種藥物性人乳腺癌和口癌細(xì)胞中，以抑制MDRl基因表達(dá)。Borras等人展示了高效scAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)人小梁網(wǎng)(TM)細(xì)胞和人TM器官灌注培物(perfusionorganculture)。另外，Yokoi，K等人(2007，InvestOphthalmolVisSci，48:3324_3328)向視網(wǎng)膜下間隙(subretinalspace)注射2型scAAV載體并觀(guān)察到綠色熒光蛋白在視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞表達(dá)。本發(fā)明的方法可用于使用RNA干擾減弱患者眼中特定基因的表達(dá)。RNA干擾(RNAi)是用雙鏈RNA(dsRNA)來(lái)沉默基因表達(dá)的方法。盡管不希望受到理論限制，RNAi由RNaseIII樣酶dicer將較長(zhǎng)的dsRNA切成小段干擾RNA(siRNA)開(kāi)始。siRNA是長(zhǎng)度通常為大約19到28個(gè)核苷酸、或20到25個(gè)核苷酸、或21到22個(gè)核苷酸的dsRNA，通常包含2個(gè)核苷酸的3’突出端，以及5’磷酸和3’羥基末端。siRNA的一條鏈并入已知為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RISC)的核糖核蛋白復(fù)合體中。RISC用這條siRNA鏈來(lái)鑒定與所并入的siRNA鏈至少部分互補(bǔ)的mRNA分子，然后切割這些靶mRNA或抑制它們的翻譯。因此，這條并入RISC的siRNA鏈已知為指導(dǎo)鏈或反義鏈。另一條siRNA鏈，已知為過(guò)客鏈或有義鏈，從siRNA中被排除掉并且與靶mRNA至少部分同源。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)意識(shí)至IJ，原則上siRNA的任意一條鏈都可以并入RISC中并發(fā)揮指導(dǎo)鏈的功能。但是siRNA的設(shè)計(jì)(例如在期望的指導(dǎo)鏈5’端減少的雙鏈體穩(wěn)定性)可以有利于期望的指導(dǎo)鏈并入RISC中。siRNA的反義鏈?zhǔn)莝iRNA的主動(dòng)指導(dǎo)物(activeguidingagent)，因?yàn)樗龇戳x鏈被并入RISC，從而使得RISC能鑒定與反義siRNA鏈至少部分互補(bǔ)的靶mRNA用于切割或翻譯抑制。具有與指導(dǎo)鏈至少部分互補(bǔ)的序列的mRNA的RISC-介導(dǎo)的切割導(dǎo)致該mRNA和由這一mRNA所編碼的相應(yīng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)態(tài)水平的降低?？蛇x地，RISC還可以通過(guò)無(wú)靶mRNA切割的翻譯阻抑來(lái)降低相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)。干擾RNA似乎是以催化方式作用用于對(duì)靶mRNA的切割，也就是說(shuō)，干擾RNA能以亞化學(xué)計(jì)量的量來(lái)達(dá)到靶mRNA的抑制。與反義療法相比，在這種切割條件下，提供療效所需的干擾RNA顯著更少。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了遞送干擾RNA以抑制靶mRNA表達(dá)，從而降低患有眼病的患者中靶mRNA水平的方法。本文中所用的短語(yǔ)“減弱靶mRNA表達(dá)”是指施用或表達(dá)一定量的干擾RNA(例如siRNA)，以通過(guò)mRNA切割或通過(guò)直接翻譯抑制，來(lái)降低靶mRNA向蛋白質(zhì)的翻譯。本文所用的術(shù)語(yǔ)“抑制”、“沉默”以及“減弱”，是指與沒(méi)有本發(fā)明方法中使用的干擾RNA存在時(shí)靶mRNA或相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)相比，該靶mRNA或相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)可測(cè)量的降低。靶mRNA或相應(yīng)蛋白質(zhì)表達(dá)的降低通常被稱(chēng)為“敲低(knock-down)”，并且被報(bào)道為相對(duì)于非靶向?qū)φ誖NA(例如非靶向?qū)φ誷iRNA)的施用或表達(dá)后存在的水平。本文的實(shí)施方案預(yù)期將表達(dá)敲低50%至100%之間(包括端點(diǎn))的量。但達(dá)到這樣的敲低水平并非本發(fā)明的目的所必需的。通過(guò)用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)擴(kuò)增來(lái)測(cè)量mRNA水平或通過(guò)用Western印跡法或酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)來(lái)測(cè)量蛋白質(zhì)水平來(lái)通常評(píng)估敲低。分析蛋白質(zhì)水平提供了對(duì)mRNA切割和翻譯抑制二者的評(píng)估。其它測(cè)量敲低的技術(shù)包括RNA溶液雜交、核酸酶保護(hù)、Northern雜交、用微陣列的基因表達(dá)監(jiān)控、抗體結(jié)合、放射免疫測(cè)定和熒光激活細(xì)胞分析。通過(guò)觀(guān)察眼病癥狀的改善，可以推斷出在人或其它哺乳動(dòng)物中干擾RNA分子減弱了靶基因的表達(dá)，包括例如，例如眼內(nèi)壓降低指示了青光眼靶基因的抑制。在一個(gè)實(shí)施方案中，單種干擾RNA分子被遞送以降低靶mRNA水平。在其他實(shí)施方案中，兩種或多種靶向mRNA的干擾RNA被施用以降低靶mRNA水平?？梢栽谕粋€(gè)scAAV載體或分別的載體中遞送干擾RNA0本文所用的術(shù)語(yǔ)“干擾RNA”及“干擾RNA分子”是指所有能與RISC相互作用并參與RISC介導(dǎo)的基因表達(dá)變化的RNA或RNA樣分子。其他能與RISC相互作用的干擾RNA分子的實(shí)例包括短發(fā)夾RNA(shRNA)、單鏈siRNA、微小RNA(miRNA)及dicer-底物27_mer雙鏈體。能與RISC相互作用的“RNA樣”分子的實(shí)例包括siRNA、單鏈siRNA、微小RNA以及shRNA分子，所述分子含有一個(gè)或多個(gè)經(jīng)化學(xué)修飾的核苷酸、一個(gè)或多個(gè)非核苷酸、一個(gè)或多個(gè)脫氧核糖核苷酸，以及/或者一個(gè)或多個(gè)非磷酸二酯鍵。因此，siRNA、單鏈siRNA、shRNA、miRNA以及dicer-底物27_mer雙鏈體是“干擾RNA”或“干擾RNA分子”的子集。本文中所用的術(shù)語(yǔ)“siRNA”，除非另外說(shuō)明，否則都是指雙鏈干擾RNA。本發(fā)明的方法中使用的siRNA通常是含有兩條核苷酸鏈的雙鏈核酸分子，每條鏈有大約19到大約28個(gè)核苷酸(即約19，20，21，22，23，24，25，26，27或28個(gè)核苷酸)。本發(fā)明方法中使用的干擾RNA通常有約19到約49個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。當(dāng)提到雙鏈干擾RNA時(shí)，短語(yǔ)“19到49個(gè)核苷酸長(zhǎng)”是指反義鏈和有義鏈獨(dú)立地有約19到約49個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，包括其中有義鏈和反義鏈通過(guò)接頭分子連接起來(lái)的干擾RNA分子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)單鏈干擾RNA實(shí)現(xiàn)mRNA沉默，盡管不如雙鏈RNA有效。因此，本發(fā)明的實(shí)施方案也提供了施用單鏈干擾RNA。與上述關(guān)于雙鏈干擾RNA—樣，單鏈干擾RNA長(zhǎng)約19到大約49個(gè)核苷酸。單鏈干擾RNA具有5’磷酸或者在5’位置被原位或體內(nèi)磷酸化。術(shù)語(yǔ)“5’磷酸化”用于描述例如具有磷酸基團(tuán)的多核苷酸或寡核苷酸，該磷酸基團(tuán)在該多核苷酸或寡核苷酸的5’端以酯鍵與糖(例如核糖、脫氧核糖或者其類(lèi)似物)的C5羥基相連。單鏈干擾RNA可以化學(xué)合成或通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄合成，或從本文所述(根據(jù)雙鏈干擾RNA)的載體或表達(dá)盒內(nèi)源性表達(dá)。5’磷酸基團(tuán)可通過(guò)激酶添加，或者5’磷酸可以是核酸酶切割RNA的結(jié)果。發(fā)夾干擾RNA是單分子(比如單寡核苷酸鏈)，它含有以莖-環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)(如shRNA)的干擾RNA的有義鏈和反義鏈。例如，shRNA可從這樣DNA載體表達(dá)，該載體中編碼有義干擾RNA鏈的DNA寡核苷酸通過(guò)短的間隔區(qū)與編碼反向互補(bǔ)反義干擾RNA鏈的DNA寡核苷酸相連。如果所選擇的表達(dá)載體需要，可以添加3’末端T’s和形成限制性位點(diǎn)的核苷酸。得到的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物折疊到自己上形成莖_環(huán)結(jié)構(gòu)。本文中所用的短語(yǔ)“靶序列”和“靶mRNA”是指能被本發(fā)明方法中所用的干擾RNA識(shí)別的mRNA或mRNA序列的部分，其中干擾RNA如本文所述沉默基因表達(dá)。使用可用的設(shè)計(jì)工具來(lái)選擇在靶mRNA序列內(nèi)的干擾RNA靶序列(如siRNA靶序列)。提供了用于選擇siRNA的靶序列的技術(shù)，例如，通過(guò)由Tuschl，T.等人，"ThesiRNAUserGuide,“(2004年5月6日修訂，可以在RockefellerUniversity網(wǎng)站獲?。患夹g(shù)公報(bào)#506，“siRNADesignGuidelines,“AmbionInc(Ambion的網(wǎng)站)；和其他基于網(wǎng)頁(yè)的設(shè)計(jì)工具，例如在Invitrogen、Dharmacon、IntegratedDNATechnoIogies>Genscript或Proligo網(wǎng)站提供。最初的搜索參數(shù)可以包括35%到55%之間的G/C含量和19到27個(gè)核苷酸的siRNA長(zhǎng)度。靶序列可以位于mRNA的編碼區(qū)或者5’或3’非翻譯區(qū)中。靶序列可用于衍生干擾RNA分子，例如此處所述的那些?？梢酝ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)染表達(dá)靶mRNA的細(xì)胞隨后評(píng)估如此處所述的敲低來(lái)體外測(cè)試對(duì)應(yīng)于靶序列的干擾RNA?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知?jiǎng)游锬Ｐ驮隗w內(nèi)進(jìn)一步評(píng)估干擾RNA?？扇缦略隗w外評(píng)估干擾RNA敲低例如HeLa細(xì)胞中內(nèi)源性靶基因表達(dá)水平的能力。在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)將HeLa細(xì)胞平板接種在標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(例如，補(bǔ)充了10%胎牛血清的DMEM)中。使用例如Dharmafect1(Dharmacon,Lafayette,CO)根據(jù)生產(chǎn)商的教導(dǎo)以0.InM到IOOnM的干擾RNA濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將SiCONTROL非靶向siRNA#l和siCONTROL親環(huán)蛋白BSiRNA(Dharmacon)分別用作陰性和陽(yáng)性對(duì)照。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)通過(guò)qPCR評(píng)估靶mRNA水平和親環(huán)蛋白BmRNA(PPIB,NM_000942)水平，使用例如優(yōu)選覆蓋靶位點(diǎn)的TAQMAN基因表達(dá)測(cè)定法(AppliedBiosystems,FosterCity，CA)。當(dāng)轉(zhuǎn)染效率是100%時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照siRNA給出了親環(huán)蛋白BmRNA的基本完全的敲低。因此，通過(guò)參考轉(zhuǎn)染了親環(huán)蛋白BsiRNA的細(xì)胞中親環(huán)蛋白BmRNA水平來(lái)就轉(zhuǎn)染效率校正靶mRNA敲低?？梢栽谵D(zhuǎn)染后約72小時(shí)(實(shí)際的時(shí)間取決于蛋白質(zhì)更新率)通過(guò)例如western印跡評(píng)估靶蛋白水平。用于從培養(yǎng)的細(xì)胞分離RNA和/或蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。為了降低非特異性、脫靶效應(yīng)的機(jī)會(huì)，使用干擾RNA的最低可能的濃度，其將產(chǎn)生希望水平的靶基因表達(dá)敲低。人角膜上皮細(xì)胞或其它人眼細(xì)胞系也可用于評(píng)估干擾RNA對(duì)內(nèi)源靶基因的敲低水平的能力。在某些實(shí)施方案中干擾RNA分子-配體綴合物含有干擾RNA分子，其靶向與眼病相關(guān)的基因。設(shè)計(jì)本發(fā)明的干擾RNA以靶向的mRNA靶基因的實(shí)例包括與影響視網(wǎng)膜的病癥相關(guān)的基因，與青光眼相關(guān)的基因，和與眼炎癥相關(guān)的基因。與視網(wǎng)膜病癥相關(guān)的mRNA靶基因的實(shí)例包括酪氨酸激酶，內(nèi)皮(TEK)；補(bǔ)體因子B(CFB)；低氧誘導(dǎo)因子1，α亞基(HIFlA)；HtrA絲氨酸肽酶1(HTRAl)；血小板-衍生生長(zhǎng)因子受體β(PDGFRB)；趨化因子，CXC基序，受體4(CXCR4)；胰島素樣生長(zhǎng)因子I受體(IGFlR)；血管生成素2(ANGPT2)；v-fosFBJ鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物(FOS)；組織蛋白酶Li，轉(zhuǎn)錄變體I(CTSLl)；組織蛋白酶Li，轉(zhuǎn)錄變體2(CTSL2)；胞內(nèi)黏著分子1(ICAMl)；胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGFl)；整聯(lián)蛋白a5(ITGA5)；整聯(lián)蛋白β1(ITGBl)；核因子κ-B，亞基1(NFKBl)；核因子κ-B，亞基2(NFKB2)；趨化因子，CXC基序，配體12(CXCL12)；腫瘤壞死因子-α-轉(zhuǎn)化酶(TACE)；以及激酶插入結(jié)構(gòu)域受體(KDR)。和青光眼相關(guān)的靶基因的實(shí)例包括碳酸酐酶II(CA2)；碳酸酐酶IV(CA4)；碳酸酐酶XII(CA12)；β1腎上腺素能受體(ADBRl)；β2腎上腺素能受體(ADBR2)；乙酰膽堿酯酶(ACHE)；Na+/K+-ATP酶；溶質(zhì)載體家族12(鈉/鉀/氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，成員1(SLC12A1)’溶質(zhì)載體家族12(鈉/鉀/氯化物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)，成員2(SLC12A2)；結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)；血清淀粉樣A(SAA)；分泌的frizzled-相關(guān)蛋白1(sFRPl)；gremlin(GREMl)；賴(lài)氨酰氧化酶(LOX)、c-Maf；rho-相關(guān)的含卷曲螺旋的蛋白激酶I(ROCKl)；rho-相關(guān)的含卷曲螺旋的蛋白激酶2(R0CK2)；纖溶酶原激活物抑制劑I(PAIl)；內(nèi)皮分化，鞘脂G蛋白偶聯(lián)受體，3(Edg3R)；肌纖蛋白(MYOC)；NADPH氧化酶4(N0X4)；蛋白激酶Cδ(PKCδ)；水通道蛋白I(AQPl)；水通道蛋白4(AQP4)；補(bǔ)體級(jí)聯(lián)系統(tǒng)的成員；ATP酶、H+轉(zhuǎn)運(yùn)，溶酶體Vl亞基A(ATP6V1A)；間隙連接蛋白α-I(GJAl)；甲酰肽受體1(FPRl)；甲酰肽受體樣1(FPRLl)；白介素8(IL8)；核因子κ-B，亞基I(NFKBl)；核因子κ-B，亞基2(NFKB2)；早老蛋白1(PSENl)；腫瘤壞死因子-α-轉(zhuǎn)化酶(TACE)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGFB2)；瞬時(shí)受體潛在陽(yáng)離子通道(transientreceptorpotentialcationchannel)，亞家方矣V，成員1(TRPVl)；氯離子通道3(CLCN3)；間隙連接蛋白a-5(GJA5)；以及殼多糖酶3樣-2(CHI3L2)。和眼炎癥相關(guān)的mRNA靶基因的實(shí)例包括腫瘤壞死因子受體超家族，成員lA(TNFRSFlA)；磷酸二酯酶4D，cAMP特異(PDE4D)；組胺受體Hl(HRHl)；脾酪氨酸激酶(SYK)；白介素1β(ILlB)；核因子κ-B，亞基I(NFKBl)；核因子κ-B，亞基2(NFKB2)；以及腫瘤壞死因子_α_轉(zhuǎn)化酶(TACE)。此類(lèi)靶基因在例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)中有描述，所述專(zhuān)利申請(qǐng)具有公開(kāi)號(hào)20060166919、20060172961、20060172963、20060172965、20060223773、20070149473，以及20070155690中，其公開(kāi)內(nèi)容以其整體引入作為參考。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了降低患者眼內(nèi)壓的眼藥物組合物，所述組合物含有自補(bǔ)腺伴隨病毒(scAAV)載體，該載體能在眼科可接受的運(yùn)載體(carrier)中表達(dá)治療有效量的干擾RNA分子，其中該干擾RNA分子能減弱與眼病相關(guān)基因的表達(dá)。該scAAV載體可被包裝在scAAV病毒粒體中。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選是制劑，所述制劑含有干擾RNA或其鹽，以重量計(jì)高達(dá)99%地與可藥用運(yùn)載體介質(zhì)(medium)混合，所述介質(zhì)包括下面描述的那些，并且例如水、緩沖液、鹽水、甘氨酸、透明質(zhì)酸、甘露醇等等。含有干擾RNA的scAAV載體或者本發(fā)明的藥物組合物可以作為溶液劑、混懸劑或乳劑被施用。以下是可用于本發(fā)明方法的藥物組合物制劑的例子。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>如此處所用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生治療反應(yīng)所確定的干擾RNA或包含干擾RNA的藥物組合物的量。此類(lèi)治療有效量通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員并利用如此處所述的方法是容易確定的。通常，本發(fā)明的治療有效量的干擾RNA導(dǎo)致靶細(xì)胞表面的細(xì)胞外濃度為IOOpM到1μΜ，或InM到ΙΟΟηΜ，或5nM到約50nM或到約25nM。實(shí)現(xiàn)該局部濃度所需的劑量將隨著許多因素而變，所述因素包括遞送方法、遞送位點(diǎn)、遞送位點(diǎn)和靶細(xì)胞或組織之間細(xì)胞層數(shù)目，遞送是局部還是全身的，等等。遞送位點(diǎn)的濃度可以比靶細(xì)胞或組織表面的顯著更高。根據(jù)臨床醫(yī)生的常規(guī)考慮，將局部組合物每天一至四次或以延長(zhǎng)的遞送時(shí)間表，如每天、每周、每?jī)芍?、每月或更長(zhǎng)時(shí)間遞送到靶器官例如眼睛表面。制劑的PH為約pH4.0到約pH9.0，或約pH4.5到約pH7.4。制劑的治療有效量可以取決于如下因素，如受試者的年齡、種族和性別、靶基因轉(zhuǎn)錄物/蛋白質(zhì)更新的速率、干擾RNA效力、和干擾RNA穩(wěn)定性。在一個(gè)實(shí)施方案中，將包含干擾RNA的scAAV載體局部遞送到靶器官并且以治療劑量到達(dá)含有靶mRNA的組織，如小梁網(wǎng)、視網(wǎng)膜或視神經(jīng)頭，從而改善靶基因相關(guān)的疾病過(guò)程。預(yù)期用針對(duì)靶mRNA的干擾RNA對(duì)患者的治療性治療比與小分子治療有益處，干擾RNA治療性治療通過(guò)增加作用持續(xù)時(shí)間從而允許較低頻率給藥和更大的患者依從性，并通過(guò)增加靶特異性從而減輕副作用來(lái)實(shí)現(xiàn)所述益處。如此處所用的“眼科可接受的載體”是指那些載體，其最多引起、很少引起或不引起眼刺激、如果需要，提供合適的防腐作用，和以均勻劑量遞送本發(fā)明的一種或多種干擾RNA。用于施用本發(fā)明實(shí)施方案的干擾RNA的可接受的載體包括基于陽(yáng)離子脂類(lèi)的轉(zhuǎn)染試劑TransIT-TKO(MirusCorporation，Madison,WI)、LIPOFECTIN、Lipofectamine、OLIGOFECTAMINE(Invitrogen,Carlsbad,CA)或DHARMAFECT(Dharmacon,Lafayette,CO)；聚陽(yáng)離子，如聚乙烯亞胺；陽(yáng)離子肽，如Tat、聚精氨酸或者Penetratin(Antp肽)；納米顆粒；或者脂質(zhì)體。脂質(zhì)體從標(biāo)準(zhǔn)的形成小泡的脂類(lèi)和固醇，如膽固醇形成，并且可以包括靶向分子，如對(duì)細(xì)胞表面抗原具有結(jié)合親和力的單克隆抗體。此外，脂質(zhì)體可以是加入聚乙二醇的脂質(zhì)體?？梢砸匀芤?、懸浮液、或者生物蝕解的或非生物蝕解的遞送裝置遞送包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物。例如，可以通過(guò)氣霧劑、含服、皮膚、皮內(nèi)、吸入、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、肺內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)鼻、眼、口、耳、腸胃外、貼劑、皮下、舌下、局部或者經(jīng)皮施用遞送包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物。在某些實(shí)施方案中，用干擾RNA分子治療眼病是通過(guò)將包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物直接施用于眼來(lái)完成的。由于許多原因，對(duì)眼局部施用是有利的，包括劑量可比全身遞送更小，且分子在不同于眼睛的組織中沉默基因靶的機(jī)會(huì)更少。許多研究已顯示在體內(nèi)成功并有效將干擾RNA遞送至眼。例如，Kim等人證實(shí)結(jié)膜下注射和全身遞送靶向VEGF通路基因的siRNA抑制了小鼠眼中的血管發(fā)生(Kim等人·，2004，Am.J.Pathol.165:2177_2185)。另外，研究已顯示遞送至玻璃體腔的siRNA可擴(kuò)散至整個(gè)眼睛，并在注射后達(dá)5天都可檢測(cè)到(Campochiaro，2006，GeneTherapy13:559-562)。研究也表明scAAV載體可有效地體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)至人小梁網(wǎng)(TM)細(xì)胞中。例如，Borras等人表明，可以用scAAV載體來(lái)實(shí)現(xiàn)在分離的HTM細(xì)胞中和來(lái)自死后捐獻(xiàn)者的完整組織上的TM的轉(zhuǎn)導(dǎo)(Borras等人，2006，JGeneMed8:589_602)?？梢酝ㄟ^(guò)眼組織注射，如眼周、結(jié)膜、眼球筋膜下(subtenon)、前眼房(intracameral)、玻璃體內(nèi)、眼內(nèi)、視網(wǎng)膜下、結(jié)膜下、眼球后、或者小管內(nèi)注射將包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物直接遞送到眼中；或者使用導(dǎo)管或者其他放置裝置，如視網(wǎng)膜彈丸劑、眼內(nèi)插入物、栓劑或者包含多孔的、非多孔的或者凝膠狀材料的植入物直接應(yīng)用于眼；通過(guò)局部眼滴劑或者軟膏劑；或者通過(guò)盲路中的緩釋裝置或者植入鞏膜附近(經(jīng)鞏膜)或鞏膜中(鞏膜內(nèi))或者眼中進(jìn)行遞送。前眼房注射可以通過(guò)角膜注射到前房中以允許活性劑到達(dá)小梁網(wǎng)。小管內(nèi)注射可以注射到靜脈集合管引流輸淋管或者注射到輸淋管中。對(duì)于眼遞送，包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物可以與眼科可接受的防腐劑、共溶劑、表面活性劑、粘性增強(qiáng)劑、滲透增強(qiáng)劑、緩沖劑、氯化鈉或者水組合以形成水性的無(wú)菌眼用混懸液或溶液。通過(guò)將包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物溶解在生理學(xué)上可接受的等滲水性緩沖液中可以制備溶液制劑。此外，溶液可以包括可接受的表面活性劑以幫助溶解包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物。粘性助劑，如羥甲基纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等等可以加入到本發(fā)明的組合物中用于提高化合物的保留。為了制備無(wú)菌眼用軟膏制劑，將包含干擾RNA的scAAV載體或本發(fā)明的藥物組合物與防腐劑在合適的載體(vehicle)，如礦物油、液體羊毛脂或者白礦脂中組合。根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法，通過(guò)將干擾RNA懸浮在從例如CARBOPOL-94()(BFGoodrich,Charlotte,NC)等的組合制備的親水基質(zhì)中制備無(wú)菌眼用凝膠制劑。VISCOAT(AlconLaboratories,Inc.,FortWorth,TX)可以用于例如眼內(nèi)注射。在干擾RNA在眼中的滲透性較弱的情況下，本發(fā)明的其他組合物可以含有滲透增強(qiáng)劑，如cremephor和TWEEN80(聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯，SigmaAldrich,St.Louis,MO)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了試劑盒，其包括用于減弱如本文引用的mRNA在細(xì)胞中表達(dá)的試劑。該試劑盒含有能夠減弱與眼病相關(guān)基因表達(dá)的干擾RNA和/或scAAV載體和/或scAAV載體的產(chǎn)生所必須的組分(例如，包裝細(xì)胞系以及包含病毒載體模板的載體和用于包裝的額外輔助載體)。試劑盒也可以含有陽(yáng)性和陰性對(duì)照siRNA或者shRNA表達(dá)載體(例如，非靶向?qū)φ誷iRNA或者靶向不相關(guān)mRNA的siRNA)。試劑盒還可以含有用于評(píng)估預(yù)期靶基因的敲低的試劑(例如，用于檢測(cè)靶標(biāo)mRNA的定量PCR的弓|物和探針和/或用于Western印跡的抗對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)的抗體)。備選地，試劑盒可以包含siRNA序列或者shRNA序列和使用說(shuō)明書(shū)和通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生siRNA或者構(gòu)建shRNA表達(dá)載體必須的材料。還提供了藥盒形式的藥物組合，其在包裝的組合中包括載體工具(其適于接受與之密切限制的容器工具)，和第一個(gè)容器工具，其包括干擾RNA組合物和scAAV載體。如果需要，此類(lèi)藥盒可以還包括多種常規(guī)的藥物藥盒組分的一種或多種，如具有一種或多種可藥用的載體的容器、額外容器，等等，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)。藥盒中也可以包括作為插頁(yè)或標(biāo)簽的印刷的說(shuō)明書(shū)，其指出待施用的組分的量，施用指導(dǎo)，和/或用于混合組分的指導(dǎo)。本文中所引用之參考，以它們?yōu)楸疚乃龅哪切┨峁┦纠猿绦蚧蚱渌?xì)節(jié)補(bǔ)充的程度通過(guò)參考特異性并入。本領(lǐng)域技術(shù)人員參考本公開(kāi)將理解可以進(jìn)行本文公開(kāi)的實(shí)施方案的多種修飾而不背離本發(fā)明的精神和范圍。參考本公開(kāi)可以不用過(guò)度實(shí)驗(yàn)就可以做出和實(shí)施本文公開(kāi)的所有實(shí)施方案。本發(fā)明的完整范圍在本公開(kāi)和其等同實(shí)施方案中給出。不應(yīng)將本說(shuō)明書(shū)理解為過(guò)度地限制本發(fā)明的完整保護(hù)范圍。應(yīng)當(dāng)理解上述公開(kāi)強(qiáng)調(diào)了本發(fā)明的特定技術(shù)方案，并且所有等同的修飾或備選方案均在如所附的權(quán)利要求中給出的本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。權(quán)利要求減弱患者眼中靶mRNA的表達(dá)的方法，其包括(a)提供含有干擾RNA分子的自補(bǔ)腺伴隨病毒(scAAV)載體；和(b)將該scAAV載體施用至患者眼，其中干擾RNA分子能減弱眼中靶mRNA的表達(dá)2.權(quán)利要求1的方法，其中scAAV載體被包裝進(jìn)scAAV病毒粒體中。3.權(quán)利要求1的方法，其中所述載體通過(guò)眼內(nèi)注射、眼局部應(yīng)用、靜脈內(nèi)注射、口服施用、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、經(jīng)皮用或經(jīng)黏膜用來(lái)施用。4.權(quán)利要求1的方法，其中干擾RNA分子是siRNA、miRNA或shRNA。5.權(quán)利要求1的方法，其中靶mRNA與眼病相關(guān)。6.權(quán)利要求5的方法，其中眼病與眼血管生成、干眼、眼炎癥狀況、眼高血壓或青光眼相關(guān)。7.含有自補(bǔ)腺伴隨病毒(scAAV)載體的藥物組合物，所述載體攜帶有治療有效量的干擾RNA分子和眼科可接受的載體，其中干擾RNA分子能減弱與眼病相關(guān)基因的表達(dá)。8.權(quán)利要求7的組合物，其中scAAV載體被包裝在scAAV病毒粒體中。9.權(quán)利要求7的方法，其中干擾RNA分子是siRNA、miRNA或shRNA。10.權(quán)利要求7的方法，其中眼病與眼血管生成、干眼、眼炎癥狀況、眼高血壓或青光眼相關(guān)。全文摘要本發(fā)明提供了遞送干擾RNA分子至患者眼以治療眼病的方法。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的方法包括自補(bǔ)腺伴隨病毒(scAAV)載體的應(yīng)用，該載體能遞送干擾RNA分子至患者眼，從而抑制與眼病相關(guān)的基因的表達(dá)。文檔編號(hào)A61K48/00GK101815536SQ200880110028公開(kāi)日2010年8月25日申請(qǐng)日期2008年10月1日優(yōu)先權(quán)日2007年10月1日發(fā)明者A·R·謝帕德申請(qǐng)人:愛(ài)爾康研究有限公司