專利名稱：膽甾烷-3β,5α,6β-三醇在制備神經(jīng)元保護藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及內(nèi)源性甾體化合物膽甾烷-315，5a，6J3-三醇在腦缺血、脊髓缺血， 癲癇發(fā)作和驚厥中神經(jīng)元損傷的保護作用。
背景技術：
中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中絕大多數(shù)的快速興奮性傳遞與谷氨酸受體以及相關 的神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放有關。谷氨酸受體參與人CNS的早期發(fā)育，在突觸可 塑性如學習和記憶中起決定性作用。雖然谷氨酸是維持正常神經(jīng)細胞活性的重要 介質(zhì)，但大量的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)(如谷氨酸，Glu)釋放，過度刺激谷氨酸受體 會引發(fā)神經(jīng)細胞死亡(被稱為興奮性毒性作用(excitotoxicity))。這種興奮性毒 性引起的神經(jīng)損傷通常伴有過度的鈣離子內(nèi)流，氧自由基(ROS)及氮自由基 (RNS)的產(chǎn)生，之后可引起細胞內(nèi)膜的損傷，激活引起凋亡的信號而導致遲發(fā) 性細胞死亡。
包括鈣離子細胞內(nèi)流在內(nèi)的細胞內(nèi)游離鈣[C^+]i的變化，代表著某種細胞功 能啟動、加強或抑制，在某些疾病的發(fā)生、發(fā)展中有重要意義，細胞[C^+]i的 變化可能是一系列病理損傷和病理生理機制改變的"促發(fā)點"。細胞內(nèi)鈣離子的 含量及[C^+]i的變化可以提供鈣離子信號傳導與疾病間關聯(lián)的直接證據(jù)。而谷 氨酸引起的神經(jīng)興奮性毒性損傷，刺激了離子型受體，而最主要是激活NMDA受 體引起細胞膜的去極化，導致大量鈣離子內(nèi)流。體外培養(yǎng)神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞時， 如果培養(yǎng)基中沒有鈣離子，能夠組斷海人酸(KA)引起的細胞死亡，這表明鈣 離子內(nèi)流對興奮性毒性所致?lián)p傷的過程是很必要的。同時已經(jīng)證明，胞外鈣離子 濃度降低可使KA受體和AMPA受體引起的皮層神經(jīng)元的毒性損傷明顯減輕。 因此，鈣離子內(nèi)流是引起神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞死亡過程中不可缺少的因素，也是探 討神經(jīng)保護機制的有效方法。
腦和脊髓缺血后會引起谷氨酸的過度釋放，經(jīng)過多個鏈級反應造成神經(jīng)元的 損傷甚至死亡。隨著社會的老齡化，這類CNS疾病發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重威脅著人們的生命健康。對缺血腦、脊髓和神經(jīng)細胞進行保護已成為當今中樞神經(jīng) 缺血損傷治療的研究熱點。神經(jīng)保護劑治療急性缺血性損傷的主要機理有Ca2+ 通道阻滯劑、清除自由基、使用興奮性氨基酸受體拮抗劑、神經(jīng)營養(yǎng)因子和 氨基丁酸受體激動劑等。鈣通道阻滯劑主要有以尼莫地平為代表的二氫吡啶類藥 物以及硫酸鎂。急性缺血導致大量自由基大量產(chǎn)生，使膜結構破壞、神經(jīng)元損害， 也可誘導血管痙攣及血管內(nèi)凝血，使梗死范圍擴大。故自由基治療十分重要。維 生素E、維生素C、超氧化物歧化酶(SOD)為常用的自由基清除劑。
谷氨酸也一直認為與癲癇發(fā)作和驚厥密切相關，一方面谷氨酸的過量釋放可 導致癲癇發(fā)作及驚厥的啟動與傳播，另一方面癲癇發(fā)作及驚厥后又可導致谷氨酸 的過量釋放，繼而產(chǎn)生興奮毒性損害，導致神經(jīng)元壞死或凋亡。并且谷氨酸導致 癲癇發(fā)作及驚厥可能是由于其早期胞內(nèi)合成增加、后期胞外大量釋放的結果。研 究發(fā)現(xiàn)細胞外高濃度的谷氨酸鹽可以觸發(fā)顳葉癲癇發(fā)作、產(chǎn)生驚厥，與腦和脊髓 缺血具有相同的病理基礎。
尋找有效的神經(jīng)保護劑一直是全世界神經(jīng)科學家們的夢想。但由于中樞神經(jīng) 組織和細胞損傷的病理機制涉及復雜的時間和空間的級聯(lián)反應和交互作用，所以 目前只針對其中單一環(huán)節(jié)或個別分子機制進行干預的治療嘗試收效甚微，原因可 能是忽視了引起的細胞損傷過程具有多階段、多中心機制和多向性的特點。因此， 有藥理學家預測，具備多個環(huán)節(jié)、多個靶點作用機制的神經(jīng)保護劑是最有希望獲 得理想臨床效果的藥物。
在眾多化合物中，神經(jīng)活性甾體對神經(jīng)保護具有廣泛效應而日益受到關注。
這些神經(jīng)活性甾體水平與CNS疾病的發(fā)生發(fā)展相關，對神經(jīng)元損傷、死亡以及 多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有顯著調(diào)節(jié)作用。上世紀80年代，科學家們開始把這些 天然存在或人工合成的，在神經(jīng)組織具有活性的甾體激素命名為神經(jīng)活性甾體 (neuroactive steroids, NAS)。目前臨床上已將這些甾體激素作為替代療法運用 于臨床。雌激素是已知神經(jīng)保護作用最強的NAS，絕經(jīng)婦女卵巢停止產(chǎn)生雌激 素，可引起AJ3沉積，導致阿爾茨海默氏病(AD)。而給予雌激素能明顯降低大 腦的Afi水平，臨床上將雌激素用于AD的治療，收到良好的效果。有研究表明， 別孕烯醇酮可以保護由低氧和谷氨酸引起的體外培養(yǎng)海馬細胞不可逆的神經(jīng)毒
性損傷。脫氫表雄酮能降低谷氨酸類似物和皮質(zhì)甾類的神經(jīng)毒性作用。到目前為 此,還沒有研究報導膽甾垸-3fi，5a,6B-三醇(YC-5)在神經(jīng)組織具有活性或作為神經(jīng)
4活性甾體的研究。
YC-5廣泛存在于哺乳動物體內(nèi)，正常人血漿中已檢測到YC-5的存在。已 證實YC-5為膽固醇的基礎代謝產(chǎn)物之一。膽固醇在有氧的環(huán)境下經(jīng)自氧化或酶 催化形成膽固醇-5,6-環(huán)氧化合物，后者在膽固醇-5，6-環(huán)氧化酶的作用下水化，形 成YC-5。除此之外，人的組織或體液也檢測到多種"氧化甾醇"，比如7-羥基膽 固醇，24-羥基膽固醇和27-羥基膽固醇等。在高膽固醇人群的血漿中及LDL中 的"氧化甾醇"含量遠高于正常人群。YC-5被認為是體內(nèi)是毒性最大的"氧化 甾醇"之一。體內(nèi)YC-5的來源主要有二個 一是食源性的，即直接食用了經(jīng)由 膽固醇氧化的含YC-5的食物；二是膽固醇-5，6-環(huán)氧化合物在體內(nèi)經(jīng)膽固醇-5,6 環(huán)氧化酶催化生成YC-5。膽固醇-5,6-環(huán)氧化合物主要由膽固醇經(jīng)非酶氧化產(chǎn)生。 參與非酶氧化的主要為氧自由基。這些自由基多來由脂質(zhì)過氧化，另一部分則來
自于巨噬細胞和嗜中性粒細胞中的活性產(chǎn)物。非酶氧化過程在"氧化甾體"的形 成過程中占著很重要的位置。因為給動物抗氧化劑，動物體內(nèi)的氧化甾醇的水平 即下降。YC-5在冠心病人冠狀動脈粥樣硬化斑中分布最為豐富。
如上所述，過去的幾十年間，YC-5的研究一直圍繞富含膽固醇食品的氧化、 高膽固醇血癥以及動脈粥樣硬化展開，氧化膽固醇與動脈粥樣硬化之間的相關性 一度成為動脈粥樣硬化成因的熱點研究領域。大量研究已經(jīng)證實，長期的高膽固 醇血癥增加了動脈粥樣硬化的發(fā)病率。鑒于膽固醇本身沒有致動脈粥樣硬化的作 用，我們推測，膽固醇代謝產(chǎn)物，包括其氧化產(chǎn)物(即"氧化甾醇")可能是導 致動脈粥樣硬化的原因。氧化甾醇被LDL轉(zhuǎn)運至內(nèi)膜下并沉積，對動脈粥樣硬 化斑的壞疽區(qū)的形成起了重要作用。這些區(qū)域伴隨著脂質(zhì)的沉淀和細胞壞死，長 期將導致內(nèi)皮細胞的不可逆損壞，血小板粘附、聚集和血栓形成。包括YC-5在 內(nèi)的氧化甾醇，在低uM濃度即可誘導內(nèi)皮細胞的凋亡，這是主要的細胞死亡方 式，也是粥樣硬化主要的病理過程。而在中高uM濃度則可引發(fā)細胞壞死。氧化 甾醇僅少量在動脈粥樣硬化斑區(qū)沉積，其中包括YC-5。在粥樣硬化區(qū)可發(fā)現(xiàn)一 層由YC-5或25-羥其膽固醇、膽固醇形成的結晶。動脈粥樣硬化的形成也與內(nèi) 皮細胞炎癥細胞因子上調(diào)有關。沉積后的氧化甾醇作為一個炎癥刺激，誘導上調(diào) 氧化LDL對脈管系統(tǒng)的炎癥細胞因子，并誘導這些粘附因子高表達，促進細胞 凋亡、壞死和細胞因子產(chǎn)生。但混合的"氧化甾體"對內(nèi)皮細胞的毒性比純的、 單一的"氧化甾體"要低。有趣的是，在中國和印度延用了幾千年的牛黃(?；蜓虻哪懡Y石)，含有豐 富的膽固醇及其代謝產(chǎn)物，證明對CNS疾病如急性休克、癲癇、驚厥有良好的 治療作用。近年來臨床研究表明，血漿高膽固醇病人較正常膽固醇病人患中風的 的死亡率低并且預后較好。由于膽固醇本身對原代培養(yǎng)的神經(jīng)元無保護作用，可 以認為膽固醇的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物與中風的治療和預防存在某種相關性，也即，膽 固醇的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物可能具有神經(jīng)保護作用。經(jīng)發(fā)明人進行實驗研究，首次證 實，在哺乳動物體內(nèi)分布較為豐富的膽固醇內(nèi)源性代謝產(chǎn)物YC-5體內(nèi)、外均具 有神經(jīng)保護作用。

發(fā)明內(nèi)容
YC-5為膽固醇的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。膽固醇在脂質(zhì)過氧化形成的自由基的存 在下可以自氧化或經(jīng)NADPH/Fe力ADP酶系統(tǒng)催化形成膽固醇-5，6-環(huán)氧化合物， 后者在膽固醇-5,6-環(huán)氧化合物水化酶的作用下水化，生成YC-5。研究表明YC-5 可被LDL轉(zhuǎn)運至血管內(nèi)膜下沉積，致血管內(nèi)皮損傷，并誘導血小板粘附、聚集 和血栓形成，是動脈粥樣硬化的危險因素。到目前為此，還沒有YC-5對神經(jīng)組 織具有活性或具有神經(jīng)保護作用的研究報導。
發(fā)明人的研究表明，作為膽固醇的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，YC-5可能通過對NMDA 受體以及非NMDA受體的負性調(diào)控發(fā)揮生理性神經(jīng)保護作用；2) YC-5發(fā)揮神 經(jīng)保護作用的濃度對受試動物無明顯的毒副作用，提示YC-5是一種潛在的有效 治療腦缺血損傷、脊髓缺血損傷、癲癇及驚厥等CNS疾病的神經(jīng)保護藥。
YC-5可明顯抑制谷氨酸誘導的小腦顆粒神經(jīng)元、皮層神經(jīng)元和脊髓運動神 經(jīng)元興奮性損傷的毒性作用，提高神經(jīng)元計數(shù)、神經(jīng)元的存活率，降低乳酸脫氫 酶釋放值，并呈劑量依賴性。Confocal測定皮層神經(jīng)元細胞內(nèi)C^+濃度變化 [Ca2+]i和全細胞膜片鉗技術測定細胞膜Cf電流(/NMDA)的變化表明，這一作 用可能是通過抑制NMDA受體激活，進而抑制其引起的C^+濃度升高來實現(xiàn)的。
為了證實YC-5在體內(nèi)有無神經(jīng)保護作用，我們采用阻斷腹主動脈的脊髓損 傷模型，研究YC-5對兔脊髓缺血模型神經(jīng)元的保護作用。施行脊髓缺血前30 分鐘預先注射YC-5 ，其神經(jīng)功能評分明顯高于未處理的對照組，且無動物出現(xiàn) 癱瘓。而對照組全部動物呈現(xiàn)癱瘓。組織病理學顯示，YC-5組的正常細胞數(shù)量 明顯多于對照組，進一步說明YC-5對神經(jīng)元損傷有明顯的保護作用。
6YC-5可明顯抑制海人酸誘導的小腦顆粒神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元興奮性損傷的毒性作用，提高神經(jīng)元代謝活性和存活率，降低乳酸脫氫酶的釋放值，并呈劑量信賴性。Confocal測定[C^+]i和全細胞膜片鉗技術測定/nmda表明，這一作用可能是通過抑制海人酸引起的非NMDA受體激活，進而抑制其引起的(^2+濃度升高來實現(xiàn)的(數(shù)據(jù)略)。因此，YC-5對于腦缺血損傷、脊髓缺血損傷，癲癇發(fā)作和驚厥具有神經(jīng)保護作用。
綜上所述，膽甾垸-3B,5a，6fi-三醇可應用于神經(jīng)元保護藥物的制備，可應用于抗腦缺血損傷、抗脊髓缺血損傷、抗癲癇及抗驚厥藥物的制備。


圖1 YC-5對谷氨酸誘導的小腦顆粒神經(jīng)元興奮性損傷的保護作用
A.相差顯微鏡照片；B.FDA染色熒光照片；C.Hoechst 33258染色熒光照片；
D.神經(jīng)元存活率；E.LDH釋放值
圖2 YC-5對谷氨酸誘導的皮層神經(jīng)元興奮性損傷的保護作用
A.相差顯微鏡照片；B. FDA染色熒光照片；C. Hoechst 33258染色熒光照片；D.神經(jīng)元存活率；E.LDH釋放值
圖3 YC-5抑制谷氨酸誘導的皮層神經(jīng)元細胞[Ca"]i增加
A.神經(jīng)元細胞[C^+]i變化曲線；B.神經(jīng)元細胞[C]i變化值圖4 YC-5抑制谷氨酸誘導的皮層神經(jīng)元細胞膜的Jnmda
A.神經(jīng)元細胞/nmda變化曲線；B.神經(jīng)元細胞/nmda變化值
圖5 YC-5對谷氨酸誘導的脊髓運動神經(jīng)元興奮性損傷的保護作用
A.相差顯微鏡照片；B.神經(jīng)元存活率
圖6 YC-5對腹主動脈夾閉致兔脊髓缺血模型的神經(jīng)保護作用
A.神經(jīng)功能評分；B.FDA染色熒光照片；C.正常神經(jīng)元數(shù)量
圖7 YC-5對海人酸誘導的小腦顆粒神經(jīng)元的興奮性損傷的保護作用
A.相差顯微鏡照片；B. FDA染色熒光照片；C. Hoechst 33258染色熒光照片；
D.神經(jīng)元存活率；E.LDH釋放值
圖8 YC-5對海人酸誘導的海馬神經(jīng)元的興奮性損傷的保護作用
A.相差顯微鏡照片；B. FDA染色熒光照片；C.Hoechst 33258染色熒光照片；
D.神經(jīng)元存活率；E.LDH釋放值
具體實施例方式
一、由膽固醇合成YC-5
Cholesterol Cholestane-5,6-epoxide YC-:
YC-5的13C-NMR(DMSO)
11.578(18-CH3), 18.107(21陽CH3), 20.53 5(26-CH3), 21.988(27-CH3)，23.581(24-CH3), 66.374 (3-CH)， 74.782(6-CH), 75.005(5-C)
二、神經(jīng)元的培養(yǎng)
1. 大鼠小腦顆粒神經(jīng)元的培養(yǎng)
取出生7 8d，體重約15 20g大鼠的去除腦膜和血管的小腦，用0.25g/L胰酶消化后，用0.05g/LDNasel的吹散液將細胞吹散為單細胞懸液，離心，取沉淀，用含10n/。(v/v)FBS和25mMKCl的BME培養(yǎng)基稀釋并接種于經(jīng)多聚賴氨酸預包被的培養(yǎng)皿中。接種24小時后加入10jiMAra-C以抑制非神經(jīng)元細胞的生長和增殖，使小腦顆粒神經(jīng)元的純度在95%以上。培養(yǎng)時加入葡萄糖補充細胞代謝所需能量。第8天進行實驗。
2. 大鼠皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)
取出生ld的大鼠的去除腦膜和血管的皮層，用0.25g/L胰酶消化后，用0.05g/LDNase I的吹散液將細胞吹散為單細胞懸液，離心，取沉淀，用含5M(v/v) FBS和2MB27的DMEM-F12培養(yǎng)基稀釋并接種于經(jīng)多聚賴氨酸預包被的培養(yǎng)皿中。接種24小時后加入10pMAra-C以抑制非神經(jīng)元細胞的生長和增殖，以后每周2-3次半量換液。第8天進行實驗。
3. 脊髓運動神經(jīng)元的培養(yǎng)
孕15天SD大鼠分離脊髓，去除脊膜和血膜，取胎鼠脊髓組織用0.125%胰酶
8消化后，離心，取含有豐富運動神經(jīng)元的中層，離心去掉細胞碎片后，差速貼壁lh，選取貼壁速度慢的，懸浮的脊髓運動神經(jīng)元。接種24h后加入阿糖胞苷，第3天全量換液，以L-15無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2-3天半量換液。第3-5天進行實驗。
4.海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)
取出生ld的大鼠的去除腦膜和血管的海馬組織，同皮層神經(jīng)元培養(yǎng)，第8天進行實驗。
三、YC-5對腦缺血損傷的保護作用及作用機制
1. YC-5對谷氨酸誘導的小腦顆粒神經(jīng)元興奮性損傷的保護作用
培養(yǎng)8天的小腦顆粒神經(jīng)元，分別設正常對照組、谷氨酸組、MK-801+谷氨酸、YC-5+谷氨酸組。正常對照組不做任何處理，谷氨酸組加入20(^M谷氨酸，其它組預先加入YC-5和MK801， 37r孵育30分鐘后加入谷氨酸，24h后用相差顯微鏡神經(jīng)細胞形態(tài)；用FDA染色，倒置熒光顯微鏡觀察，進行細胞計數(shù)，并計算神經(jīng)元的存活率
存活率=各組活細胞數(shù)/對照組活細胞數(shù)>< 100%。
Hoechst33258染色，倒置熒光顯微鏡觀察神經(jīng)元核形態(tài)。并測定各組乳酸及乳酸酶的活性。
如圖l所示，YC-5+谷氨酸組和MK-801+谷氨酸組大部分小腦顆粒神經(jīng)元能保持胞體和突起的完整，F(xiàn)DA染色顯示細胞存活率增加，細胞核及染色質(zhì)呈正常形態(tài)，LDH釋放值降低，與谷氨酸組比較呈現(xiàn)明顯差異(PO.05)，且所有結果均顯示與YC-5存在濃度依賴關系。而在上述劑量范圍YC-5對正常神經(jīng)細胞的存活率無影響。
2. YC-5對谷氨酸誘導的皮層神經(jīng)元興奮性損傷的保護作用
培養(yǎng)10天的皮層神經(jīng)元，分別設正常對照組、谷氨酸組、MK-801+谷氨酸、YC-5+谷氨酸組。正常對照組不做任何處理，谷氨酸組加入200 nM谷氨酸，其它組預先加入溶劑、YC-5和MK801， 37'C孵育30分鐘后加入谷氨酸,24h后用相差顯微鏡神經(jīng)細胞形態(tài)，用FDA染色，倒置熒光顯微鏡觀察，進行細胞計數(shù)，并計算神經(jīng)元的存活率
存活率=各組活細胞數(shù)/對照組活細胞數(shù)x 100% 。Hoechst33258染色，倒置熒光顯微鏡觀察神經(jīng)元核形態(tài)。并測定各組乳酸及乳酸酶的活性。
如圖2所示，YC-5+谷氨酸組和MK-801+谷氨酸組大部分皮層神經(jīng)元能保持胞體和突起的完整，F(xiàn)DA染色顯示細胞存活率增加，細胞核及染色質(zhì)呈正常形態(tài)，LDH釋放值降低，與谷氨酸組比較呈現(xiàn)明顯差異(PO.05)，且所有結果均顯示與YC-5存在濃度依賴關系。而在上述劑量范圍YC-5對正常神經(jīng)細胞的存活率無影響。
3. YC-5濃度依賴性地抑制谷氨酸引起的大鼠皮層神經(jīng)元細胞[C^+]i增加
細胞內(nèi)游離鈣的變化，代表著某種細胞功能啟動、加強或抑制，并且[C^+]i的變化及其介導的信號轉(zhuǎn)導的變化在某些疾病的發(fā)生、發(fā)展中有重要意義，細胞[Ca2+]i的變化可能是一系列病理損傷和病理生理機制改變的"促發(fā)點"。因此了解[Ca2+]i的變化，具有多方面意義，并可以提供鈣離子信號轉(zhuǎn)導與疾病間關聯(lián)的直接證據(jù)。
Fluo-3是新一代Caa熒光指示劑，由可見光(488 nm)激發(fā)的鈣離子探針，在沒有結合鈣離子的情況下，通常不會激發(fā)熒光。Fluo-3與Ca^結合后，熒光強度增加60 80倍。所測得的熒光強度變化可以反映[C^+]i的變化。在神經(jīng)元細胞中先加入200 ^M谷氨酸，測定細胞熒光強度記為FO，給藥后測定細胞熒光強度記為F胞內(nèi)C^+濃度變化程度(A[Ca2+]i)用以給藥前后熒光強度變化值與給藥前熒光強度值的百分比值來表示，艮P:
△ [Ca2+]i= (F-FO) /F0xl00%。
如圖3所示，單獨給予溶劑或YC-5并未改變神經(jīng)元細胞內(nèi)鈣熒光強度；給予5~15fiMYC-5預處理30min后，再同時給予200 pM谷氨酸和YC-5，則可以明顯地抑制谷氨酸引起的這種細胞內(nèi)鈣熒光強度的增加。NMDA受體特異的非競爭性拮抗劑MK-801 (50 ^M)對谷氨酸引起的皮層神經(jīng)元胞內(nèi)鈣濃度的增加則主要表現(xiàn)為使已增高的細胞內(nèi)鈣熒光強度迅速降低，而YC-5主要抑制谷氨酸引起的胞內(nèi)鈣的濃度增加提示YC-5雖然與MK-801 —樣通過抑制NMDA受體的激活來發(fā)揮效應，但是Confocal測定[Ca^]i的結果顯示，YC-5負性調(diào)節(jié)NMDA受體激活的機制可能與MK-801不完全相同。
4. YC-5濃度依賴性地抑制NMDA引起的皮層神經(jīng)元細胞膜的內(nèi)向Ca"電流(/nmda)說明書第9/ll頁
為了進一步證明YC-5抑制谷氨酸誘導的神經(jīng)興奮性毒性作用與NMDA受體的關系，我們利用全細胞膜片鉗技術，記錄YC-5對NMDA引起的皮層神經(jīng)元/nmda的變化。如圖4所示，皮層神經(jīng)元用YC-5預孵后，再同時給予NMDA和YC-5， /nmda電流峰值不同程度地減小。5， 10， 15pM的YC-5可以分別使細胞對NMDA的反應減小為NMDA組的0.82士0.12， 0.67±0.11 ， 0.57±0.05。其中10和15pMYC-5組與NMDA組相比具有顯著統(tǒng)計學差異(p<0.01)。從而證明YC-5對NMDA受體的激活發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用。
綜上，YC-5對腦缺血損傷有保護作用，且是通過對NMDA受體的激活發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用。
四、YC-5對脊髓缺血損傷的保護作用及作用機制
1. YC-5對谷氨酸誘導的脊髓運動神經(jīng)元興奮性損傷的保護作用
培養(yǎng)5天的脊髓運動神經(jīng)元，分別設正常對照組、谷氨酸組、MK-801+谷氨酸、YC-5+谷氨酸組。正常對照組不做任何處理，谷氨酸組加入200 ^M谷氨酸，其它組預先加入MK-801和YC-5， 37'C孵育30分鐘后再加入谷氨酸，24 h后用相差顯微鏡神經(jīng)細胞形態(tài)，用FDA染色倒置熒光顯微鏡進行細胞計數(shù)，并計算神經(jīng)元的存活率
存活率-各組活細胞數(shù)/對照組活細胞數(shù)x 100%。如圖5所示，倒置相差顯微鏡下觀察，對照組存活的脊髓運動神經(jīng)元數(shù)目多，胞體豐滿，呈三角形、多角形、立體感強，有光暈可見分枝和突起；谷氨酸組存活脊髓運動神經(jīng)元數(shù)少，但有突起形成，細胞嚴重受損；而YC-5+谷氨酸和MK-801+谷氨酸組脊髓運動神經(jīng)元數(shù)目明顯增多(P<0.05)，并有很多突起，但仍有少數(shù)死亡細胞。與對照組比，其余三組的脊髓運動神經(jīng)元存活率均有不同程度下降，與谷氨酸組相比，YC-5+谷氨酸組存活率有明顯提高(PO.05)。且所有結果均顯示與YC-5存在濃度依賴關系。而在上述劑量范圍YC-5對正常神經(jīng)細胞的存活率無影響。
2. YC-5對腹主動脈夾閉致兔脊髓缺血模型的神經(jīng)保護作用
24只雄性新西蘭大白兔分為4組(n=6):對照組在脊髓缺血前不進行其它處理；YC-5組在脊髓缺血前30分鐘耳緣靜脈注射8mg/KgYC-5; DMSO組在脊髓缺血前30分鐘同樣方式注射等容量DMSO(lmg/Kg); Sham組即僅僅暴露腹主動脈，而不阻斷它。脊髓缺血模型參照Johnson等的方法進行。缺血前即亥ij，缺血后10min及再灌注后20min測定組間各生理學參數(shù)。用Talov評分法進行各組兔的功能評分。
如圖6所示，缺血前即刻，缺血后10min及再灌注后20min測定各組間生理學參數(shù)無明顯差異(P>0.05) 。 YC-5組功能評分明顯高于對照組，再灌注48小時后，對照組6只兔后肢完全癱瘓，而YC-5組沒有一只完全癱瘓，均能跳動或有明顯的后肢運動。而DMSO組的神經(jīng)功能評分與對照組相比無明顯差異。Sham組及YC-1組能夠觀察到較多形態(tài)正常的前角運動神經(jīng)細胞，這些神經(jīng)細胞結構完整有，核仁清晰，可見尼氏體；而對照組及DMSO組形態(tài)正常的神經(jīng)細胞稀少，脊髓損傷較重，有明顯的空泡變性。Sham組及YC-5脊髓前角正常神經(jīng)細胞數(shù)與對照組相比無明顯差異。YC-5能夠顯著抑制缺血后脊髓組織乳酸及乳酸脫氫酶活性的變化(PO.05)。
綜上，YC-5對脊髓缺血損傷具有保護作用，且是通過對NMDA受體的激活發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用。
五、YC-5對癲癇發(fā)作的保護作用及作用機制
1. YC-5對海人酸誘導的涉及顆粒神經(jīng)元興奮性損傷的保護作用
體外培養(yǎng)第8天的大鼠小腦顆粒神經(jīng)元。分別設正常對照組、海人酸組、YC-5+海人酸組、CNQA+海人酸組。正常對照組不做任何處理，海人酸組加入200 ^M海人酸，其它組預先加入YC-5和CNQA， 37匸孵育30分鐘后再加入海人酸，24 h后用相差顯微鏡神經(jīng)細胞形態(tài)，用FDA染色倒置熒光顯微鏡進行細胞計
數(shù)，并計算神經(jīng)元的存活率
存活率=各組活細胞數(shù)/對照組活細胞數(shù)>< 100%。
Hoechst33258染色，倒置熒光顯微鏡觀察神經(jīng)元核形態(tài)。并測定各組乳酸及乳酸
酶的活性。
如圖7所示，YC-5+海人酸組(先給予YC-5，之后同時給予200pM海人酸和YC-5)，培養(yǎng)24h后，相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)小腦顆粒神經(jīng)元能夠不同程度地保持胞體和突起的完整、細胞核及染色質(zhì)不同程度地呈正常形態(tài)；FDA染色顯示細胞存活率增加；LDH釋放值降低；并且這些現(xiàn)象均與所給予YC-5的濃度在一定程度上顯示劑量依賴關系。而上述劑量范圍的YC-5對正常小腦顆粒神經(jīng) 元的存活率無影響。這表明5 15pM的YC-5可以明顯抑制海人酸誘導的小腦顆 粒神經(jīng)元的毒性作用，提高神經(jīng)元的存活率。其中最大保護作用的劑量15 的 YC-5 (64.05±6.31%)。由于非NMDA受體特異的阻斷劑CNQX對海人酸誘導的 小腦顆粒經(jīng)元的毒性損傷具有顯著的保護作用(CNQA+海人酸組，神經(jīng)元存活 率為97.78±3.11%)，提示海人酸誘導的小腦顆粒經(jīng)元的毒性損傷主要是通過激 活非NMDA受體，YC-5抑制海人酸誘導的小腦神經(jīng)元的興奮性損傷可能與抑 制非NMDA受體的激活相關。
2.YC-5對海人酸誘導的海馬神經(jīng)元的興奮性損傷的保護作用
體外培養(yǎng)IO天的大鼠海馬神經(jīng)元，分別設正常對照組、海人酸組、YC-5+ 海人酸組、CNQA+海人酸組。正常對照組不做任何處理，海人酸組加入200 nM 海人酸，其它組預先加入溶劑、YC-5和CNQA， 37'C孵育30分鐘后再加入海人 酸,24h后用相差顯微鏡神經(jīng)細胞形態(tài)，用FDA染色倒置熒光顯微鏡進行細胞計 數(shù)，并計算神經(jīng)元的存活率
存活率-各組活細胞數(shù)/對照組活細胞數(shù)x 100%。 Hoechst33258染色，倒置熒光顯微鏡觀察神經(jīng)元核形態(tài)。并測定各組乳酸及乳酸 酶的活性。
如圖8所示，YC-5+海人酸組(先給予YC-5，之后同時給予200 pM海人酸和 YC-5)，培養(yǎng)24h后，相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元能夠不同程度地保持 胞體和突起的完整、細胞核及染色質(zhì)不同程度地呈正常形態(tài)；FDA染色顯示細 胞存活率增加;LDH釋放值降低；并且這些現(xiàn)象均與所給予YC-5的濃度在一 定程度上顯示劑量依賴關系。而上述劑量范圍的YC-5對正常海馬神經(jīng)元的存活 率無影響。這表明5 15^M的YC-5可以明顯抑制海人酸誘導的海馬神經(jīng)元的毒 性作用，提高神經(jīng)元的存活率。其中最大保護作用的劑量15pM的YC-5
(62.12±5.1%)。由于非NMDA受體特異的阻斷劑CNQX對海人酸誘導的海馬 經(jīng)元的毒性損傷具有顯著的保護作用(CNQA+海人酸組，神經(jīng)元存活率為 97.89±7.11%)，提示海人酸誘導的海馬經(jīng)元的毒性損傷主要是通過激活非NMDA 受體，YC-5抑制海人酸誘導的海馬神經(jīng)元的興奮性損傷可能與抑制非NMDA受 體的激活相關。
綜上，YC-5對癲癇和驚厥具有保護作用。
1權利要求
1.膽甾烷-3β，5a，6β-三醇在制備神經(jīng)元保護藥物中的應用。
2. 根據(jù)權利要求1所述用途，其特征在于膽甾烷-3B，5a,6B-三醇在制備抗腦缺血 損傷藥物中的應用。
3. 根據(jù)權利要求1所述用途，其特征在于膽甾烷-3J3,5a,6B-三醇在制備抗脊髓缺 血損傷藥物中的應用。
4. 根據(jù)權利要求1所述用途，其特征在于膽甾垸-3B,5a，6B-三醇在制備抗癲癇和 抗驚厥藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明揭示了內(nèi)源性膽固醇代謝產(chǎn)物膽甾烷-3β，5a，6β-三醇(YC-5)對腦缺血、脊髓缺血、癲癇發(fā)作及驚厥的神經(jīng)元損傷具有保護作用，涉及YC-5在制備神經(jīng)元保護藥物中的應用。從膽固醇經(jīng)兩步反應獲得YC-5。經(jīng)體外原代細胞培養(yǎng)及脊髓缺血動物模型證實YC-5對腦缺血、脊髓缺血、癲癇發(fā)作及驚厥的神經(jīng)元損傷具有明顯的保護作用。在有效劑量下YC-5未見明顯的毒副反應。YC-5是針對多個分子機理治療腦缺血損傷、脊髓缺血損傷，癲癇發(fā)作及驚厥的有效神經(jīng)保護劑。
文檔編號A61K31/575GK101683348SQ20081019870
公開日2010年3月31日 申請日期2008年9月23日 優(yōu)先權日2008年9月23日
發(fā)明者冷田東, 劉愛伶, 孫環(huán)環(huán), 張靜夏, 桑韓飛, 胡海燕, 邱鵬新, 巍 銀, 顏光美, 黃奕俊 申請人:中山大學