專利名稱：：Xage-1基因及其表達產物在腫瘤治療和診斷中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于基因治療和診斷
技術領域：
，具體涉及一種新的腫瘤抗原——XAGE-1及其表達產物在腫瘤治療和診斷中的應用。技術背景腫瘤-睪丸抗原(CT抗原)是一類主要表達于正常的種系生殖組織(特別是免疫赦免的睪丸組織)與癌變組織，在其他正常組織中完全不表達或僅有少量表達的腫瘤抗原，一些著名的腫瘤抗原，如MAGE，BAGE，GAGE等均屬于CT抗原。CT抗原這種精確的限制性分布使其成為了當前腫瘤免疫治療研究中的熱點。XAGE/CT12是利用生物信息學方法發(fā)現(xiàn)的一類新基因，包括XAGE-1，XAGE-2和XAGE-3。其中，XAGE-2與XAGE-3的腫瘤表達譜很窄，研究也很少，XAGE-1除了在正常的睪丸組織中表達外，在前列腺癌、黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、涎腺腺樣囊性癌等多種腫瘤組織中均有較高的檢出率。XAGE-l有4種表達亞型XAGE-la,XAGE-lb，XAGE-lc和XAGE-ld,主要表達亞型是XAGE-lb。目前XAGE-l的功能尚未見報道，本文以XAGE-lb為例首次闡述了XAGE-1的功能及其應用價值。涎腺腺樣囊性癌(ACC)是口腔頜面部常見的惡性腫瘤，較易發(fā)生遠地尤其是肺轉移。ACC-2是涎腺腺樣囊性癌細胞系，ACC-M是經裸鼠體內連續(xù)傳代培養(yǎng)，從低轉移細胞系ACC-2中分離出的高轉移細胞系。涎腺腺樣囊性癌高低轉移細胞系基因表達譜差異性研究發(fā)現(xiàn)高轉移細胞系中XAGE-lb呈高表達狀態(tài)。利用基因工程方法，應用真核表達質粒與腺病毒表達系統(tǒng)介導基因過表達及RNA干擾是研究基因功能的有效方法。將XAGE-lbcDNA序列構建到真核表達載體上，同時構建該基因的腺病毒表達載體，利用載體介導該基因在ACC細胞或其他細胞中的過表達，通過細胞增殖、克隆形成、體外穿膜、軟瓊脂集落形成、裸鼠皮下成瘤及尾靜脈注射肺部成瘤實驗就可以研究該基因在腫瘤細胞增殖、浸潤、轉移中的作用；以真核質?；蛳俨《据d體系統(tǒng)介導靶向XAGE-lb表達的RNA干擾，利用細胞及裸鼠模型實驗同樣可以研究該基因的功能及其在腫瘤治療上的應用。針對肝癌，臨床上迫切需要解決的問題是尋找既敏感又特異的診斷指標。目前首選指標是甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)，但其特異性及敏感性均有許多不足。采用Taq-Man熒光定量PCR方法，分析一定數(shù)量肝細胞癌患者及部分健康志愿者血液樣本中XAGE-lb的表達水平及其與AFP的相關性，從而可以探討XAGE-1作為腫瘤分子診斷標識的可行性。另外，擴增XAGE-la，lb兩種轉錄本的轉錄起始點上游序列，分別構建入報告基因載體，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)可以研究比較各片段的轉錄活性，可以推測XAGE-1基因核心啟動子和其它一些調控元件所在區(qū)域，從而可以探討XAGE—1基因調控序列在腫瘤治療等方面的應用。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是提供一種新型的腫瘤治療藥物靶點和診斷標志物，該靶點或標志物是腫瘤抗原基因XAGE-1(包括XAGE-la，XAGE-lb，XAGE-lc和XAGE-ld)及其表達產物。本發(fā)明還提供基于XAGE-1及其表達產物的應用。本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的1.XAGE-1對腫瘤細胞體外增殖能力的影響分別將表達及干擾XAGE-lb的穩(wěn)定細胞株ACC2-Xb-19與ACCM-pG-Sh-a接種于96孔板，1X104細胞/孔，分別在之后的24h、48h、72h、96h，利用MTT法檢測細胞數(shù)量，結果發(fā)現(xiàn)ACC2-Xb-19與ACC2-Xb-M組細胞增殖能力顯著強于對照組細胞，ACCM-pG-Sh-a細胞增殖能力顯著弱于對照組細胞；分別將ACC-2與ACC-M細胞接種于96孔板，3乂103細胞/匕10h后感染Adv-lb，在此之后每隔12h利用MTT法檢測一次細胞數(shù)量，共6次，結果發(fā)現(xiàn)感染Adv-lb后的細胞增殖能力顯著強于對照組細胞;分別將ACC2-Xb-19與ACCM-pG-Sh-a細胞接種于6孔板，500細胞/孔，14d后結晶紫染色觀察記錄:ACC2-Xb-19組形成的集落數(shù)量顯著多于對照組，ACCM-pG-Sh-a組形成的集落數(shù)量顯著少于對照組；分別將感染病毒后的ACC-2與ACC-M細胞接種于6孔板，500細胞/L，10d后結晶紫染色觀察記錄Adv-lb感染后的細胞形成的細胞單克隆集落要顯著大于對照組。上述結果說明XAGE-l可以顯著地促進ACC-2及ACC-M細胞的體外增殖能力。2.XAGE-1對腫瘤細胞體外浸潤能力的影響使用QCMTM24-WellCellInvasionAssay,在上室孔中準確接種ACC2-Xb-19細胞，2Xl()S細胞/孔，48h后在下室中加入裂解及染色試劑，測量熒光強度并與標準曲線對照計算細胞數(shù)量，統(tǒng)計結果顯示穿膜的ACC2-Xb-19與ACC2-Xb-M組細胞數(shù)量顯著多于對照組；在每個Boyden小室中準確接入2X105^ACCM-pU-Sh-c細胞，24h后固定、染色、計數(shù)發(fā)現(xiàn)穿膜的ACCM-pU-sh-c組細胞數(shù)量顯著少于對照組；在6孔板中的0.6%的下層瓊脂之上，分別將腺病毒感染后的ACC-M細胞準確接種于0.3%的上層瓊脂中，500細胞/L，18d后計數(shù)上層平板內所有肉眼可見的細胞克隆，統(tǒng)計顯示Adv-lb感染后的ACC-M細胞的集落形成率顯著大于對照組。上述結果說明XAGE-1可以顯著地促進ACC-M細胞的體外浸潤能力。3.XAGE-1對腫瘤細胞體內增殖能力的影響選擇4-6周的雌性裸鼠，皮下注射細胞，2X105細胞/只，待成瘤體積至0.2-0.5cm3時，每隔3-4d測量一次腫瘤體積。接種4j吉r后處死小鼠，剝離腫瘤稱重，結果統(tǒng)計顯示接種ACC2-Xb-19與ACC2-Xb-M細胞的實驗組小鼠成瘤體積與重量均顯著大于對照組，接種ACCM-pG-Sh-a細胞的實驗組小鼠成瘤體積與重量均顯著小于ACCM組。由結果可知XAGE-1可以顯著地促進ACC細胞的體內增殖能力。4.XAGE-1對腫瘤細胞體內轉移能力的影響將上述裸鼠分組，尾靜脈注射細胞，7-8周后處死細胞。提取肺組織基因組，建立定量PCR方法，檢測組織中人與小鼠e2-微球蛋白分子拷貝數(shù)之比，以此計為腫瘤細胞的肺轉移率。統(tǒng)計結果顯示接種ACC2-Xb-19細胞的實驗組小鼠轉移率顯著大于對照組，接種ACCM-pU-Sh-c細胞的實驗組小鼠轉移率顯著低于對照組。由此可知XAGE-1可以顯著地促進ACC細胞的體內轉移能力。5.收集一定數(shù)量的肝細胞癌患者及正常人血液樣本，抽提RNA并反轉錄為cDNA。設計熒光定量PCR方法分析XAGE-lb的表達水平，統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)XAGE-lb單獨可以提高14.0%的診斷靈敏度，與AFP雙檢測指標可以提高33.3X。并可以輔助良性肝病的診斷，降低誤診率。6.采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)，擴增XAGE-la，lb兩種轉錄本的轉錄起始點上游序列，分別構建入報告基因載體，與對照質粒共轉染293T細胞，24h后檢測報告熒光強弱，用兩種熒光素酶的熒光強度比值表征DNA序列的轉錄活性。結果顯示(-654..+213)序列(以XAGE-la基因轉錄起始位點為原點)具有較高的轉錄調控活性。因此，XAGE-1具有促進體內外腫瘤細胞增殖及轉移能力的作用，XAGE-1可以成為腫瘤治療，尤其是抗轉移治療中的藥物靶點；我們所構建的真核RNA干擾質粒系統(tǒng)，如pG-Sh-a，pG-Sh-b，pU-Sh-c;腺病毒載體系統(tǒng)，如Adv-Sh-a與Adv-Sh-b;相關穩(wěn)定細胞株系統(tǒng)ACCM-pG-Sh-a，ACCM-pU-Sh-c,可以在以XAGE-1為靶點的腫瘤治療中發(fā)揮有效作用。另外，XAGE-l可以成為一個具有較高靈敏度與準確度的腫瘤標識物，有效提髙肝癌及其它腫瘤的診斷水平?？梢蚤_發(fā)基因診斷用熒光定量PCR試劑盒(主要成分是基于該基因序列的特異性探針與引物等)，依次類推可以開發(fā)其他類型的診斷試劑與手段用于腫瘤、基因檢測或細胞學研究，如分子生物學試劑RT-PCR、生物芯片等；基于XAGE-1的單克隆或多克隆抗體的試劑與手段ELISA、免疫磁珠、流式細胞技術、Western-Blot等；采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)對XAGE-1的轉錄調控機制分析表明(-654..+213)序列(以XAGE-la基因轉錄起始位點為原點)具有較高的轉錄調控活性，可以用于腫瘤生物治療。說明附1為XAGE-lb表達的RNA干擾分析，其中(a)為真核質粒介導對ACCM細胞內源XAGE-lb表達的RNA干擾分析，Lipo為lipofectamine2000對照組，Blank為空白對照'組，N為干擾對照質粒組，Sh-b為轉染pG-Sh-b的細胞，Sh-a為轉染pG-Sh-a的細胞；(b)為質粒pU-Sh-c對XAGE-lb的干擾效果，Sh-c為轉染pU-Sh-c的細胞組，N為干擾對照質粒組，ACCM為空白對照組。圖2為真核質粒介導XAGE-lb過表達對ACC2細胞增殖能力的影響，ACC2-pE-Negative為轉染pEGFP-Nl質粒的穩(wěn)定細胞株，ACC2-Xb-19為轉染pE-Xb的單克隆細胞株，ACC2-Xb-M為轉染pE-Xb的多克隆細胞株，從第二天起ACC2-Xb-19組細胞數(shù)量顯著大于ACC2-pE-Negative組(PO.Ol)，第四天起ACC2-Xb-M組細胞數(shù)量顯著大于ACC2-pE-Negative組(PO.Ol)，所示數(shù)據(jù)為3次重復間平均值，本實驗重復三次。圖3為腺病毒載體介導XAGE-lb過表達對ACC細胞增殖能力的影響，其中(a)為ACC2細胞增殖實驗結果示意圖；(b)為ACCM細胞增殖實驗結果示意圖，細胞增殖實驗所示數(shù)據(jù)為6個重復間平均值，實驗重復三次，實驗組與對照組差異顯著，P<0.01。圖4為干擾XAGE-lb表達對ACCM細胞增殖能力的影響，ACCM-pG-Negative為轉染干擾對照質粒的穩(wěn)定細胞株，ACCM-pG-Sh-a為轉染pG-Sh-a的穩(wěn)定細胞株，與對照相比ACCM-pG-Sh-a組細胞增殖能力顯著降低(PO.Ol)，所示數(shù)據(jù)為3次重復間平均值，本實驗重復三次。圖5為改變XAGE-lb表達水平對ACC細胞穿膜的影響，其中(a)為過表達XAGE-lb對ACC2細胞穿膜的影響；(b)為干擾XAGE-lb表達對ACCM細胞穿膜的影響，ACCM-pU-Negative為轉染干擾對照質粒的穩(wěn)定細胞株，ACCM-pU-Sh-c為轉染pU-Sh-c的穩(wěn)定細胞株，ACC2-Xb-M與ACC2-Xb-19組細胞數(shù)目顯著多于對照，ACCM-pU-Sh-c組細胞數(shù)目顯著少于對照，P<0.01(n=3)。圖6為XAGE-lb過表達對ACC腫瘤生長的影響，其中(a)為腫瘤生長曲線；(b)為實驗結束時各組腫瘤的體積差異；(c)為實驗結束時各組腫瘤的重量差異，Xb-M組與Xb-19組均和對照組差異顯著(PO.Ol)。圖7為干擾XAGE-lb表達對ACC腫瘤生長的影響，其中(a)為腫瘤生長曲線，(b)為實驗結束時各組腫瘤的體積差異，(c)為實驗結束時各組腫瘤的重量差異，ACCM-pG-Sh-a組與ACCM組差異顯著P<0.01。具體實施方式1.表達該基因的真核質粒及腺病毒載體的構建利用RT-PCR方法從ACC-McDNA中擴增得到XAGE-lbcDNA序列，插入pEGFP-Nl質粒(Clontech，MountainView,USA)得到XAGE-lb的真核表達載體pE-Xb。并且轉染ACC-2細胞(上海市第九人民醫(yī)院口外腫瘤實驗室)，利用G418抗性篩選該載體的穩(wěn)定細胞株ACC2-Xb-19〖単克隆"抹)，ACC2-Xb-M(多克隆株)。PCR擴增XAGE-lbcDNA序列并插入pAdTrack-CMV(Stragene，USA)質粒，穿梭質粒與骨架質粒pAdEasy-l(Stragene，USA)在BJ5183菌株(Stragene,USA)同源重組后得到重組質粒，重組質粒轉染293T細胞(ATCC，USA)后包裝得到成熟病毒粒子:Adv-lb。RT-PCR與Wetem-Blot均證明ACC-2-Xb-19及Adv-lb感染后的ACC-2細胞具有較高的XAGE-lb表達水平。2.表達siRNA(smallinterferingRNA)的真核質粒及腺病毒載體的構建選擇XAGE-lb開放閱讀框(ORF)的20-38與125-143序列為作用位點，分別將含有siRNA編碼序列的正反向shRNA編碼序列黏合后插入載體pGCsi-U6/Neo/RFP(Jikai，Shanghai)，得到兩種表達靶向XAGE-lb的siRNA的真核表達載體pG-Sh-a與pG-Sh-b;選擇XAGE-lb開放閱讀框(ORF)210-230序列為作用位點，將含有siRNA編碼序列的正反向shRNA編碼序列黏合后插入pcDNA3.1(U6)構建干擾質粒pU-sh-c。利用PCR將U6啟動子及shRNA序列由載體pG-Sh-a與pG-Sh-b上擴增下來，插入穿梭質粒pAdTrack-CMV。以同樣方法構建兩種表達靶向XAGE-lb的siRNA的腺病毒載體Adv-Sh-a與Adv-Sh-b。利用熒光報告基因及RT-PCR均證實pG-Sh-b與Adv-Sh-b的干擾效果較弱，pG-Sh-a，pU-sh-c與Adv-Sh-a的千擾效果較強，(圖1)。同時將質粒pG-Sh-a與pU-sh-c轉染ACC-M細胞(來自上海市第九人民醫(yī)院口外腫瘤實驗室)，利用G418抗性篩選得到該載體的穩(wěn)定表達細胞株ACCM-pG-Sh-a與ACCM-pU-sh-c。3應用舉例(l).XAGE-l對腫瘤細胞體外增殖能力的影響1-1細胞增殖實驗分別將表達及干擾XAGE-lb的穩(wěn)定細胞株ACC-2-Xb-19與ACCM-pG-Sh-a及對照組細胞接種于96孔板，lX10"細胞/孔。分別在之后的24h、48h、72h、96h，利用MTT法檢測細胞數(shù)量。SPSS15.0軟件統(tǒng)計實驗組與對照組的細胞數(shù)量差異發(fā)現(xiàn)過表達XAGE-lb后的細胞增殖能力顯著強于對照組細胞，干擾XAGE-lb表達后的細胞增殖能力顯著弱于對照組細胞，(圖2，4)。分別將ACC-2與ACC-M細胞接種于%孔板，3X103細胞/孔。10h后感染Adv-lb，在此之后每隔12h利用MTT法檢測一次細胞數(shù)量，共6次。SPSS15.0軟件統(tǒng)計實驗組與對照組的細胞數(shù)量差異發(fā)現(xiàn)感染Adv-lb后的細胞增殖能力顯著強于對照組細胞，(圖3)。1-2克隆形成實驗分別將表達及干擾XAGE-lb的穩(wěn)定細胞株ACC-2-Xb-19與ACCM-pG-Sh-a及對照組細胞接種于6孔板，500細胞/孔。Md后結晶紫染色觀察ie:錄ACC-2-Xb-19組形成的集落數(shù)量顯著多于對照組，ACCM-pG-Sh-a組形成的集落數(shù)量顯著少于對照組。1-3集落形成實驗分別將感染病毒后的ACC-2與ACC-M細胞接種于6孔板，500細胞/L。10d后結晶紫染色觀察記錄Adv-lb感染后細胞形成的單克隆集落顯著大于對照組。由以上可知XAGE-1可以顯著地促進ACC細胞的體外增殖能力。(2).XAGE-1對腫瘤細胞體外浸潤能力的影響2-1細胞穿膜實驗使用QCMTM24-WellCellInvasionAssay,在上室孔中準確接種ACC-2-Xb-19及對照細胞，2><105細胞/孔。48h后在下室中加入裂解及染色試劑，測量熒光強度，與標準曲線對照計算細胞數(shù)量。統(tǒng)計結果顯示ACC-2-Xb-19與ACC-2-Xb-M組細胞數(shù)量顯著多于對照組；在每個Boyden小室中準確接入2X105個ACCM-pU-Sh-c及對照組細胞，24h后固定、染色、計數(shù)發(fā)現(xiàn)穿膜的ACCM-pU-Sh-c組細胞數(shù)量顯著少于對照組，(圖5)。2-2軟瓊脂集落形成實驗在6孔板中的0.6n/。的下層瓊脂(含lX完全培養(yǎng)基)之上，分別將腺病毒感染后的ACC-M細胞準確接種于0，/。的上層瓊脂(含1X完全培養(yǎng)基)中，500細胞/孔。18d后計數(shù)上層平板內所有肉眼可見的細胞克隆。統(tǒng)計顯示Adv-lb感染后的ACC-M細胞的集落形成率顯著大于對照組，(表l)。由以上可知XAGE-1可以顯著地促進ACC-M細胞的體外浸潤能力。表1ACCM細胞軟瓊脂集落形成實驗實驗分組細胞集落數(shù)/個集落形成率/%Adv-zero組140±728.0空白對照組136±1427.2Ack-lb組217±1543.4**p<0.01(3).XAGE-對腫瘤細胞體內增殖能力的影響選擇4-6周的雌性裸鼠(BALb/cnu/nu〉(由第二軍醫(yī)大學動物實驗中心提供)，皮下注射細胞，2Xl()S細胞/只。待成瘤體積至0.2-0.5cm3時，每隔3-4d測量一次腫瘤體積(V=l/2ab2，a:長徑，b:短徑)。接種4周后處死小鼠，剝離腫瘤稱重。結果統(tǒng)計顯示接種ACC-2-Xb-19與ACC-2-Xb-M細胞的實驗組小鼠成瘤體積與重量均顯著大于對照組，接種ACCM-pG-Sh-a細胞的實驗組小鼠成瘤體積與重量均顯著小于ACCM組。由此可知XAGE-1可以顯著地.促進ACC-M細胞的體內增殖能力，(圖6，7)。(4).XAGE-1對腫瘤細胞體內轉移能力的影響將上述裸鼠分組，尾靜脈注射細胞，7-8周后處死細胞。提取肺組織基因組，建立定量PCR方法，檢測組織中人與小鼠P2-微球蛋白分子拷貝數(shù)之比，以此計為腫瘤細胞的肺轉移率。統(tǒng)計結果顯示接種ACC-2-Xb-19細胞的實驗組小鼠轉移率顯著大于對照組，接種ACCM-pU-Sh-c細胞的實驗組小鼠轉移率顯著低于對照組。由此可知XAGE-1可以顯著地促進ACC細胞的體內轉移能力，(表2，3)。表2過表達XAGE-lb對ACC腫瘤肺轉移的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實驗期間每組小鼠存活數(shù)；*p<0.01表3過表達XAGE-lb對ACC腫瘤肺轉移的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>a實驗期間每組小鼠存活數(shù)；'p<0.01(5).抽提收集的腫瘤血液樣本RNA并反轉錄為c隨A，利用Taq-Man定量PCR方法分析XAGE-lb的表達水平，以GAPDH為內參照，XAGE-lb正常值界定為正常人表達范圍(P2.275-P97725)的上限，AFP正常值界定為20pg/L。結果發(fā)現(xiàn)肝細胞癌患者的XAGE-1。陽性率68.4。/。(n=57)，顯著高于良性肝病患者的26.5%(n=34)與正常人的4%(n=50)(f5<0.01，卡方檢驗)，但與其他類型腫瘤患者的46.2%(n=13)無顯著差異；XAGE-lb單獨可以提高14.0%的診斷靈敏度，與AFP雙檢測指標可以提高33.3%，并可以輔助良性肝病的診斷，降低誤診率；21例雙檢測指標陽性的肝病患者中，肝細胞癌患者占95.2%，顯著多于良性肝病患者，(表4，5)。由此可見XAGE-1可以成為肝癌尤其是肝細胞癌一較好的標識物，提高肝癌的診斷水平。(6)采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)(螢火蟲熒光素酶報告載體pGL3-Basic與，海腎焚光素酶報告載體pRL-SV40,Promega公司)，分別擴增XAGE-la,lb兩種轉錄本的轉錄起始點上游序列，(表6),構建入報告基因載體，與對照質粒共轉染293T細胞，24h后檢測報告熒光強弱，用兩種熒光素酶的熒光強度比值表征DNA序列的轉錄活性。分析表明-A1,A2,A3的轉錄活性都很低，和陰性對照組接近；B1,B2,B3轉錄活性較高，B3>B2>B1,轉錄活性隨著片段增長而增加。Bl、B2、B3片段分別相對應的A1、A2、A3在結構上的差異，僅僅是其3'端多出(+31..+213)長為181bp的一段，大致覆蓋了基因組上XAGE-la和XAGE-lb的轉錄起點之間的區(qū)域。這一段區(qū)域是造成A、B兩組片段轉錄活性巨大差異的主要原因，B1、B2、B3的轉錄活性均呈現(xiàn)近似線性的遞增趨勢，提示整個(-654..+213)范圍內均為啟動子區(qū)域，且在(-654..+31)區(qū)域存在正調控元件。表4XAGE-lbmRNA與AFP在肝細胞癌患者血液中的檢測結果AFPXAGE陽lbmRNA+一合計+20(35.1)11(19.3)31(54.4)一19(33.3)7(12.3)26(45.6)合計39(68.4)18(31.6)57括號內為占樣本總數(shù)的百分比表5XAGE-lbmRNA與AFP在良性肝病患者血液中的檢測結果AFP-XAGE-lbmRNA+—合計+1(2.9)11(32.4)12(35.3)—8(23.6)14(41.1)22(64.7)合計9(26.5)25(73.5)34括號內為占樣本總數(shù)的百分比4.具體應用免疫學手段是一種很有潛力的診治惡性腫瘤的方法，也是近年來抗腫瘤研究熱點之一，其首要目標在于確認腫瘤抗原，以有針對性地實施治療。其中最為著名的是腫瘤-睪丸抗原(CT抗原)，其嚴格的限制性分布為精確的癌癥免疫療法提供了新的可能。以老鼠為模型的實驗提示類似人CT抗原的鼠P815AB抗原在鼠睪丸、胎盤上的分布并不影響P815AB在其他部位的免疫原性；同時，誘導對P815AB的細胞毒反應后，小鼠生殖未受干擾。1999年進行的一項MAGE-A3疫苗人體研究中，25名完成疫苗治療的III，IV期黑色素瘤病人中有7名出現(xiàn)顯著改善，且所有病例均未出現(xiàn)明顯的副作用?？梢?，CT抗原具有有效的免疫原性和潛在的臨床表6擴增得到的DNA序列<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>表7熒光強度數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>Ml/M2比值，表征插入片段的轉錄活性，M1和M2分別為螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的熒光強度，單位是相對熒光強度單位(RLU)。相對值為除以PGL-3組后得到的相對轉錄活性。上述研究并未涉及XAGE-1，而該說明書闡述的正是該基因及其表達產物在腫瘤生長與轉移方面的重要功能及其與腫瘤的相關性，顯示了XAGE-1在腫瘤治療與診斷應用方面重要的價值。首先，鑒于該基因在腫瘤生長與轉移中的重要作用，該基—因及其編^產^I以"作為A及其他哺乳動物的抗腫瘤治療，尤其是抗轉移治療的藥物靶點，減少腫瘤轉移率，提高腫瘤的治療水平。其次，利用基因工程手段所構建的真核質?；蚬δ芨蓴_系統(tǒng)，如:pG-Sh-a，pG-Sh-b，pU-sh-c;腺病毒載體基因功能干擾系統(tǒng)，如Adv-Sh-a與Adv-Sh-b，及相關穩(wěn)定細胞株系統(tǒng)，如ACCM-pG-Sh-a,ACCM-pU-Sh-c可以在以XAGE-1為靶點的腫瘤治療中發(fā)揮有效作用，并且XAGE-1特異性啟動子也可用于腫瘤治療。最后，XAGE-1可以成為一個具有較高靈敏度與準確度的肝癌尤其是肝細胞癌的分子標識物，有效地提高肝癌，尤其是早期肝癌的診斷水平，從而該基因可以用來開發(fā)各種試劑或手段用于腫瘤或基因診斷。雖然本說明書中的功能研究是以涎腺腺樣囊性癌及其細胞株為例的，診斷標志研究是以肝癌為例的，但如上所述，XAGE-1的腫瘤表達譜是比較廣泛的，從而XAGE-l可以用于各種具有該基因較高表達水平的腫瘤治療及診斷。權利要求1、一種腫瘤睪丸抗原基因XAGE-1及其表達產物作為人或其他哺乳動物的抗腫瘤治療藥物靶點的應用。2.利用基因工程手段構建的干擾腫瘤睪丸抗原基因XAGE-1的質粒系統(tǒng)pG-Sh-a，pG-Sh-b，pU-Sh-c;腺病毒載體系統(tǒng)Adv-Sh-a，Adv-Sh-b;細胞株系統(tǒng)ACCM-pG-Sh-a，ACCM匿p(J-Sh-Co3.—種腫瘤睪丸抗原基因XAGE-1的特異性啟動子，該啟動子為以XAGE-la基因轉錄起始位點為原點的-654..+213序列。4、一種腫瘤睪丸抗原基因XAGE-1及其表達產物在制備腫瘤基因診斷試劑盒中的應用，該試劑盒主要成份包括腫瘤睪丸抗原基因XAGE-1的特異性探針與引物。5、一種腫瘤睪丸抗原基因XAGE-1及其表達產物在制備腫瘤生物學試劑RT-PCR或生物芯片中的應用。全文摘要本發(fā)明屬于基因治療和診斷
技術領域：
，具體為一種腫瘤抗原——XAGE-1基因及其表達產物在腫瘤治療和診斷中的應用。該發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)XAGE-1基因在腫瘤生長和轉移中具有重要作用，并且是腫瘤的重要標志物。研究結果證明XAGE-1可以促進涎腺腺樣囊性癌細胞及其它各種腫瘤細胞的增殖、轉移及浸潤能力。所以該基因及其表達產物可以作為藥物靶點，開發(fā)各種腫瘤治療藥物尤其是抗腫瘤生長和轉移的藥物；XAGE-1及其表達產物可作為腫瘤的標志物用于腫瘤診斷和病情分析，用來開發(fā)各種診斷試劑盒及方法，大大提高腫瘤，尤其是早期腫瘤的診斷水平；根據(jù)XAGE-1的轉錄調控機制，其特異性調控序列可以應用于腫瘤治療等方面。文檔編號A61K48/00GK101270360SQ20081003745公開日2008年9月24日申請日期2008年5月15日優(yōu)先權日2008年5月15日發(fā)明者洋劉,宋玉亮,朱乃碩申請人:復旦大學