專利名稱：：具有增強的免疫刺激活性的含疏水性T類似物的CpG寡聚核苷酸類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明大體上涉及免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體而言，本發(fā)明涉及具有增強的免疫刺激能力的治療性寡聚核苷酸。
背景技術(shù)：
：細(xì)菌DNA具有激活B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的免疫刺激作用，但脊推動物DNA則否(Tokunaga,T,等，1988，JCa"ceri仏79:682-686;Tokunaga，T.等，1984,72:955-962;Messina，J.R等，1991，//www"o/.147:1759-1764;并且在下述文件中進(jìn)行了綜述Krieg，1998，In:AppliedOligonucleotideTechnology,C.A.Stein和A.M.Krieg,(編)，JohnWileyandSons,Inc.,NewYork,NY，pp.431-448)?，F(xiàn)已得知細(xì)菌DNA的這些免疫刺激作用是在特殊堿基內(nèi)容(CpG模體)中存在未曱基化的CpG的結(jié)果，這種未曱基化的CpG在細(xì)菌DNA中是常見的，但在脊推動物DNA中被曱基化并表達(dá)不足(underrepresented)(Krieg等，1995Nature374:546-549;Krieg,1999Biochim.Biophys.Acta93321:1-10)。細(xì)菌DNA的免疫刺激作用可由含有這些CpG^t體的合成寡聚脫氧核苷酸(ODN)模擬。這些CpGODN對人和鼠白細(xì)胞(包括B細(xì)胞)增殖、細(xì)胞因子和免疫球蛋白分泌、自然殺傷(NK)細(xì)胞溶解活性和IFN-y分泌、以及樹突狀細(xì)胞(DC)和其它表達(dá)共刺激分子并分泌細(xì)胞因子(尤其是在促進(jìn)類Thl的T細(xì)胞應(yīng)答的發(fā)展中起重要作用的類Thl細(xì)胞因子)的抗原呈遞細(xì)胞的激活具有高刺激作用。天然磷酸二酯骨架CpGODN的這些免疫刺激作用具有很高的CpG特異性，因為如果CpG模體被曱基化、變?yōu)镚pC、或者被去掉或改變，則這些作用顯著降^[氐(Krieg等，1995Nature374:546-549;Hartmann等，1999Proc.Natl.Acad.SciUSA96:9305-10)。在早期研究中，認(rèn)為免疫刺激CpG模體遵循式嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶(Krieg等，1995Nature374:546-549;Pisetsky，1996J.Immunol.156:421-423;Hacker等，1998EMBOJ.17:6230-6240;Lipford等，1998TrendsinMicrobiol.6:496-500)。然而，現(xiàn)在已經(jīng)清楚鼠淋巴細(xì)胞對不遵循該"式，，的磷酸二酯CpG模體有很強的應(yīng)答(Yi等，1998J.Immunol.160:5898-5906)，人類B纟田月包和樹突狀纟田胞也是如此(Hartmann等，1999Proc.Natl.Acad.SciUSA96:9305-10;Liang,1996J.Clin.Invest.98:1119-1129)。最近已描述了數(shù)種不同類的CpG核酸。一類有可能激活B細(xì)胞，但在誘導(dǎo)IFN-a和NK細(xì)胞活化方面相對弱；該類被命名為B類。B類CpG核酸通常是非常穩(wěn)定的，并在某些優(yōu)選堿基內(nèi)容(basecontext)中包含未曱基化的CpG二核苷酸。參見，例如，美國專利6,194,388、6,207,646、6，214，806、6,218,371、6,239,116和6,339,068。另一類CpG核酸激活B細(xì)胞和細(xì)胞，并且誘導(dǎo)IFN-a;這類已被命名為C類。C類CpG核酸，如首先所表征的，通常是完全穩(wěn)定的，其包含B類類型的序列和富含GC的回文或近似回文。這一類已經(jīng)在2001年8月17日提交的共同未決的美國臨時專利申請60/313，273、2002年8月19日提交的US10/224,523和以國際公開號WO03/015711公開的相關(guān)PCT專利申請PCT/US02/26468中進(jìn)行了描述。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種寡聚核苷酸，其包含一種和多種能引起增強的免疫刺激能力的修飾。具體而言，本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)具有至少一個親脂性取代核苷酸類似物的特定的寡聚核苷酸亞類能非常有效地調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。這些寡聚核苷酸能治療性地和預(yù)防性地用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和用于治療諸如癌癥和病毒感染之類的疾病和功能紊亂。在一個方面，本發(fā)明是一種包含序列R!YZR2的組合物，其中R,和R2表示親脂性取代核苷酸類似物(L)、核苷酸和鍵(linkage)，其中和R2中的至少一個是親脂性取代核苷酸類似物(L),其中Y是嘧啶核芬酸，且其中Z是噪呤、嘧啶或脫石威基殘基(abasicresidue)。在一些實施方式中，L包含5或6元環(huán)的核石威基類似物(nucleobaseanalog)。在本發(fā)明這一方面的其它實施方式中，L是下式I的基團(tuán)X式I該式中具有以下元素A、B、X、D、E和F,它們是選4奪性地具有氫或取代基的C(碳)或N(氮)；n是0或l;虛線表示選擇性的雙鍵；其中至少一個取代基不是從下組中選擇氧代、硫代、羥基、巰基、亞氨基、氨基、曱基和氫，并且A、B、X、D、E和F原子中總共不超過3個氮(N)。在一些情況中，n是l，而在另一些情況中n是0。在一些實施方式中，A、B、X、D、E和F原子都是碳(C)。在一些實施方式中，A、B、X、D、E和F原子中的一個、兩個或三個是氮(N)。根據(jù)一些實施方式，A、B、X、D、E和F原子中的至少一個被以下基團(tuán)之一所取代F、Cl、Br、I、烷基、烯基、炔基、卣代烷基、卣代烯基、環(huán)烷基、O-烷基、O-烯基、-NH-烷基、-N(烷基)2;-S-烷基、-SO-烷基、-SOr烷基、硝基、氰基、羧酸酯、苯基、苯硫基、芐基、氧代、硫代、羥基、巰基和亞氨基，其中至少一個取代基不是氧代、硫代、羥基、巰基、亞氨基、氨基或曱基。根據(jù)其它實施方式，A或E這兩個原子中一個被F、Cl、Br、I、C2-CV烷基、烯基、炔基、卣代烷基、鹵代烯基、環(huán)烷基、O-烷基、O-烯基、-NH-烷基、"N(烷基)2;-S-烷基、-SO-烷基、-S(V烷基、硝基、氰基、羧酸酯、苯基、苯硫基、千基或曱基所取代，條件是如果被曱基取代，則A、B、X、D、E和F全是C。在一些實施方式中，式I包括取代嘧咬、尿嘧，定、甲苯、咪唑或吡唑或三唑。根據(jù)其它實施方式，式I選自5-氯-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧啶、5-乙基-尿嘧啶、5-丙基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、(E)-5-(2-溴乙烯基)-尿嘧啶和2，4-二氟-曱苯。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，與3至6元芳環(huán)或脂環(huán)體系相稠合。根據(jù)其它實施方式，式I與5至6元的糖部分(sugarmoiety)相連接，所述5至6元糖部分包括戊糖或己糖。在一些情況下，戊糖是呋喃糖，己糖是吡喃糖，它們可選擇性地被F、氨基、烷氧基、烷氧基-乙氧基、氨基丙基、烯基、炔基或02,C4-亞烷基橋(02,C4-alkylenebridge)所取代。在其它情況下，戊糖是核糖或脫氧核糖。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，R,和R2都是L。在一些實施方式中，R,是L，且R2是核苷酸。另一種方式，在一些情況下，R,是L,且R2是#:，因此寡聚核苷酸包含結(jié)構(gòu)5'R!CG3'。其它實施方式包括這樣的寡聚核苷酸其中R!是L,R2是鍵，且其中R3位于R!YZ的5'，因此寡聚核苷酸包含結(jié)構(gòu)5'RsI^YZ3'。在一些實施方式中，R是L，且R2是鍵，且其中第二個R^位于RJZ的5'并與R,YZ通過一個核苷酸N隔開，因此寡聚核苦酸包含結(jié)構(gòu)5'R^NR,YZ3'。在一些情況下，寡聚核苷酸包含兩個5'R,NR,YZ3'模體。根據(jù)一些實施方式，寡聚核苷酸包括Y，所述Y是以下嘧啶之一胞嘧啶、5-曱基-胞嘧啶、5-羥基-胞嘧啶、5-羥曱基-胞嘧啶、5-卣素-胞嘧啶、2-硫代-胞嘧啶、4-硫代-胞嘧啶、N3-曱基-胞嘧啶、N4-烷基-胞嘧咬或6-取代胞嘧啶。根據(jù)一些實施方式，寡聚核苷酸包括Z，所述Z是包括下述的嘌呤核苷酸鳥噤呤、7-脫氮-鳥噪呤、次黃噪呤、7-脫氮-次黃嘌呤、2-氨基-嘌呤、4-硫代-嘌呤、2.6-二氨基-嘌呤、8-氧代-7，8-二氫鳥嘌呤、7-硫代-8-氧代-7,8-二氫鳥嘌呤、7-烯丙基-8-氧代-7，8-二氫鳥噪呤、7-脫氮-8-氮-鳥嘌呤、8-氮-鳥嘌呤、Nl-曱基-鳥嘌呤或嘌呤。在其它實施方式中，Z是包括T的嘌呤核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，R2是L，且R,是核苷酸。根據(jù)一些實施方式，寡聚核普酸的長度為3個核苷酸；例如，寡聚核香酸的長度為3-6個核苷酸、長度為3-100個核苷酸或長度為7-100個核苷酸。在一些情形下，寡聚核苷酸富含T，由此使得至少80%的核苷酸是T。本發(fā)明包括含有至少一個回文序列的實施方式。例如，在一些情況下，寡聚核苷酸包含兩個回文結(jié)構(gòu)。根據(jù)本發(fā)明，一些實施方式包括一至四個未曱基化的CG二核苷酸。在一些實施方式中，包含至少一個(G)m序列，其中m為4至10。在一些情況下，至少一個但至多所有的CG二核苷酸均未被曱基化。根據(jù)一些實施方式，寡聚核苷酸另外還包含非核普酸修飾(non-nucleotidicmodification)。所述非核苷酸修飾包括但不限于C6-C48-聚乙二醇、C3-C2『烷-二醇、C3-C,8-烷基氨基連接子和CVC，8-烷基硫醇連接子、膽固醇、膽汁酸、飽和或不飽和脂肪酸、葉酸、十六烷基-甘油或二(十六烷基)甘油基團(tuán)、十八烷基-甘油或二(十八烷基)-甘油基團(tuán)、維生素E基團(tuán)。在另一些實施方式中，本發(fā)明的寡聚核苷酸進(jìn)一步包括非核苷酸分枝部分或核苷酸分枝部分。在一些實施方式中，寡聚核苷酸包括分枝部分(branchermoiety),其中所述寡聚核苷酸具有至少兩個5'-末端。根據(jù)本發(fā)明，一些實施方式包括所述寡聚核苷酸的至少兩個核苷酸具有穩(wěn)定鍵，所述穩(wěn)定鍵包括硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、曱基磷酸酯鍵、曱基硫代磷酸酯鍵、硼代磷酸酯鍵、氨基磷酸酯鍵或脫磷鍵(dephospholinkage),它們是對映體混合物或者是對映體純的S或R構(gòu)型。在另一些實施方式中，R，YZR2中的YZ具有磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵。在一些情況下，R,YZR2中的R,Y和/或ZR2具有硫代磷酸酯鍵。在一些實施方式中，所有其它寡聚核苷酸具有硫代磷酸酯鍵。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，寡聚核苷酸不含包括脂質(zhì)載體在內(nèi)的微載體。根據(jù)本發(fā)明，寡聚核苷酸可以是A類寡聚核苷酸、B類寡聚核苷酸、C類寡聚核苷酸、P類寡聚核苷酸或T類寡聚核苷酸。對于本發(fā)明的B類寡聚核苷酸，一些實施方式包括序列5'TCN,TX!X2CGX3X43'，其中Xi是G或A;X2是T、G或A;Xs是T或C;X4是T或C;且N是任何核苷酸，Ni和N2是各自由約0-25個N構(gòu)成的核普酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，寡聚核苷酸包括至少一個3'-3'鍵和/或至少一個5'-5'4建。在另一方面，本發(fā)明是本文所描述的寡聚核苷酸與抗原或諸如抗微生物劑之類的其它治療化合物的組合物?？刮⑸飫┛梢允?，例如，抗病毒劑、抗寄生蟲劑、抗細(xì)菌劑或抗真菌劑。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種包括本文所述的寡聚核苷酉吏的持續(xù)釋》文裝置(sustainedreleasedevice)的纟且合物。該組合物可選擇性地包括藥物載體和/或在輸送裝置中配制。在一些實施方式中，輸送裝置選自陽離子脂質(zhì)、細(xì)胞滲入蛋白和持續(xù)釋放裝置。在一些實施方式中，持續(xù)釋放裝置是可生物降解的聚合物或微粒。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種刺激免疫應(yīng)答的方法。該方法包括對受試對象施用能夠有效地在該受試對象體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的量的寡聚核苷酸。優(yōu)選寡聚核苷酸通過下述方式施用經(jīng)口、局部、在持續(xù)釋放裝置中、經(jīng)粘膜、全身性地、腸胃外或肌內(nèi)施用。當(dāng)寡聚核普酸施用至粘膜表面時，其可以以有效地誘導(dǎo)粘膜免疫應(yīng)答或全身性免疫應(yīng)答的量來輸送。在優(yōu)選實施方式中，粘膜表面選自口、鼻、直腸、陰道和眼睛表面。在一些實施方式中，本發(fā)明包括將受試對象與抗原接觸，其中免疫應(yīng)答是抗原特異性免疫應(yīng)答。在一些實施方式中，抗原選自腫瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、寄生蟲抗原和肽抗原。寡聚核香酸可用于在患有癌癥的受試對象中或在具有患癌癥風(fēng)險的受試對象中治療癌癥(例如，降低癌癥發(fā)生風(fēng)險)。這些癌癥可選自膽道癌、乳腺癌、子宮頸癌、絨毛膜癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌、上皮內(nèi)腫瘤、淋巴瘤、肝癌、肺癌(例如小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)、黑色素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、口癌(oralcancer)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、直腸癌、肉瘤、曱狀腺癌和腎癌，以及其它癌及肉瘤。在一些重要的實施方式中，癌癥選自骨癌、大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌、結(jié)締組織組織癌、食道癌、眼癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin，slymphoma),喉癌、口月空癌(oralcavitycancer)、皮月夫癌和睪丸癌。選擇性地，當(dāng)CpG免疫刺激性寡聚核苦酸與抗癌療法聯(lián)合施用時，寡聚核苷酸也可用于提高癌細(xì)胞對癌癥療法(例如抗癌療法)的應(yīng)答性。這些抗癌療法可以是化療、疫苗(例如，體外已接觸抗原的樹突狀細(xì)胞疫苗或癌癥抗原疫苗)或抗體類療法。后一種療法也可包括施用對例如癌細(xì)胞的細(xì)胞表面抗原具有特異性的抗體，其中免疫應(yīng)答導(dǎo)致抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)。在一個實施方式中，抗體選自瑞布他辛(Ributaxin)、赫塞汀(Herceptin)、套左門特(Quadramet)、盤諾瑞克斯(Panorex)、IDEC匿Y2B8、BEC2、C225、昂可林(Oncolym)、SMARTM195、ATRAGEN、歐瓦瑞克斯(Ovarex)、百克沙(Bexxar)、LDP-03、iort6、MDX-210、MDX-ll、MDX-22、OV103、3622W94、抗-VEGF、塞尼咪(Zenapax)、MDX-220、MDX-447、MELIMMUNE-2、MELIMMUNE-1、CEACIDE、預(yù)耙定(Pretarget)、NovoMAb-G2、TNT、Gliomab畫H、GNI-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA676、Monopharm-C、4B5、ioregf,r3、iorc5、BABS、抗匿FLK畫2、MDX陽260、ANAAb、SMART1D10Ab、SMARTABL364Ab和ImmuRAIT畫CEA。因此，根據(jù)本發(fā)明的一些方面，向患有癌癥或者具有患癌癥風(fēng)險的受試對象施用寡聚核苷酸和抗癌療法。在一些實施方式中，抗癌療法選自化療劑、免疫治療劑和癌癥疫苗。本發(fā)明在其它方面涉及防治受試對象的疾病的方法。該方法包括定期向受試對象施用寡聚核苷酸以提高免疫系統(tǒng)應(yīng)答，從而防治受試對象的疾病。采用本發(fā)明的預(yù)防方法進(jìn)行防治的疾病和病癥的例子包括細(xì)菌感染(例如性傳播疾病)和因食物過敏而導(dǎo)致的過敏性休克。在另一方面，本發(fā)明是一種通過向受試對象施用能有效激活先天免疫應(yīng)答(innateimmuneresponse)的量的寡聚核苷酸以誘導(dǎo)先天免疫應(yīng)答的方法。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種治療病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的方法。該方法涉及向患有病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染或者具有患病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的風(fēng)險的受試對象施用能有效治療病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的量的任何本發(fā)明的組合物。在一些實施方式中，病毒感染由例如乙肝病毒、丙肝病毒、HIV、皰滲病毒或乳頭狀瘤病毒之類的病毒引起。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種治療細(xì)菌感染的方法。該方法包括向患有細(xì)菌感染或具有患細(xì)菌感染的風(fēng)險的受試對象施用能有效治療細(xì)菌感染的量的任何本發(fā)明的組合物。在一個實施方式中，細(xì)菌感染由細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌引起。根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種治療寄生蟲感染的方法。該方法包括向患有細(xì)菌感染或具有患寄生蟲感染的風(fēng)險的受試對象施用能有效治療寄生蟲感染的量的任何本發(fā)明的組合物。在一個實施方式中，寄生蟲感染由細(xì)胞內(nèi)寄生蟲引起。在另一個實施方式中，寄生蟲感染由非腸道寄生蟲引起。在一些實施方式中，受試對象是人；在其它實施方式中，受試對象是選自下組的非人脊推動物狗、貓、馬、牛、豬、火雞、山羊、魚、猴子、雞、大鼠、小鼠和綿羊。在其它方面，本發(fā)明涉及一種通過向患有自免疫疾病或具有患自免疫疾病的風(fēng)險的受試對象施用能有效治療或防治自免疫疾病的量的任何本發(fā)明的組合物從而治療自免疫疾病的方法。本發(fā)明在一些方面是一種治療氣道重塑(airwayremodeling)、哮喘或過敏的方法，所述方法包括對受試對象施用能有效治療受試對象的氣道重塑、哮喘或過敏的量的任何本發(fā)明的組合物。在一個實施方式中，受試對象患有哞喘、慢性阻塞性肺疾病，或者受試對象是吸煙者。在其它實施方式中，受試對象沒有哮喘癥狀。作為本發(fā)明的一個方面，還提供了本發(fā)明的寡聚核苷酸用于刺激免疫應(yīng)答的應(yīng)用。還提供了一種用于刺激免疫應(yīng)答的本發(fā)明的寡聚核苷酸藥物的制造方法。本發(fā)明的每一條限制可包含本發(fā)明的各種實施方式。因此，可預(yù)期的是，涉及任一要素或要素組合的每一條本發(fā)明的限制均能包含在本發(fā)明的每個方面之中。本發(fā)明并非將其應(yīng)用局限于在以下描述中闡述的或者在附圖中描述的各個部分的構(gòu)造和布局的細(xì)節(jié)之中。本發(fā)明可具有其它實施方式并且以各種方式得以實踐或進(jìn)行實施。同樣，在本文中使用的短語和術(shù)語是出于描述的目的而不應(yīng)當(dāng)被當(dāng)作進(jìn)行限制。本文中"包括"、"包含"或"具有"、"含有"、"涉及"，以及其各種變化方式的使用意指涵蓋其后所羅列的條目及其等效方式以及額外的條目。圖1是舉例說明本發(fā)明的經(jīng)修飾的堿基結(jié)構(gòu)的兩幅圖。圖la顯示了CpG六聚體模體(GTCGTT)部分。圖lb顯示了摻入的疏水性2'-脫氧胸腺嘧啶的形狀類似物2,4-二氟曱苯(FF)、5-溴尿嘧啶(BU)和5-碘尿嘧啶(JU)。圖2是顯示了用胸腺嘧啶形狀類似物2,4-二氟曱苯(FF)修^飾的B類寡聚核苷酸進(jìn)行熒光素酶檢測結(jié)果的圖形。FF修飾的ODN(SEQIDNO:3-9)的活性與未經(jīng)修飾的B類母本序列(SEQIDNO:l)、完全PS母本序列(SEQIDNO:2)和第三未經(jīng)修飾的B類ODN(SEQIDNO:37)的活性進(jìn)行比較。用指定量的ODN刺激hTLR9-LUC-293細(xì)胞，并通過測量16小時后的焚光素酶活性來測定NF-KB刺激。x軸是單位為的logODN濃度，y軸是相對刺激指數(shù)。圖3是描述用經(jīng)修飾的B類ODN進(jìn)行熒光素酶檢測結(jié)果的圖形。胸腺嘧啶(T)被5-溴-2'-脫氧尿嘧啶(BU)(SEQIDNO:10-12)和5-碘-2'-脫氧尿嘧啶(JU)(SEQIDNO:13-15)替代。它們的活性與未經(jīng)修飾的B類母本序列(SEQIDNO:l)、完全PS母本序列(SEQIDNO:2)和第三未經(jīng)修飾的B類ODN(SEQIDNO:37)的活性進(jìn)行比較。用指定量的ODN刺激hTLR9-LUC-293細(xì)胞，并通過測量16小時后的熒光素酶活性測定NF-kB刺激。x軸是logODN濃度(單位為pM)，y軸是相對刺激指數(shù)。圖4是描述用經(jīng)修飾的B類ODN進(jìn)行熒光素酶檢測結(jié)果的圖形。2'-脫氧胸腺嘧啶(T)被2'-脫氧尿嘧啶(U)(SEQIDNO:16-18)替代。U-經(jīng)修飾的ODN的活性與未經(jīng)修飾的B類母本序列(SEQIDNO:l)、完全PS母本序列(SEQIDNO:2)和第三未經(jīng)修飾的B類ODN(SEQIDNO:37)的活性進(jìn)行比較。用指定量的ODN刺激hTLR9-LUC-293細(xì)胞，并通過測量16小時后的熒光素酶活性測定NF-kB刺激。x軸是logODN濃度(單位為I^M),y軸是相對刺激指數(shù)。圖5是描述用經(jīng)修飾的B類ODN進(jìn)行熒光素酶檢測和PBMC檢測結(jié)果的兩幅圖形。具有5-乙基-2'-脫氧尿嘧啶(EU)(SEQIDNO:42)、2'-脫氧尿嘧啶(U)(SEQIDNO:16)、5-碘-2'-脫氧尿嘧啶(JU)(SEQIDNO:13)、5-溴-2'-脫氧尿嘧啶(BU)(SEQIDNO:10)和5-氯-2'-脫氧尿嘧啶(CU)(SEQIDNO:41)的ODN的相對活性與母本序列(SEQIDNO:l)的活性進(jìn)行比較。圖5a顯示了TLR9活性，圖5b顯示了IFN-a的產(chǎn)生。顯示的是三個供體的平均+/-SEM。x軸是單位為！iM的ODN濃度，y軸是相對刺激指數(shù)(圖5a)或單位為pg/ml的IFN-a濃度(圖5b)。圖6是描述用EU修飾的ODN進(jìn)行熒光素酶檢測結(jié)果的圖形。EU2、30和42的活性與母本序列和其它未經(jīng)修飾的B類ODN(SEQIDNO:37)的活性進(jìn)行比較。x軸是單位為的ODN濃度，y軸是相對刺激指數(shù)。圖7是描述用經(jīng)修飾的B類ODN進(jìn)行熒光素酶檢測結(jié)果的圖形。JU修飾的SEQIDNO:19-24的活性與母本序列SEQIDNO:37的活性相比。x軸是單位為pM的ODN濃度，y軸是相對刺激指數(shù)。圖8是描述用經(jīng)修飾的A類ODN進(jìn)行熒光素酶檢測和PBMC檢測結(jié)果的兩幅圖形。JU修飾的SEQIDNO:35-37的活性與未經(jīng)修飾的母本序列(SEQIDNO:43)和未經(jīng)修飾的B類ODNSEQIDNO:1的活性進(jìn)行比較。圖8a顯示了TLR9活性，圖8b顯示了IFN-a的產(chǎn)生。顯示的是三個供體的平均+/-SEM。x軸是logODN濃度(圖8a)或ODN濃度(圖8b)(單位為pM),y軸是相對刺激指數(shù)(圖8a)或IFN-a濃度(單位為pg/ml(圖8b)。圖9是描述用經(jīng)修飾的A類ODN進(jìn)行熒光素酶檢測結(jié)果的圖形。JU修飾的C類ODNSEQIDNO:27-28和44-45的活性與未經(jīng)修飾的母本序列SEQIDNO:45和未經(jīng)修飾的B類ODN(SEQIDNO:37)的活性進(jìn)行比較。x軸是單位為pM的ODN濃度，y軸是相對刺激指數(shù)。圖10是描述用經(jīng)修飾的P類ODN進(jìn)行熒光素酶檢測結(jié)果的圖形。JU修飾的SEQIDNO:31-33的活性與(SEQIDNO:52)的活性進(jìn)行比較。x軸是logODN濃度(單位為pM),y軸是相對刺激指數(shù)。圖11是描述用經(jīng)修飾的T類ODN進(jìn)行熒光素酶檢測結(jié)果的圖形。JU修飾的SEQIDNO:47-50和U修飾的SEQIDNO:51的活性與未經(jīng)修飾的母本序列SEQIDNO:25的活性進(jìn)行比較。x軸是logODN濃度(單位為(iM),y軸是相對刺激指數(shù)。圖12是描述用短ODN進(jìn)行熒光素酶檢測結(jié)果的圖形。JU修飾的短ODNSEQIDNO:39-40的活性與未經(jīng)^修飾的母本序列SEQIDNO:38和B類ODNSEQIDNO:37的活性進(jìn)行比較。用或者不用DOTAP配制ODN。x軸是logODN濃度(單位為pM)，y軸是相對刺激指數(shù)。圖13是測量脾細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子濃度的ELISA檢測結(jié)果的四幅圖形，其中用不同的ODN培養(yǎng)BALB/c小鼠脾細(xì)胞。培養(yǎng)上清液在6小時(對于TNF-a)或24小時(對于IL-6、IL-10和IL-12)收獲。對JU修飾的B類ODN(SEQIDNO:13)、未經(jīng)修飾的B類ODN(SEQIDNO:37)和非pG負(fù)對照ODN(SEQIDNO:26)的活性進(jìn)行比較。圖13a-d分別顯示了TNF-a、IL-6、IL-10和IL-12濃度。x軸是單位為jig/ml的ODN濃度，y軸是單位為pg/ml的細(xì)胞因子濃度。圖14是顯示B細(xì)胞增殖的FACS分析結(jié)果的圖形。CFSE染色BALB/c小鼠脾細(xì)胞(4xl0V孔)用0.001、0.01、0.1、0.3、1、3或10pg/ml的ODN進(jìn)行溫育。在溫育后72小時，細(xì)胞針對CD19進(jìn)行染色，用FACS測量B-細(xì)胞增殖，隨后用ModFit軟件分析。JU修飾的B類ODN(SEQIDNO:13)、未經(jīng)修飾的B類ODN(SEQIDNO:37)和非CpG負(fù)對照(SEQIDNO:26)的活性進(jìn)行比較。x軸是單位為嗎/ml的ODN濃度，y軸是相對B細(xì)胞增殖。圖15是顯示經(jīng)ELISA測量的體內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生的兩幅圖形。BALB/c小鼠(每組5只)用10、50或100的ODN進(jìn)行皮下注射。對照組則只接受100pi的PBS。在注射后1小時(對于TNF-a)或3小時(對于IP-10),利用心臟穿刺使動物出血，利用ELISA檢測血漿中的TNF-a和IP-IO。JU修飾的B類ODN(SEQIDNO:13)和未經(jīng)修飾的B類ODN(SEQIDNO:37)的活性進(jìn)行比較。圖15a顯示了TNF-a濃度，圖15b顯示了IP-10濃度。x軸是單位為嗎的ODN劑量，y軸是單位為pg/ml的細(xì)胞因子濃度。圖16是顯示了用通用堿基(6-硝基苯并吡唑)替代母本序列(SEQIDNO:l)中胸腺嘧咬的B類ODN(SEQIDNO:178)對TLR9介導(dǎo)的NF-kB的活化的圖形。hTLR9-LUC-293細(xì)胞用指定量的核酸進(jìn)行溫育，在16小時后通過測量焚光素酶活性測定NF-kB活化。x軸是單位為的ODN濃度的log值，y軸是單位為pg/ml的IFN-a濃度。圖17是顯示了用5-(2-溴乙烯基)-尿嘧啶替代母本序列(SEQIDNO:l)中胸腺嘧啶的B類ODN(SEQIDNO:153和154)對TLR9介導(dǎo)的NF-kB的活化的圖形。hTLR9-LUC-293細(xì)胞用指定量的核酸進(jìn)行溫育，在16小時后通過測量熒光素酶活性測定NF-kB活化。x軸是單位為|iM的ODN濃度的log值，y軸是單位為pg/ml的IFN-a濃度。圖18是顯示了具有糖修飾(2'-0-曱基鳥噪呤核苦)和親脂性取代核脊酸類似物的B類ODN(SEQIDNO:lll-113)對TLR9介導(dǎo)的NF-kB的活化的圖形。這些ODN的活性與母本序列(SEQIDNO:l)和僅具有親脂性取代核芬酸類似物的相同序列(SEQIDNO:13)的活性進(jìn)行比較。hTLR9-LUC-293細(xì)胞用指定量的核酸進(jìn)行溫育，在16小時后通過測量熒光素酶活性測定NF-kB活化。x軸是單位為pM的ODN濃度的log值，y軸是單位為pg/ml的IFN-a濃度。圖19是顯示了具有多個可接近的5'端的分枝B類ODN對TLR9介導(dǎo)的NF-kB的活化的圖形。分枝ODN(SEQIDNO:96、97、101和102)的活性與SEQIDNO:l的活性進(jìn)行比較。hTLR9-LUC-293細(xì)胞用指定量的核酸進(jìn)行溫育，在16小時后通過測量熒光素酶活性測定NF-kB活化。x軸是單位為的ODN濃度的log值，y軸是單位為pg/ml的IFN-a濃度。圖20是顯示了較短的未經(jīng)修飾B類ODN(SEQIDNO:38)和具有親脂性取代核苷酸類似物和親脂性3'標(biāo)簽的相同序列的ODN(SEQIDNO:126)對TLR9介導(dǎo)的NF-kB的活化的圖形。用或者不用DOTAP對二者進(jìn)行配制。hTLR9-LUC-293細(xì)胞用指定量的核酸進(jìn)行溫育，在16小時后通過測量熒光素酶活性測定NF-kB活化。x軸是單位為pM的ODN濃度的log值，y軸是單位為pg/ml的IFN-a濃度。圖21是顯示了用5-丙烯基-dU替代母本序列(SEQIDNO:l)中胸腺嘧，定的兩條B類ODN(SEQIDNO:116和117)對TLR9介導(dǎo)的NF-kB的活化的圖形。hTLR9-LUC-293細(xì)胞用指定量的核酸進(jìn)行溫育，在16小時后通過測量熒光素酶活性測定NF-kB活化。x軸是單位為的ODN濃度的log值，y軸是單位為pg/ml的IFN-a濃度。圖22是顯示了具有第二核苷酸類似物和親脂性取代核苷酸類似物的B類ODN(SEQIDNO:138,7-脫氮-dG;SEQIDNO:139，肌苷；SEQIDNO:140,5-曱基-dC)對hTLR9介導(dǎo)的NF-kB的活化的圖形。這些ODN的活性與母本序列(SEQIDNO:l)和僅具有親脂性取代核苷類似物的相同序列(SEQIDNO:13)的活性進(jìn)行比較。hTLR9-LUC-293細(xì)胞用指定量的核酸進(jìn)行溫育，在16小時后通過測量熒光素酶活性測定NF-kB活化。x軸是單位為的ODN濃度的log值，y軸是單位為pg/ml的IFN-a濃度。圖23是顯示了具有親脂性取代核苷酸類似物的T-類ODN(SEQIDNO:132-134)對hTLR9介導(dǎo)的NF-kB的活化的圖形。它們的活性與免疫刺激性C類ODN(SEQIDNO:198)的活性進(jìn)行比較。hTLR9-LUC-293細(xì)胞用指定量的核酸進(jìn)行溫育，在16小時后通過測量熒光素酶活性測定NF-kB活化。x軸是單位為的ODN濃度的log值，y軸是單位為pg/ml的IFN-a濃度。圖24是顯示了具有親脂性取代核苦酸類似物的P類ODN(SEQIDNO:58-63)對hTLR9介導(dǎo)的NF-kB的活化的兩幅圖形。圖24a顯示了SEQIDNO:58-61的活性與B類正對照(SEQIDNO:55)和未經(jīng)修飾的P類ODN(SEQIDNO:56)的活性進(jìn)行比較。圖24b顯示了SEQIDNO:62-63的活性與相同的正對照和負(fù)對照的活性進(jìn)行比較。hTLR9-LUC-293細(xì)胞用指定量的核酸進(jìn)行溫育，在16小時后通過測量熒光素酶活性測定NF-kB活化。x軸是單位為的ODN濃度的log值，y軸是相對刺激指數(shù)。圖25是顯示了具有親脂性取代核苷酸類似物的P類ODN(SEQIDNO:64、66-67)對hTLR9介導(dǎo)的NF-kB的活化的圖形。它們的活性與B類正對照(SEQIDNO:55)、C類ODN(SEQIDNO:68)和未經(jīng)修飾的P類ODN(SEQIDNO:57)的活性進(jìn)行比較。hTLR9-LUC-293細(xì)胞用指定量的核酸進(jìn)行溫育，在16小時后通過測量熒光素酶活性測定NF-kB活化。x軸是單位為的ODN濃度的log值，y軸是相對刺激指數(shù)。圖26是顯示了具有親脂性取代核苷酸類似物的P類ODN(SEQIDNO:58-63)對IFN-a的誘導(dǎo)的兩幅圖形。圖26a顯示了SEQIDNO:58-61的活性與B類正對照(SEQIDNO:55)和未經(jīng)修飾的P類ODN(SEQIDNO:56)的活性進(jìn)行比較。圖26b顯示了SEQIDNO:62-63的活性與相同正對照和負(fù)對照的活性進(jìn)行比較。人類PBMC與指定的ODN進(jìn)行溫育48小時。然后通過ELISA測定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IFN-a。x軸是單位為的ODN濃度，y軸是單位為pg/ml的IFN-a濃度。圖27是顯示了具有親脂性取代核香酸類似物的P類ODN(SEQIDNO:64、66-67)對IFN-a的誘導(dǎo)的圖形。它們的活性與B類正對照(SEQIDNO:55)、C類ODN(SEQIDNO:68)和未經(jīng)4務(wù)飾的P類ODN(SEQIDNO:57)的活性進(jìn)行比較。人類PBMC與指定的ODN進(jìn)行溫育48小時。然后通過ELISA觀'J定細(xì)月包i咅養(yǎng)上清液中的IFN-a。x軸是單位為|iM的ODN濃度，y軸是單位為pg/ml的IFN-a濃度。圖28是顯示了具有親脂性取代核苷酸類似物的P類ODN(SEQIDNO:58、60-62，圖28a)(SEQIDNO:64和67，圖28b)對IL-6誘導(dǎo)的圖形?；钚耘c未經(jīng)修飾的B類ODN(SEQIDNO:55)和未經(jīng)》務(wù)飾的C類ODN(SEQIDNO:54)、負(fù)對照ODN(SEQIDNO:53)、以及未經(jīng)》務(wù)飾的P類ODN(SEQIDNO:56)的活性進(jìn)行比較。來自4是供者的PBMC與所述ODN溫育24小時，并通過luminex對上清液進(jìn)行分析。顯示的是平均+/-SEM。x軸是單位為jaM的ODN濃度，y軸是單位為pg/ml的IL-6濃度。圖29是顯示了用具有親脂性取代核香酸類似物的P類ODN(SEQIDNO:58、60-62，圖29a)(SEQIDNO:64和67,圖29b)進(jìn)4亍處理后的B-細(xì)胞增殖的圖形?；钚耘c未經(jīng)修飾的B類ODN(SEQIDNO:55)、未經(jīng)修飾的C類ODN(SEQIDNO:54)、負(fù)對照ODN(SEQIDNO:53)、未經(jīng)修飾的P類ODN(SEQIDNO:56)、LPS、R-848、SEB和聚[I]:[C]ODN的活性進(jìn)行比較。來自提供者的CFSE-標(biāo)記PBMC與所述ODN溫育5天，然后用CD19抗體進(jìn)行染色。測定具有減弱的CFSE染色的B細(xì)胞的百分比。x軸是單位為的ODN濃度，y軸是是分化后具有減弱的染色的B細(xì)胞的百分比％。圖30是顯示了具有親脂性取代核普酸類似物的P類ODN(SEQIDNO:58、60-62、64和67)對鼠類IFN-a的i秀導(dǎo)的圖形。它們的活性與B類正對照(SEQIDNO:55)和負(fù)對照(SEQIDNO:26)的活性進(jìn)行比較。BALB/c小鼠(每組5只)用不同劑量的ODN進(jìn)行皮下注射。在注射后3小時使動物出血，通過ELISA檢測血漿中的TNF-a。x軸是單位為嗎的ODN劑量，y軸是單位為pg/ml的IFN-a濃度。圖31是顯示了在小鼠SA1N腫瘤模型中ODN對腫瘤體積的作用的兩幅圖形。雌性A/J小鼠(每組IO只)在第0日用5xl()SSal/N腫瘤細(xì)胞進(jìn)行皮下注射。在腫瘤誘導(dǎo)后的第8日開始每周一次皮下注射提供35嗎(圖31a)或100嗎(圖Mb)具有親脂性取代寡聚核苷酸類似物的P類ODN(SEQIDNO:60、64和67)、未經(jīng)修飾的C類ODN、未經(jīng)修飾的B類ODN(SEQIDNO:55)或僅提供PBS進(jìn)行治療。監(jiān)測動物的存活和腫瘤體積。使用數(shù)字游標(biāo)卡尺測量肺瘤尺寸(長度和寬度)。利用以下公式計算肺瘤體積腫瘤體積-(0.4)(ab2),其中a-較大直徑，且b=較小直徑。x軸顯示腫瘤誘導(dǎo)后的天數(shù)，y軸顯示了單位為mn^的腫瘤體積。具體實施例方式本發(fā)明部分基于顯示出增強的免疫刺激能力的CpG寡聚核苷酸。已知CpG寡聚核苷酸例如通過與toll樣受體9(TLR9)相互作用從而刺激免疫系統(tǒng)。TLR9的刺激具有許多作用，包括刺激Thl偏移免疫應(yīng)答、NK細(xì)胞活化和B細(xì)胞活化。本發(fā)明在一些方面涉及具有被改變的結(jié)構(gòu)的免疫刺激性寡聚核苷酸的鑒別，所述被改變的結(jié)構(gòu)影響了它們與TLR9的相互作用。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在CpG模體之外的具有親脂性取代核苷酸類似物的寡聚核苷酸具有增強的刺激干擾素-a(IFN-a)產(chǎn)生和誘導(dǎo)TLR9活化的能力。已在經(jīng)測試的所有類型的免疫刺激性寡聚核苷酸中觀察到這種作用。這些具有增強的刺激能力的修飾寡聚核苷酸已被命名為E類寡聚核苷酸。本發(fā)明的E類修飾寡聚核苷酸在一些情況下具有增強的誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。誘導(dǎo)免疫應(yīng)答是指免疫細(xì)胞數(shù)量或活性的任何增加，或者諸如細(xì)胞因子之類的免疫因子的表達(dá)或絕對水平的提高。免疫細(xì)胞包括但不限于NK細(xì)胞、CD4+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其它抗原呈遞細(xì)胞。細(xì)胞因子包括但不限于白細(xì)胞介素，TNF-ot,IFN-a、卩和y，F(xiàn)lt-配體和共刺激分子。已知含有未曱基化的CpG模體的寡聚核苷酸能通過Toll樣受體9(TLR9)途徑刺激免疫應(yīng)答。許多細(xì)胞因子的誘導(dǎo)與TLR9活化相關(guān)。因此誘導(dǎo)隨著TLR9活化的提高而提高。然而，對于CpGODN來說，在TLR9和IFN-a誘導(dǎo)之間通常存在負(fù)相關(guān)。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的一些修飾物能產(chǎn)生改變的信號模式，由此觀察到TLR9和IFN-a之間更直接的相關(guān)，而不是負(fù)相關(guān)。本發(fā)明人開始研究CpG模體周圍區(qū)域中親脂性殘基的影響。正如在以下例子中所描述的，將諸如2,4-二氟曱苯、5-溴尿嘧咬和5-碘尿嘧啶之類的不同類型的親脂性取代核苷酸類似物在CpG模體的5'或3'端接入到CpG寡聚核苷酸中。出乎意料地是，這些親脂性取代核苷酸類似物的接入導(dǎo)致hTLR9活性以及人類PBMC中IFN-a誘導(dǎo)非同尋常地明顯提高。用諸如尿嘧啶(其與胸腺嘧啶結(jié)構(gòu)相似但缺少曱基)之類的非親脂性核苦酸殘基取代會造成hTLR9刺激的顯著降低。在所測試的寡聚核芬酸中，如果親脂性取代核苷酸類似物位于CpG模體的5'時，TLR9刺激的提高似乎強于當(dāng)親脂性取代核苷酸類似物位于所述模體的3'時。雙替代(即，5'和3'親脂性取代核苷酸類似物替代)導(dǎo)致經(jīng)測試的那些寡聚核苷酸的最有力的刺激。相反，CpG模體上用2,4-二氟曱苯替代鳥。票呤或胞嘧啶則在兩種情況下均導(dǎo)致TLR9刺激指數(shù)的顯著降低。親脂性取代核苦酸類似物修飾導(dǎo)致IFN-a誘導(dǎo)的明顯增強。尤其是，對于5-溴尿嘧咬和5-碘尿嘧啶修飾的ODN，似乎在TLR9刺激和IFN-a誘導(dǎo)之間有良好的相關(guān)。如上所提及的，該觀察結(jié)果是出乎意料的，這是由于(i)母本分子21317事實上對誘導(dǎo)IFN-a是沒有活性的，以及(ii)對于不含有這些修飾的CpGODN而言，TLR9和IFN-a誘導(dǎo)之間通常是負(fù)相關(guān)的。在本發(fā)明的一些方面，寡聚核苷酸具有序列R,YZR2。該寡聚核苷酸可包括一個或多個這樣的模體。R,和R2獨立地是親脂性取代核苷酸類似物(L)、核普酸和鍵中的任一種。然而，優(yōu)選R^和R2中的至少一個是親脂性取代核苷酸類似物(L)。在一些情況下，R^和R2都是L。正如以下實施例章節(jié)中所示的，在CpG模體的5'和3'均具有L的寡聚核苷酸具有非常強的刺激性。然而有時僅一個R是L。例如，&可以是L且R2是核普酸，反之亦然。另一種方式，R!可以是L且R2可以是鍵，因此寡聚核苷酸包含結(jié)構(gòu)5'&CG3'。在一些情況下，寡聚核苷酸具有序列R,N!YZN2R2，其中Ni和N2是長度為0-3個核苷酸的核苷酸。其它可能的變化形式包括諸如5'NjR!YZN23'、5'R3R,YZ3和RiZNzRz之類的結(jié)構(gòu)。Y是嘧啶核苷酸。Z是嘌呤、嘧啶或脫堿基殘基。在一些實施方式中，Z優(yōu)選為。票呤。L是親脂性取代核苷酸類似物，例如是5或6元環(huán)的核堿基類似物。5或6元環(huán)的核4^基類似物的例子如下式I的基團(tuán)所示。X式IA、B、X、D、E和F獨立地是C(碳)或N(氮)之一，其選擇性地具有氫或取代基，這些取代基諸如但不限于F、Cl、Br、I、烷基、烯基、炔基、卣代烷基、卣代晞基、環(huán)烷基、O-烷基、O-烯基、-NH-烷基、-N(烷基h;-S-烷基、-SO-烷基、-SOr烷基、硝基、氰基、羧酸酯、苯基、苯硫基、千基、氧代、硫代、雍基、巰基和亞氨基。在一些情況下，至少一個取代基不是氧代、硫代、羥基、巰基、亞氨基、氨基或曱基。n是0或l。虛線表示選擇性的雙鍵。然而，至少一個取代基不是從下組中選擇氧代、硫代、羥基、巰基、亞氨基、氨基、曱基和氫。此外，A、B、X、D、E和F原子中總共不超過3個氮(N)。在一些實施方式中，A、B、X、D、E和F原子都是碳(C)。另外可選地，A、B、X、D、E和F原子中的至少一個、兩個或三個是氮(N)。上式的化合物可以是，例如，以下任一種親脂性取代核苷酸類似物取代嘧啶、取代尿嘧啶、取代甲苯、取代咪唑或吡唑、取代三唑、5-氯-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-碘-尿嘧咬、5-乙基-尿嘧啶、5-丙基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、(E)-5-0溴乙烯基)-尿嘧啶或2,4-二氟-甲苯。親脂性取代核香酸類似物可以是獨立的，或者與其它化合物相稠合。例如，可以與3至6元芳環(huán)或脂環(huán)體系相稠合。也可以與諸如戊糖或己糖之類的相連。戊糖的例子是諸如核糖或脫氧核糖之類的呋喃糖，己糖的例子是吡喃糖。戊糖或己糖可選擇性地被F、氨基、烷氧基、烷氧基-乙氧基、氨基丙基、烯基、炔基或02,C4-亞烷基橋取代。寡聚核香酸也可以包括非核香酸修飾，所述非核苷酸^^飾的例子是Q-C48-聚乙二醇、CrC2o-烷-二醇、CrC,8-烷基氨基連接子和CrC18-烷基硫醇連接子、膽固醇、膽汁酸、飽和或不飽和脂肪酸、葉酸、十六烷基-甘油或二(十六烷基)甘油基團(tuán)、十八烷基-甘油或二(十八烷基)-甘油基團(tuán)或維生素E基團(tuán)。親脂性取代核香酸類似物可以接入到任何免疫刺激性寡聚核香酸中。在本發(fā)明的一些實施方式中，所述免疫刺激性寡聚核苷酸包括作為"CpG二核苦酸"的免疫刺激性模體。CpG二核苦酸可以是曱基化的或未曱基化的。一種含有至少一個未曱基化的CpG二核苷酸的免疫刺激性核酸是下述核酸分子所述核酸分子含有未曱基化的胞嘧啶-鳥"票呤二核苷酸序列(即，通過磷酸酯化學(xué)鍵相連的未曱基化的5'胞嘧咬和3'鳥噪呤)，并且激活免疫系統(tǒng)；這樣的免疫刺激性核酸是CpG核酸。CpG核酸已在大量已授權(quán)專利、專利申請公開和其它公開出版物中有所描述，包括美國專利6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116和6,339,068。一種含有至少一個曱基化CpG二核苷酸的免疫刺激性核酸是下述核酸分子所述核酸分子含有曱基化胞嘧啶-烏噪呤二核苷酸序列(即，通過磷酸酯化學(xué)鍵相連的甲基化5'胞嘧啶和3'烏嘌呤)，并且激活免疫系統(tǒng)。在其它實施方式中，免疫刺激性寡聚核苷酸不含有CpG二核苦酸。這些不含有CpG二核苷酸的寡聚核苷酸稱為非CpG寡聚核苷酸，并且它們具有非CpG免疫刺激性模體。優(yōu)選這些寡聚核苷酸是富含T的ODN，諸如含有至少80%的T的ODN。本發(fā)明的E類ODN可包括諸如A類、B類、C類、T類和P類之類的其它CpGODN類別的模體和性質(zhì)，只要它們包括YGZ模體的親脂性取f^核苷酸類4以物5'和/或3'(lipophilicsubstitutednucleotideanalogs5'and/or3'ofaYGZmotif)。"A類"CpG免疫刺激性核酸已在美國非臨時專利申請09/672,126和已公開的PCT申請PCT/US00/26527(WO01/22990)中進(jìn)行了描述，上述兩項申請均在2000年9月27日提交。這些核酸的特征在于能謗導(dǎo)高水平的千擾素-a而同時保持最小的B細(xì)胞活化作用的能力。A類CpG免疫刺激性核酸并非必須含有Yamamoto及其同伴所描述的六聚體回文GACGTC、AGCGCT或AACGTT。見YamamotoS等《//mww"o/.148:4072-6(1992)。A類免疫刺激性核酸的示例性序列在美國非臨時專利申請09/672,126和已公開的PCT申請PCT7US00/26527(WO01/22990)中描述，上述兩項申請均在2000年9月27日提交。"B類"ODN能有效地激活B細(xì)胞，但在誘導(dǎo)IFN-a和NK細(xì)胞活化方面相對弱。B類CpG核酸通常是完全穩(wěn)定的，并在某些優(yōu)選石威基內(nèi)容中包含未曱基化的CpG二核苷酸。參見，例如美國專利6,194,388、6,207,646、6,214,806、6,218,371、6,239,116和6,339,068。另一類CpG核酸能有效地誘導(dǎo)IFN-a和NK細(xì)胞活化，但在刺激B細(xì)胞方面相對弱；這一類被稱為"A類"。A類CpG核酸通常具有在5'和3'端穩(wěn)定的多G序列和至少六個核苷酸的含磷酸二酯CpG二核苷酸的回文序列。參見，例如已公開的專利申請PCT/US00/26527。再另一類CpG核酸激活B細(xì)胞和NK細(xì)胞并誘導(dǎo)IFN-a;這類已被命名為C類。"C類，，免疫刺激性核酸含有對免疫系統(tǒng)細(xì)胞有獨特和所希望的刺激效果的至少兩個不同的模體。這些ODN中的一些同時具有傳統(tǒng)的"刺激性"CpG序列以及"富含GC，，或"B細(xì)胞中和，，的模體。這些組合模體核酸具有處在與傳統(tǒng)的"B類"CpGODN相關(guān)的那些作用之間某處的免疫刺激作用，所述傳統(tǒng)的"B類"CpGODN是B細(xì)胞活化和樹突狀細(xì)胞(DC)活化的強誘導(dǎo)子，并且這些作用與最近描述的一類免疫刺激性核酸("A類"CpGODN)相關(guān)，所述"A類"CpGODN是IFN-a和自然殺傷(NK)細(xì)胞活化的強誘導(dǎo)子，然而是B細(xì)胞和DC活化的相對較弱的誘導(dǎo)子。見KriegAM等(1995)Atowe374:546-9;BallasZK等(1996)//mmimo/157:1840-5;YamamotoS等(1992)//mmw/w/148:4072-6。雖然優(yōu)選的B類CpGODN經(jīng)常具有硫代磷酸酯鍵骨架且優(yōu)選的A類具有混合或嵌合的骨架，但C類組合模體免疫刺激性核酸可具有穩(wěn)定的(例如硫代磷酸酯)、嵌合的或磷酸二酯骨架，在一些優(yōu)選實施方式中，它們具有半軟性骨架。該類在2002年8月19曰提交的美國專利申請US10/224,523中描述，該專利申請的全部內(nèi)容在此以引用的方式引入。"P類"免疫刺激性寡聚核苷酸具有若干域，這些域包括5'TLR活化域、2雙鏈形成區(qū)域和選擇性的間隔子及3'尾部。與C類相比，這類寡聚核苷酸在一些情況下具有誘導(dǎo)更高水平的IFN-a分泌的能力。P類寡聚核苷酸具有在體外和/或體內(nèi)自發(fā)地自組裝為串聯(lián)體的能力。不希望受任何關(guān)于這些分子的作用方法的具體理論的約束，一種可能的假設(shè)是該性質(zhì)使P類寡聚核苷酸與先前描述的CpG寡聚核苷酸類別相比具有在某些免疫細(xì)胞中更大程度地交聯(lián)TLR9、誘導(dǎo)獨特的免疫活化模式的能力。TLR9受體的交聯(lián)可通過漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞中的I型IFNR反饋回路來誘導(dǎo)更強的IFN-a活化。P類寡聚核苷酸至少在美國專利11/706,561中描述。當(dāng)沒有如同本發(fā)明的ODN—樣進(jìn)行修飾時，與B類和C類寡聚核苦酸相比，"T類"寡聚核苦酸誘導(dǎo)較低水平的IFN-a分泌和IFN-相關(guān)的細(xì)胞因子和趨化因子，但同時保留了與B類寡聚核苦酸相似的IL-IO誘導(dǎo)水平。T類寡聚核苦酸至少在美國專利申請11/099,683中有所描述，上述專利申請的全部內(nèi)容在此以引用的方式引入。在一個實施方式中，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)DN有利地與陽離子脂質(zhì)相結(jié)合。在一個實施方式中，陽離子脂質(zhì)是DOTAP(N-[l-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三曱基(曱基硫酸)銨)。替代DOTAP或者除DOTAP之外可以使用其它具有相似的性質(zhì)(包括運輸至內(nèi)體嚢)的其它試劑。其它脂質(zhì)制劑包括例如EFFECTENE(—種具有特異性DNA壓縮增強子的非脂質(zhì)體脂質(zhì))和superfect(—種新型作用樹突狀技術(shù))。脂質(zhì)體可從GibcoBRL通過商業(yè)途徑獲得，例如，如LIPOFECTINtm和LIPOFECTACE,它們由諸如N-[l-(2,3-二油酰氧基)-丙基]-N,N，N-三曱基氯化銨(DOTMA)和二曱基二(十八烷基)溴化銨(DDAB)之類的陽離子脂質(zhì)形成。制造脂質(zhì)體的方法在本領(lǐng)域中是公知的，并且在許多文獻(xiàn)中描述。GregoriadisG(1985)7k"cfe傷otec/z"o/3:235-241也對脂質(zhì)體進(jìn)行了綜述。在其它實施方式中，免疫刺激性O(shè)DN并未配制在陽離子脂質(zhì)體中。由于ODN中修飾類似物的親脂性性質(zhì)，即使諸如長度為3個核苷酸的較短的ODN也可無需加以配制以在體內(nèi)有效地發(fā)揮作用。在一個實施方式中，本發(fā)明的免疫刺激性O(shè)DN為具有一級和二級結(jié)構(gòu)的共價封閉啞鈴狀分子的形式。在一個實施方式中，這種環(huán)狀的寡聚核糖核苦酸包括兩個通過居間的雙鏈片段相連的單鏈環(huán)。在一個實施方式中，至少一個單鏈環(huán)包括本發(fā)明的免疫刺激性DNA模體。本發(fā)明的另一種共價封閉啞鈴狀分子包括嵌合的DNA:RNA分子，其中，例如，所述雙鏈片段至少部分是DNA(例如，同二聚體dsDNA或異二聚體DNA:RNA)，且至少一個單鏈環(huán)包括本發(fā)明的免疫刺激性DNA模體。另外一種方式，嵌合分子的雙鏈片段是DNA。在某些實施方式中，免疫刺激性O(shè)DN是孤立的。孤立分子是基本上純的并且不伴有通常在自然界或體內(nèi)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)與其相伴的其它物質(zhì)，其程度使之能實際地合適地用于其用途的分子。具體而言，所述免疫刺激性O(shè)DN充分純凈并且充分地不伴有其它生物細(xì)^i且成部分，因此可用在例如制造藥物制劑之中。因為孤立的本發(fā)明的免疫剌激性O(shè)DN可與可藥用載體在藥物制劑中相混合，所述免疫刺激性O(shè)DN可僅占制劑重量的很小的百分比。然而，免疫刺激性O(shè)DN是基本上純的，因此其基本上與其在活體系統(tǒng)中相連物質(zhì)進(jìn)行了分離。免疫刺激性核酸分子可具有嵌合骨架。出于本發(fā)明的目的，嵌合骨架指部分穩(wěn)定的骨架，其中至少一個核苷酸間鍵是磷酸二酯或類磷酸二酯，并且其中至少一個其它核苷酸間鍵是穩(wěn)定的核苷酸間鍵，其中至少一個磷酸二酯或類磷酸二酯鍵與至少一個穩(wěn)定的核普酸間鍵是不同的。由于已報道相對于磷酸二酯鍵，硼代磷酸酯鍵是穩(wěn)定的，出于骨架嵌合特性的目的，硼代磷酸酯鍵可根據(jù)上下文而被劃分為為類磷酸二酯鍵或劃分為穩(wěn)定的鍵。例如，本發(fā)明的嵌合骨架可在一個實施方式中包括至少一個磷酸二酯(磷酸二酯或類磷酸二酯)鍵和至少一個硼代磷酸酯(穩(wěn)定的)鍵。在另一個實施方式中，本發(fā)明的嵌合骨架可以包括硼代磷酸酯(磷酸二酯或類磷酸二S旨)和硫代磷酸酯(穩(wěn)定的)鍵。"穩(wěn)定的核苷酸間鍵"應(yīng)指與磷酸二酯核苷酸間鍵相比能相對耐受體內(nèi)降解(例如，通過外切或內(nèi)切核酸酶)的核苷酸間鍵。優(yōu)選的穩(wěn)定核苷酸間鍵包括但不限于硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯鍵、甲基磷酸酯鍵和曱基硫代磷酸酯鍵。其它穩(wěn)定的核苷酸間鍵包括但不限于肽、烷基、脫磷及上述其它穩(wěn)定的核苷酸間鍵?？墒褂冕娪冒被姿狨セ騂-磷酸酯化學(xué)的自動技術(shù)來合成諸如硫代磷酸酯之類的經(jīng)修飾的骨架。芳基磷酸酯和烷基磷酸酯可如美國專利4,469,863所述般制備；烷基磷酸三酯(其中帶電荷的氧部分如美國專利5,023,243和歐洲專利092,574所述4殳進(jìn)行烷基化)可使用市售試劑通過自動固相合成來制備。制造其它DNA骨架修飾和替代的方法也已有描述。UhlmannE等(1990)iev.90:544;GoodchildJ(1990)所oco"/w伊teC7ze柳.1:165。制備嵌合寡聚核香酸的方法也是已知的。例如授權(quán)給Uhlmann等的專利已描述了這樣的技術(shù)?；旌系墓羌苄揎桹DN可以利用商業(yè)提供的DNA合成儀和標(biāo)準(zhǔn)氨基磷酸酯化學(xué)進(jìn)行合成。(見F.E.Eckstein,"OligonucleotidesandAnalogs-APracticalApproach"IRLPress,Oxford,UK,1991,及M.D.MatteucciandM.H.Camthers，TetrahedronLett.21，719(1980》。在偶聯(lián)后，通過葉吏用Beaucagei式劑(R.P.Iyer,W.Egan，J.B.ReganandS.L.Beaucage,J.Am.Chem.Soc.112,1253(1990))(0.075Minacetonitrile)或者苯乙?；蚧?PADS)進(jìn)行硫化從而引入PS鍵，隨后用乙酸酐、2，6-二曱基吡咬和四氬呋喃(1:1:8;v:v:v)和TV-曱基咪唑(16%四氫呋喃溶液)來封端(capping)。封端步驟在硫化反應(yīng)后進(jìn)行，從而在碌u代磷酸酯鍵應(yīng)當(dāng)處于的位置上盡可能少地形成不需要的磷酸二酯(PO)鍵。例如在CpG二核苷酸中引入磷酸二酯鍵的情況下，中間體磷-III通過用碘的水/p比啶溶液處理而被氧化。在從固體載體上切下并用濃氨水處理(50°C,15小時)進(jìn)行最后的脫保護(hù)之后，通過在Gen-PakFax柱(Millipore-Waters)上使用NaCl-梯度(例如，緩沖液A:10NaH2P04在乙腈/水=l:4/v:v中，pH6.8;緩沖液B:10mMNaH2PO4，1.5MNaCl在乙腈/水=1:4/v:v中；30分鐘由5至60%B，1ml/min)的HPLC或者通過毛細(xì)管凝膠電泳對ODN進(jìn)行分析。ODN可經(jīng)HPLC或者經(jīng)源高效柱(AmershamPharmacia)上的FPLC進(jìn)行純化。合并HPLC-均相餾分，通過C18柱或者通過超濾脫鹽。用質(zhì)譜分析ODN以確認(rèn)計算質(zhì)量。本發(fā)明的核酸也可包括其它修飾。這些包括非離子DNA類似物，諸如烷基磷酸酯和芳基磷酸酯(其中帶電荷的磷酸酯的氧被烷基或芳基替換)、磷酸二酯和烷基磷酸三酯，其中帶電荷的氧部分被烷基化。在一個或兩個終端處含有諸如四乙二醇或六乙二醇之類的二醇的核酸也已顯示出能實際耐受核酸酶降解。在一些實施方式中，寡聚核苷酸可以是軟或半軟的寡聚核苷酸。軟寡聚核苦酸是具有部分穩(wěn)定骨架的免疫刺激性寡聚核苷酸，其中僅在至少一個內(nèi)部嘧啶-。票呤二核苷酸(YZ)內(nèi)或與其緊鄰的位置上出現(xiàn)磷酸二酯或類磷酸二酯核普酸間鍵。優(yōu)選YZ是YG,嘧咬-鳥噤呤(YG)二核苷酸。至少一個內(nèi)部YZ二核苷酸自身具有磷酸二酯或類磷酸二酯核苦酸間鍵。與至少一個內(nèi)部YZ二核苷酸緊鄰出現(xiàn)的磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間一鍵可以位于所述至少一個內(nèi)部YZ二核苷酸的5'、3'，或者同時位于5'和3'。具體而言，磷酸二酯或類磷酸二酯核芬酸間鍵涉及到"內(nèi)部二核苷酸"。內(nèi)部核香酸一般應(yīng)指通過核苷酸間鍵相連的任何相鄰核苷酸對，其中核苷酸對中的任一個都不是末端核苷酸，即，核苷酸對中的任一個都不是界定寡聚核芬酸的5'或3'末端的核苷酸。因此，n個核苷酸長的直鏈寡聚核苷酸具有總共n-l個二核苷酸并且僅有n-3個內(nèi)部二核苷酸。每個在內(nèi)部二核苷酸中的核普酸間鍵是內(nèi)部核苷酸間鍵。因此，n個核苷酸長的直鏈寡聚核苷酸具有總共n-l個核苷酸間鍵并且僅有n-3個內(nèi)部核苦酸間鍵。按策略放置的磷酸二酯或類磷酸二酯核香酸間鍵因此指位于核酸序列中任何核苷酸對之間的磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵。在一些實施方式中，磷酸二酯或類磷酸二酯核苦酸間一建并不位于最接近5'或3'端的任一核苷酸對之間。優(yōu)選緊鄰至少一個內(nèi)部YZ二核苷酸出現(xiàn)的磷酸二酯或磷酸二酯核苷酸間鍵自身是內(nèi)部核苷酸間#:。因此，對于序列1^YZN2，其中Nj和N2各自相互獨立地是任何單個核苷酸，YZ二核苦酸具有磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵，并且此外(a)當(dāng)N!是內(nèi)部核苷酸時，Nj和Y通過磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵相連，(b)當(dāng)N2是內(nèi)部核芬酸時，Z和N2通過磷酸二酯或類磷酸二酯核苦酸間鍵相連，或者(c)當(dāng)N,是內(nèi)部核苷酸時，N,和Y通過磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵相連，當(dāng)N2是內(nèi)部核苷酸時，Z和N2通過磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵相連。在本發(fā)明的寡聚核苷酸中，至少一個R^YZR2的YZ具有磷酸二酯鍵。另外一種方式，R,YZR2的YZ可具有硫代磷酸酯鍵。在一些實施方式中，R4YZR2的RJ和/或ZR2具有硫代磷酸酯鍵。與完全穩(wěn)定的寡聚核苷酸相比，本發(fā)明的軟寡聚核苷酸被認(rèn)為相對更易被核酸酶切割。不希望受具體理論或機(jī)制的約束，相對于全長軟寡聚核苦酸而言，認(rèn)為本發(fā)明的軟寡聚核香酸可被切割為具有相對降低的免疫刺激活性或不具有免疫刺激活性的片段。加入至少一個對核酸酶敏感的內(nèi)部核香酸間鍵，尤其靠近寡聚核苷酸中部，則被認(rèn)為提供了"關(guān)閉開關(guān)"，其將改變寡聚核香酸的藥代動力學(xué)，從而縮短寡聚核苷酸的最大免疫刺激活性的持續(xù)時間。這在諸如腎之類的其中需要避免與慢性局部發(fā)炎或免疫刺激相關(guān)的損傷的組織和臨床應(yīng)用中特別有價值。半軟寡聚核苦酸是具有部分穩(wěn)定骨架的免疫刺激性寡聚核苷酸，其中磷酸二酯或類磷酸二酯核苦酸間鍵僅出現(xiàn)在至少一個內(nèi)部嘧啶-。票呤(YZ)二核苷酸內(nèi)。與相應(yīng)的完全穩(wěn)定的免疫刺激性寡聚核苷酸相比，半軟寡聚核苷酸通常具有提高的免疫刺激潛力。由于半軟寡聚核苷酸的更大的潛力，在一些情況下，半軟寡聚核苷酸可以以較低的有效濃度使用，并且與傳統(tǒng)的完全穩(wěn)定的免疫刺激性寡聚核苷酸相比以更小的有效劑量獲得所希望的生物效果。人們認(rèn)為上述半軟寡聚核苷酸的性質(zhì)通常隨著牽涉到內(nèi)部YZ二核普酸的磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵的"劑量"的增加而提高。因此，可認(rèn)為，例如通常對于具有五個內(nèi)部YZ二核香酸的給定寡聚核苷酸序列而言，具有五個內(nèi)部磷酸二酯或類磷酸二酯YZ核苷酸間4建的寡聚核苷酸的免疫刺激性比具有四個內(nèi)部磷酸二酯或類磷酸二酯YG核苷酸間鍵的寡聚核苷酸的免疫刺激性更強，后者的免疫刺激性又比具有三個內(nèi)部磷酸二酯或類磷酸二酯YZ核苷酸間鍵的寡聚核苦酸的免疫刺激性更強，后者的免疫刺激性又比具有兩個內(nèi)部磷酸二酯或類磷酸二酯YZ核苷酸間鍵的寡聚核苷酸的免疫刺激性更強，后者的免疫刺激性又比具有一個內(nèi)部磷酸二酯或類磷酸二酯YZ核苷酸間鍵的寡聚核苷酸的免疫剌激性更強。重要的是，即使包括一個內(nèi)部磷酸二酯或類磷酸二酯YZ核苦酸間鍵也被認(rèn)為比沒有內(nèi)部磷酸二酯或類磷酸二酯YZ核苷酸間鍵更加有力。除磷酸二酯或類磷酸二酯核香酸間鍵的數(shù)目之外，沿核酸長度方向的位置也可影響潛力。除位于優(yōu)選內(nèi)部位置的磷酸二酯或類磷酸二酯核苷酸間鍵之外，所述軟或半軟寡聚核香酸通常包括耐降解的5'和3'端。這些耐降解末端可包括使其與相應(yīng)的未經(jīng)修飾的末端相比具有提高的外切核酸酶消化耐受性的任何合適的修飾。例如，5'和3'端可通過加入骨架的至少一個磷酸酯修飾而穩(wěn)定。在優(yōu)選實施方式中，在骨架的每個末端處的至少一個磷酸酯修飾獨立地是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、曱基磷酸酯或曱基硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在另一個實施方式中，耐降解末端包括在3'端通過肽鍵或酰胺鍵相連的一個或多個核苷酸單元。磷酸二酯核香酸間鍵是在自然界中發(fā)現(xiàn)的核酸的特征鍵類型。磷酸二酯核苷酸間鍵包括與兩個橋接氧原子側(cè)面相連并與另外兩個氧原子(一個帶有電荷而另一個不帶有電荷)相連的磷原子。當(dāng)縮短寡聚核苷酸的組織半衰期非常重要時，特別優(yōu)選磷酸二酯核苷酸間鍵。類磷酸二酯核苷酸間鍵是含有磷的橋接基團(tuán)，其與磷酸二酯化學(xué)地和/或非對映地相似。與磷酸二酯的相似性的量度包括對核酸酶消化的易受性和活化RNAseH的能力。因此，例如磷酸二S旨(而不是硫代磷酸酯)寡聚核普酸易被核酸酶消化，盡管磷酸二酯和硫代磷酸酯寡聚核苷酸均活化RNAseH。在優(yōu)選實施方式中，類磷酸二酯核苷酸間鍵是硼代磷酸S旨(或者相當(dāng)于硼代磷酸S旨)鍵。見美國專利5,177,198;美國專利5,859,231;美國專利6,160,109;美國專利6，207，819;Sergueev等，(1998>/爿w.CTzem.5bc.120:9417-27。在另一個優(yōu)選實施方式中，類磷酸二酯核香酸間鍵是非對映的純Rp硫代磷酸酯。據(jù)認(rèn)為非對映的純Rp硫代磷酸酯與混合的或非對映的純Sp硫代磷酸酯更容易被核酸酶消化并能更好地活化RNAseH。CpG寡聚核苷酸的立體異構(gòu)體是1999年6月27日提交的共同未決的美國專利申請09/361,575和已公開的PCT申請PCT/US99/17100(WO00/06588)的主題。應(yīng)當(dāng)注意到出于本發(fā)明的目的，術(shù)語"類磷酸二酯核苷酸間鍵"特意排除了二硫代磷酸酯和曱基磷酸酯核苦酸間鍵。如上所述，本發(fā)明的軟和半軟寡聚核苷酸可以在C和G之間具有類磷酸二酯鍵。類磷酸二酯鍵的一個例子是Rp構(gòu)象的硫代磷酸酯鍵。根據(jù)活性測量的時間點，寡聚核普酸p-手性對CpG寡聚核苦酸的免疫活性有明顯的相反作用。在早期40分鐘時間點，硫代磷酸酯CpG寡聚核苷酸的Rp而不是Sp立體異構(gòu)體誘導(dǎo)了小鼠脾細(xì)胞中的JNK磷?；?。相反，當(dāng)在較晚的44小時時間點，Sp而并非Rp立體異構(gòu)體在刺激脾細(xì)胞增殖中起作用。Rp和Sp立體異構(gòu)體的動力學(xué)和生物活性的差異并非源自于任何細(xì)胞攝取的差異，而最可能是由于p-手性的兩種相反的生物角色。首先，在早期時間點Rp立體異構(gòu)體相比Sp而言增強的刺激免疫細(xì)胞的活性表明Rp可更有效地與CpG受體TLR9相互作用，或者誘導(dǎo)下游信號途徑。另一方面，與Sp相比，RpPS-寡聚核苷酸的更快速降解導(dǎo)致了短得多的信號持續(xù)時間，因此當(dāng)在較后期時間點，SpPS-寡聚核普S吏似乎更具生物活性。由CpG二核苷酸自身的p-手性實現(xiàn)了令人驚奇的強烈作用。與立體隨機(jī)的CpG寡聚核普酸相比，其中單一CpG二核苷酸以Rp連接的同類物的活性稍微高一些，而含有Sp鍵的同類物對于誘導(dǎo)脾細(xì)胞增殖幾乎沒有活性。術(shù)語"核酸"和"寡聚核苷酸"也涵蓋諸如在堿基和/或糖上具有取代或修飾的核酸或寡聚核普酸。例如，它們包括具有與除2'位置上的羥基和除5'位置上的磷酸酯基團(tuán)或羥基之外的低分子量有機(jī)基團(tuán)共價相連的骨架糖的核酸。因此，經(jīng)修飾的核酸可包括2'-0-烷基化核糖基團(tuán)。此外，經(jīng)修飾的核酸可包括諸如阿拉伯糖或2'-氟阿拉伯糖之類的糖以替代核糖。因此，核酸在骨架組成上可以是異質(zhì)的，從而含有連接在一起的聚合物單元的任意組合，例如肽-核酸(具有帶核酸堿基的氨基酸骨架)。核酸也包括諸如C-5丙炔嘧啶和7-脫氮-7-取代嘌呤》》飾石威基之類的取代噪呤和嘧咬。見WagnerRW等(1996)A^.B/otec/2"o/.14:840-4。。票呤和嘧咬包括但不限于腺噤呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、5-曱基胞嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黃嘌呤及其它天然或非天然的核》成基、取代的和未取代的芳香部分。其它這樣的修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。與天然RNA和DNA相比，本發(fā)明的免疫刺激性寡聚核苷酸可涵蓋各種化學(xué)修飾和取代，包括磷酸二酯核苷酸間橋、(3-D-核糖單元和/或天然核苷酸堿基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)?；瘜W(xué)修飾的例子對本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的，并且在例如UhlmannE等(1990)CAew.iev.90:543;"ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs"SynthesisandProperties&SynthesisandAnalyticalTechniques,S.Agrawal,Ed,HumanaPress,Totowa,USA1993;CrookeST等(1996>4畫.iev.泡r應(yīng)co/.7bx/co/.36:107-129;和HunzikerJ等(1995)ModS，仇Ma/70血7:331-417中描述。本發(fā)明的寡聚核苷酸可具有一種或多種修飾，其中與由天然DNA或RNA構(gòu)成的相同序列的寡聚核苷酸相比，每種修飾位于特定的磷酸二酯核苷酸間橋上和/或在特定J3-D-核糖單元上和/或在特定天然核芬酸》威基位置上。例如，本發(fā)明涉及一種可包括一種或多種修飾的寡聚核苦酸，其中每種修飾獨立地選自a)在核普酸的3'和/或5'端由經(jīng)修飾的核芬酸間橋替代磷酸二酯核苷酸間橋，b)在核苷酸的3'和/或5'端由脫磷橋替代磷酸二酯核香酸間橋，c)由另一個單元替代來自糖磷酸酯骨架的糖磷酸酯單元，d)由經(jīng)修飾的糖單元替代(3-D-核糖單元，和e)由經(jīng)修飾的核苷酸堿基替代天然核苷酸堿基。寡聚核苷酸的化學(xué)修飾的更詳細(xì)例子如下。位于核苷酸的3'和/或5'端的磷酸二酯核苷酸間橋可由經(jīng)修飾的核苷酸間橋替代，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸間橋例如選自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR^R、氨基磷酸酯、硼代磷酸酯、a-羥基芐基磷酸酯、磷酸酯-(d-C2,)-0-烷基酯、磷酸酯-[(C6-Q2)芳基-(CrC2,)-0-烷基]酯、(d-C8)烷基磷酸酯和/或(Q-d2)芳基磷酸酯橋、(CVd2)-cc-羥曱基-芳基(例如，在WO95/01363中所公開)，其中(CVd2)芳基、(C6-C2o)芳基和(C6-d4)芳基選擇性地被囟素、烷基、烷氧基、硝基、氰基取代，且其中R'和R2相互獨立地是氫、(C廣d8)-烷基、(C6-C20)-芳基、(C6-C")-芳基-(Q-Cs)-烷基，優(yōu)選為氫、(CrCs)-烷基，優(yōu)選為(d-C4)-烷基和/或曱氧基乙基,或者R1和R2與承載它們的氮原子一起形成5-6元雜環(huán)，該雜環(huán)還可以含有更多選自O(shè)、S和N的雜原子。位于核苷酸的3'和/或5'端的磷酸二酯核苷酸間橋可由脫磷橋(脫磷橋的例子是UhlmannE,口PeymanA在"MethodsinMolecularBiology",Vol.20，"ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs",S.Agrawal,Ed.，HumanaPress,Totowa1993，Chapter16,pp.355ff中所述者)替代，其中脫磷橋例如選自脫磷橋甲縮醛、3'-硫代甲縮醛、甲基羥胺、肟、亞曱基二曱基-肼?lián)?、二亞甲基砜?或曱硅烷基。來自糖磷酸酯骨架(即，糖磷酸酯骨架由糖磷酸酯單元構(gòu)成)的糖磷酸酯單元(即，(3-D-核糖和磷酸二酯核苷酸間橋共同形成糖磷酸酯單元)可由其它單元替代，其中所述其它單元例如適合于構(gòu)建"嗎啉-衍生"寡聚物(例如在StirchakEP等(1989)淑/"cJc,.血L17:6129-41中所述者)，即，例如，由嗎啉衍生單元替代；或者構(gòu)建聚酰胺核酸("PNA，，；例如在NielsenPE等(1994)所oco")wg.C/zem.5:3畫7中所述)，即，例如由PNA骨架單元替代，例如2-氨基乙基甘氨酸。卩-核糖單元或P-D-2'-脫氧核糖單元可被經(jīng)修飾的糖單元替代，其中所述經(jīng)修飾的糖單元例如選自(3-D-核糖、ct-D-2'-脫氧核糖、L-2'-脫氧核糖、2'-F-2'-脫氧核糖、2'-F-阿拉伯糖、2'-0-(C,-C6)烷基-核糖，優(yōu)選為2'-0-(d-Q)烷基-核糖是2'-0-曱基核糖、2'-0-(CrC6)烯基-核糖、2'--核糖、2'-麗2-2'-脫氧核糖、(3-D-木糖-呋喃糖、a-阿拉伯呋喃糖、2,4-二脫氧-P-D-赤式-己糖-吡喃糖和碳環(huán)(例如在FroehlerJ(1992)Jw.C&w.Soc.114:8320中所述)和/或開鏈糖類似物(例如在Vandendriessche等(1993)7^ra/2^row49:7223中所述)和/或雙環(huán)糖類似物(例如在TarkovM等(1993)//e/v.CTz/m.^cto,76:481中所說)。在一些優(yōu)選的實施方式中，糖是2'-0-甲基核糖，尤其是對于一個或兩個由磷酸二酯或類磷酸二酯核普酸間^t相連的核苷酸而言。核酸也包括取代噤呤和嘧啶，諸如C-5丙炔嘧啶和7-脫氮-7-取代噤呤修飾堿基。WagnerRW等(1996)Waf.B/ofec/z"o/.14:840-4。嘌呤和嘧啶包括但不限于腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶和其它天然和非天然核堿基、取代或非取代的方向部分。經(jīng)修飾的堿基是與通常在DNA和RNA中發(fā)現(xiàn)的諸如T、C、G、構(gòu)的任何堿基。經(jīng)修飾的核苷酸堿基可以例如選自次黃嘌呤、尿嘧啶、二氫尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(d-C6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(CrC6)-炔基尿嘧啶、5-(羥曱基)尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-(d-C6)-烷基胞嘧啶、5-(C2-Q)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧咬、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N、二曱基鳥嘌呤、2,4-二氨基-噤呤、8-氮噤呤、取代7-脫氮嘌呤，優(yōu)選7-脫氮-7-取代和/或7-脫氮-8-取代嘌呤、5-羥曱基胞嘧咬、N4-烷基胞嘧啶(例如N4-乙基胞嘧啶)、5-羥基脫氧胞苷脫氧胞苷、5-羥曱基脫氧胞苷、N4-烷基脫氧胞苷(例如N4-乙基脫氧胞普)、6-硫代鳥苷和硝基吡咯的脫氧核糖核苷酸、C5-丙炔基嘧啶以及二氨基嘌呤(例如2,6-二氨基嘌呤)、肌苷、5-曱基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯噪呤、次黃嘌呤或其它天然核苷S交堿基的修飾。該名單僅是示例性的，而不應(yīng)被理解為限制性的。在本文中所描述的具體結(jié)構(gòu)式中定義了一套經(jīng)《務(wù)飾的》成基。例如，字母Y用于指代嘧啶，且在一些實施方式中指代含有胞嘧啶或修飾胞嘧啶的核苷酸。本文中所使用的修飾胞嘧啶是胞嘧啶的天然或非天然的嘧啶堿基類似物，其可以替代該堿基而不破壞寡聚核苷酸的免疫刺激活性。修飾胞嘧啶包括但不限于5-取代胞嘧啶(例如5-曱基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-氯-胞嘧啶、5-溴-胞嘧啶、5-碘-胞嘧啶、5-羥基-胞嘧啶、5-羥甲基-胞嘧啶、5-二氟曱基-胞嘧啶、以及未取代或取代的5-炔基-胞嘧，定)、6-取代胞嘧啶、N4-取代胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)、5-氮-胞嗜啶、2-巰基-胞嘧啶、異胞嘧啶、假-異胞嘧啶、具有稠環(huán)體系的胞嘧咬類似物(例如N，N'-丙烯胞嘧啶或吩噁嗪)和尿嘧啶及其衍生物(例如5-氟-尿嗜咬、5-溴-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羥基-尿嘧啶、5-丙烯基-尿嘧咬)。一些優(yōu)選的胞嘧啶包括5-曱基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-羥基-胞嘧啶、5-羥曱基-胞嘧啶和N4-乙基-胞嘧啶。在其它本發(fā)明的實施方式中，胞嘧咬堿基被通用堿基(例如3-硝基吡咯、P-堿基)、芳香環(huán)體系(例如氟苯或二氟苯)或鹵素原子(d間隔子)替代。字母Z用于指代嘌呤、嘧啶或脫堿基殘基，且在一些實施方式中指代鳥嘌呤或修飾鳥嘌呤堿基。本文中使用的修飾鳥嘌呤是鳥噪呤的天然或非天然嘌呤堿基類似物，其可以替代該堿基而不破壞寡聚核苷酸的免疫刺激活性。修飾鳥嘌呤包括但不限于7-脫氮鳥嘌呤、7-脫氮-7-取代鳥嘌呤(諸如7-脫氮-7-(C2-C6)炔基鳥嘌呤)、7-脫氮-8取代鳥嘌呤、次黃嘌呤、N2-取代鳥嘌呤(例如N2-曱基-鳥嘌呤)、5-氨基-3-曱基-3H,6H-噻唑并[4，5-d]嘧啶-2,7-二酮、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、p引味、腺。票呤、取代腺嘌呤(例如N6-曱基-腺嘌呤、8-氧代-腺嘌呤)8-取代鳥嘌呤(例如8-羥基鳥嘌呤和8-溴鳥嘌呤)和6-硫代鳥噪呤。在其它本發(fā)明的實施方式中，鳥嘌呤堿基被通用堿基(例如4-甲基-。引哚、5-硝基-口引哚和K-堿基)、芳環(huán)體系(例如苯并咪唑或二氯苯并咪唑、1-曱基-lH-[l,2，4]三唑-3-甲酰胺)或氫原子(d間隔子)替代。寡聚核苷酸可具有一個或多個可接近的5'端。可以形成具有兩個這樣的5'端的修飾寡聚核苷酸。這可以例如通過將兩個寡聚核苷酸經(jīng)3'-3'鍵形成具有一個或兩個可接近的5'端從而實現(xiàn)。所述3'-3'-鍵可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯任何其它修飾核苷酸間橋。實現(xiàn)這些鍵的方法在本領(lǐng)域中是已知的。例如，這些鍵已在Seliger,H.等，Oligonucleotideanalogswithterminal3'-3'-and5'-5'-intemucleotidiclinkagesasantisenseinhibitorsofviralgeneexpression,7Vwc/eo/油jc&7Vwc/eo/油j(1991)，10(1-3),469-77;以及Jiang等,Pseudo-cyclicoligonucleotides:invitroandinvivoproperties,B/oorg朋/c&MW"'加/C7z，/s"(1999)，7(12)，2727-2735中描述。此外，其中位于3'-端核苷酸之間的鍵不是磷酸二酯、硫代磷酸酯或其它修飾橋的3'3'-連接核酸可利用諸如三或四-乙二醇磷酸酯部分之類的其它間隔子來制備(Durand，M.等，Tripe-helixformationbyanoligonucleotidecontainingone(dA)12andtwo(dT)12sequencesbridgedbytwohexaethyleneglycolchains,5z'oc/zew^^y(1992)，31(38)，9197-204;美國專利5658738;和美國專利5668265)。另外一種方式，所述非核苷酸連接子可以采用標(biāo)準(zhǔn)氨基磷酸酯化學(xué)而衍生自乙二醇、丙二醇，或者衍生自脫堿基脫氧核糖(d間隔子)單元(Fontanel,MarieLaurence等，StericalrecognitionbyT4polynucleotidekinaseofnon-nucleosidicmoieties5'-attachedtooligonucleotides;臉c/efc^4c油iesearc/(1994),22(11),2022-7)。所述非核苷酸連接子可以接入一次或多次，或者相互組合從而獲得被連接的兩個ODN的3'-端之間的任意距離。寡聚核苷酸部分地耐受降解(例如，被穩(wěn)定)。"穩(wěn)定的寡聚核苷酸分子，，應(yīng)當(dāng)指能相對耐受體內(nèi)降解(例如通過外切或內(nèi)切核酸酶)的寡聚核苷酸。核酸穩(wěn)定可通過骨架修飾而實現(xiàn)。具有硫代磷酸酯鍵的寡聚核苷酸提供了最大活性并保護(hù)寡聚核苷酸免受細(xì)胞內(nèi)外切和內(nèi)切核酸酶降解。其它修飾寡聚核苷酸包括磷酸二酯修飾核酸、磷酸二酯和硫代磷酸酯核酸組合、甲基硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、p-乙氧基及其組合?？墒褂貌捎冒被姿狨セ蛘逪-磷酸酯化學(xué)的自動技術(shù)合成經(jīng)修飾的骨架諸如硫代磷酸酯。芳基-和烷基-磷酸酯可如美國專利4,469,863所述般進(jìn)行制備；烷基磷酸三酯(其中帶電荷的氧部分如美國專利5,023,243和歐洲專利092,574所述般進(jìn)行烷基化)可使用市售試劑通過自動固相合成而進(jìn)行制備。制造其它DNA骨架修飾和替代的方法也已凈皮4笛述(例長口UhlmannE禾口Peyman,A.,C7ze肌iev.2^:544,1990;Goodchild，丄，所oco—g她C7ze肌丄165,1990)。其它穩(wěn)定的寡聚核苷酸包括非離子DNA類似物，諸如烷基磷酸酯和芳基磷酸酯(其中帶電荷的磷酸酯氧被烷基或芳基替換)；磷酸二酯；和烷基磷酸三酯，其中帶電荷的氧部分被烷基化。在一個或兩個終端處含有諸如四乙二醇或六乙二醇之類的二醇的核酸也已顯示出能實際耐受核酸酶降解。在一些實施方式中，寡聚核苷酸包括一個或多個回文序列。如本文中所使用，"回文，，以及等同的"回文序歹ij，，應(yīng)指倒置的重復(fù)，即，諸如ABCDEE'D'C'B'A'的序列，其中A和A'、B和B'等是能形成常規(guī)Watson-Crick堿基對的堿基。在一些情況下，回文是富含GC的。富含GC的回文是石威基組成為G和C占至少三分之二的回文。在一些實施方式中，富含GC的區(qū)域優(yōu)選為"B細(xì)胞刺激域"的3'—側(cè)。在10-堿基長的富含GC的回文的情況中，所述回文因此含有至少8個G和C。在12-石成基長的富含GC的回文的情況中，所述回文也含有至少8個G和C。在14聚體富含GC的回文的情況中，所述回文的至少十個堿基是G和C。在一些實施方式中，所述富含GC的回文完全由G和C組成。在一些實施方式中，所述寡聚核苷酸含有一個以上的回文序列。DNA是經(jīng)3'-5'磷酸二酯^t相連的脫氧核糖核苷酸的聚合物。本發(fā)明的聚合物的單元也可經(jīng)3'-5'磷酸二酯鍵相連。然而，本發(fā)明也涵蓋具有異常核苷酸間鍵(具體包括5'-5'、3'-3'、2'-2'、2'-3'和2'-5'核苷酸間鍵)的聚合物。在一個實施方式中，盡管一個或多個這樣的鍵可以出現(xiàn)在聚合物中其它地方，但這些異常鍵不包含在免疫刺激性DNA模體之外。對于具有游離末端的聚合物，包括一個3'-3'核苷酸間鍵可形成具有兩個游離5'端的聚合物。反之，對于具有游離末端的聚合物，包括一個5'-5'核苷酸間鍵可形成具有兩個游離3'端的聚合物。本發(fā)明的免疫刺激性組合物可含有通過分枝單元相連的兩個或多個免疫刺激性DNA模體。這些核苷酸間鍵可以是3'-5'、5'-5'、3'-3'、2'-2'、2'-3'或2'-5'鍵。因此，命名2'-5'是根據(jù)脫氧核糖的碳原子而選定的。然而，如果采用非天然糖部分，諸如環(huán)擴(kuò)張?zhí)穷愃莆?例如，己糖、環(huán)己烯或吡喃糖)或者二環(huán)或三環(huán)糖類似物，則該命名根據(jù)單體的命名而改變。異常核苷酸間鍵可以是磷酸二酯鍵，但另外一種方式，也可以修飾為硫代磷酸酯或任何其它在本文中描述的修飾鍵。式IV顯示了通過核苷酸分枝單元而成的分枝DNA寡聚物和本發(fā)明的修飾寡聚核糖核苷酸類似物的通用結(jié)構(gòu)。因此，Nu,、Nii2和Nu3可通過3'-5'、5'-5'、3'-3'、2'-2'、2'-3'或2'-5'-鍵相連。DNA寡聚物的分枝也可涉及采用非核苷酸連接子和脫堿基間隔子。在一個實施方式中，NupNii2和Nu3表示相同的或不同的免疫刺激性DNA模體。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage43</formula>式IV修飾寡聚核糖核苷酸類似物可含有二倍子或三倍子單元(GlenResearch,Sterling,VA)，尤其是那些具有3'-3'鍵的修飾寡聚核糖核苷酸類似物。在一個實施方式中的二倍子單元可以基于1,3-二-[5-(4,4'-二曱氧基三苯曱氧基)戊基氨基]丙基-2-[(2-氰乙基)-(N,N-二異丙基)]-氨基磷酸酯。在一個實施方式中的三倍子可基于接入三-2，2，2-[3-(4，4'-二曱氧基三苯曱氧基)丙氧基曱基]乙基-[(2-氰乙基)-(N，N-二異丙基)]-氨基磷酸酯。通過多個二倍子、三倍子或其它加倍單元造成的修飾寡聚核糖核苷酸的分枝形成樹突，這是本發(fā)明的又一個實施方式。與所述類似物的非分枝形式相比，分枝的修飾寡聚核糖核苷酸類似物導(dǎo)致特別針對免疫刺激性RNA和DNA組合的具有獨特免疫作用的受體諸如TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的交聯(lián)。此外，分枝或多體類似物可穩(wěn)定DNA而耐降解，并且能使低效或部分有效的DNA序列發(fā)揮治療水平的免疫活性。修飾寡聚脫氧核糖核苷酸也可含有源自于肽修飾劑或寡聚核苷酸修飾劑(GlenResearch)的連接子單元。此外，修飾寡聚脫氧核糖核苷酸類似物可含有通過肽(酰胺)鍵與聚合物相連的一個或多個天然或非天然氨基酸殘基。3'-5'、5'-5'、3'-3'、2'-2'、2'-3'和2'-5'核苷酸間鍵可以是直接或間接鍵。在該行文中直接鍵指如本文所公開的磷酸酯或修飾磷酸酯鍵，其不具有居間的連接子部分。居間的連接子部分是與本文中所公開的磷酸酯或修飾磷酸酯鍵不同的有機(jī)部分，其可包括例如聚乙二醇、三乙二醇、六乙二醇、d間隔子(即，脫堿脫氧核苷酸)、二倍子單元或三倍子單元。所述鍵優(yōu)選由C、H、N、O、S、B、P和卣素構(gòu)成，含有3至300個原子。3個原子的例子是縮醛鍵(ODNl-3'-0-CH2-0-3'-ODN2),其將例如一個核苷酸的3'-羥基連接到第二個寡聚核苷酸的3'-羥基。含有約300個原子的例子是PEG-40(四十聚乙二醇)。優(yōu)選的鍵是磷酸二酯、硫代磷酸酯、曱基磷酸酯、氨基磷酸酯、硼代磷酸酯、酰胺、醚、硫醚、縮醛、硫代縮醛、脲、硫脲、磺胺、希夫堿和二硫鍵。也可以使用SolulinkBioConjugationSystem,即(www.trilinkbiotech.com)。如果寡聚核脊酸由兩個或多個序列部分組成，這些部分可以是相同或不同的。因此，在具有3'3'-鍵的寡聚核苷酸中，所述序列可以是相同的5'-ODNl-3'3'-ODNl-5'或不同的5'-ODNl-3'3'-ODN2-5'。此外，各寡聚核苷酸部分以及將其連接的連接子的化學(xué)修飾可以是不同的。由于短寡聚核苷酸的攝取似乎不如長寡聚核苷酸的攝取有效，兩個或多個短寡聚核苷酸的連接能導(dǎo)致提高的免疫刺激。短寡聚核苷酸的長度優(yōu)選為2-20個核苷酸，更優(yōu)選為3-16個核苷酸，最優(yōu)選為5-10個核苷酸。優(yōu)選具有兩個或兩個以上未連接的5'-端的連接寡聚核苷酸。寡聚核苷酸部分序列也可以通過非核苷酸連接子相連。本文中所使用的"非核苷酸連接子"指任何非核苷酸或其聚合物(即聚核苷酸)的連接子部件，其中核苷酸包括嘌呤或嘧啶核i咸基和糖磚酸酯，具體為脫堿基連接子(d間隔子)、三乙二醇單元或六乙二醇單元。其它優(yōu)選的連接子是諸如C3、C6、C12氨基連接子之類的烷基氨基連接子和諸如C3或C6硫醇連接子之類的烷基硫醇連接子。這些寡聚核苦酸也可以通過芳香性殘基相連，所述芳香性殘基可進(jìn)一步被烷基或取代烷基所取代。為有助于攝取進(jìn)入細(xì)胞，在一些實施方式中的免疫刺激性寡聚核苷酸長度為3至100個堿基。在一些實施方式中，寡聚核苷酸長度為7-100個堿基。通常，如果存在足夠的免疫刺激模體，長度超過6個核苦酸(甚至數(shù)個kb長)的核酸能誘導(dǎo)根據(jù)本發(fā)明的免疫應(yīng)答。然而，本發(fā)明的修飾寡聚核苷酸的提高的免疫刺激能力為免疫刺激分子提供了短得多的長度。在一些實施方式中，免疫刺激性寡聚核苷酸的長度為3-6個石威基。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸可在本發(fā)明的一些方面用作治療具有患過敏或哮喘、被傳染性生物體感染或其中特定癌癥抗原已被鑒定的癌癥的風(fēng)險的受試對象的疫苗。也可以在沒有抗原或過敏原的情況下給予CpG免疫刺激性寡聚核苷酸以保護(hù)受試者免于患感染、過敏或癌癥，在此情況下，重復(fù)劑量可進(jìn)行更長期的保護(hù)。本文中所使用的具有風(fēng)險的受試對象是具有暴露于導(dǎo)致感染的病原體或癌癥或過敏原中的任何風(fēng)險或具有患癌癥的風(fēng)險的受試對象。例如，具有風(fēng)險的受試對象可以是計劃到發(fā)現(xiàn)了特殊類型傳染劑的地區(qū)旅游的受試對象，可以是由于生活方式或醫(yī)療過程而暴露于含有傳染性生物體的體液或直接暴露于所述生物體、或者甚至與在已鑒別出傳染性生物體或過敏原的區(qū)域中生活的受試對象進(jìn)行接觸的受試對象。具有患感染的風(fēng)險的受試對象也包括醫(yī)療組織向其推薦具有特定傳染性生物體抗原的疫苗的普通人群。如果抗原是過敏原，受試對象對該特定抗原出現(xiàn)過敏反應(yīng)，且受試對象可能暴露于該抗原(例如，在花粉季節(jié))，則受試對象具有暴露于該抗原的風(fēng)險。具有患過敏或哮喘風(fēng)險的受試對象包括那些已被鑒定為患有過敏或哮喘但在CpG免疫刺激性寡聚核苷酸治療期間未出現(xiàn)活性疾病的受試對象，以及那些由于基因或環(huán)境因素而被認(rèn)為具有患這些疾病的風(fēng)險的受試對象。具有患癌癥的風(fēng)險的受試對象是很有可能患癌癥的受試對象。這些受試對象包括，例如，具有其存在已被證實與更高的患癌癥的可能性有關(guān)的基因異常的受試對象，以及暴露于諸如煙草、石棉或其它化學(xué)毒素之類的致癌劑的受試對象，或者之前已因為癌癥進(jìn)行治療并且表現(xiàn)出復(fù)發(fā)的受試對象。當(dāng)具有患癌癥風(fēng)險的受試對象用對該受試對象具有風(fēng)險患上的那種癌癥類型具有特異性的抗原和CpG免疫刺激性寡聚核苷酸進(jìn)行治療時，受試對象可以在癌癥細(xì)胞發(fā)展時殺滅癌癥細(xì)胞。如果在受試對象中開始形成肺瘤時，所述受試對象將出現(xiàn)特異性免疫應(yīng)答以4氐抗該腫瘤抗原。除使用CpG免疫刺激性寡聚核普酸用于預(yù)防性治療之外，本發(fā)明還包括使用CpG免疫刺激性寡聚核苷酸治療患有感染、過敏、嗜喘或癌癥的受試對象。患感染的受試對象是已暴露于傳染性病原體并在體內(nèi)出現(xiàn)急性或慢性可檢測水平的病原體的受試對象。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸可伴有或者不伴有抗原而用于引起能夠降低傳染性病原體水平或者清除傳染性病原體的抗原特異性全身性或粘膜性免疫應(yīng)答。如本文中所使用，傳染性疾病是由于在身體中存在外來微生物而導(dǎo)致的疾病。尤其重要的是開發(fā)出有效免疫策略和治療以保護(hù)身體粘膜表面，身體粘膜表面是病原進(jìn)入的首要位置?；加羞^敏的受試對象是患有或者具有患響應(yīng)過敏原的過敏反應(yīng)的受試對象。過敏指對物質(zhì)(過敏原)的后天超敏性。過敏性病癥包括但不限于濕滲、過敏性鼻炎或鼻炎、花粉熱、結(jié)膜炎、支氣管哮喘、蕁麻瘆(麻滲)和食物過敏以及其它遺傳過敏性病癥。過敏通常由抗無害過敏原而產(chǎn)生的IgE抗體導(dǎo)致。由CpG免疫刺激性寡聚核苷酸的全身性或粘膜性施用誘導(dǎo)的細(xì)胞因子主要是被稱之為Thl的一類(例子有IL-12、IP-IO、IFN陽a和IFN-y)，并且它們同時誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。另一種主要類型的免疫應(yīng)答與IL-4和IL-5細(xì)胞因子的產(chǎn)生相關(guān)，其被稱為Th2免疫應(yīng)答。通常，似乎免疫疾病是由Th2型免疫應(yīng)答介導(dǎo)的?；贑pG免疫刺激性寡聚核苷酸改變受試對象體內(nèi)的免疫應(yīng)答由占主要的Th2(與IgE抗體和過敏相關(guān))變?yōu)槠?軒的Th2/Thl應(yīng)答(保護(hù)免受過敏反應(yīng))，誘導(dǎo)CpG免疫刺激性寡聚核苷酸的過敏應(yīng)答的有效劑量可施用給受試對象以治療或防治哮喘和過敏。因此，CpG免疫剌激性寡聚核苷酸在諸如哮喘之類的過敏和非過敏病癥的治療中具有顯著的治療效用。Th2細(xì)胞因子，尤其是IL-4和IL-5，在哮喘受試對象的氣道中升高。這些細(xì)胞因子促進(jìn)哮喘炎性應(yīng)答的重要方面，包括IgE同位素切換、嗜酸性粒細(xì)胞趨化性和活化和肥大細(xì)胞生長。Thl細(xì)胞因子，尤其是IFN々和IL-12，能抑制Th2克隆的形成和Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生。啤喘指呼吸系統(tǒng)疾病，其特征在于發(fā)炎、氣道狹窄和氣道對被吸入的試劑的提高的反應(yīng)性。哮喘通常但非絕對性地與遺傳過敏性或過敏癥狀相關(guān)?；及┌Y的受試對象是具有可^r測到的癌細(xì)胞的受試對象。癌癥可以是惡性或非惡性癌癥。癌癥或肺瘤包括但不限于膽道癌；腦癌；乳腺癌；子宮頸癌；絨癌；結(jié)腸癌；子宮內(nèi)膜癌；食管癌；胃癌；內(nèi)腫瘤；淋巴瘤；肝癌；肺癌(例如，小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌)；黑色素瘤；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；直腸癌；肉瘤；皮膚癌；睪丸癌；曱狀腺癌和腎癌；以及其它癌及肉瘤。在一個實施方式中，癌癥是毛細(xì)胞白血病、慢性髓細(xì)胞性白血病、皮膚T細(xì)胞白血病、多發(fā)性骨髓瘤、濾泡性淋巴瘤、惡性黑色素瘤、鱗狀細(xì)胞癌、腎細(xì)胞癌、前列腺癌、膀胱癌或結(jié)腸癌。受試對象應(yīng)指人類或脊推動物，包括但不限于狗、貓、貓、牛、豬、綿羊、山羊、火雞、雞、例如猴之類的靈長類和例如鮭魚之類的魚(水產(chǎn)物種)。因此，本發(fā)明也可用于治療非人受試對象的癌癥和腫瘤、感染和過敏/哮喘。癌癥是伴侶動物(即，貓和狗)死亡的主要原因之一。如本文中所使用的，當(dāng)針對諸如傳染性疾病、癌癥、過敏或譯喘之類的病癥來使用時，術(shù)語治療、已治療或治療中指預(yù)防性治療及在受試對象已患疾病之后的治療，所述預(yù)防性治療提高受試對象對患所述疾病(例如感染病原體)的抵抗力，或者換言之，降低受試對象患所述疾病(例如被病原體感染)的可能性；且所述在受試對象已患疾病之后的治療對抗所述疾病(例如減少或消除感染)或防止疾病惡化。在將CpG寡聚核苷酸與抗原一起施用的情況下，受試對象暴露于抗原。如本文中所使用的，術(shù)語"暴露于"是指受試對象與抗原的主動接觸或受試對象對抗原的體內(nèi)被動暴露。受試對象對抗原的主動暴露方法在本領(lǐng)域中是公知的。通常，通過諸如靜脈注射、肌肉注射、經(jīng)口、透皮、經(jīng)粘膜、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)或皮下注射施用等任何方式直接向受試對象施用抗原?？乖扇硎┯没蚓植渴┯?。抗原和CpG免疫刺激性寡聚核苷酸的施用方法在以下更詳細(xì)地進(jìn)行描述。當(dāng)抗原變得可暴露于體內(nèi)的免疫細(xì)胞時，受試對象被動暴露于抗原。受試對象可胞的發(fā)展從而被動地暴露于抗原。其中受試對象被動暴露于抗原的方法可特別依賴于CpG免疫刺激性寡聚核香酸的施用時機(jī)。例如，在具有患癌癥或傳染性疾病或過敏或哮喘性應(yīng)答的風(fēng)險的受試對象中，當(dāng)風(fēng)險最大時，即在過敏季節(jié)或在暴露于致癌劑之后，可以定期向受試對象施用CpG免疫刺激性寡聚核苦酸。此外，在旅行者前往他們具有暴露于傳染性媒介風(fēng)險的國外地區(qū)旅行之前可向其施用CpG免疫刺激性寡聚核苷酸。同樣，可向具從而在受試對象暴露于抗原時:秀導(dǎo)對所述抗原:^身性或粘S免疫應(yīng)答。本文中所使用的抗原是能激起免疫應(yīng)答的分子?？乖ǖ幌抻诩?xì)胞、細(xì)胞提取物、蛋白質(zhì)、多肽、肽、多糖、多糖軛合物、多糖的肽或非肽模擬物以及其它分子、小分子、脂質(zhì)、糖脂、碳水化合物、病毒和病毒提取物和多細(xì)胞生物體諸如寄生蟲和過敏原。術(shù)語抗原廣泛地包括被宿主免疫系統(tǒng)識別為外來的任何類型的分子?？乖ǖ幌抻诎┛乖?、微生物抗原和過敏原。本文中所使用的癌抗原是與肺瘤或癌細(xì)胞表面相連的化合物諸如肽或蛋白質(zhì)，當(dāng)其依據(jù)MHC分子而在抗原呈遞細(xì)胞表面表達(dá)時能夠激起免疫應(yīng)答。可通過例如在Cohen等，1994，C騰e"置aw/z,54:1055中所述制備癌細(xì)胞粗提取物，通過部分純化抗原，通過重組技術(shù)，或者通過已知抗原的重新合成而從癌細(xì)胞制備癌抗原。癌抗原包括^S不限于是能重組表達(dá)的抗原，腫瘤或癌癥的免疫原部分或整個腫瘤或癌癥。這些抗原可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的任何其它方法進(jìn)行分離或重組制備。本文中所使用的微生物抗原是^:生物的抗原，包括但不限于病毒、細(xì)菌、寄生蟲和真菌。這些抗原包括完整的微生物及其天然分離物和片段或衍生物，以及與天然微生物抗原相同或者相似并能誘導(dǎo)對該微生物具有特異性的免疫應(yīng)答的合成化合物。如果化合物誘導(dǎo)對天然微生物抗原的免疫應(yīng)答(體液的和/或細(xì)胞的)，則其與天然微生物抗原相似。這些抗原在本領(lǐng)域中經(jīng)常使用并且對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是廣為所知的。病毒是小的傳染性媒介，其通常含有核酸核心和蛋白質(zhì)外殼，但不是獨立存活的生物體。病毒也可以采取缺失蛋白的傳染性核酸的形式。病毒在沒有活體細(xì)胞時不能存活，其能在活體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制。病毒通過細(xì)胞內(nèi)吞作用或直接注入DNA(噬菌體)而進(jìn)入特定活體細(xì)胞并繁殖，導(dǎo)致疾病。繁殖的病毒隨后能被釋放并感染其它細(xì)胞。一些病毒是含有DNA的病毒，其它是含有RNA的病毒。DNA病毒包括痘病毒(Pox)、皰滲病毒(Herpes)、腺病毒(Adeno)、乳多空病毒(Papova)、細(xì)小病毒(Parvo)和嗜肝DNA病毒(Hepadna)。RNA病毒包括微小核糖核酸病毒(Picorna)、杯狀病毒(Calici)、Astro、披膜樣病毒(Toga)、黃病毒(Flavi)、冠^j犬病毒(Corona)、副粘'液病毒(Pammyxo)、正粘病毒(Orthomyxo)、布尼亞病毒(Bunya)、沙粒病毒(Arena)、彈狀病毒(Rhabdo)、絲狀病毒(Filo)、波爾納病毒(Borna)、呼腸孤病毒(Reo)和逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retro)。在一些方面，本發(fā)明也意圖治療其中在病程中牽涉到朊病毒的疾病諸如例如動物中的牛海綿狀腦病(即瘋牛病，BSE)或羊瘙癢癥，或人類中的克羅伊茨費爾特-雅各布病。病毒包括但不限于腸道病毒(包括但不限于小RNA病毒科(picomaviridae)病毒家族，諸如脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇病毒、艾柯病毒)、輪狀病毒(rotavimses)、腺病毒和肝炎病毒比如肝炎甲、乙、丙、丁、戊型病毒。已在人類中發(fā)現(xiàn)的病毒的具體例子包括但不局限于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)(例如，人類免疫缺陷性病毒，諸如HIV-1(也稱為HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV,或HIV-III;以及其它分離抹，諸如HIV-LP));小RNA病毒科(Picomaviridae)(例如，骨髓灰白質(zhì)炎病毒、曱肝病毒；腸道病毒，人柯薩奇病毒、鼻病毒、艾柯病毒)；Calciviridae(例如，導(dǎo)致胃腸炎的病毒抹)；披蓋病毒科(Togaviridae)(例如，馬腦炎病毒、風(fēng)滲病毒)；黃病毒科(Flaviviridae)(例如，登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病毒)；管狀病毒科(Coronaviridae)(例如，日冕形病毒)；彈狀病毒科(Rhabdoviridae)(例如，水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒)；纖絲病毒科(Filoviridae)(例如，埃博拉病毒)；副粘病毒科(例如，副流感病毒、腮腺炎病毒、麻滲病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒)；布尼亞病毒牙+(Bunyaviridae)(例如，漢坦病毒、布尼亞病毒、phlebo病毒和內(nèi)羅病毒)；沙沖立病毒-牛(Arenaviridae)(出血熱病毒)；呼腸孑瓜病毒牙牛(Reoviridae)(例如，呼腸孫、病毒、orbiviurses和輪狀病毒)；雙核糖核酸病毒科(Birnaviridae);嗜肝DNA病毒^)"(Hepadnaviridae)(乙肝病毒)；樣吏細(xì)小病毒一牛(Parvoviridae)(微細(xì)小病毒)；乳多泡病毒科(Papovaviridae)(乳頭瘤病毒、多形瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(最主要是腺病毒)；皰滲病毒科(Herpesviridae)(單純皰滲病毒(HSV)l和2、水痘帶狀皰滲病毒、巨細(xì)胞病毒(CMV));痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲豬瘟病毒)；及其它病毒急性哮吼伴隨病毒、A病毒、考波希肉瘤相關(guān)的皰療皰瘆病毒、新城疫病毒、尼巾白病毒(Mpahvirus)、諾沃克病毒(Norwalkvirus)、乳頭瘤病毒(Papillomavirus)、副;克感病毒、禽;充感、SARs病毒禾口西尼羅河病毒。本發(fā)明的方法在一些實施方式中特別有用于治療人類免疫缺陷性病毒(HIV)和肝炎病毒。HIV，一種逆轉(zhuǎn)錄病毒，也稱為人類T-細(xì)胞淋巴細(xì)胞病毒III(HTLVIII),其造成導(dǎo)致稱之為AIDS的疾病的惡化。HIV感染并摧毀T細(xì)胞，擾亂免疫系統(tǒng)的整體平衡，導(dǎo)致患者與其它感染斗爭的能力，使患者有更大的機(jī)會患通常為致命的感染。病毒性肝炎是肝臟的炎癥，其可造成腫脹、觸痛并且有時候造成肝臟的永久損傷。如果肝臟的炎癥持續(xù)至少六個月或者更長，則稱之為慢性肝炎。已知存在至少五種不同的病毒導(dǎo)致肝炎，包括曱、乙、丙、丁、戊型肝炎。曱型肝炎通常通過被人類糞便污染的食物或飲用水傳染。乙型肝炎通常通過體液諸如血液傳播。例如，可在分娩時由母親傳染給嬰兒、通過性接觸、污染的血液輸血和針頭傳播。丙型肝炎很常見并且類似于乙型肝炎，其通常通過輸血和污染的針頭傳播。丁型肝炎大多在為與之共同相關(guān)的乙肝病毒攜帶者的IV藥物使用者中發(fā)現(xiàn)。戊型肝炎與病毒性曱型肝炎相似，通常與較差的衛(wèi)生狀況有關(guān)。革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細(xì)菌均為脊推動物體的抗原。這些革蘭氏陽性菌包括但不限于巴氏桿菌屬(尸^te"M^)、葡萄球菌屬(5"to/7/^/ococcO和鏈球菌屬OSym;tococcw"。革蘭氏陰性細(xì)菌包括但不限于大腸桿菌(Esc/zen'c/zz'"co//)、夯支單胞菌屬(/^ewc/omowoy)和沙門氏菌屬(5Wmo"e〃a)。傳染性細(xì)菌的具體例子包括但不限于幽門螺旋桿菌(//e/z'co6(3c/er;jVcWs)、布氏^1螺;5走體(^0^//06wrgdo/^n')、4曼月申軍團(tuán)菌(丄^g7'o"e〃a/7"eiw7o;/n7/a)、分才支4干菌屬(辟co6acfen'a5p"(例^口結(jié)才亥分枝桿菌(M^Jm^/ow》、貪食分枝桿菌(Mav/wm)、胞內(nèi)分枝桿菌(M^race〃w/a)、堪薩斯分枝桿菌(Mkmra//)、戈登分枝桿菌(M、金黃色葡萄球菌(5to//2_y/ococcwsai/us)、淋病奈瑟氏菌(iVe/^en'agowon^oecze)、月S月莫炎奈瑟氏J求菌{TVe/^eWawem."g7'/7.ofe)、單核細(xì)月包增生利斯特氏菌(丄/Wen'awo"ocytoge"e力、釀膿鏈球菌(浙e//ococcMSp;;oge"as1)(A類鏈球菌)、無乳鏈球菌(5W/tococcuag"/acriae)(B類鏈球菌)、鏈球菌(》eptococcws)(草綠色類(viridians))、糞鏈球菌(浙eptococ，/aecafe)、牛鏈球菌(浙，ococ面Z)ov,s)、鏈球菌(jS/re//oco"wj)(厭氧屬(fl""era6/csps.))、月巿炎4連3求菌(S^e^tococcwsp"e臓om'ae)、病原性彎曲桿菌屬(pathogenicC翻/y/o^"ers/.)、腸球菌屬(五"feracoccws流感嗜血軒菌(//"￡膨//7"">/^"2—、炭癥芽孑包軒菌(6g"7/ws""加"》、白喉棒軒菌(cc^yweZ"cfer/m附卻楊en'oe)、棒一夂才干菌屬(co;^"efcacfen.w附、纟工J汪丹毒絲菌(EV^s^e/o^n'xr/zMw.opaf/n.fi^)、產(chǎn)氣莢膜才麥菌(C7ostn'Ww附pe，/wge/^)、石皮傷風(fēng)4干菌(C7osr/t/,-Mwfetom〕、產(chǎn)氣腸4f菌(fiV^era6"cferaeragewe)、克雷白氏4干菌(尺/eZw/e〃fl/wewmom'ae)、多殺巴斯德氏菌(尸ostwre〃amw/to"V/a)、類才干菌屬(Sacfera/(iay5/.)、具4盡才炎4干菌(Fwso6acten'ww/wc/aa/wm)、念玉朱^犬4連斥干菌(6^e/to6ac/〃wswom7z》wn》、蒼白密蟲累》走體(7e/70"ew"/%〃/(^"附)、才及纟田密蟲累S走體(7>e/owem<3peWewwe)、4勾3離蟲累S走體(Z^/to—ra)、立克次氏體(WcA:etoV!f)、和衣氏放線菌W"owyces真菌的例子包括新型隱球菌(Co^tococcw"eo/ommw)、莢膜組織月包^t菌(/Z&top/aymac(3/ww/(3^w)、^SJ求孑包子菌(Cocc/Wo/ciayz7wm'to)、皮炎芽生菌(5/ostow;/cas(aferw加故6fc)、沙0艮衣原、體(CTz/awy&a/rac/zow"^)、白色念珠菌(C"wc^fofl/Z)/omy)。其它傳染性生物體(即原生生物)包括疰原蟲屬(尸/wmo^www/.)，諸^口鐮4犬癡原蟲(P/aswoc/wm/a/c^pan/m)、三日癡原蟲(/Vosmo^wnwa/an'ae)、卵形痞原蟲(/Vos7wWwwov"/e)禾口間日疾原蟲(戶/osmoWwwvivax)和龔地弓形蟲(7bxo//aywagow/")。血液傳播和/或組織寄生蟲包才舌癡原蟲屬(/7aywc^/wwspp.)、田鼠巴貝蟲(5aZ&s^m/crad)、分離巴貝蟲(5"6es/a(i/vergera)、熱帶利"f十曼蟲(丄e/s/zwam'aZra//ca)、利4十曼原蟲(丄e/Wmam'aspp.)、巴西利"f十曼蟲(Z^&Zwaw/a6razz7/em7》、4土氏利"f十曼蟲(丄e/sAmam'aaowovam〕、岡比亞4,蟲(27yj^mayo附agowZn'e"5^)和羅《急西亞4,蟲(ropawasomaAocfe^eme)(非洲昏睡病)、南美洲4,蟲(7)7/a"oscw7acrwz/)(沙力口其斤疾病)和龔》也弓形蟲(7bxo//as附agow/")。其它醫(yī)學(xué)相關(guān)的微生物已在文獻(xiàn)中廣泛地進(jìn)行了描述，例如參見C.G,AThomas,MWca/Mcra&o/o肌BailliereTindall,GreatBritain1983,其全部內(nèi)容在此以引用的方式引入。過敏原指能在易感受試對象中誘導(dǎo)過敏性或哮喘應(yīng)答的物質(zhì)(抗原)。過敏原的列表將非常龐大并且可包括花粉、昆蟲毒素、動物毛屑、真菌孢子和藥物(例如盤尼西林)。天然、動物和織物過敏原的例子包括但不限于以下具體屬的蛋白質(zhì)犬屬(家犬)；塵螨屬(例如粉塵螨(Z^wato//wgo/fifey々W"ae));貓屬(家貓)；Jw/raw'a(^w6raw'aarte/m^/o/Za);黑麥草屬(Lo/Zww)(例如黑麥草(丄o"wmpere朋e)或多花黑麥草(丄o/Zwwmw/n;/7orww));湘卩才》(Co^towen.")(曰本杉卩才j(Oy;tomen'a乂apo"/ca));交鏈孢屬(鏈格孢)；赤楊G4Ww);赤楊屬(^/"w力G4/"wgw/^oosa);樺屬(5"M/a)(祝皮樺CS"w/avern/cosa));櫟屬(gwercw)(白櫟(gwercwsa/6a));木樨欖屬(9/ea(油橄欖((9/eaewra/a));蒿(^4Wew/w'")(艾蒿G4rtem/w'avw/gan》)；車前屬(P/a"togo)(例如長葉車前(尸/a"togoAa"ceo/ata》；墻草屬(尸an'eton'a)(例如藥用墻草(尸an'eton'(3q^c/"a〃5)或者猶大墻草(尸an'etan,a>^n'ca));小蠊屬(5/a"e〃a)(例如德國小蠊(S/"/fe〃ag^wa柳.c");蜂04p/力(例^口黑麥草蟲奪(^;"ww/打y/o廠w附》；4白木屬(Cw/rewz^)(例如地中海柏(Cwpres5^化w尸erwVe""、綠桿柏(Cw/re^Marz'zo"/ca)、金葉大果柏(Cw/mwz^macracar/"》；檢屬歐洲刺柏(Jwm^en^cowmwm》和德、州雪^"(Jwm》en^<^/zez〕)；側(cè)柏屬(77zwya)(例^口傷W白(77zi/j;"on'e"to/^));扁;f白屬(C7zam"ec^/^r/s)(如H口曰本扁柏(C7zawaeqy/ar/soZ)/i^e));大嫌屬(尸en)/aweto)(例^口美洲大嫌re/e"力)；黑麥屬(5feca/e)(例^。黑麥(5^ca/ecerea/e));小麥(7H"cMm)(例如小麥(7H"cwmaeW/wm));鴨茅屬(Dac(yfc)(例如鴨茅(Dac(y/^g/o附erarto》；羊茂屬(Fesfwc")"列^口高羊茅(Fe5fwc"e/a&w));早熟禾屬(例如草地早熟禾(尸oofprafera&)或扁早熟禾CPoacom/re^(3));燕麥屬(y4ve朋)(例如燕麥(Jve"am"v"));絨毛草屬(7/o/cw》(例如絨毛草(//o/cm/a"a^s));黃花茅屬(^4"^20^"http://7"附)(例^口黃花茅(^4wf/2ax:(3w^mwodora/MW))、燕麥草屬(y4/r/2ewa決eram)(例如燕麥草(v4/r/ze"af/zer騰e/加'w力)；翦股穎屬(v4gra幼'力(例如小糠草(」gra^;"/Za));梯牧草屬(尸/z/ewm)(例如梯牧草(尸/z/ewmprate"化))；鶴草屬CP/^/an.力(例如藺草(尸/zfl/an、an^W"acea));毛花雀牙卑(戶as77a/ww)(i"列^口百喜草(尸oypa/wwwof"/ww));高粱(5brg/mw)(例如約l裔遜草(5brg/m附/za/e/eww'力)和雀麥屬(5ra附ws)(例^口無芒雀麥(5ramws/"ew2&)。本文中使用的術(shù)語"基本純凈"指基本上不含有與之天然相關(guān)的其它蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物或其它材料的多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員能采用用于蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)純化病毒或細(xì)菌多肽。這些基本純凈的多肽通常在非還原聚丙烯酰胺凝膠上形成單一主要條帶。在部分糖基化多肽或者具有數(shù)個開始密碼子的情況下，在非還原聚丙烯酰胺凝膠上可以有多條帶，但這些帶將形成該多肽的特征圖形。病毒或細(xì)菌多肽的純度可由氨基端氨基酸序列分析進(jìn)行測定。非核酸載體編碼的其它類型的抗原諸如多糖、小分子、模擬物等也包括在本發(fā)明中本發(fā)明的寡聚核苷酸可以與抗微生物劑一起施用給受試對象。本文中所使用的抗微生物劑指能殺滅或抑制傳染性^:生物的天然或合成化合物。根據(jù)本發(fā)明可用的抗微生物劑類型將取決于受試對象所感染的或者具有被其感染的風(fēng)險的微生物類型?？刮⑸飫┌ǖ幌抻诳辜?xì)菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑和抗寄生蟲劑。諸如"抗感染劑"、"抗細(xì)菌劑"、"抗病毒劑"、"抗真菌劑"、"抗寄生蟲劑"和"殺寄生蟲劑"之類的短語對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說已有明確含義，并且已在標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)教科書中定義。簡言之，抗細(xì)菌劑殺滅或抑制細(xì)菌，并包括抗生素以及具有相似功能的其它合成或天然化合物。抗生素是能通過細(xì)胞諸如微生物產(chǎn)生次級代謝物的低分子量分子。通常而言，抗生素干擾微生物特有的在宿主細(xì)胞中并不存在的一個或多個細(xì)菌功能和結(jié)構(gòu)。抗病毒劑可從天然來源中分離或者合成，并可用于殺滅或抑制病毒。抗真菌劑用于治療表面真菌感染以及機(jī)會感染和原發(fā)性全身真菌感染?？辜纳x劑殺滅或抑制寄生蟲。不限于阿苯達(dá)唑、兩性霉素B、千硝唑、硫氯酚、氯喹鹽酸鹽、氯喹磷酸鹽、氯脫氧林肯霉素、去氫吐根堿、二乙基氨基曱吖嗪、二氯尼特糠酸鹽或酯、依氟鳥氨酸、fiirazolidaone、糖皮質(zhì)激素、卣泛群、碘化奎寧、異阿凡曼菌素、磺唑氨酯、甲氟喹、葡甲胺銻酸鹽、美拉胂醇、美曲膦酯、依氟鳥氨酸、滅絳靈、硝呋噻氧、羥胺硝喹、巴龍霉素、異硫化羥酸羥乙基磺酸鹽、哌嗪、吡喹酮、伯氨喹啉磷酸鹽、白樂君、雙羥萘酸會嘧啶、乙胺嘧啶-氨石黃酰、乙胺嘧"定-磺胺多辛、奎吖因鹽酸鹽、硫酸奎寧、葡糖酸奎尼定、螺旋霉素、葡萄糖酸銻鈉(stibogluconatesodium(sodiumantimonygluconate))、手早爾205、四J不素、強力霉素、噻菌靈、磺曱硝咪唑、三曱氧芐氨嘧啶-磺胺曱基異惡唑和對氨甲酰曱胺苯胂酸鈉，其中一些可單獨使用或與其它組合使用?？辜?xì)菌劑殺滅或抑制細(xì)菌的生長或功能。一大類抗細(xì)菌劑是抗生素。能有效殺滅或抑制大范圍細(xì)菌的抗生素稱之為光譜抗生素。其它類型的抗生素主要有效地抗革蘭氏陽性或革蘭氏陰性類的細(xì)菌。這些類型的抗生素稱之為狹譜抗生素。能抗單一生物體或疾病而不抗其它類型的細(xì)菌的抗生素稱之為受限譜抗生素?？辜?xì)菌劑有時候根據(jù)其主要作用模式進(jìn)行分類。通常，抗細(xì)菌劑是細(xì)胞壁合成抑制劑、細(xì)胞膜抑制劑、蛋白合成抑制劑、核酸合成或功能抑制劑和竟?fàn)幰种苿？共《緞┦悄芊乐辜?xì)胞被病毒感染或細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制的化合物。相比抗細(xì)菌劑藥物，抗病毒藥物少很多，這是因為病毒復(fù)制的過程與宿主細(xì)胞中的DNA復(fù)制緊密相關(guān)，而非特異性抗病毒劑通常對宿主也是有毒的。病毒感染過程中存在多個階段可被抗病毒劑阻斷或抑制。這些階段包括病毒附著于宿主細(xì)胞(免疫球蛋白或結(jié)合肽)、病毒脫殼(例如金剛烷胺)、病毒mRNA的合成或翻譯(例如干擾素)、病毒RNA或DNA的復(fù)制(例如核苷酸類似物)、新病毒蛋白的成熟(例如蛋白酶抑制劑)和病毒出芽和釋放。核苷酸類似物是與核苷酸相似但具有不完整的或異常的脫氧核糖或核糖基團(tuán)的合成化合物。一旦核苷酸類似物在細(xì)胞中，它們被磷酰化，形成與正常核苷酸竟?fàn)庍M(jìn)入病毒DNA或RNA的三磷酸酯形式。一旦核普酸類似物的三磷酸酯形式進(jìn)入生長中的核酸鏈，它導(dǎo)致與病毒聚合酶的不可逆結(jié)合從而造成鏈終止。核苷酸類似物包括但不限于阿昔洛韋(acyclovir)(用于單純皰滲病毒和水痘帶狀皰滲病毒的治療)、更昔洛韋(gancyclovir)(用于巨細(xì)胞病毒的治療)、碘苷(idoxuridine)、利巴韋林(ribavirin)(用于呼吸道合胞病毒的治療)、二脫氧肌苷、二脫氧胞苷、疊氮胸苷(azidothymidine)、咪喹莫特(imiquimod)和瑞咪喹莫特(resimiquimod)。千擾素是由病毒感染細(xì)胞以及免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子。干擾素通過與感染細(xì)胞相鄰的細(xì)胞上的特異性受體相結(jié)合而發(fā)揮作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生變化以保護(hù)其免受病毒感染。a和(3-干擾素也誘導(dǎo)感染細(xì)胞表面上I類和II類MHC分子的表達(dá)，導(dǎo)致更多的抗原呈現(xiàn)以供宿主免疫細(xì)胞識別。a和(3-干擾素以重組形式提供并用于慢性乙肝和丙肝感染的治療。以有效進(jìn)行抗病毒治療的劑量，干擾素有嚴(yán)重的副作用，諸如發(fā)熱、不適和體重降低?？捎糜诒景l(fā)明的抗病毒劑包括但不限于免疫球蛋白、金剛烷胺、干擾素、核苷酸類似物和蛋白酶抑制劑?？共《緞┑木唧w例子包括但不限于醋孟南(Acemannan);阿昔洛韋(Acyclovir);阿昔洛韋鈉；阿德福韋酉旨(Adefovir);阿羅夫定(Alovudine);阿韋舒托(AlvirceptSudotox);鹽酸金剛烷胺；阿拉諾丁(Aranotin);阿立酮(Arildone);阿替韋啶(Atevirdine)曱磺酸鹽；阿夫立定(Avridine);西多弗韋(Cidofovir);西潘茶堿(Cipamfylline);鹽酸阿糖胞苷；地拉韋啶(Delavirdine)甲磺酸鹽；地昔洛韋(Desciclovir);去羥肌苷(Didanosine);二惡沙利(Disoxaril);依度尿苷(Edoxudine);恩韋拉登(Enviradene);恩韋肟(EnViroxime);泛昔洛韋(Famciclovir);抑感靈鹽酸鹽(FamotineHydrochloride);非西他濱(Fiacitabine);非阿尿苷(Fialuridine);磷利酯(Fosarilate);膦曱酸鈉(Foscarnetsodium);膦乙醇鈉(Fosfonetsodium);更昔洛韋(Ganciclovir);更昔洛韋鈉；碘苷；乙氧二羥丁酮(Kethoxal);拉米夫定(Lamivudine);洛布卡韋(Lobucavir);美莫汀(Memotine)鹽酸鹽；美替沙月宗(Methisazone);萘維拉平(Nevirapine);噴昔洛韋(Penciclovir);p比羅達(dá)韋(Pirodavir);利巴韋林(Ribavirin);鹽酸金剛乙胺(RimantadineHydrochloride);沙奎那維(Saquinavir)曱磺酸鹽；索金剛胺(Somantadine)鹽酸鹽；索立夫定(Sorivudine);旬支青霉菌素(Statolon);司他夫定(Stavudine);雙二乙氨乙基藥酮(Tilorone)鹽酸鹽；曲氟尿苷(Trifluridine);鹽酸伐昔洛韋(ValacyclovirHydrochloride);阿糖腺普(Vidarabine);阿糖腺苷磷酸鹽；阿糖腺苷磷酸鈉；韋羅肟(Viroxime);扎西他濱(Zalcitabine);齊多夫定(Zidovudine)禾口凈韋坊(Zinviroxime)?？拐婢鷦┛捎糜趥魅拘哉婢闹委熀头乐巍？拐婢鷦┯袝r候根據(jù)其作用機(jī)理進(jìn)行分類。一些抗真菌劑通過抑制葡萄糖合成酶作為細(xì)胞壁抑制劑。這些包括但不限于basiungin/ECB。其它抗真菌劑通過使細(xì)胞膜整體性失穩(wěn)而起作用。這些包括但不限于咪唑諸如克霉唑、sertaconzole、氟康峻、伊曲康峻、酮康峻、咪康峻和voriconacole，以及FK463、兩性霉素B、BAY38-9502、MK991、pradimicin、UK292、布替萘芬和特比萘芬。其它抗真菌劑通過破壞曱殼素(例如幾丁質(zhì)酶)或免疫抑制(501霜)起作用。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸能與其它治療劑諸如佐劑聯(lián)合以增強免疫應(yīng)答。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸和其它治療劑可同時施用或依序施用。當(dāng)其它治療劑同時施用時，可以在同一制劑或獨立的制劑中施用，但同時施用。當(dāng)其它治療劑和CpG免疫刺激性寡聚核苷酸時間上分離時，另一治療劑與在另一治療劑以及與CpG免疫刺激性寡聚核普酸依序施用。這些化合物的施用之間的時間間隔可以為數(shù)分鐘或者更長。其它治療劑包括但不限于佐劑、細(xì)胞因子、抗體、抗原等。本發(fā)明的組合物可以與非核酸佐劑一起施用。非核酸佐劑是除本文所描述的CpG免疫刺激性寡聚核苷酸之外的能刺激體液和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答的任何分子或化合物。非核酸佐劑包括例如能形成depo作用的佐劑、免疫刺激佐劑和能形成d印o作用并刺激免疫系統(tǒng)的佐劑。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸也可用做粘膜佐劑。先前已發(fā)現(xiàn)全身和粘膜免疫性可被CpG核酸的粘膜輸送誘導(dǎo)。因此，所述寡聚核香酸能與其它粘膜佐劑聯(lián)合施用。通過細(xì)胞因子(81^&Mulligan,1996;Chow等，1997;Geissler等，1997;Iwasaki等，1997;Kim等，1997)或B-7共刺激性分子(Iwasaki等，1997;Tsuji等，1997)與CpG免疫刺激性寡聚核苷酸的共同施用或者共線表達(dá)也可誘導(dǎo)或增加免疫應(yīng)答。術(shù)語細(xì)胞因子用作各類在納獨立細(xì)胞和組織的功能活性的可溶性蛋白質(zhì)和肽的通用名稱。這些蛋白也直接介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用并且調(diào)節(jié)在細(xì)胞外環(huán)境中發(fā)生的過程。細(xì)胞因子的例子包括但不限于IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-IO、IL-12、IL-15、IL-18、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、干擾素-y(y-IFN)、IFN-a、腫瘤壞死因子(TNF)、TGF-P、FLT-3配體和CD40配體。寡聚核苷酸也可用于將來自Th2的免疫應(yīng)答重新指向Thl免疫應(yīng)答。這導(dǎo)致形成相對平衡的Thl/Th2環(huán)境。來自于Th2的免疫應(yīng)答重新指向Thl免疫應(yīng)答可通過測量響應(yīng)于所迷核酸而產(chǎn)生的細(xì)胞因子水平而進(jìn)行評估(例如，通過誘導(dǎo)單核細(xì)胞和其它細(xì)胞從而產(chǎn)生Thl細(xì)胞因子，包括IL-12、IFN-y和GM-CSF)。來自于Th2的免疫應(yīng)答重新指向或者重新平衡至Thl應(yīng)答對于哮喘的治療或防治特別有用。例如，治療哮喘的有效量可以是能用于將與哮喘相關(guān)的Th2型免疫應(yīng)答重新指向Thl型應(yīng)答或者平衡的Thl/Th2環(huán)境的量。在哮喘受試對象氣道中的Th2細(xì)胞因子，尤其是IL-4和IL-5增加。本發(fā)明的CpG免疫刺激性寡聚核苷酸導(dǎo)致Thl細(xì)胞因子的增加，有助于重新平衡免疫系統(tǒng)、防止或減少與占主要的Th2免疫應(yīng)答相關(guān)的副作用本發(fā)明的寡聚核苷酸可用于治療氣道重塑(airwayremodeling)。氣道重塑源自于氣道中平滑肌細(xì)胞增殖和/或粘膜增厚，并最終導(dǎo)致氣道狹窄而限制氣流。本發(fā)明的寡聚核苷酸可防止進(jìn)一步重塑并甚至可能減少源自于重塑過程的組織堆積。寡聚核苷酸也可用于改善樹突狀細(xì)胞的存活、分化、活化和成熟。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸具有能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的細(xì)胞存活、分化、活化和成熟的獨特能力。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸也提高自然殺傷細(xì)胞的胞解活性和抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)?？墒褂肅pG免疫刺激性寡聚核苷酸以及細(xì)胞目標(biāo)諸如癌細(xì)胞的特異性抗體進(jìn)行ADCC。當(dāng)CpG免疫刺激性寡聚核苷酸與所述抗體一起施用于受試對象時，受試對象的免疫系統(tǒng)被誘導(dǎo)以殺滅肺瘤細(xì)胞。在ADCC中可用的抗體包括能與體內(nèi)細(xì)胞相互作用的抗體。許多這樣的細(xì)胞目標(biāo)特異性抗體已在本領(lǐng)域中得以描述并且許多可^Mv商業(yè)途徑獲得。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸也可與抗癌療法聯(lián)合施用?？拱┋煼òò┌Y藥物、放射和手術(shù)過程。如本文中所使用的，"癌癥藥物"指出于治療癌癥的目的向受試對象施用的試劑。本文所使用的"治療癌癥"包括防止癌癥發(fā)展、減少癌癥癥狀和/或抑制已形成的癌癥的生長。在其它方面，出于減小患癌癥的風(fēng)險的目的向具有患癌癥風(fēng)險的受試對象施用癌癥藥物。在本文中描述了各種類型的用于癌癥治療的藥物。為本說明書的目的，癌癥藥物分類為化療試劑、免疫療法試劑、癌癥疫苗、荷爾蒙療法和生物應(yīng)答修改劑。此外，本發(fā)明的方法意圖包括一種以上的癌癥藥物和CpG免疫刺激性寡聚核苷酸的聯(lián)合使用。舉例，當(dāng)適合時，CpG免疫剌激性寡聚核苷酸可以與化療劑和免疫療法試劑共同施用。另外一種方式，癌癥藥物可包括免疫療法試劑和癌癥疫苗或者化療劑和癌癥疫苗或者化療劑、免疫療法試劑和癌癥疫苗，出于治療患有癌癥或者具有患癌癥風(fēng)險的受試對象的目的將所有均施用給一個受試對象。所述4b療劑可選自曱氨蟲萊。令(methotrexate)、長春新石咸(vincristine)、阿霉素(adriamycin)、順鉑(cisplatin)、含有氯乙基灘基的非糖來源、5-氟尿嘧啶、絲裂霉素(mitomycinC)、博萊霉素(bleomycin)、阿霉素(doxorubicin)、達(dá)卡巴。秦(dacarbazine)、紫杉醇(taxol)、f乏戈沐木(fragyline)、葡曱胺GLA、戊柔比星(valrubicin)、卡姆司坦恩(caramstaine)和潑立氟潑散(poliferposan)、MMI270、BAY12-9566、RAS法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑、MMP、MTA/LY231514、LY264618/羅莫特松(Lometexol)、格蘭莫雷克(Glamolec)、CI-994、TNP-470、和美新(Hycamtin)/托泊替康(Topotecan)、PKC412、伐司樸達(dá)(Valspodar)/PSC833、諾消靈(Novantrone)/米托蒽醌(Mitroxantrone)、美他特(Metaret)/蘇拉明(Suramin)、巴馬司他(Batimastat)、E7070、BCH畫4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、英賽爾(Incel)/VX畫710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN698、TA2516/馬迷司他(Marmistat)、BB2516/馬迷司他(Marmistat)、CDP845、D2163、PD183805、DX8951f、LemonalDP2202、FK317、畢西巴尼(Picibanil)/OK-432、AD32/戊柔比星(Valmbicin)、美他特龍(Metastron)/鍶衍生物、泰道(Temodal)/替莫唑胺(Temozolomide)、伊瓦瑟(Evacet)/脂質(zhì)體阿霉素、紫杉醇(Yewtaxan)/紫杉醇(Paclitaxel)、紫杉醇(Taxol)/紫杉醇(Paclitaxel)、Xeload/卡培他濱、氟鐵龍(Furtulon)/去氧氟尿普(Doxifluridine)、環(huán)派克斯(Cyclopax)/口服紫杉醇、口服Taxoid、SPU-077/順鉑(Cisplatin)、HMR1275/弗拉平度(Flavopiridol)、CP匿358(774)/EGFR、CP畫609(754)/RAS癌基因抑制劑、BMS-182751/口服鉑、UFT(替加氟(Tegafbr)/尿嘧啶)、爾吉咪唑(Ergamisol)/左旋咪唑、氟尿嘧啶(Eniluracil)/776C85/5FU增強子、開普拓(Campto)/左旋咪唑、坎普特莎(Camptosar)/伊立替康(Irinotecan)、Tumodex/Ralitrexed、樂司他丁(Leustatin)/克拉利賓(Cladribine)、紫杉醇(Paxex)/紫杉醇(Paclitaxel)、多絲爾(Doxil)/月旨質(zhì)體阿霉素、楷萊(Caelyx)/脂質(zhì)體阿霉素、福達(dá)華(Fludara)/氟達(dá)拉濱(Fludarabine)、表柔比星(Pharmarubicin)/表阿霉素、DepoCyt、ZD1839、LU79553/Bis-Naphtalimide、LU103793/多拉司坦(Dolastain)、Caetyx/月旨質(zhì)體阿霉素、健擇(Gemzar)/吉西他濱(Gemcitabine)、ZD0473/Anormed、YM116、碘種子、CDK4和CDK2抑制劑、PARP抑制劑、D4809/Dexifosamide、Ifes/美司那(Mesnex)/異環(huán)磷酰胺(Ifosamide)、衛(wèi)萌(Vumon)/替尼泊戒(Teniposide)、伯爾定(Paraplatin)/卡柏(Carboplatin)、Plantinol/順柏(cisplatin)、足葉乙甙(Vepeside)/依托泊苷()、ZD9331、泰索帝(Taxotere)/多西紫杉醇(Docetaxel)、鳥嘌呤阿糖胞苷藥物前體、紫杉類似物、nitrosoureas,烷基化試劑諸如美芬蘭(melphdan)和環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、氨魯米4寺(Aminoglutethimide)、天冬酰胺酶(Asparaginase),馬利蘭(Busulfan)、卡鉑(Carboplatin)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、阿糖胞香鹽酸鹽(CytarabineHCI)、更生霉素(Dactinomycin)、鹽酸柔紅霉素(DaunorubicinHC1)、雌莫司汀(Estramustine)磷酸鈉、足葉乙甙(VP16-213)、氟尿苷(Floxuridine)、氟尿嘧啶(5-FU的)、氟他胺(Flutamide)、羥基脲(羥基碳酰二胺脲)、異環(huán)磷酰胺(Ifosfamide)、干擾素Alfa-2a、Alfa-2b、醋酸亮丙瑞林(LHRH釋放因子類似物)、洛莫司汀(Lomustine)(CCNU)、鹽酸氮芥(MechlorethamineHC1)(氮芥子氣)、巰基噤呤、美司那(Mesna)、米托坦(Mitotane)(op'-DDD)、鹽酸米托蒽醌(Mitoxantrone)、奧曲肽(Octreotide)、光輝霉素(Plicamycin)、鹽酸丙卡巴肼(Procarbazine)、鏈佐星(Streptozocin)、枸櫞酸他莫昔芬(Tamoxifencitrate)、硫代鳥噤呤、塞替派(Thiotepa)、硫酸長春堿(Vinblastine)、胺苯丫咬(Amsacrine)(m-AMSA)、阿扎胞苷(Azacitidine)、促紅細(xì)胞生成素(Erthropoietin)、六曱三聚氰胺(HMM)、白細(xì)胞介素2、米托胍腙(Mitoguazone)(甲基-GAG;甲基乙二醛雙咪腙；MGBG)、噴司他丁(Pentostatin)(2'-脫氧肋間型霉素(2'-deoxycoformycin))、司莫司汀(Semustine)(曱基-CCNU)、替尼泊苷(Teniposide)(VMJ6)和硫酸長春地辛(Vindesine),但并非僅限于此。免疫治療劑可選自瑞布他辛(Ributaxin)、赫塞汀(Herceptin)、奎左門特(Quadramet)、盤諾瑞克斯(Panorex)、IDEC-Y2B8、BEC2、C225、昂可林(Oncolym)、SMARTM195、ATRAGEN、歐瓦瑞克斯(Ovarex)、百克沙(Bexxar)、LDP-03、iort6、MDX-210、MDX-11、MDX-22、OV103、3622W94、抗-VEGF、塞尼哌(Zenapax)、MDX-220、MDX-447、MELIMMUNE-2、MELIMMUNE-1、CEACIDE、預(yù)靶定(Pretarget)、NovoMAb-G2、TNT、Gliomab-H、GNI-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA676、Monopharm-C、4B5、ioregf.r3、iorc5、BABS、anti-FLK-2、MDX-260、ANAAb、SMART1D10Ab、SMARTABL364AbandImmuRAIT-CEA,但并非局限于此。癌癥疫苗可選自EGF、Gp75抗原、GMK黑色素瘤疫苗、MGV神經(jīng)節(jié)香脂結(jié)合疫苗、Her2/neu、歐瓦瑞克斯(Ovarex)、M-Vax、O-Vax、L-Vax、STn-KHL色拉特普(theratope)、BLP25(MUC-1)、脂質(zhì)體獨特型疫苗、美拉辛(Melacine)、肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、MVA-類疫苗、PACIS、BCG疫苗、TA-HPV、TA-CIN、DISC-病毒和ImmuCyst/TheraCys，^f旦并非局限于此。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸與免疫治療劑諸如單克隆抗體的聯(lián)合使用能夠通過大量機(jī)制包括ADCC的顯著增強(如上所述)、自然殺傷(NK)細(xì)胞的活化和IFNot水平的提高從而提高長期存活。當(dāng)與單克隆抗體聯(lián)合使用時，這些核酸用以減少實現(xiàn)生物結(jié)果所需要的抗體的劑量。如本文中所使用的，術(shù)語"癌癥抗原"和"腫瘤抗原"可相互替換，用以指被癌細(xì)胞所差別表達(dá)的抗原并因此可被開發(fā)用來靶定癌細(xì)胞。癌抗原是能潛在地刺激顯著腫瘤特異性免疫應(yīng)答的抗原。這些抗原中的一些是被正常細(xì)胞編碼的，盡管并非必須表達(dá)。這些抗原可被表征為在正常細(xì)胞中通常是靜默(即，未被表達(dá))的那些，僅在分化的某些階段被表達(dá)的那些以及臨時被表達(dá)的那些例如胚胎和胎兒抗原。其它癌抗原由突變細(xì)胞基因編碼，諸如癌基因(例如，激活的ms癌基因)、抑制基因(例如，突變體p53)、由于內(nèi)部缺失或染色體移位導(dǎo)致的融合蛋白。更多其它癌基因可由病毒基因編碼，諸如由RNA和DNA腫瘤病毒攜帶的那些。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸也可用于治療和防治自免疫疾病。自免疫疾病是其中受試對象自身的抗體與宿主組織反應(yīng)，或者其中免疫效應(yīng)子T細(xì)胞對內(nèi)源自身肽是自反應(yīng)的從而導(dǎo)致組織破壞的一類疾病。因此，免疫應(yīng)答產(chǎn)生以對抗受試對象自身的抗原(稱為自體抗原)。自免疫疾病包括但不限于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、多發(fā)性硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼掩(SLE)、自身免疫性腦脊髓炎、重癥肌無力(MG)、橋本曱狀腺炎、肺出血-腎炎綜合征(Goodpasture，ssyndrome)、天皰掩(例如尋常性天皰瘡)、格雷夫斯病(Grave'sdisease)、自身免疫性溶血貧血、自身免疫性血小板減少性紫瘕、硬皮病抗膠原抗體、混合性結(jié)締組織病、多發(fā)性肌炎、惡性貧血、特發(fā)性阿狄森氏病、自身免疫相關(guān)的不孕癥、腎小球腎炎(例如新月體腎炎、增生性腎小球腎炎)、大皰性類天皰瘡、Sj6gren氏綜合征、胰島素抵抗和自身免疫性糖尿病。本文中所使用的"自身抗原"指正常宿主組織的抗原。正常宿主組織不包括癌細(xì)胞。因此在自免疫疾病中，出現(xiàn)的抗自身抗原的免疫應(yīng)答是不合需要的免疫應(yīng)答，并且導(dǎo)致正常組織的破壞和損傷，而出現(xiàn)的抗癌抗原的免疫應(yīng)答是合乎需要的免疫應(yīng)答并且導(dǎo)致腫瘤或癌的破壞。因此，在針對治療自免疫疾病的本發(fā)明的一些方面中，并不推薦將CpG免疫刺激性核酸與自身抗原一起施用，尤其是作為自免疫疾病標(biāo)耙的那些。在其它例子中，CpG免疫刺激性核酸可與低劑量的自身抗原一起輸送。大量的動物研究已經(jīng)證實低劑量抗原的粘膜施用可導(dǎo)致免疫低應(yīng)答性或"耐受"狀態(tài)。活性機(jī)制似乎是偏離Thl而朝向占主導(dǎo)的Th2和Th3(即，TGF-(3主導(dǎo))應(yīng)答的細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫偏離。伴有低劑量抗原輸送的活性抑制也能抑制非相關(guān)的免疫應(yīng)答(旁側(cè)抑制)，其在自免疫疾病例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和SLE的治療中引起相當(dāng)?shù)淖⒁狻Ｅ詡?cè)抑制牽涉到在局部環(huán)境中Thl-反調(diào)節(jié)、抑制子細(xì)胞因子的分泌，其中促炎和Thl細(xì)胞因子以抗原特異性或抗原非特異性方式得以釋放。本文中所使用的"耐受"用以指這種現(xiàn)象。實際上，口腔耐受在大量動物的自免疫疾病治療中是有效的，所述自免疫疾病包括實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、實驗性自身免疫性重癥肌無力、膠原性關(guān)節(jié)炎(CIA)和胰島素依賴型糖尿病。在這些模型中，自免疫疾病的防治和抑制是與抗原特異性體液和細(xì)胞應(yīng)答由Thl變換至Th2/Th3應(yīng)答相關(guān)聯(lián)的。本發(fā)明還包括利用CpG免疫刺激性寡聚核苷酸誘導(dǎo)抗原非特異性先天免疫活化和對傳染性挑戰(zhàn)的廣譜抵抗力。本文中所使用的術(shù)語抗原非特異性先天免疫活化指除B細(xì)胞之外的免疫細(xì)胞的活化，例如可包括NK細(xì)胞、T細(xì)胞或其它能以抗原非依賴性方式進(jìn)行應(yīng)答的免疫細(xì)胞，或者這些細(xì)胞的一些組合。對傳染性挑戰(zhàn)的廣譜抵抗力被誘導(dǎo)是因為免疫細(xì)胞處于活化狀態(tài)并準(zhǔn)備好對任何侵入的化合物或微生物作出應(yīng)答。細(xì)胞并未針對特定的抗原進(jìn)行特異性的準(zhǔn)備。這在生物戰(zhàn)爭中，以及上述的其它環(huán)境例如旅行者中尤其有用。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸可直接施用給受試對象或者與核酸輸送復(fù)合物一起施用。核酸輸送復(fù)合物應(yīng)指與靶定方法(例如能導(dǎo)致與靶定細(xì)胞以更高親合力結(jié)合的分子)相結(jié)合(例如離子地或共價地相連；或包封其中)的核酸分子。核酸輸送復(fù)合物的例子包括與固醇(例如膽固醇)、脂質(zhì)(例如陽離子脂質(zhì)、病毒顆?；蛑|(zhì)體)、或靶細(xì)胞特異性結(jié)合劑(例如被耙細(xì)胞特異性受體識別的配體)相連的核酸。優(yōu)選的復(fù)合物在體內(nèi)足夠穩(wěn)定以防止在被靶細(xì)胞內(nèi)吞之前出現(xiàn)明顯的分離。然而，所述復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的合適條件下能可^Ml切割，從而將核苷酸以功能性形式釋放。用于輸送抗原或寡聚核苷酸至表面的輸送載體或輸送裝置已被描述。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸和/或抗原和/或其它治療劑可單獨施用(例如，在鹽水或緩沖液中)或釆用本領(lǐng)域中已知的任何輸送載體進(jìn)行施用。例如，以下輸送載體已被描述脂質(zhì)雙層體(Cochleates);Emulsomes、ISCOM;月旨質(zhì)體；活細(xì)菌載體(例如，沙門氏菌(Sa/mo"e〃a)、大腸^干菌(五sc/^n'c/n'aco/z')、5"c/〃wsc"/m""e-g^en'w、志賀氏菌(57z/ge//a)、乳酸菌0^"06^///^));活病毒載體(例如，痘苗病毒、腺病毒、單純皰滲)；微球體；核酸疫苗；聚合物；聚合物環(huán)；蛋白體；氟化鈉；轉(zhuǎn)基因植入物；病毒顆粒；類病毒微粒。其它輸送載體在本領(lǐng)域中已知并在以下載體的討論中提供更多的例子。術(shù)語CpG免疫刺激性寡聚核苷酸有效量指實現(xiàn)所需生物效果所必需的或者足夠的量。例如，用于誘導(dǎo)粘膜免疫的與抗原一起施用的CpG免疫刺激性寡聚核苷酸有效量是能在暴露于抗原時導(dǎo)致產(chǎn)生IgA以應(yīng)答抗原所必需的量，而誘導(dǎo)全身免疫所需要的量是能在暴露于抗原時導(dǎo)致產(chǎn)生IgG以應(yīng)答抗原所必需的量。與本文所提供的教導(dǎo)相結(jié)合，通過在各種活性化合物中進(jìn)行選擇并權(quán)衡諸如潛力、相對生物利用度、患者體重、不利副作用的嚴(yán)重性和施用的優(yōu)選模式等因素，則能計劃出有效的預(yù)防性或治療性醫(yī)治方案，而不導(dǎo)致實質(zhì)性的毒性并且對治療特定的受試對象完全有效。任何特定應(yīng)用的有效量可根據(jù)諸如被治療的疾病或病癥、施用的具體CpG免疫刺激性寡聚核苷酸、受試對象的大小或所述疾病或病癥的嚴(yán)重性等因素而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員能經(jīng)驗性地確定特定CpG免疫刺激性寡聚核苷酸和/或抗原和/或治療劑的有效量而無須進(jìn)行不必要的試驗。經(jīng)粘膜或局部輸送的本文所描述的化合物的受試對象的劑量通常為每次施用約0.1itig至10mg，根據(jù)用途其可以以每日、每周或每月及其間的任何其它時間量來給予。更常見為經(jīng)粘膜或局部劑量為每次施用約10嗎至5mg,最常見為約100(xg至1mg，每天或每周施用24次。更常見為，免疫刺激劑量為每次施用1嗎至10mg,并最常見為10嗎至lmg,每日或每周施用。出于誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答而腸胃外輸送的本文所描述的化合物(其中藥物與抗原一起輸送但沒有其它治療劑)的受試對象劑量通常比疫苗佐劑或免疫刺激應(yīng)用的有效粘膜量高5至10,000倍，更常見為高10至l，OOO倍，最常見為高20至100倍。當(dāng)CpG免疫刺激性寡聚核苷酸與其它治療劑聯(lián)合施用或者在特制輸送載體中進(jìn)行施用時，出于誘導(dǎo)先天免疫應(yīng)答或提高ADCC或誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答的目的，用于腸胃外輸送的本文所描述的化合物的劑量通常為每次施用約0.1嗎至10mg，根據(jù)用途其可以以每日、每周或每月及其間的任何其它時間量來給予。更常見為腸胃外劑量為每次施用約10昭至5mg，最常見為約100嗎至1mg，每天或每周施用2-4次。然而，在一些實施方式中，出于這些目的的腸道外劑量可以以比上述典型劑量高5至10,000倍使用。對于本文所描述的任何化合物，治療有效量最初可由動物模型確定。也可以由已經(jīng)在人體中進(jìn)行測試的CpG寡聚核苦酸(已開始人類臨床試驗)和已知表現(xiàn)出相似藥理活性的化合物諸如其它佐劑，例如LT和用于接種疫苗目的的其它抗原的人類數(shù)據(jù)確定治療有效劑量。對于腸道外施用可需要更高劑量?？筛鶕?jù)所施用的化合物的相對生物利用度和潛力調(diào)整所用劑量。根據(jù)以上所描述的方法以及本領(lǐng)域中已知的其它方法調(diào)整劑量以實現(xiàn)最大功效是在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍之內(nèi)的。本發(fā)明的制劑以可藥用溶液進(jìn)行施用，其中可例行地含有可藥用濃度的鹽、緩沖劑、防腐劑、相容載體、佐劑和選擇性的其它治療成分。為在治療中使用，可以通過將寡聚核苷酸輸送至例如粘膜、全身等所需表面的任何模式來將有效量的CpG免疫刺激性寡聚核苷酸施用給受試對象。可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法實現(xiàn)本發(fā)明的藥物組合物的施用。優(yōu)選的施用途徑包括但不限于經(jīng)口、腸胃外、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、舌下、氣管內(nèi)、吸入、經(jīng)眼、陰道和直腸。對于口服施用，可通過將活性化合物與本領(lǐng)域中已知的可藥用載體相混合從而容易地配制化合物(即CpG免疫刺激性寡聚核苷酸、抗原和其它治療劑)。這些載體使本發(fā)明的化合物能被配制為片劑、丸劑、糖衣丸劑、膠嚢劑、液體劑、凝膠劑、糖漿劑、漿劑、懸浮劑等以便被治療的受試對象口服消化?？梢砸怨腆w賦形劑，選擇性地研磨所得混合物并加工所述顆?；旌衔铮枰獣r加入合適的輔劑之后得到片劑或糖衣丸劑芯從而獲得口服用藥物制劑。合適的賦形劑具體為，諸如糖之類的填料，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纖維素制劑，諸如玉米淀粉、小麥淀粉、大米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃芪膠、曱基纖維素、羥丙基曱基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。需要時可以加入崩解劑，諸如交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂或褐藻酸或其鹽(諸如海藻酸鈉)。選擇性地，口服制劑也可配制在鹽中水或用于中和內(nèi)部酸環(huán)境的緩沖液(如EDTA)中或者無需任何載體而施用。還具體設(shè)想的是上述一種或多種成分的口服劑型。所述一種或多種成分可經(jīng)化學(xué)修飾從而使得衍生物的口服輸送有效。通常，所設(shè)想的化學(xué)修飾是將至少一部分連接在所述成分分子本體上，其中所述部分能夠(a)抑制蛋白質(zhì)水解；和(b)從胃或腸攝入到血液中。還希望的是一種或多種成分的整體穩(wěn)定性的增加和體內(nèi)循環(huán)時間的增加。這些部分的例子包括聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧曱基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和斜f氨酸。見Abuchowski和Davis，1981,"SolublePolymer-EnzymeAdducts"In:￡>^ymesasZ)rwgs，Hocenberg和Roberts,eds.，Wiley-Interscience,NewYork,NY,pp.367-383;Newmark，等，1982，J.Appl.Biochem.4:185-189。其它可使用的聚合物是聚-l,3-二氧戊環(huán)和聚-l，3,6-tioxocane。如上所述，優(yōu)選為藥物使用的是聚乙二醇部分。對于所述成分(或衍生物)，釋放位置可以是胃、小腸(十二指腸、空腸或回腸)，或大腸。本領(lǐng)域技術(shù)人員有可供使用的不在胃中溶解，卻在十二指腸或腸道其它位置釋放材料的制劑。優(yōu)選為，所述釋放或者通過寡聚核香酸(或衍生物)的保護(hù)或通過在胃環(huán)境之外例如在腸中釋放生物活性材料從而避免胃環(huán)境的不利影響。為確保完全的胃耐受性，至少在pH5.0時不能穿透的糖衣是必須的。用作腸糖衣的更常見的惰性成分的例子是纖維素乙酸酯偏苯三酸酯(CAT)、羥丙基曱基纖維素鄰苯二曱酸酯(HPMCP)、HPMCP50、HPMCP55、聚乙烯乙酸酯鄰苯二曱酸酯(PVAP)、EudragitL30D、Aquateric、纖維素乙酸酯鄰苯二曱酸酯(CAP)、EudragitL、EudragitS和蟲膠清漆(Shellac)。這些糖衣可用作混合膜。糖衣或糖衣混合物可也用在片劑上，而這并非旨在保護(hù)免受胃的影響。這可包括糖制糖衣或使片劑易于吞咽的糖衣。膠嚢可由硬殼(諸如明膠)構(gòu)成以輸送干燥治療劑即粉末；對于液體形式，可使用軟明膠。膠嚢劑的殼材料可以是厚淀粉或其它可食用紙。對于丸劑、錠劑、模制片劑或片劑粉末，可以使用濕式結(jié)塊技術(shù)。治療劑可以以粒徑約1mm的顆?；蛭⑶蛐问桨谥苿┲凶鳛槲⒓?xì)的復(fù)合顆粒。用于膠嚢施用的材料的制劑也可以是粉末、略微壓縮的栓劑或者甚至片劑。所述治療劑可通過壓縮制備。著色劑和調(diào)味劑也均可加入。例如，寡聚核苷酸(或衍生物)可經(jīng)配制(諸如通過脂質(zhì)體或微球體包封)，然后進(jìn)一步包裝在可食用產(chǎn)品諸如含有著色劑和調(diào)味劑的水凍飲料之中。可用惰性材料稀釋或增加治療劑的體積。這些稀釋劑可包括碳水化合物，具體為甘露醇、a-乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、改性葡聚糖和淀粉。某些無機(jī)鹽也可用作填料，包括三磷酸釣、碳酸鎂和氯化鈉。一些商售稀釋劑是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx1500、Emcompress和Avicell。可包括崩解劑使治療劑制劑為固體劑型。用作崩解劑的材料包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商業(yè)崩解劑，羧曱基淀粉鈉(Explotab)。乙醇酸淀粉鈉、安伯來特(Amberlite)、羧甲基纖維素鈉、超直鏈淀粉(ultramylopectin)、褐藻酸鈉、明膠、橘皮、酸式羧曱基纖維素、天然海綿和膨潤土均可使用。崩解劑的另一形式是不溶性陽離子交換樹脂。粉末樹膠也可用作崩解劑和粘合劑并且這些可包括粉末樹膠諸如瓊脂、刺梧桐樹膠或黃芪膠。褐藻酸及其鈉鹽也可用作崩解劑。粘合劑可用以將治療劑保持在一起乙撐硬質(zhì)片劑并包括來自天然產(chǎn)品的材料諸如阿拉伯樹膠、黃芪膠、淀粉和明膠。其它包括曱基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)和羧曱基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基曱基纖維素(HPMC)都可用在醇溶液使治療劑成粒?？鼓Σ羷┛砂ㄔ谥委焺┲苿┲幸苑乐乖谂渲七^程中起粘?？稍谥委焺┖湍＞弑谥g使用潤滑劑層，所述潤滑劑可包括但不限于硬脂酸包括其鎂鹽和鈣鹽、聚四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、蔬菜油和蠟?？扇苄詽櫥鸵部墒褂弥T如十二烷^i^克S臾鈉、十二烷J^碌u酸4美、具有各種分子量的聚乙二醇、Carbowax4000和6000。也可加入滑動劑以在配制過程中改善藥物的流動性質(zhì)并有助于在壓縮時的重新分配。所述滑動劑可包括淀粉、滑石、熱解硅石和含水硅鋁酸鹽。為有助于治療劑溶解在水性環(huán)境中，可加入表面活性劑作為潤濕劑。表面活性劑可包括陰離子去垢劑諸如十二烷基硫S交鈉、二辛基硫代琥珀酸鈉和二辛基磺酸鈉。陽離子去垢劑也可以使用，包括氯化勒L溴銨或千索氯銨。可包含在制劑之中作為表面活性劑的潛在非離子去垢劑的列表有l(wèi)auromacrogo1400、硬脂酸聚烴氧(40)酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60、甘油單硬脂酸酯、聚山梨酸酯40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、曱基纖維素和羧曱基纖維素。這些表面活性劑或者單獨地或者作為具有不同比例的混合物存在于所述寡聚核苷酸或衍生物的制劑中?？煽诜褂玫乃幬镏苿┌ㄓ擅髂z制得的壓入式(push-fit)膠嚢，以及由明膠和塑化劑諸如甘油或山梨糖醇制得的軟密封膠嚢。所述壓入式(push-fit)膠嚢可含有與填料諸如乳糖、粘合劑諸如淀粉和/或潤滑劑諸如滑石或硬脂酸鎂和可選地穩(wěn)定劑相混合的活性成分。在軟膠嚢中，活性化合物可溶解或懸浮在合適的液體諸如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中。此外，可加入穩(wěn)定劑。也可以使用用于口服施用的微球體。這些微球體已經(jīng)在本領(lǐng)域中很好地得以定義。用于口服施用的所有制劑應(yīng)當(dāng)為適于如此施用的劑量。對于口腔施用，所述組合物可以采用以傳統(tǒng)方式配制的片劑或4走劑形式。為了通過吸入進(jìn)行施用，根據(jù)本發(fā)明使用的化合物可以利用合適的推進(jìn)劑例如二氯二氟曱烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體，以來自加壓包裝或噴霧器的氣溶膠噴霧形式便捷地輸送。在加壓氣溶膠的情況下，通過提供輸送特定量的閥門確定單位劑量。在吸入器或吹藥器中使用的例如明膠的膠嚢和藥筒可以配制為含有化合物和合適的粉末基質(zhì)諸如乳糖或淀粉的粉末混合物。本文還設(shè)想的是寡聚核普酸(或其衍生物)的肺部輸送。所述寡聚核苷酸(或衍生物)在吸氣時輸送至哺乳動物肺部并橫跨肺上皮層進(jìn)入血液。吸入分子的其它才艮道包括Adjei等，1990,PharmaceuticalResearch,7:565-569;Adjei等，1990，InternationalJournalofPharmaceutics,63:135-144(leuprolideacetate);Braquet等，1989，JournalofCardiovascularPharmacology,13(suppl.5):143-146(endothelin-l);Hubbard等，1989,AnnalsofInternalMedicine,Vol.辺，pp.206-212(al-antitrypsin);Smith等，1989，J.Clin.Invest.84:1145-1146(a-l-proteinase);Oswein等，1990,"AerosolizationofProteins",ProceedingsofSymposiumonRespiratoryDrugDeliveryII，Keystone,Colorado,March,(重組人類生長荷爾蒙)；Debs等，1988,丄Immunol.140:3482-3488(干擾素-g和肺瘤壞死因子a)和Platz等，美國專利5,284,656(粒細(xì)胞群落刺激因子)。全身作用肺部藥物輸送的方法和組合物在于1995年9月19日授權(quán)給Wong等的美國專利5,451,569中進(jìn)行描述。在本發(fā)明的實踐中設(shè)想使用的是大量設(shè)計用于治療劑產(chǎn)品肺部輸送的機(jī)械裝置，包括但不限于吹藥器、配量吸入器和粉末吸入器，所有這些對本領(lǐng)域技術(shù)人員都是熟悉的。適用于本發(fā)明的實踐的商業(yè)裝置的一些具體例子是Ultravent吹藥器，由Mallinckrodt,Inc.，圣路易斯，密蘇里制造；AcornII吹藥器，由MarquestMedicalProducts,Englewood，科羅拉多州制造；Ventolin配量吸入器，由GlaxoInc.,ResearchTrianglePark,北卡羅來納州制造；和Spinhaler粉末吸入器，由FisonsCorp.,Bedford,馬薩諸塞州制造。所有這些裝置要求使用適用于分配寡聚核苷酸(或衍生物)的制劑。通常，每種制劑專用于所使用的裝置類型并可涉及到合適的推進(jìn)劑材料，以及在治療中有用的常見稀釋劑、佐劑和/或載體的使用。同樣，也設(shè)想了脂質(zhì)體、微膠嚢或微球體，內(nèi)含復(fù)合物或其它類型載體。根據(jù)化學(xué)修飾的類型或所采用的裝置的類型可將化學(xué)修飾寡聚核苷酸制備為不同制劑。適合與噴氣或超聲吹藥器一起使用的制劑通常包括以約每mL溶液中0.1至25mg生物活性寡聚核香酸的濃度溶解在水中的寡聚核苷S吏(或衍生物)。所述制劑也可包括緩沖劑和簡單糖(例如，為了寡聚核苷酸穩(wěn)定和滲透壓的調(diào)整)。吹藥器制劑也可含有表面活性劑以減小或防止由于在形成氣溶膠時溶液氣霧化導(dǎo)致的寡聚核苷酸的表面誘導(dǎo)聚結(jié)。與配量吸入器一起使用的制劑通常包括精細(xì)M的粉末，其含有在表面活性劑的協(xié)助下懸浮在推進(jìn)劑中的寡聚核苦酸(或衍生物)。所述推進(jìn)劑可以是任何能為此目的采用的傳統(tǒng)材料，諸如含氯氟烴、含氯氟碳?xì)浠衔?、含氟碳?xì)浠衔锘蛱細(xì)浠衔?，包括三氯氟甲烷、二氯二氟曱烷、二氯四氟乙烷?,1，1，2-四氟乙烷或其組合。合適的表面活性劑包括山梨聚糖三油酸酯和大豆卵磷脂。油酸也可用作表面活性劑。從粉末吸入器裝置中分發(fā)而出的制劑將包括含有寡聚核苷酸(或衍生物)的精細(xì)分離的粉末并還可以含有能有助于粉末從裝置中分散而出的量例如占制劑50重量％至90重量％的疏松劑諸如乳糖、山梨糖醇、蔗糖或甘露醇。所述寡聚核苷酸(或衍生物)應(yīng)當(dāng)最有利地制備為顆粒形式，平均粒于10mm(或微米)，最優(yōu)選為0.5至5mm，以便于最有效地輸送至肺末梢。也設(shè)想了本發(fā)明的藥物組合物的鼻腔輸送。鼻腔輸送使得在施用治療劑產(chǎn)品至鼻部之后本發(fā)明的藥物組合物直接進(jìn)入血液，而無需將產(chǎn)品堆積到肺部。鼻腔輸送的制劑包括含有葡聚糖或環(huán)葡聚糖的那些制劑。針對鼻腔施用，有用的裝置是其上連接有配量噴霧器的小硬質(zhì)瓶。在一個實施方式中，通過將本發(fā)明的藥物組合物吸入到具有確定體積的小室中從而輸送配定劑量，所述小室具有小孔，小孔的大小使得通過小室中的液體被壓縮時形成噴霧從而使氣溶膠制劑氣霧化。小室被壓縮從而施用本發(fā)明的藥物組合物。在具體實施方式中，小室為活塞式設(shè)置。這些裝置可通過商業(yè)途徑獲得。另外一種方式，可使用塑料擠壓瓶，其具有小孔或開口，小孔或開口的大小使得通過擠壓形成噴霧從而使氣溶膠制劑氣霧化。開口通常位于瓶子的頂部，頂部通常逐漸變細(xì)以適合放入鼻腔從而有效地施用氣溶膠制劑。優(yōu)選為，為了施用測定劑量的藥物，鼻腔吸入器將提供配量的氣溶膠制劑。當(dāng)希望全身輸送時，所述化合物可配制用于經(jīng)注射的腸道外施用，例如通過彈丸式注射(bolusinjection)或連續(xù)輸液。用于注射的制劑可以以加入防腐劑的單位劑型存在，例如在安瓿瓶或多劑量容器中。所述組合物可以采用諸如在油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳液形式，并且可含有配制劑諸如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。用于腸道外施用的藥物制劑包括為水溶性形式的活性化合物的水69溶液。此外，可以將活性化合物的懸浮液制備為適宜的油性注射懸浮液。適合的親脂性溶劑或載體包括脂肪酸諸如芝麻油或合成脂肪酸酯諸如油酸乙酯或甘油三酸酯或脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可含有能提高懸浮液粘度的物質(zhì)，諸如羧曱基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。選擇性地，所述懸浮液也可含有合適的穩(wěn)定劑或能提高所述化合物的溶解度的試劑從而能獲得高濃縮溶液制劑。另外一種方式，活性化合物可以為粉末形式，以供在使用前用合適的載體例如無菌無熱原水重新配制。所述化合物可配制為直腸或陰道組合物諸如栓劑或滯留灌腸劑，例如含有傳統(tǒng)栓劑基質(zhì)諸如可可油或其它甘油酯。除之前描述的制劑之外，所述化合物還可以調(diào)制為長效制劑。這樣的長期作用制劑可用穩(wěn)定的聚合性或疏水性材料(在可接受的油中的乳液)或離子交換樹脂，或微溶衍生物例如微溶鹽進(jìn)行配制。所述藥物組合物也可含有合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。這些載體或賦形劑的例子包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物諸如聚乙二醇。合適的液體或固體藥物制劑形式是例如用于吸入的水性或鹽水溶液，微包封的，encochleated、涂覆在在微觀金顆粒上的，包含在脂質(zhì)體中的，霧化的，氣溶膠，用于植入皮膚的小丸或在尖銳物體上干燥以便扎入皮膚的等形式。所述藥物組合物還包括粒劑、粉末劑、片劑、包衣片劑、(微)膠嚢劑、栓劑、糖漿劑、乳劑、懸浮劑、霜劑、滴劑或活性化合物緩釋制劑，在這些制劑中，通常如上所述使用賦形劑和添加劑和/或助劑諸如崩解劑、粘合劑、涂覆劑、膨脹劑、潤滑劑、調(diào)味劑、甜味劑或溶解劑。這些藥物組合物適用于各種藥物輸送系統(tǒng)。藥物輸送方法的簡短綜述參見Langer，&Ze"ce249:1527-1533，1990,在此以引用的方式引入。CpG免疫刺激性寡聚核苷酸和可選的其它治療劑和/或抗原可以以其自體(純)進(jìn)行施用，或者以可藥用鹽的形式施用。當(dāng)在藥物中使用時，所述鹽應(yīng)當(dāng)是可藥用的，但非藥用鹽也可以便利地用于制備其可藥用鹽。這些鹽包括但不限于由以下酸制得的鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、對曱苯苯磺酸、酒石酸、檸檬酸、甲基石黃酸、曱酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-石黃酸和苯磺酸。同樣，這些鹽可制備為羧酸基團(tuán)的堿金屬或堿土金屬鹽，諸如鈉、鉀或4丐鹽。合適的緩沖劑包括乙酸和鹽(1-2%w/v);檸檬酸和鹽(1-3%w/v);硼酸和鹽(0.5-2.5%w/v);磷酸和鹽(0.8-2%w/v)。適合的防腐劑包括(0.003-0.03%w/v);氯丁醇(0,3-0.9%w/v);尼泊金(0.01-0.25%w/v)和瘞汞撒(0.004-0.02%w/v)。本發(fā)明的組合物含有選"^性地包含在可藥用載體中的有效量的CpG免疫刺激性寡聚核苷酸和選擇性的抗原和/或其它治療劑。術(shù)語可藥用載體指一種或多種適用于向人類或其它脊推動物施用的相容固體或液體填料、稀釋劑或包封物質(zhì)。術(shù)語載體指有機(jī)或無機(jī)成分、天然的或合成的，活性成分與其相結(jié)合以助于應(yīng)用。所述藥物組合物的成分也能與本發(fā)明的化合物以不會出現(xiàn)實質(zhì)性破壞所希望的藥效的方式相互混合。通過以下實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，其決不可解釋為進(jìn)行限制。在本申請中引用的參考文獻(xiàn)(包括文獻(xiàn)、授權(quán)專利、公開專利申請和共同未決專利申請)的全部內(nèi)容以引用的方式引入。實施例材料和方法寡聚脫氧核苷酸(ODN)和試劑所有ODN按照標(biāo)準(zhǔn)氨基磷酸酯化學(xué)方案進(jìn)行合成，并通過ColeyPharmaceuticalGmbH進(jìn)行成分(identity)和純度的控制，并具有經(jīng)鱟檢驗(BioWhittaker,Verviers,比利時)測量的不可檢測的內(nèi)毒素水平(<0.1EU/ml)。ODN懸浮在無菌無內(nèi)毒素的Tris-EDTA(Sigma,Deisenhofen,德國)中，并在無菌環(huán)境下保存和操作以防止微生物和內(nèi)毒素污染。使用無內(nèi)毒素Tris-EDTA進(jìn)行所有稀釋。TLR檢驗用表達(dá)相應(yīng)人類TLR的載體和6xNF-KB-熒光素酶報道子質(zhì)粒通過電穿孔對HEK293細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子(3x104細(xì)胞/孔)用指定量的ODN在加濕溫育器中在37。C溫育16小時。每個數(shù)據(jù)點重復(fù)進(jìn)行三次。細(xì)胞被裂解并檢測熒光素酶基因活性(采用來自Perkin-Elmer，Zaventem，比利時的BriteLite試劑盒)。參照沒有加入ODN的培養(yǎng)基中的報道基因活性計算刺激指數(shù)。細(xì)胞純化來自健康人類捐獻(xiàn)者的外周血血沉棕黃層制劑從杜塞爾多夫大學(xué)(德國)血庫獲得，并通過Ficoll-Hypaque(Sigma)離心對PBMC進(jìn)行純化。37°C，在加濕溫育器中，細(xì)胞在補充有5。/。(v/v)熱滅活人類AB血清(BioWhittaker)或10。/。(v/v)熱滅活FCS、2mML-谷氨酰胺、100U/ml盤尼西林和IOOiug/ml鏈霉素(均來自Sigma)的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞因子檢測和流式細(xì)胞分析以5x1(^細(xì)胞/ml的濃度重新懸浮PBMC,并加入到96孔圓底板(250jul/孔)中。PBMC與ODN進(jìn)行溫育，在指定時間點收集培養(yǎng)上清液(SN)。如果并非立即使用，SN在-2(TC進(jìn)行保存直至需要。使用市售抗體(PBL，NewBrunswick,NJ,美國)利用針對IFN-a產(chǎn)生的內(nèi)部ELISA或者在Luminexmultiplexsystem(LuminexCorporation,12212TechnologyBoulevard,Austin,Texas78727-6115)上對在SN中細(xì)胞因子的數(shù)量進(jìn)行評估。動物雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)購自CharlesRiverCanada(魁北克，加拿大)，并關(guān)養(yǎng)在ColeyPharmaceuticalGroupCanada的動物護(hù)理所的微隔離間中。在加拿大動物保護(hù)協(xié)會的指導(dǎo)下依照CoelyCanada動物保護(hù)委員會進(jìn)行所有研究。所有動物均未接觸過CpGODN。SAIN月中瘤模型雌性A/J小鼠(每組10只)在第0日用5xl05Sal/N肺瘤細(xì)胞進(jìn)行皮下注射。在腫瘤誘導(dǎo)后的第8日開始每周一次皮下注射用100嗎ODN或僅用PBS進(jìn)行治療。一企測動物的存活和腫瘤體積。使用數(shù)字游標(biāo)卡尺測量腫瘤尺寸(長度和寬度)。利用以下公式計算腫瘤體積腫瘤體積=(0.4)(ab2)，其中a=較大直徑和b=較小直徑。體外檢驗新鮮BALB/c小鼠脾細(xì)胞(來自3-5只動物的合并液)用于體外檢驗。用異氟醚對動物進(jìn)行麻醉并通過頸推脫位進(jìn)行安樂死。在無菌條件下摘除脾臟并放置在PBS+0.2%牛血清白蛋白(SigmaChemicalCompany)中。然后將脾臟勻漿粉碎并將脾細(xì)胞重新懸浮在補充有2%正常小鼠血清(CedarlaneLaboratories,安大略，加拿大)、盤尼西林-鏈霉素溶液(分別最終濃度為1000U/ml和1mg/ml;SigmaChemicalCompany)和5x10-5Mb-巰基乙醇(SigmaChemicalCompany)的RPMI1640(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)組織培養(yǎng)介質(zhì)中。B細(xì)胞增殖檢驗羧基-熒光素-二乙酸酯，琥珀酰亞胺酯(CFSE)(Invitrogen,Eugene,俄勒岡，美國)染色的BALB/c小鼠脾細(xì)胞(4xlO"孔)與不同濃度的ODN在5%C02溫育箱中在37。C溫育5天。然后用PE軛合抗-CD19抗體(BDPharmingen，圣地亞哥，加州，美國)針對CD19對細(xì)胞進(jìn)行染色，經(jīng)FACS測量B-細(xì)胞增殖，隨后用ModFit軟件V3.0(VeritySoftwareHouseInc.，Topsham，ME，美國)進(jìn)行分析。實施例l:CpG模體處結(jié)構(gòu)活性關(guān)系的研究已知含有未曱基化的CpG模體的寡聚核苷酸能通過類Toll受體9(TLR9)途徑刺激免疫應(yīng)答。為了鑒別具有最強刺激TLR9途徑活性的寡聚核苷酸，進(jìn)行了CpG模體處全面的結(jié)構(gòu)活性關(guān)系(SAR)研究。結(jié)果顯示鳥。票呤被次黃噤呤和6-硫代鳥噪呤替代將導(dǎo)致hTLR9檢驗中的相似活性，而噪呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、8-氧代-7，8-二氫鳥嘌呤和7-脫氮鳥嘌呤替代將導(dǎo)致40-80Q/。的hTLR9刺激減小。此外，在C5和N4的修飾導(dǎo)致沒有hTLR9途徑的修飾。這些觀測結(jié)果為在SAR模型中，鳥。票呤是通過Hoogsteen位點被識別的，而胞嘧啶在C,H-邊與TLR9受體結(jié)合(參見圖la)。因此，對鳥嘌呤的Hoogsteen識別位點以及胞嘧啶的C,H-邊進(jìn)行修飾而不導(dǎo)致hTLR9活性的顯著喪失是不可能的。在被研究的在二核苷酸模體上的堿基修飾中無一比未修飾的CpG模體的活性更高。實施例2:接近CpG模體的疏水性胸腺嘧咬石成基形狀類似物的作用為研究CpG模體附近dT殘基的影響，多個疏水胸腺嘧咬i咸基形狀類似物，諸如2，4-二氟曱苯(FF)(SEQIDNO:3-9)、5-溴-2'-脫氧尿嘧啶(BU)和5-碘-2'-脫氧尿嘧啶(JU)接入到CpG模體之外(參見表1和圖2-3)。出乎意料地，所有經(jīng)測試的疏水性胸腺嘧啶類似物的接入均導(dǎo)致異乎尋常的hTLR9活性的明顯增加，而用尿嘧啶殘基(缺失甲基的胸腺嘧咬，圖4)進(jìn)行替代則導(dǎo)致hTLR9刺激的明顯下降。當(dāng)所述修飾位于CpG模體的5'時，TLR9刺激增加明顯。用5-碘尿嘧啶(JU)在CpG的5'和3'進(jìn)行雙替代導(dǎo)致所有測試中最強的刺激。相反，在CpG模體用2,4-二氟曱苯替代鳥。票呤和胞嘧啶導(dǎo)致在兩種情況下TLR9刺激指數(shù)的明顯降低。疏水T類似物的接入也導(dǎo)致人類PBMC中IFN-a誘導(dǎo)的明顯增強。未曾預(yù)料的是，用5-溴烏苷和5-碘鳥苷對實際上沒有IFN-a誘導(dǎo)活性的ODN(SEQIDNO:l)進(jìn)行修飾特別地導(dǎo)致了提高的TLR9刺激和IFN-a誘導(dǎo)。通常針對不含有這些修飾的CpGODN為TLR9和IFN-a誘導(dǎo)之間的負(fù)相關(guān)。表1:CpG模體附近具有疏7jc性胸腺嘧咬堿基形狀類似物的修飾寡聚核苷酸的例子<table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>*辟-代z疇酸酯核芬酸間鍵:-磷酸二酯核苷酸間鍵實施例3:親脂性堿基形狀替代的TLR9活化由于位于CpG模體的5'側(cè)的堿基的不同類型的親脂性替代導(dǎo)致hTLR9刺激的顯著提高，研究了其它堿基類似物諸如5-氯-尿嘧咬、5-三氟曱基-尿嘧啶、苯基、芳基和取代芳基殘基刺激hTLR9的能力(表3)。為研究用不同親脂性堿基類似物修飾的B類寡聚核苷酸的人類TLR9活化，B類ODNSEQIDNO:l用5-氯-2'-脫氧尿嘧咬(CU)、5-溴-2'-脫氧尿嘧啶(BU)、5-碘-2'-脫氧尿嘧啶(JU)和5-乙基-2'-脫氧尿嘧啶(EU)進(jìn)行修飾。hTLR9-NFkB-293細(xì)胞與指定的ODN(圖5a)溫育16小時。然后將細(xì)胞溶解并測定熒光素酶活性。CU修飾的(SEQIDNO:41)、BU修飾的(SEQIDNO:10)、JU修飾的(SEQIDNO:13)和EU修飾的(SEQIDNO:42)寡聚核苷酸全部顯示出相比對照(SEQIDNO:l)更強的TLR9活性刺激。具有尿苷修飾的SEQIDNO:16顯示出明顯降低的活性。在第二試驗中測量了IFN-a生成(圖5b)。人類PBMC與指明的經(jīng)修飾的ODN共同溫育24小時，隨后利用ELISA測試上清液。JU修飾的、BU修飾的和EU修飾的ODN相比對照導(dǎo)致最高的IFN-a增加。這些數(shù)據(jù)證實了B類ODN上dU的5'-替代提高TLR9活性和IFN-a產(chǎn)生。為進(jìn)一步研究EU修飾對TLR9活化的作用，用具有CpG的5'(SEQIDNO:42)、CpG的3'(SEQIDNO:29)和CpG的5'和3'(SEQIDNO:30)的EU修飾的修飾寡聚核苷酸重復(fù)所述試驗。SEQIDNO42和30顯示了相比未修飾的SEQIDNO:l和未i'務(wù)飾的B類ODNSEQIDNO:37(圖6)的TLR9活化的明顯提高。。表2:具有親脂'I^基類似物替代的修飾寡聚核普酸的例子<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>SeqID編號寡聚核苷酸序列描述/類別衍生自42T*G*EU*C-G*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*TSEQIDNO:1的EU衍生物29丁承G承了傘G—G氺EU木T糸了承T豐了氺了承了承了承了承了氺了氺了承TT氺T舉了SEQIDNO:l的3'EU衍生物30T*G*EU*C-G*EU*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*TSEQIDNO:l的5'3'EU衍生物*硫代磷酸酯核普酸間鍵-磷酸二酯核苷酸間鍵實施例4:A、B、C、P和T類寡聚核苷酸上的親脂性替代為研究親脂性磁基類似物替代對不同類型的ODN的影響，在A類、B類、C類、P類和T類寡聚核苷酸上進(jìn)行了纟f飾。這些寡聚核普酸的一些例子在表3中給出。表3:JU修飾的A、B、C、P和T類寡聚核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table>P*.硫代磷酸酯核苷酸間鍵-磷酸二酯核苷酸間鍵為研究修飾B類寡聚核苷酸對人類TLR9的活化，在熒光素酶檢驗中評估了SEQIDNO:37的5-碘-2'-脫氧尿香修飾的B類衍生物活化TLR9的能力(參見材料和方法)。所有修飾的B類寡聚核苷酸相比未經(jīng)修飾的SEQIDNO:37顯示出TLR9活化的顯著提高(圖7)。為研究修飾A類寡聚核苷酸對人類TLR9的活化，如圖5，在熒光素酶檢驗中(圖8a)和PBMC檢驗(圖Sb)評估了SEQIDNO:43的5_碘-2'-脫氧尿苷修飾的A-類衍生物活化TLR9的能力。盡管CpG模體的5'和3'側(cè)的雙5-碘尿嘧啶(JU)替代導(dǎo)致最有效的剌激，但當(dāng)修飾位于CpG模體的5'側(cè)時，TLR9刺激的增加明顯。為研究修飾C類寡聚核苷酸對人類TLR9的活化，測試了SEQIDNO:46、SEQIDNO:44和45的5-碘-2'-脫氧尿苷修飾的C類衍生物活化TLR9的作用。同時測試了A類序列SEQIDNO:43(未經(jīng)修飾)和SEQIDNO:35和36。如圖9所示，在熒光素酶檢驗中，經(jīng)修飾的ODNSEQIDNO:35、36、44和45全部顯示出在未經(jīng)》務(wù)飾的A和C類以上的提高的TLR9刺激。為研究修飾P類寡聚核苷酸對人類TLR9的活化，測試了SEQIDNO:46的5-硪-2'-脫氧尿苷修飾的P類衍生物在熒光素酶檢驗中活化TLR9的作用。如圖10所示，修飾的ODNSEQIDNO:31-33顯示出相比未經(jīng)修飾的ODN提高的TLR9刺激。為研究修飾T類寡聚核苷酸對人類TLR9的活化，測試了SEQIDNO:52的5-石典-2'-脫氧尿苷修飾的T類衍生物活化TLR9的作用。如圖11所示，修飾的ODNSEQIDNO:47-50顯示出在熒光素酶檢驗中相比未經(jīng)修飾的ODN提高的TLR9刺激。尿苷衍生物SEQIDNO:51顯示出降4氐的TLR9刺激。如以上實施例所證實，在所有測試的類別中，CpG模體5'側(cè)的親脂性T-類似物替代導(dǎo)致TLR9活化的明顯提高，并導(dǎo)致了提高的誘導(dǎo)IFN-a產(chǎn)生的能力。實施例5:短修飾寡聚核苷酸對TLR9的刺激尋常的親合力，研究了非常的CpGODN活化TLR9的能力。非常短的寡聚核苷酸在治療中使用相比更長的寡聚核普酸具有優(yōu)勢，這是因為更容易被細(xì)胞攝取，以及更簡單地配制，而無需使用DOTAP。研究了三條短CpGODN(短聚體)(表3):6-聚體CpG模體六聚體(SEQIDNO:38),所述六聚體的5'JU修飾(SEQIDNO:39)和所述六聚體的5'3'JU修飾(SEQIDNO:40)(表4)。在熒光素酶檢驗中比較了短聚體與未經(jīng)修飾的B類寡聚核苷酸SEQIDNO:37的活性。如圖12所示，尤其是SEQIDNO:40，使用修飾短聚體顯示出作為改進(jìn)的免疫治療藥物的巨大潛力。表4:修飾短寡聚核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>*硫代磷酸酯核苦酸間鍵-磷酸二酯核普酸間鍵實施例6:修飾寡聚核芬酸對體內(nèi)TLR9途徑的活化為了測定本發(fā)明的經(jīng)修飾的ODN的體內(nèi)效率，在獨立的小鼠脾細(xì)胞中測試了具有親脂性T類似物的ODN。分離BALB/c小鼠脾細(xì)胞并與修飾B類(SEQIDNO:13)、未經(jīng)修飾的B類(SEQIDNO:37)和非CpGODN(SEQIDNO:26)(表5)共同溫育。在6小時(TNF-a)或24小時(IL-6、IL-10、IL-12)收集培養(yǎng)上清液并用ELISA測量細(xì)胞因子濃度。如圖13所示，與經(jīng)修飾的SEQIDNO:13共同溫育導(dǎo)致所測試的所有細(xì)胞因子水平顯著增加。隨后測試ODN誘導(dǎo)脾細(xì)胞中B細(xì)胞增殖的能力。CFSE-染色BALB/c小鼠脾細(xì)月包(4乂105/孔)與0.001、0.01、0.1、0.3、1、3或10pg/ml的指定ODN(圖14)共同溫育。在溫育后72小時，針對細(xì)胞表面標(biāo)記CD19對細(xì)胞染色，并通過FACS測量B-細(xì)胞增殖，隨后用ModFit軟件進(jìn)行分析。如圖14所示，與經(jīng)修飾的SEQIDNO:13共同溫育導(dǎo)致B-細(xì)胞增殖的明顯增加。即使在更低ODN濃度下該增加也是明顯的。為測量經(jīng)修飾的ODN的體內(nèi)作用，BALB/c小鼠(每組5只)用10、50或100嗎的SEQIDNO:13或100|igofSEQIDNO:37以100pi的總體積進(jìn)行皮下注射(SC)。對照組則只接受100pi的PBS。在注射后1小時(TNF-a)或3小時(IP-10)利用心臟穿刺使動物出血，利用ELISA針對TNF-a(圖15a)和IP-10(圖15b)對血漿進(jìn)行檢驗。用經(jīng)修飾的SEQIDNO:13對BALB/c小鼠的注射相比未經(jīng)修飾的SEQIDNO:37而言導(dǎo)致更高的TNF-a和IP-10產(chǎn)生，證實了本發(fā)明的親脂性i成基形狀替代的ODN相比未經(jīng)修飾的免疫刺激性O(shè)DN能引起更高的體內(nèi)免疫刺激。表5:體內(nèi)測試的寡聚核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table>*硫代磷酸酯核普酸間鍵-磷酸二酯核苷酸間鍵實施例7:具有其它修飾的寡聚核苷酸測試了具有親脂性堿基類似物的ODN在熒光素酶檢驗中誘導(dǎo)TLR9介導(dǎo)的NF-KB活性的能力(參見材料和方法)。圖16_23顯示了具有其它修飾的ODN的活性(參見表6)。為了測試其它石威基類似物的活修飾的母本序列SEQIDNO:l的活性。如圖12所示，SEQIDNO:178能夠活化TLR9介導(dǎo)的NF-kB至可與未經(jīng)修飾的母本序列相比的水平。隨后將5-(2-溴乙烯基)-鳥苷修飾的ODN(SEQIDNO:153-154)的活性與未經(jīng)修飾的母本序列SEQIDNO:l的活性進(jìn)行比較。如圖17所示，在檢驗中兩條經(jīng)修飾的ODN均比母本序列活性更強。隨后，用5-丙炔基NO:116和117)的活性。如圖21所示，兩條經(jīng)f務(wù)飾的ODN均具有與母本序列的活性可比的活性。其中4務(wù)飾位于CG二核苷酸5'側(cè)的SEQIDNO:116的活性略微強于母本序列。為了測試JU修飾的ODN上的第二類型的修飾的作用，將2'0-曱基鳥普接入到JU修飾的ODN中。2'-0-曱基鳥苷/JUODNSEQIDNO:111-113的活性與母本SEQIDNO:1和僅有JU修飾的SEQIDNO:13的活性進(jìn)行比較。如圖18所示，所有的JU修飾的ODN均比母本ODN的活性更強。在CG二核苷酸的3'側(cè)具有2'0-曱基鳥苦的ODN(SEQIDNO:112-113)比在CG二核苷酸的5'側(cè)具有2'0-曱基鳥苷的ODN(SEQIDNO:111)或僅有JU修飾的ODN(SEQIDNO:13)的活性略強。然后，JU修飾的分枝ODN(SEQIDNO:96、97、101和102)的活性與SEQIDNO:l的活性進(jìn)行比較。如圖19所示，在4企驗中，具有兩個可接近的5'端的分枝ODN與未經(jīng)修飾的SEQIDNO:1的活性相當(dāng)或者更強。具有三乙二醇磷酸酯間隔子的SEQIDNO:101和102比具有3'-0-曱基-G間隔子的SEQIDNO:96和97的活性更強。然后，將短未經(jīng)修飾的B類ODN(SEQIDNO:38)的活性與具有親脂性取代核苷酸類似物和親脂性3'標(biāo)簽的相同序列的ODN(SEQIDNO:126)的活性進(jìn)行比較。二者伴有或者不伴有DOTAP進(jìn)行配制。如圖20所示，與加入DOTAP相同，加入JU》f飾和親脂性標(biāo)簽顯著地增強了ODN的活性。然后，具有除親脂性取代核苷酸類似物之外的第二核苷酸類似物的B類ODN(SEQIDNO:138,7-脫氮-dG;SEQIDNO:139,肌苷；SEQIDNO:140，5-曱基-dC)的活性與母本序列(SEQIDNO:1)和僅具有親脂性取代核苷酸類似物的相同序列(SEQIDNO:13)的活性進(jìn)行比較。如圖22所示，在檢驗中，所有經(jīng)修飾的ODN均比母本ODN的活性更強。然后，將具有親脂性取代核苷酸類似物的T-類ODN(SEQIDNO:132-134)的活性與已知為免疫刺激性的C類ODN(SEQIDNO:198)的活性進(jìn)行比較。如圖23所示，在檢驗中，所有經(jīng)修飾的ODN均比未經(jīng)修飾的C類ODN的活性更強。表6:具有其它修飾的親脂性替換寡聚核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>*硫代磷酸酯核苷酸間鍵-磷酸二酯核苷酸間鍵實施例8:經(jīng)修飾的P類寡聚核苷酸的活性經(jīng)焚光素酶檢驗測定，測試了具有親脂性堿基類似物的P類ODN活化經(jīng)由TLR9的NF-kB途徑的能力。具有親脂性取代核苷酸類似物的P類ODN(SEQIDNO:58-61)的活性與B類正對照(SEQIDNO:55)和未經(jīng)修飾的P類ODN(SEQIDNO:56)的活性進(jìn)行比較。如圖24所示，所有顯示的經(jīng)修飾的P類ODN相比于對照顯示出提高的TLR9刺激。圖24a顯示了JU修飾的P類ODN和24b顯示了EU修飾的P類ODN。然后，將經(jīng)修飾的P類ODN(SEQIDNO:64(EU修飾)、66-67(JU修飾)的活性與B類正對照(SEQIDNO:55)、C類ODN(SEQIDNO:68)和未經(jīng)修飾的P類ODN(SEQIDNO:57)的活性進(jìn)行比較。如圖25所示，所有經(jīng)修飾的ODN相比未經(jīng)修飾的P類ODN顯示出更高程度的TLR9刺激。在CG二核苷酸之間具有磷酸二酯鍵的SEQIDNO:66相比于全部為硫代硫酸酯的SEQIDNO:67顯示出降低的活性。然后，測試經(jīng)修飾的P類ODN誘導(dǎo)IFN-a表達(dá)的能力。經(jīng)ELISA檢驗測量，將具有親脂性取代核苷酸類似物的P類ODN(SEQIDNO:58-61)的活性與B類正對照(SEQIDNO:55)和未經(jīng)修飾的P類ODN(SEQIDNO:56)的活性進(jìn)行比較。如圖26所示，所有經(jīng)》務(wù)飾的P類ODN顯示出IFN-a誘導(dǎo)的增加。圖26a顯示了JU修飾的P類ODN和26b顯示了EU修飾的P類ODN。然后，經(jīng)ELISA檢驗的測量，比較了經(jīng)修飾的P類ODN(EU修飾)、66-67(JU修飾)與B類正對照(SEQIDNO:55)、C類ODN(SEQIDNO:68)和未經(jīng)修飾的P類ODN(SEQIDNO:57)的誘導(dǎo)IFN-a的能力。如圖27所示，經(jīng)修飾的P類ODN顯示了誘導(dǎo)IFN-a的增強能力。如在圖24中，SEQIDNO:66相比SEQIDNO:67顯示出降低的活性。然后，測試了經(jīng)修飾的P類ODN在人類PBMC中誘導(dǎo)IL-6的能力。來自三名捐獻(xiàn)者的PBMC與指明濃度的ODN共同溫育24小時，隨后針對IL-6對上清液進(jìn)行l(wèi)uminex25-plex分析。經(jīng)修飾的P類ODN(SEQIDNO:58、60-62,圖28a)(SEQIDNO:64和67,圖28b)的活性與未經(jīng)修飾的B類ODN(SEQIDNO:55)和未經(jīng)修飾的C類ODN(SEQIDNO:54)、負(fù)對照ODN(SEQIDNO:53)和未經(jīng)修飾的P類ODN(SEQIDNO:56)的活性進(jìn)行比較。JU修飾的ODN(SEQIDNO:58，60-61和67)相比EU修飾的ODN(SEQIDNO:62和64)顯示出略微較高的IL-6的活化。所有經(jīng)修飾的ODN相比未經(jīng)修飾的ODN顯示出提高的活性。然后，將經(jīng)修飾的P類ODN(SEQIDNO:58、60-62，圖29a)(SEQIDNO:64和67,圖29b)的活性與未經(jīng)修飾的B類ODN(SEQIDNO:55)、未經(jīng)修飾的C類ODN(SEQIDNO:54)、負(fù)對照ODN(SEQIDNO:53)、未經(jīng)修飾的P類ODN(SEQIDNO:56)、LPS、R-848、SEB和聚[I]:[C]ODN的活性進(jìn)行比較。來自三名捐獻(xiàn)者的CFSE-標(biāo)記的PBMC與ODN溫育5天，然后用CD19抗體染色。測量具有減少的CFSE染色的B細(xì)胞的百分比。用B類ODN進(jìn)行的處理導(dǎo)致分化后最高百分比的B細(xì)胞。用JU修飾的ODN進(jìn)行的處理導(dǎo)致相比EU修飾的ODN更高的B細(xì)月包的百分比。為了測量經(jīng)修飾的P類ODN的體內(nèi)作用，BALB/c小鼠(每組5只)用不同劑量的ODN進(jìn)行皮下注射。在注射后3小時使動物出血，通過ELISA檢測血漿中的TNF-a。經(jīng)修飾的P類ODN(SEQIDNO:58、60-62、64和67)的活性與B類負(fù)對照(SEQIDNO:55)和負(fù)對照(SEQIDNO:26)的活性進(jìn)行比較。如圖30所示，用JU修飾的ODNSEQNO:58、60和61相比EU修飾的ODNSEQIDNO:64導(dǎo)致略樣i更高的IFN-a誘導(dǎo)。B類ODNSEQIDNO:55如預(yù)期未能誘導(dǎo)許多鼠類IFN-a。然后，評估經(jīng)修飾的P類ODN減小小鼠SA1N腫瘤模型中肺瘤體積的能力。雌性A/J小鼠(每組10只)在第0日用5x105Sal/N肺瘤細(xì)胞進(jìn)行皮下注射。小鼠用35昭(圖31a)或100昭(圖31b)具有親脂性取代寡聚核苷酸類似物的P類ODN(SEQIDNO:60、64和67)、未經(jīng)修飾的C類ODN、未經(jīng)修飾的B類ODN(SEQIDNO:55)或僅提供PBS進(jìn)行治療。在腫瘤誘導(dǎo)后的第8日開始每周一次皮下注射提供ODN。監(jiān)測動物的存活和腫瘤體積。如圖31a所示，用較低劑量的經(jīng)修飾的P類ODN治療顯示出腫瘤體積的最大程度的縮小。在3lb中的更高劑量，所有經(jīng)修飾的P類ODN和C類ODN均能有效減小腫瘤體積。表7:經(jīng)修飾的P類寡聚核苷酸<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>*硫代磷酸酯核香酸間鍵-磷酸二酯核苷酸間鍵示例性經(jīng)修飾的ODN—覽列在表8中:表8<image>imageseeoriginaldocumentpage84</image><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>權(quán)利要求1.一種寡聚核苷酸，其包括序列R1YZR2，其中R1和R2選自親脂性取代核苷酸類似物L(fēng)、核苷酸和鍵，其中R1和R2中的至少一個是親脂性取代核苷酸類似物L(fēng)，其中Y是嘧啶核苷酸，且其中Z是嘌呤、嘧啶或脫堿基殘基。2.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苦酸，其中L包含5或6元環(huán)的核石威基類似物。3.如權(quán)利要求1所述的寡聚核芬酸，其中L包括下式I的基團(tuán)，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>式I其中A、B、X、D、E和F選自選擇性地帶有氫或取代基的碳或氮；n是O或1;虛線表示選擇性的雙鍵；其中至少一個取代基不是從下組中選擇氧代、硫代、羥基、巰基、亞氨基、氨基、曱基和氫，且A、B、X、D、E和F原子中總共不超過3個氮(N)。4.如權(quán)利要求3所述的寡聚核苦酸，其中n是1。5.如權(quán)利要求3所述的寡聚核苷酸，其中n是0。6.如權(quán)利要求3所述的寡聚核苷酸，其中所述A、B、X、D、E和F原子都是碳。7.如權(quán)利要求3所述的寡聚核苷酸，其中所述A、B、X、D、E和F原子中的一個是氮。8.如權(quán)利要求3所述的寡聚核苷酸，其中所述A、B、X、D、E和F原子中的兩個是氮。9.如權(quán)利要求3所述的寡聚核苷酸，其中所述A、B、X、D、E和F原子中的三個是氮。10.如權(quán)利要求3所述的寡聚核苦酸，其中所述A、B、X、D、E和F原子中的至少一個^皮下組中的成員所取代F、Cl、Br、I、烷基、烯基、炔基、卣代烷基、卣代烯基、環(huán)烷基、O-烷基、O-烯基、-NH-烷基、-N(烷基)2、-S-烷基、-SO-烷基、-S02-烷基、硝基、氰基、羧酸酯、苯基、苯硫基、千基、氧代、硫代、羥基、巰基和亞氨基，其中至少一個取代基不是氧代、硫代、羥基、巰基、亞氨基、氨基或曱基。11.如權(quán)利要求3所述的寡聚核普酸，其中所述A或E這兩個原子中的一個被F、Cl、Br、I、C2-Q-烷基、烯基、炔基、卣代烷基、卣代烯基、環(huán)烷基、O-烷基、O-烯基、-NH-烷基、^(烷基)2、-S-烷基、-SO-烷基、-802-烷基、硝基、氰基、羧酸酯、苯基、苯硫基、千基或甲基所取代，條件是如果被曱基取代，則A、B、X、D、E和F都是C。12.如權(quán)利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I包括取代嘧啶。13.如權(quán)利要求3所述的寡聚核普酸，其中式I包括取代尿嘧啶。14.如權(quán)利要求3所述的寡聚核普酸，其中式I包括取代曱苯。15.如權(quán)利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I包括取代咪唑或吡唾。16.如權(quán)利要求3所述的寡聚核苦酸，其中式I包括取代三唑。17.如權(quán)利要求3所述的寡聚核普酸，其中式I是5-氯-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶或5-碘-尿嘧啶。18.如權(quán)利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I是5-乙基-尿嘧啶或5-丙基-尿嘧啶。19.如權(quán)利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I是5-丙炔基-尿嘧啶或(E)-5-(2-溴乙烯基)-尿嘧啶。20.如權(quán)利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I是2,4-二氟-曱苯。21.如權(quán)利要求3所述的寡聚核苷酸，其中式I與3至6元芳環(huán)或脂環(huán)體系相稠合。22.如權(quán)利要求3所述的寡聚核普酸，其中式I與5至6元糖部分相連。23.如權(quán)利要求22所述的寡聚核苷酸，其中所述5至6元糖部分是戊糖或己糖。24.如權(quán)利要求23所述的寡聚核苦酸，其中所述戊糖是呋喃糖且所述己糖是吡喃糖，它們能夠選擇性地被F、氨基、烷氧基、烷氧基-乙氧基、氨基丙基、烯基、炔基或02,C4-亞烷基橋取代。25.如權(quán)利要求23所述的寡聚核苷酸，其中所述呋喃糖是核糖或脫氧核糖。26.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R,和R2都是L。27.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R!是L且R2是核苷酸。28.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R,是L且R2是鍵，因此所述寡聚核苷酸包含結(jié)構(gòu)5'R,CG3'。29.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R!是L且R2是鍵，其中R3位于R,YZ的5'，因此所述寡聚核苷酸包含結(jié)構(gòu)5'R3R!YZ3'。30.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R,是L且R2是tt:,其中第二個R!位于R,YZ的5'并與RiYZ通過一個核苷酸N隔開，因此所述寡聚核普酸包含結(jié)構(gòu)5'R!NR，YZ3'。31.如權(quán)利要求1所述的寡聚核普酸，其包含兩個5'R!NR,YZ3'模體。32.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中Y包括選自下組的嘧啶胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、5-羥基-胞嘧啶、5-羥曱基-胞嘧啶、5-鹵代-胞嘧啶、2-硫代-胞嘧啶、4-硫代-胞嘧啶、N3-曱基-胞嘧啶、N4-烷基-胞嘧啶或6-取代胞嘧啶。33.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中Z是噪呤核苷酸。34.如權(quán)利要求1所述的寡聚核普酸，其中Z包括選自下組的嘌呤鳥嘌呤、7-脫氮-鳥。票呤、次黃噪呤、7-脫氮-次黃噪呤、2-氨基-嘌呤、4-硫代-嘌呤、2,6-二氨基-嘌呤、8-氧代-7,8-二氫鳥嘌呤、7-硫代-8-氧代-7,8-二氫鳥噪呤、7-烯丙基-8-氧代-7，8-二氫鳥嘌呤、7-脫氮-8-氮-鳥嘌呤、8-氮-鳥嘌呤、Nl-曱基-鳥嘌呤或嘌呤。35.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苦酸，其中Z是嘧啶核苷酸。36.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中Z是T。37.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苦酸，其中R2是L且R,是核苷酸。38.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苦酸的長度為3個核苷酸。39.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸的長度為3-6個核芬酸。40.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸的長度為3-100個核苦酸。41.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸的長度為7-100個核苦酸。42.如權(quán)利要求41所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸富含T。43.如權(quán)利要求42所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸包括至少80%的T。44.如權(quán)利要求1所述的寡聚核普酸，其包含至少一個回文序列。45.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其包含兩個回文序列。46.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其包含一至四個未曱基化的CG二核苷酸。47.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苦酸，其包含至少一個(G)m序列，其中m為4至10。48.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其包含至少一個甲基化CG二核苦酸。49.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所有CG二核苷酸均未甲基化。50.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其還包含非核苷酸修飾。51.如權(quán)利要求50所述的寡聚核苷酸，其中所述非核苷酸修飾選自C6-C48-聚乙二醇、CrC,烷-二醇、CVC,8-烷基氨基連接子和CrCI8-烷基硫醇連接子。52.如權(quán)利要求50所述的寡聚核苷酸，其中所述非核苷酸修飾選自膽固醇、膽汁酸、飽和或不飽和脂肪酸、以及葉酸。53.如權(quán)利要求50所述的寡聚核苦酸，其中所述非核苷酸修飾是十六烷基-甘油或二(十六烷基)甘油基團(tuán)。54.如權(quán)利要求50所述的寡聚核苦酸，其中所述非核苷酸修飾是十八烷基-甘油或二(十八烷基)-甘油基團(tuán)。55.如權(quán)利要求50所述的寡聚核苷酸，其中所述非核苷酸修飾是維生素E基團(tuán)。56.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其進(jìn)一步包含非核苷酸分枝部分。57.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苦酸，其進(jìn)一步包括核苷酸分枝部58.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其進(jìn)一步包括分枝部分，其中所述寡聚核苷酸具有至少兩個5'-末端。59.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苦酸，其中所述寡聚核苷酸的至少兩個核芬酸具有穩(wěn)定的鍵。60.如權(quán)利要求59所述的寡聚核苷酸，其中所述穩(wěn)定的鍵是硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、甲基磷酸酯鍵、曱基硫代磷酸酯鍵、硼代磷酸酯鍵、氨基磷酸酯鍵或脫磷鍵，它們是對映體混合物或者是對映體純的S或R構(gòu)型。61.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R,YZR2中的YZ具有磷酸二酯鍵。62.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R、YZR2中的YZ具有硫代磷酸酯鍵。63.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中R,YZR2中的R,Y具有硫代磷酸酯鍵。64.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中RJZR2中的ZR2具有硫代磷酸酯鍵。65.如權(quán)利要求61所述的寡聚核苷酸，其中所有其它核苷酸具有硫代磷酸酯鍵。66.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核普酸不含微載體。67.如權(quán)利要求66所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸不含脂質(zhì)載體。68.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸是A類寡聚核苷酸。69.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸是B類寡聚核苷酸。70.如權(quán)利要求69所述的寡聚核苷酸，其中所述B類寡聚核苷酸具有序列5'TCNiTX!X2CGX3X43',其中X,是G或A，Xs是T、G或A，X3是T或C,X4是T或C，且N是任何核苷酸，N,和N2是各自由約0-25個N構(gòu)成的核普酸序列。71.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸是C類寡聚核苷酸。72.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸是P類寡聚核苷酸。73.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸是T類寡聚核苷酸。74.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸包括至少一個3'一3'鍵。75.如權(quán)利要求1所述的寡聚核苷酸，其中所述寡聚核苷酸包括至少一個5'-5'鍵。76.—種誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括將免疫細(xì)胞與權(quán)利要求1-75中任一項所述的寡聚核苷酸相接觸。77.如權(quán)利要求76所述的方法，其中所述免疫應(yīng)答是IFN-a誘導(dǎo)。78.如權(quán)利要求76所述的方法，其進(jìn)一步包括抗原。79.如權(quán)利要求76所述的方法，其中所述寡聚核苷酸通過選自下組的途徑輸送經(jīng)口、鼻內(nèi)、舌下、靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)粘膜、經(jīng)眼、氣管內(nèi)、直接注射和皮內(nèi)。80.如權(quán)利要求76所述的方法，其中所述寡聚核苷酸或組合物以有效誘導(dǎo)細(xì)胞因子和/或趨化因子表達(dá)的量輸送給受試對象。81.如;K利要求76所述的方法,外的免疫調(diào)節(jié)劑。82.如權(quán)利要求76所述的方法,對象以治療受試對象的自免疫疾病。83.如權(quán)利要求76所述的方法，對象以治療受試對象的氣道重塑。84.如權(quán)利要求76所述的方法,苦酸但不施用抗原。其進(jìn)一步包括向受試對象施用另其中所述寡聚核苷酸輸送給受試其中所述寡聚核苷酸輸送給受試其中向受試對象施用所述寡聚核85.—種治療患有癌癥的受試對象的方法，所述方法包括向受試對象施用有效治療所述癌癥的量的如權(quán)利要求1-75中任一項所述的寡聚核香酸。86.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述癌癥選自基底細(xì)胞癌、膽道癌、膀胱癌、骨癌、大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)癌；乳腺癌、宮頸癌；絨癌；結(jié)腸和直腸癌；結(jié)締組織癌；消化系統(tǒng)癌癥；子宮內(nèi)膜癌；食管癌；眼癌；頭頸部癌；胃癌；上皮內(nèi)腫瘤；腎癌；喉癌；白血??；肝癌；肺癌；包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤在內(nèi)的淋巴瘤；黑色素瘤；骨髓瘤；神經(jīng)母細(xì)胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；橫紋肌肉瘤；直腸癌；腎癌；呼吸系統(tǒng)癌癥；肉瘤；皮膚癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌；泌尿系統(tǒng)癌癥；以及其它癌和肉瘤。87.如權(quán)利要求85所述的方法，其進(jìn)一步包括向受試對象施用抗癌藥物或治療，例如化療劑、》文射。88.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述寡聚核苷酸通過選自下組的途徑輸送經(jīng)口、鼻內(nèi)、舌下、靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)粘膜、經(jīng)眼、氣管內(nèi)、直接注射和皮內(nèi)。89.如權(quán)利要求85所述的方法，其中所述受試對象經(jīng)過外科手術(shù)治療。90.一種治療受病毒感染或存在受病毒感染風(fēng)險的受試對象的方法，所述方法包括向受病毒感染或存在受病毒感染風(fēng)險的受試對象施用有效治療所述病毒感染的量的如權(quán)利要求1-75中任一項所述的寡聚核苷酸。91.如權(quán)利要求90所述的方法，其中所述病毒感染由下述病毒引起乙肝病毒HBV、丙肝病毒HCV、人類免疫缺陷病毒HIV、流感病毒、呼吸道合胞病毒RSV或乳頭狀瘤病毒HPV。92.如權(quán)利要求90所述的方法，其中所述寡聚核苷酸通過選自下組的途徑輸送經(jīng)口、鼻內(nèi)、舌下、靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)粘膜、經(jīng)眼、氣管內(nèi)、直接注射和皮內(nèi)。93.如權(quán)利要求90所述的方法，其進(jìn)一步包括抗病毒劑。94.如權(quán)利要求90所述的方法，其中所述受試對象對非CpG抗病毒療法無應(yīng)答。全文摘要本發(fā)明涉及包含至少一個親脂性取代核苷酸類似物和嘧啶-嘌呤二核苷酸的寡聚核苷酸。本發(fā)明還涉及藥物組合物及其使用方法。文檔編號A61P37/04GK101517082SQ200780035967公開日2009年8月26日申請日期2007年9月25日優(yōu)先權(quán)日2006年9月27日發(fā)明者哈拉爾德·德貝拉克,尤金·烏爾曼,瑪麗昂·朱爾克申請人:科勒制藥有限責(zé)任公司