專利名稱：：GnRH-PE突變體融合蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及GnRH-PE突變體融合蛋白，以及所述突變體融合蛋白用于制備治療銀屑病的藥物的用途。
背景技術(shù)：
：銀屑病俗稱牛皮癬，是一種常見的具有特征性皮損的慢性易于復(fù)發(fā)的皮膚病。表面銀白色鱗屑、薄膜、點狀出血是該病的三大臨床特征。該病的病因及發(fā)病機(jī)理尚不完全明確。近年來大多認(rèn)為遺傳、代謝障礙，感染、免疫功能障礙等可能為發(fā)病的重要因素，季節(jié)變化、潮濕、精神創(chuàng)傷或手術(shù)等也可能誘發(fā)該病。銀屑病組織病理學(xué)的改變主要表現(xiàn)為角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖、炎癥細(xì)胞聚集和真皮乳頭部血管擴(kuò)張三大特征。其中，角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖常常伴有異常的角化過程，同時出現(xiàn)角蛋白表達(dá)的改變。根據(jù)臨床表現(xiàn)，銀屑病通?？煞譃樗男?，即尋常型銀屑病(psoriasisvulgaris)、膿皰型銀屑病(Psoriasispustulosa)、關(guān)節(jié)病型銀屑病(psoriasisarthropathica)與紅皮病型4艮屑病(erythrodermicpsoriasis)。目前對銀屑病尚無特效療法?，F(xiàn)有各種療法只能達(dá)到近期療效，不能防止復(fù)發(fā)，主要包括l)心理療法主要包括解除思想顧慮，消除精神創(chuàng)傷，避免各種誘發(fā)因素；2)外用藥物療法常用的外用藥物有角質(zhì)促成劑和皮質(zhì)類固醇霜劑；3)全身療法對于外用藥物療效欠佳可考慮應(yīng)用全身療法，包括采用免疫抑制劑、維曱酸、抗生素(青霉素及新型青霉素)、皮質(zhì)類5固醇等；和4)物理療法包括浴療、光療及光化學(xué)療法。利用豚鼠銀屑病樣動物模型，本發(fā)明人出人意料的發(fā)現(xiàn)，采用GnRH-PE突變體融合蛋白，能夠有效治療銀屑病，包括尋常型銀屑病、膿皰型銀屑病、關(guān)節(jié)病型銀屑病與紅皮病型銀屑病。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及GnRH-PE突變體融合蛋白，以及所述突變體融合蛋白用于制備治療銀屑病的藥物的用途。GnRH-PE融合蛋白由人促黃體生成激素釋放因子(GnRH)和假單胞菌外毒素A(PE)組成，是已知用于治療腫瘤的生物乾向性藥物。其中GnRH為由10個氨基酸組成的小肽，其序列用三字母表示為pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly，其中第一位氨基酸殘基為焦谷氨酸，氨基酸序列如序列表中SEQIDN0:1所示。假單胞菌外毒素A(PE)已知是一個由613個氨基酸組成的蛋白質(zhì)分子(GE醒ANK，gi:151215)，其具體氨基酸序列如序列表中SEQIDNO:2所示。具體的，在所述融合蛋白中，GnRH作為耙向性藥物的導(dǎo)向部分，PE作為靶向性藥物的毒素部分。為了提高所述融合蛋白殺傷癌變T細(xì)胞的活性，基于所述GnRH-PE融合蛋白，已經(jīng)分別針對上述導(dǎo)向部分的GnRH和毒素部分的PE開發(fā)并制備了一系列融合蛋白的突變體(參見中國發(fā)明專利"一種能特異殺死腫瘤細(xì)胞的基因工程重組蛋白"，專利號ZL03137587.1)。GnRH-PE突變體融合蛋白的組成及種類在本發(fā)明中，所述GnRH-PE突變體融合蛋白由GnRH突變體與PE突變體組成，其中所述突變體融合蛋白選自1)GnRH突變體的C—末端與PE突變體的N-末端通過接頭序列以肽鍵相連形成的突變體融合蛋白LLP，即GnRH突變體-接頭序列-PE突變體。任選的，在所述突變體融合蛋白LLP中，所述PE突變體的C-末端還可以含有2-5個選自-XYEL或-REDLK的重復(fù)片段，即GnRH突變體一接頭序列-PE突變體-(XYEL)n,或GnRH突變體-接頭序列-PE突變體-(REDLK)n，其中n為2-5的整數(shù)；2)PE突變體的C-末端與GnRH突變體的N-末端通過接頭序列以肽鍵相連形成的突變體融合蛋白PLL，即PE突變體-接頭序列-GnRH突變體。任選的，在所述突變體融合蛋白PLL中，所述GnRH突變體的C-末端還可以含有2-5個選自-XYEL或-REDLK的重復(fù)片段，即PE突變體-接頭序列-GnRH突變體-(XYEL)n或PE突變體-接頭序列-GnRH突變體-(REDLK)n,其中n為2-5的整數(shù)；3)具有1)或2)中所述突變體融合蛋白氨基酸序列中一個或幾個氨基酸的插入、缺失和/或替換的變體或其功能性片段，前提是基本上保持1)或2)中所述突變體融合蛋白的生物學(xué)活性；以及4)與1)或2)中所述突變體融合蛋白氨基酸序列具有大于等于90%序列同一性的變體或其功能性片段，前提是基本上保持l)或2)中所述突變體融合蛋白的生物學(xué)活性。在本發(fā)明中，所述接頭序列為一段由0-20個氨基酸殘基所組成的序列。具體的，在所述GnRH突變體與PE突變體之間可以不使用接頭序列，也可以根據(jù)需要選擇使用由3個氨基酸殘基、5個氨基酸殘基、IO個氨基酸殘基、15個氨基酸殘基，甚至20個氨基酸殘基組成的接頭序列。優(yōu)選的，所述接頭序列可以為如下所示(用三字母表示)的序列-His-Met-Ala-Glu-Glu-(SEQIDNO:3);-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-(SEQIDNO:4);-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(SEQIDNO:5)。7在本發(fā)明上下文中，所述片段-XYEL中，X代表賴氨酸(Lys)或精氨酸(Arg),Y代表天冬氨酸(Asp),谷氨酰胺(Gln)或谷氨酸(Glu)，E代表谷氨酸(Glu)，L代表亮氨酸(Leu);所述片段-REDLK為采用單字母表示的氨基酸序列片段，其中，R代表精氨酸(Arg)，E代表谷氨酸(Glu)，D代表天冬氨酸(Asp),L代表亮氨酸(Leu)，K代表賴氨酸(Lys);在本發(fā)明中，所述GnRH突變體是指其氨基末端第一位氨基酸替換成谷氨酸(Glu)，以及任選的，其氨基末端第6位由甘氨酸(Gly)突變?yōu)楸彼?Ala)或色氨酸(Trp)或亮氨酸(Leu)的突變體。在本發(fā)明中，所述GnRH-PE突變體融合蛋白在保留或基本上保留其生物學(xué)活性的前提下可以被進(jìn)一步修飾，包括在親本蛋白質(zhì)氨基酸序列的兩個殘基之間插入一個或多個另外的殘基，以及從氨基酸序列中刪除、替換一個或多個殘基。具體的，在本發(fā)明中，人促黃體生成激素釋放因子(GnRH)氨基末端第一位氨基酸由焦谷氨酸替換成谷氨酸的所述GnRH突變體其氨基酸序列為Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly(SEQIDN0:6);當(dāng)其氨基末端第6位由甘氨酸(Gly)分別由丙氨酸(Ala)或色氨酸(Trp)或亮氨酸(Leu)所替代后，其氨基酸序列分別為Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Ala-Leu-Arg-Pro-Gly(SEQIDNO:7)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly(SEQIDNO:8)Glu-His-Trp-Ser-Tyr-Uu-Uu-Arg-Pro-Gly卿IDNO:9)在本發(fā)明中，所述PE突變體包括1)假單胞菌外毒素A(PE)去掉N末端1-252位氨基酸后形成的缺失突變體PE40，參見序列表中SEQIDNO:10;任選的，所述PE40的C-末端的5個氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)可被替換為-XYEL;2)將假單胞菌外毒素A(PE)的第253-364位，第381-613位兩段氨基酸序列按原順序相連得到蛋白PE38，參見序列表中SEQIDNO:11;任選的，所述PE38的C-末端的5個氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)可^f皮替換為-XYEL;3)將假單胞菌外毒素A(PE)的第280-364位，第381-613位兩段氨基酸序列按原順序相連得到蛋白PE35,參見序列表中SEQIDNO:12;任選的，所述PE35的C-末端的5個氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)替換為-XYEL;4)假單胞菌外毒素A(PE)的第280-613位氨基酸序列的片段蛋白PE37,參見序列表中SEQIDNO:13;任選的，所述PE37的C-末端的5個氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)可^皮替換為-XYEL;5)將假單胞菌外毒素A(PE)的第253-358位，第366-613位兩段氨基酸序列按原順序相連得到蛋白PE39，參見序列表中SEQIDNO:14;任選的，所述PE39的C-末端的5個氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)可被替換為-XYEL。具體的，本發(fā)明中所述"變體"是指至少具有以下特征的多肽(1)與GnRH-PE突變體融合蛋白的多肽序列具有約80%或以上的氨基酸序列同一性，優(yōu)選至少約81%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少約82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90°/。、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98°/?；?9%的氨基酸序列同一性。"百分00氨基酸序列同一性"被定義為在排比兩個序列時，候選序列中與所述GnRH-PE突變體融合蛋白之氨基酸序列的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)。為了測定％氨基酸同一性，將序列排比并在必要時為了獲得最大％序列同一性而引入空位；保守置換不被認(rèn)為是序列同一性的一部分。測定百分同一性的氨基酸序列排比方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常使用可公開獲得的計算機(jī)軟件，如BLAST、BLAST2、ALIGN或Mega1ign(DNASTAR)軟件，來排比肽序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定用于排比的適當(dāng)參數(shù)，包括在所比較的序列全長上獲得最大排比所需的任何算法。當(dāng)排比氨基酸序列時，特定氨基酸序列A與特定氨基酸序列B(或者可以表述為與特定氨基酸序列B具有或者包含一定。/。氨基酸序刮同一性的特定氨基酸序列A)的％氨基酸序列同一性可以如下計算%氨基酸序列同一性=X/Y100其中X是通過A和B的序列排比程序或算法排比被評分為相同匹配的氨基酸殘基的數(shù)目，Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)。如果氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度，則A與B的％氨基酸序列同一性將不等于B與A的％氨基酸序列同一性。在本發(fā)明優(yōu)選實施方案中，所述GnRH-PE突變體融合蛋白選自GnRH-PE40，參見序列表中SEQIDNO:15;GnRH-PE40KDEL，參見序列表中SEQIDNO:16;6Ala-GnRH-PE40KDEL，參見序列表中SEQIDNO:17;GnRH-PE39KDEL，參見序列表中SEQIDNO:18;和GnRH-PE38，參見序列表中SEQIDNO:19。所述GnRH-PE突變體融合蛋白的構(gòu)建策略本發(fā)明所述突變體融合蛋白可以用本領(lǐng)域公知的基因突變和重組方法容易地產(chǎn)生。具體的，所述突變體融合蛋白可以用本領(lǐng)域公知的方法如寡核苷酸-介導(dǎo)的(定點)誘變、丙氨酸掃描和PCR誘變來制備?？梢詫Ρ豢寺〉腄NA進(jìn)行定點誘變、盒誘變、限制選擇誘變或其他已知的技術(shù)，以產(chǎn)生GnRH-PE突變體融合蛋白之變體的DNA序列。編碼GnRH突變體的核酸序列可以與編碼PE或其突變體的核酸序列在閱讀框內(nèi)融合。所述編碼突變體融合蛋白的基因也可以通過常規(guī)技術(shù)合成，包括自動DNA合成儀。也可以釆用使用錨定引物的PCR擴(kuò)增，該錨定引物在兩個連續(xù)的基因片段之間產(chǎn)生互補的突出端，然后可以退火，再擴(kuò)增，產(chǎn)生嵌合基因序列。通過將如上述獲得的編碼突變體融合蛋白的基因在閱讀框內(nèi)亞克隆到用于目標(biāo)蛋白表達(dá)的本領(lǐng)域已知的多種表達(dá)載體上，可以生產(chǎn)所述突變體融合蛋白。具體的，為獲得本發(fā)明所述GnRH-PE突變體融合蛋白，分別采取如下策略人促黃體生成激素釋放因子(GnRH)和假單胞桿菌外毒素A(PE)進(jìn)行改造。(一)、對融合蛋白的GnRH部分之改造，包括1.將天然GnRH的N末端第一位的焦谷氨酸改為谷氨酸；2.任選的，將根據(jù)步驟1獲得的GnRH突變體的N末端第6位氨基酸分別替換為為Ala或Trp或Leu。3.任選的，將步驟1或2中獲得的GnRH突變體C末端連接上-(XYEL)n或-(REDLK)n,其中n為2-5的整數(shù)。(二)、融合蛋白假單胞桿菌外毒素A部分之改造1.PE40及其突變體的構(gòu)建將假單胞菌外毒素A(PE)去掉N末端1-252位氨基酸得到缺失突變體稱為PE40。根據(jù)需要，可進(jìn)一步將所述PE40的C-末端的5個氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即一RDELK)替換為-XYEL。2.PE38及其突變體的枸建將假單胞菌外毒素A(PE)的第253-364位，第381-613位兩段氨基酸序列按原順序相連，得到蛋白PE38。根據(jù)需要，可以將所述PE38的C-末端的5個氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)替換為-XYEL。3.PE35及其突變體的構(gòu)建將假單胞菌外毒素A(PE)的第280-364位，第381-613位兩段氨基酸序列按原順序相連得到蛋白PE35。根據(jù)需要，可進(jìn)一步將所述PE35的C-末端的5個氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)替換為-XYEL。4.PE37及其突變體的構(gòu)建將假單胞菌外毒素A(PE)去掉N末端1-279位氨基酸得到的缺失突變體，即假單胞菌外毒素A(PE)的第280-613位氨基酸序列片段稱為蛋白PE37。根據(jù)需要，可以將所述PE37的C-末端的5個氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)替換為-XYEL。5.PE39及其突變體的構(gòu)建將假單胞菌外毒素A(PE)的第253-358位，第366-613位兩段ii氨基酸序列按原順序相連得到蛋白PE39。根據(jù)需要，所述PE39的C-末端的5個氨基酸-Arg-Glu-Asp-Leu-Lys(即-RDELK)可被替換為-XYEL。本發(fā)明另一方面，涉及所述GnRH-PE突變體融合蛋白用于治療銀屑病的用途。本發(fā)明另一方面，涉及所述GnRH-PE突變體融合蛋白用于制備治療銀屑病的藥物的用途。在本發(fā)明中，所述"治療"包括在給藥后使得所述銀屑病的癥狀緩解、有效、顯效和逆轉(zhuǎn)的情形。具體的，按照通用的Baker方法(BakerBS等人，BrJDermatol,1992,126:105110)制定組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，即典型的銀屑病皮損評分在4.0~10.0之間，根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的判定對于用藥前評分大于7.0的患者，凡用藥后評分小于5.0的，判定為銀屑病癥狀緩解，凡用藥后評分小于3.0的，判定為銀屑病癥狀有效，凡用藥后評分小于2.0的，判定為銀屑病癥狀顯效，凡用藥后評分小于l.0的，判定為銀屑病癥狀逆轉(zhuǎn)。相應(yīng)的，本發(fā)明所述治療有效量是指當(dāng)根據(jù)受試者疾病或病癥的性質(zhì)和嚴(yán)重程度對特定受試者施用時具有所需療效的量，例如將緩解、有效、顯效和逆轉(zhuǎn)所述銀屑病的量本發(fā)明中，通過采用以下兩種動物模型判定所述GnRH-PE突變體融合蛋白治療銀屑病的效果。模型一采用現(xiàn)有技術(shù)中用于評價銀屑病治療效果的常用動物模型一一豚鼠銀屑病樣動物模型，評價本發(fā)明所述GnRH-PE突變體融合蛋白治療銀屑病的效果(參見"豚鼠銀屑病樣動物模型中角蛋白K14，16,17表達(dá)水平的變化，，，樊平申，瘳文俊，劉玉峰，第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(新)2001年12月第22巻第24期)。模型二鱗片狀皮膚(fsn/fsn)突變鼠模型。所述模型是美國Jackson實驗室1985年新發(fā)現(xiàn)的一種自發(fā)常染色體隱性基因突變小鼠品系，這種12小鼠剛出生時表現(xiàn)為低色素性貧血，不久全身或局部出現(xiàn)鱗狀灰白色斑塊。而且發(fā)現(xiàn)角化過度、棘層肥厚、角層下膿皰和真皮毛細(xì)血管擴(kuò)張等病理特征在出生后2周出現(xiàn)，3~4周皮損融合擴(kuò)散，其發(fā)生與大量淋巴細(xì)胞和少量的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞在真皮的浸潤有關(guān)，表現(xiàn)出與銀屑病極為相似的組織病理學(xué)特征[ChinaJLeprSkinDis.Jan2006，Vol.22，No.1;PathogenicfunctionofIL-lbinpsoriasiformskinlesionsofflakyskin(fsn/fsn)mice;ClinExpImmunol2001;123:505-510]。實施例1GnRH-PE突變體編碼基因的制備1、GnRH-PE40編碼基因的獲得依據(jù)已知GnRH突變體和PE40突變體的氨基酸序列，選用大腸桿菌偏好密碼子全基因合成GnRH-PE4QDNA序列，得到GnRH-PE40核酸序列，為方便基因重組操作，同時在相應(yīng)于所述多肽之N末端和C末端加上限制性酶切位點Ndel(CATATG)、EcoRI(GAATTC)，在3，端修飾上終止密碼子。按照本領(lǐng)域常用方法，參見如《分子克隆(第二版)實驗室指南》(1992，冷泉港實驗室)，將如上述制備的GnRH-PE40DNA序列以及篩選質(zhì)粒pBSK(Stratagene公司，貨號212205)用限制性內(nèi)切酶NdeI、EcoRI處理，經(jīng)計算各樣品濃度后，按摩爾比l:1加入T4連接體系。經(jīng)轉(zhuǎn)化、篩選出得到包含上述GnRH-PE40核酸序列的重組質(zhì)粒，命為pSK-GnRH-PE40，測序后備用。2、GnRH-PE其他突變體編碼基因的獲得按照本領(lǐng)域常用方法，參見如《分子克隆(第二版)實驗室指南》(1992，冷泉港實驗室)，以GnRH-PE40基因為模板，采用PCR方法，通過常規(guī)DNA序列的缺失與突變方法，獲得其它GnRH-PE突變體的編碼基因。將所述編碼基因片段以Ndel、EcoRI為位點順序插入到測序載體pBSK(Stratagene/>司，貨號212205)中，測序后備用。實施例2GnRH-PE突變體融合蛋白的制備本發(fā)明中，GnRH-PE突變體融合蛋白的制備可通過如下方法完成將所述從實施例1中得到的測序載體上用Ndel、EcoRI雙酶切取下目的基因片段，插入表達(dá)載體中，再把重組表達(dá)載體導(dǎo)入表達(dá)宿主菌中，經(jīng)培養(yǎng)表達(dá)，疏水層析、螯合層析、離子交換層析得到目的蛋白。以下以GnRH-PE突變體融合蛋白GnRH-PE40為例進(jìn)行說明。其它融合蛋白均可按照類似方法制得。1.重組質(zhì)粒？￡120-GnRH-PE40的制備分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶從實施例1制備的載體上切下所述融合蛋白基周，再將該融合蛋白基因片段與經(jīng)Ndel和EcoRI雙酶切質(zhì)粒PET20(NOVAGEN)的回收大片段，18。C在T4連接酶體系中兩段目的基因片段進(jìn)行連接。經(jīng)酶切和序列測定對所得重組子篩選鑒別，得到正確連接的重組質(zhì)粒，命名為PET20-GnRH-PE40。2.含有重組質(zhì)粒PET20-GnRH-PE40的基因工程菌的制備然后用CaClr法轉(zhuǎn)化大腸桿菌RBL21(N0VAGEN公司)，涂布在含有100網(wǎng)/ml氨千青霉素的LB平板，挑選陽性菌落，鑒別含有上述重組質(zhì)粒PET20-GnRH-PE40的轉(zhuǎn)化子。在LA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化子至OD600為0.6-0.8時，加入IPTG0.lmM誘導(dǎo)3-4小時離心收集菌體，8M尿素破菌后15%SDS-PAGE電泳時出現(xiàn)一條43KD左右的蛋白帶，表達(dá)量為35%。經(jīng)PE的單克隆抗體免疫印跡檢定，顯示陽性反應(yīng)。獲得高效表達(dá)GnRH-PE40蛋白的基因工程菌，命名為PET20-GnRH-PE40/RBL21。3.GnRH-PE40的表達(dá)及純化1)搖瓶表達(dá)將如上述制備的含GnRH-PE40蛋白基因的基因工程菌PET20-GnRH-PE40/RBL21，在含100jug/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中搖瓶過夜培養(yǎng)(37°C,200rpm),再按體積比1:30接種至含有100Mg/ml氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)3小時后，加入0.lmMIPTG誘導(dǎo)4小時。收集菌體經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)含GnRH-PE40(43KD)以可溶性表達(dá)為主，表達(dá)量占菌體總蛋白的35%。2)大規(guī)模發(fā)酵表達(dá)a.培養(yǎng)基組成a)種子液培養(yǎng)基(LA):大豆蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化鈉10克/升、卡那霉素50微克/毫升。b)培養(yǎng)基(15升)磷酸氫二鈉315克、磷酸二氫鉀1QQ克、氯化鈉10.05克、氯化銨50克、大豆蛋白胨90克。以上成分一起在罐中滅菌；下面的成分單獨滅菌后加入發(fā)酵罐。硫酸鎂15克、葡萄糖450克、補料(500克/升)葡萄糖。發(fā)酵及誘導(dǎo)表達(dá)i)種子培養(yǎng)從已鑒定的平亞上劃取菌種，接種到50毫升(250毫升的三角瓶)LK中，36°C、200轉(zhuǎn)/分、8小時后將這50毫升種子液轉(zhuǎn)接到700毫升LK中，36。C、200轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)過夜。ii)發(fā)酵及誘導(dǎo)表達(dá)過程將培養(yǎng)好的種子液(OD600=3-4)加入罐中，調(diào)好各參數(shù)，36°C、150轉(zhuǎn)、溶氧100%，開始發(fā)酵；5小時后開始以2.5速流加2小時，約加入800毫升補料，加入1克IPTG誘導(dǎo)(四小時)。3)純化的步驟i)破菌取出餅狀凍存的200克菌體，用1600mL的破菌緩沖液(20mMTris-HC1，pH8，lmMEDTA)進(jìn)行溶解完全，冰浴攪拌15分鐘。離心10000rpm，20min，收集上清。ii)補鹽測量樣品的體積，補加入硫酸銨使之達(dá)到終濃度為0.3M，補加氯化鈉使之達(dá)到終濃度為1M。iii)PhenylSepharoseHP層析層析柱直徑為50mm,高20cm,介質(zhì)約2t)0mL，280nm進(jìn)行監(jiān)測，用5隨Tris-HCl，0.3M匪3(S04)2,1MNaCl，pH8對層析柱進(jìn)行平衡，上一步的樣品進(jìn)行上樣，然后再用上述溶液平衡至基線后，用50mMTris-HC1，0.5MNaCl，pH8進(jìn)行洗脫，收集蛋白洗脫峰。以上流速均為20ml7min。iv)ChelatingSepharoseFastFlow層析緩沖液A:20mMPB，pH7.4，0.5MNaCl緩沖液B:20mMPB，pH7.4，0.5MNaCl，50mM咪唑。層析柱直徑為35mm，高20cm,介質(zhì)約lOOmL，280nm監(jiān)測。首先水洗，然后用1%硫酸銅溶液通過層析柱，待介質(zhì)結(jié)合完全銅離子之后，水洗，緩沖液A平衡5個柱體積，然后上一步的樣品直接上樣，之后再平衡至基線，然后進(jìn)行線形梯度洗脫，100°/"到100%B，20個柱體積。收集目的蛋白洗脫峰。以上流速均為15mL/min。v)QSepharoseHP層析緩沖液A:20mMPB，pH7.4。緩沖液B:20mMPB，pH7.4，0.5MNaCl，。層析柱直徑為26mm，高20cm,介質(zhì)約60毫升。緩沖液A平衡，上樣，然后再平衡，之后進(jìn)行線形梯度洗脫，100%A到100。/。B，10個柱體積。收集目的蛋白洗脫峰。以上流速均為15mL/min。通過以上步驟，200g菌體可以得到大約200mg目的蛋白純品。4).質(zhì)量檢測通過SDS-PAGE電泳和反相HPLC檢測，得到的目的蛋白純度大于95%。實施例3GnRH-PE其他突變體融合蛋白的制備按照上述實施例2制備方法，分別構(gòu)建并獲得了高效表達(dá)GnRH-PE40KDEL、6Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE39KDEL和GnRH-PE38蛋白的基因工程菌，命名為PET20-6Ala-GnRH-PE40KDEL/RBL21、PET20-GnRH-PE39K亂/RBL21、PET20-GnRH-PE38/RBL21、PET20-GnRH-PE40KDEL/RBL21。利用上述基因工程菌，得到純度大于95%的目的蛋白GnRH-PE40KDEL、6Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE39KDEL和G週-PE38。實施例4GnRH-PE突變體融合蛋白GnRH-PE40對4艮屑病的治療效果1、材料70只健康成年豚鼠(體質(zhì)量300~400g,雌雄不限)，5%心得安乳劑由北京諾思蘭德生物技術(shù)有限責(zé)任公司配制，試驗樣品GnRH-PE40按照實施例1所述方法制備。2、方法2.1、豚鼠銀屑病樣模型制備實驗動物隨機(jī)分為模型組和模型對照組共兩組，其中模型組60只實驗動物，應(yīng)用5%心得安乳劑均勻外涂雙耳背皮膚，每日4次，連續(xù)涂4周(參見"心得安涂藥造成豚鼠耳部銀屑病樣病理變化"，中華皮膚雜志，1991，24(2):9697;抗角蛋白自身抗體對豚鼠銀屑病樣模型的影響，中國皮膚性病學(xué)雜志2002年3月第16巻第2期73-5)。模型對照組IO只實驗動物，用單純?nèi)閯┩磕p耳背皮膚，每日4次，連續(xù)涂4周。每周分別隨機(jī)取模型組與模型對照組6只豚鼠耳廓標(biāo)本，石蠟包埋，HE染色，觀察組織學(xué)變化。HE染色將用10y。甲醛溶液固定的標(biāo)本脫水，透明浸蠟后包埋，制作石蠟切片，常規(guī)HE染色.在光鏡下逐一觀察組織學(xué)所見。參考Baker的方法制定組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)，即典型的銀屑病皮損評分在4.0~10.0之間，見表l。17表l組織學(xué)評分方法項目組織學(xué)評夯角質(zhì)層M匿o小膿胂角化不全角化過度1.5分0.5~1.5分(輕重)0.5分表皮層表皮突延伸呈棒狀棘層肥厚顆粒層消失0.5-1.1.0分1.0分分(輕重)真皮層炎性細(xì)胞浸潤乳突上伸扦狀變毛細(xì)血管擴(kuò)張0.5-1.1.0分0.5分分(輕~重)2.2、GnRH-PE突變體融合蛋白GnRH-PE40對豚鼠銀屑病樣模型動物的治療將模型組中的48只豚鼠隨機(jī)分成4組，每組12只。分別施用以下4種不同濃度的融合蛋白GnRH-PE4030ug/kg、GnRH-PE4060ug/kg、GnRH-PE40120ug/kg、溶媒(5%甘露醇、20raM的磷酸緩沖液，pH值7-8)lml/只。采用靜脈注射方式給藥，l次/天，連續(xù)15天。給藥前0天、給藥第15分別取耳廓皮膚標(biāo)本儲存待檢。3結(jié)果3.1豚鼠銀屑病樣模型的制備過程中采集標(biāo)本HE染色結(jié)果正常模型對照組豚鼠皮膚可見菲薄的角質(zhì)層，顆粒層約為1~3層，棘細(xì)胞層約3~5層，基底層為單層柱狀細(xì)胞.真表皮交界較平，真皮內(nèi)有散在少數(shù)單核細(xì)胞浸潤。模型組經(jīng)心得安涂藥3周后大部分標(biāo)本均見到角質(zhì)層角化過度、18表皮層棘層肥厚、真皮層乳突內(nèi)有炎細(xì)胞浸潤，部分標(biāo)本見到廣泛或灶狀角化不全，顆粒層變薄或消失，表皮突延伸呈棒狀，乳突上伸呈桿狀變，毛細(xì)血管擴(kuò)張。我們通過參考Baker評分方法，對每份標(biāo)本逐一進(jìn)行組織學(xué)評分分析.應(yīng)用組織評分法(典型的銀屑病皮損評分在4.0~10.0之間)評分得到，涂藥前組標(biāo)本組織學(xué)評分為O.47±0.18，涂藥4周組標(biāo)本組織學(xué)評分為7.23±0.71，正常模型對照組單純?nèi)閯┩磕ㄇ昂蠼M織學(xué)評分為0.47±0.18，0.38±0.24。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果，涂藥后組與涂藥前組以及正常模型對照組相比較差異顯著(P<0.01)，而對照組涂單純?nèi)閯┣敖M與對照組涂單純?nèi)閯┖蠼M無差異，見表2。表2豚鼠銀屑病模型和對照組樣本的組織學(xué)評分分組組織學(xué)評分涂藥前后比較P模型組涂藥前0.47±0.18-對照組涂單純?nèi)閯┣?.42±0.05-模型組涂藥后7.23±0.71<0.01對照組涂單純?nèi)閯┖?.38±0.240.47上述實驗結(jié)果表明，利用豚鼠可以成功建立的銀屑病模型，可用于治療銀屑病藥物的效果評估。3.2采用不同濃度的GnRH-PE40對豚鼠銀屑病模型治療前后各組標(biāo)本HE染色結(jié)果采用不同濃度的GnRH-PE40對豚鼠銀屑病模型中的模型組豚鼠靜脈注射藥物15天后，GnRH-PE4060ug/kg組與120ug/kg處理組標(biāo)本中，角質(zhì)層角化不全現(xiàn)象基本消失，僅個別處有角化不全改變。表皮層棘細(xì)胞層變薄，多數(shù)出現(xiàn)l~2層顆粒層細(xì)胞，表皮突延伸及乳突上伸、毛細(xì)血管擴(kuò)張等明顯減輕，真皮層乳突內(nèi)僅有少數(shù)炎細(xì)胞浸潤。GnRH-PE4030ug/kg處理組與前述改變相似，但改變較輕，空白對照組組織學(xué)無明顯改變。各組給藥前后組織學(xué)評分見表3。表3不同濃度的GnRH-PE40給藥前后組織學(xué)評分組別處理時評分處理15天后評分PGnRH—PE4030ug/kg組7.33±0.244.38±0.630.000781GnRH-PE4060ug/kg組7.38±0.732.15±0.758.58E-06GnRH—PE40120ug/kg組7.46士0.461.42±0.536.38E-10空白對照組7.42±0.396.88土0.370.267819由上述結(jié)果可知，30ug/kg組、60ug/kg組和120ug/kg組GnRH-PE40均有改善銀屑病癥狀的效果，隨著給藥濃度增加，改善銀屑病癥狀的效果也明顯增強。實施例5、GnRH-PE突變體融合蛋白6Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE39KDEL、GnRH-PE38對4艮屑病的治療效果1、材料80只健康成年豚鼠(體質(zhì)量300~400g,雌雄不限)，5%心得安乳劑由北京諾思蘭德生物技術(shù)有限責(zé)任公司配制，試驗樣品GnRH-PE突變體融合蛋白6A1a-GnRH-PE4OKDEL、GnRH-PE4OKDEL、GnRH-PE39KDEL、GnRH-PE38分別按照實施例1所述方法制備獲得。2、方法2.l豚鼠銀屑病樣模型制備參照實施例3所述，將實驗動物隨機(jī)分為模型組和模型對照組共兩組。按照實施例3描述的方式建立豚鼠銀屑病樣模型，通過組織學(xué)評分確認(rèn)所述動物模型適于銀屑病治療效果的評估。2.2、GnRH-PE突變體融合蛋白的施用方案將模型組中的60只豚鼠隨機(jī)分成5組，每組12只，分別施用以下5種GnRH-PE突變體融合蛋白6Ala-GnRH-PE40KDEL60ug/kg、GnRH-PE40KDEL60ug/kg、GnRH-PE39KDEL60ug/kg、GnRH-PE3860ug/kg、溶媒lml/只。采用靜脈注射方式給藥，1次/天，連續(xù)15天。給藥前、給藥第15天時取耳廓皮膚標(biāo)本儲存待檢。3結(jié)果3.1豚鼠銀屑病模型采集標(biāo)本的HE染色結(jié)果正常模型對照組豚鼠皮膚可見菲薄的角質(zhì)層，顆粒層約為1~3層，棘細(xì)胞層約3~5層，基底層為單層柱狀細(xì)胞.真表皮交界較平，真皮內(nèi)有散在少數(shù)單核細(xì)胞浸潤。模型組經(jīng)心得安涂藥3周后大部分標(biāo)本均見到角質(zhì)層角化過度、表皮層棘層肥厚、真皮層乳突內(nèi)有炎細(xì)胞浸潤，部分標(biāo)本見到廣泛或灶狀角化不全，顆粒層變薄或消失，表皮突延伸呈棒狀，乳突上伸呈扦狀變，毛細(xì)血管擴(kuò)張。我們通過參考Baker評分方法，對每份標(biāo)本逐一進(jìn)行組織學(xué)評分分析。應(yīng)用組織評分法(典型的銀屑病皮損評分在4.0~10.0之間)評分得到，模型組涂藥前標(biāo)本組織學(xué)評分為O.35±0.28，涂藥4周組標(biāo)本組織學(xué)評分為7.81±0.62，正常模型對照組涂單純?nèi)閯┣昂蠼M織學(xué)評分分別為0.41±0.32、0.47±0.11，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理結(jié)果，涂藥后組與涂藥前組以及正常模型對照組相比較差異顯著(P<0.01)，而對照組涂單純?nèi)閯┣敖M與對照組涂單純?nèi)閯┖蠼M無差異，見表4。表4豚鼠銀屑病模型和對照組樣本的組織學(xué)評分分組模型組涂藥前對照組涂單純?nèi)閯┣澳Ｐ徒M涂藥后對照組涂單純?nèi)閯┖蠼M織學(xué)評分0.35±0.280.41±0.327.81±0.620.47±0.11涂藥前后比較P<0.010.46上述實驗結(jié)果表明，利用豚鼠可以成功建立的銀屑病模型，可用于治療銀屑病藥物的效果評估。3.2GnRH-PE突變體融合蛋白施用于豚鼠銀屑病模型前后各組標(biāo)本HE染色結(jié)果按照此前2、2節(jié)中所述的施用方案，將GnRH-PE突變體融合蛋白施用于模型組豚鼠15天后，6Ala-GnRH-PE40KDEL60ug/kg組、GnRH-PE40KDEL60ug/kg組、GnRH-PE39KDEL60ug/kg組以及GnRH-PE3860ug/kg組的標(biāo)本中，角質(zhì)層角化不全現(xiàn)象基本消失，僅個別處有角化不全改變。表皮層棘細(xì)胞層變薄，多數(shù)出現(xiàn)1~2層顆粒層細(xì)胞，表皮突延伸及乳突上伸、毛細(xì)血管擴(kuò)張等明顯減輕，真皮層乳突內(nèi)僅有少數(shù)炎細(xì)胞浸潤?？瞻讓φ战M組織學(xué)無明顯改變。各組給藥前后組織學(xué)評分見表5。表5各組給藥前后組織學(xué)評分<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>由上述結(jié)果可知，GnRH-PE突變體融合蛋白6A1a-GnRH-PE4OKDEL、GnRH-PEWKDEL、GnRH-PE39KDEL、GnRH-PE38均有明顯改善銀屑病癥狀的效果。實施例5、GnRH-PE突變體融合蛋白GnRH-PE40、6Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE39KDEL、GnRH-PE38對鱗片狀皮膚(fsn/fsn)突變鼠模型的治療效果1、材料36只健康成年鱗片狀皮膚(fsn/fsn)突變鼠(雌雄不限)，試驗樣品GnRH-PE40、6Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE39KDEL、GnRH-PE38由北京諾思蘭德生物技術(shù)有限責(zé)任公司根據(jù)實施例生產(chǎn)提供。2、樣品對模型的治療將模型組中的36只豚鼠隨機(jī)分成6組，每組6只。分別對應(yīng)于以下6種處理方案GnRH-PE4060ug/kg、6Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE40KDEL60ug/kg、GnRH-PE39KDEL60ug/kg、GnRH-PE3860ug/kg、溶媒lml/只。采用靜脈注射方式給藥，l次/天，連續(xù)15天。給藥前O天、給藥第15天分別取耳廓皮膚標(biāo)本儲存待檢。石蠟包埋，HE染色，觀察組織學(xué)變化。HE染色將用10%甲醛溶液固定的標(biāo)本脫水，透明浸蠟后包埋，制作石蠟切片，常規(guī)HE染色.在光鏡下逐一觀察組織學(xué)所見。參考Baker的方法制定組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)。3模型治療前后各組標(biāo)本HE染色結(jié)果模型組豚鼠靜脈注射藥物15天后，GnRH-PE4060ug/kg組、6Ala-GnRH-PE40KDEL60ug/kg組、GnRH-PE40KDEL60ug/kg組、GnRH-PE39KDEL60ug/kg組以及GnRH-PE3860ug/kg組標(biāo)本中幾乎都出現(xiàn)下列現(xiàn)象角化不全現(xiàn)象基本消失，僅個別處有角化不全改變。棘細(xì)胞層變薄，多數(shù)出現(xiàn)l~2層顆粒層細(xì)胞，表皮突延伸及乳突上伸、毛細(xì)血管擴(kuò)張等明顯減輕，乳突內(nèi)僅有少數(shù)炎細(xì)胞浸潤?？瞻讓φ战M組織學(xué)無明顯改善，角質(zhì)層角化過度、表皮層棘層肥厚、真皮層乳突內(nèi)有大量炎細(xì)胞浸潤，顆粒層變薄或消失，表皮突延伸呈棒狀，乳突上伸呈杵狀變，毛細(xì)血管擴(kuò)張。各組給藥前后組織學(xué)評分見表6。表6各組給藥前后組織學(xué)評分<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>序列表〈110〉北京諾思蘭德生物技術(shù)有限責(zé)任公司〈120〉GnRH-PE突變體融合蛋白及其用途<1.30>IDC070102<160>19〈170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉10〈212〉PRT<213〉人<400>1GluHisTrp1<210〉2<211>613<212〉PRT<213>人<400>2AlaGluGlu1SerTyrGlyLeu5ArgProGly10LeuAspAlalieLeuGlu50Serlie65ProAsnTrpSerlieLysMetSer130LeuAla145MetGinAlaGinGlyLysLeuAla210TyrArg225ProThrAlaAlaLeuAla35GlyThrLysLeuVal115ProArgProThrVal195GinValValLeuAlaPheAspLeu5LysAspGly'Val20AspThrAsnGlyGlyAsnAspAla55SerAspGlyLeu70ProValArgTyr85AsnTrpLeuVal100PhelieHisGlulieTyrThrlie135AspAlaThrPhe150ThrLeuAlalie165GinProArgArg180LeuCysLeuLeuGinArgCysAsn215LeuAlaGlyAsn230lieSerHisArg245TrpAsnGlu10ArgSerSer25GinGlyVal40LeuLysLeuThrlieArgSerTyrThr'90ProlieGly105LeuAsnAla120GluMetGlyPheValArgSerHisAla170GluLysArg185AspProLeu200LeuAspAspProAlaLysLeuHisPhe250ThrAlaHisGinAlaCysHisCysAlsLysAlsCysVal15ArgMetSerValAspPro30LeuHisTyrSerMetVal45AlalieAspAsnAlaLeu60LeuGluGlyGlyValGlu7580ArgGinAlaArgGlySer95HisGluLysProSerAsn110GlyAsnGinLeuSerHis125AspGluLeuLeuAlaLys140AlaHisGluSerAsnGlu155160GlyValSerValValMet175.TrpSerGluTrpAlaSer190AspGlyValTyrAsnTyr205ThrTrpGluGlyLyslie220HisAspLeuAsplieLys235240ProGluGlyGlySerLeu255LeuProLeuGluThrPheThrArgTyrPro290TrpAsn305SerGlyArgLeuGinGlySerLeu370SerGly385LeuGlyTrpThrGlyTyrSerlie450lieTrp465TyrAlaAlaLeuArgThrArgLeu530ProGlu545His275ValGinGlyAlaThr355ThrAspAspValVal435ValArgGinLeuSer515lieGluArgGlyAlaGluAsnValAlalieAsp<210>3Ser595ArgGlu610260ArgGinValAspLeu340GlyCysAlaGlyGlu420PhePheGlyAspArg500LeuGlyGluThrGly580AlaLeuGinArgAspLeu325ThrAsnProLeuGly405ArgValGlyPheGin485ValThrHisGlyVal565AspLeuLysProLeuGin310GlyLeuAspValLeu390AspLeuGlyGlyTyr470GluTyrLeuProGly550ValLeuProArgVal295ValGluAlaGluAla375GluValLeuTyrVal455lieProValAlaLeu535ArglieAspAspGly280AlalieAlaAlaAla360AlaArgSerGinHis440ArgAlaAspProAla520ProLeuProProTyr600265TrpLeuArglieAla345GlyGlyAsnPhe■Ala425GlyAlaGlyAlaArg505ProLeuGluSerSer585AlaGluTyrAsnArg330GluAlaGluTyrSer410HisThrArgAspArg490SerGluArgThrAla570SerSerGinLeuAla315GluSerAlaCysPro395ThrArgPheSerPro475GlySerAlaLeulie555lielieGinLeuAla300LeuGinGluAsnAla380ThrArgGinLeuGin460AlaArg.LeuAlaAsp540LeuProProProGlu285AlaAlaProArgAla365GlyGlyGlyLeuGlu445AspLeulieProGly525AlaGlyThrAspGly605270GinArgSerGluPhe350AspProAlaThrGlu430AlaLeuAlaArgGly510GlulieTrpAspLys590LysCysLeuProGin335ValValAlaGluGin415GluAlaAspTyrAsn495PheValThrProPro575GluProGlySerGly320AlaArgValAspPhe400AsnArgGinAlaGly480GlyTyrGluGlyL_eu560ArgGinPro<formula>formulaseeoriginaldocumentpage26</formula>AlaArg50AlaSer65ProGluArgPheAlaAspGlyPro130GlyAla145GlyThrLeuGluGluAlaAspLeu210LeuAla225lieArgProGlyGlyGluAlalie290GlyTrp305ThrAspAspLysGlyLysLeuProGinValVal115AlaGluGinGluAla195AspTyrAsnPheVal275ThrProProGluPro355SerGlyAlaArg100ValAspPheAsnArg180GinAlaGlyGlyTyr260GluGlyLeuArgGin340ProTrpSerArg85GinSerSerLeuTrp165GlySerlieTyrAla245ArgArgProAlaAsn325AlaArg<210〉11<211>345<212〉PRT<213>人工序列〈400〉11GlyGlySerLeu1AsnGly70LeuGlyLeuGlyGly150ThrTyrlieTrpAla230LeuThrLeuGluGlu310VallieGluGin55GlyAlaThrThrAsp135AspValValValArg215GinLeuSerlieGlu295ArgGlySerAspValAspLeuGlyCys120AlaGlyGluPhePhe200GlyAspArgLeuGly280GluThrGlyAlaLeu360AspGinVallie60LeuGlyGluAla75ThrLeuAlaAla90AsnAspGluAla105ProValAlaAlaLeuLeuGluArg140GlyAspValSer155ArgLeuLeuGin170ValGlyTyrHis185GlyGlyValArgPheTyrlieAla220Gin—GluProAsp235ValTyrValPro250ThrLeuAlaAla265HisProLeuProGlyGlyArgLeu300ValValliePro315AspLeuAspPro330LeuProAspTyr345LysArgAsnlieArgAlaGluGlyAla110GlyGlu125AsnTyrPheSerAlaHisGlyThr190AlaArg205GlyAspAlaArgArgSerProGlu270LeuArg285GlirThrSerAlaSerSerAlaSer350AlaLeuGluGin80SerGlu95AlaAsnCysAlaProThrThrArg160ArgGin175PheLeuSerGinProAlaGlyArg240SerLeu255AlaAlaLeuAsplieLeuliePro320liePro335GinProAla5LeuGluThrPheThrAlaArgLeuHisThrArgAlaHisGinAlaCysHis10LeuPro15GinProArgGlyTrpGluGinLeuGluGinAlaArg50AlaSer65ProGluArgPheGlyProGlyAla130GlyThr145LeuGluGluAlaAspLeuLeuAla210lieArg225ProGlyGlyGluAlalieGlyTrp290ThrAsp305AspLysGlyLysCys35LeuProGinValAla115GluGinGluAlaAsp195TyrAsnPheValThr275ProProGluPro20GlySerGlyAlaArg100AspPheAsnArgGin180AlaGlyGlyTyrGlu260GlyLeuArgGin2530Pro340TyrTrpSerArg85GinSerLeuTrpGly165SerlieTyrAlaArg245ArgProAlaAsnAla325ArgProValGinArgLeu40AsnGinValAspGin55GlyGlyAspLeuGly70LeuAlaLeuThrLeu90GlyThrGlyAsnAsp105GlyAspAlaLeuLeu120GlyAspGlyGlyAsp135Thr—ValGluArgLeu150TyrVal'PheValGly170lieValPhe.GlyGly185TrpArgGlyPheTyr200AlaGinAspGinGlu215LeuLeuArgValTyr230ThrSerLeuThrLeu250LeulieGlyHisPro265GluGluGluGlyGly280GluArgThrValVal295ValGlyGlyAspLeu310lieSerAlaLeuPro330GluAspLeuLys345ValAlaLeuTyrLeuAla45VallieArgAsnAlaLeu60GluAlalieArgGluGin7580AlaAlaAlaGluSerGlu95GluGluValLeu155TyrVallieProVal.235AlaLeuArglieAsp315AspAlaGlyAlaAlaAsn110ArgAsnTyrProThr125SerPheSerThrArg140GinAlaHisArgGin160HisGlyThrPheLeu175ArgAlaArgSerGin190AlaGlyAspProAla205AspAlaArgGlyArg220ProArgSerSerLeu240AlaProGluAlaAla255ProLeuArgLeuAsp270LeuGluThr285ProSerAla300ProSerSerlieLeulieProliePro320TyrAlaSerGinPro335<210>12<211>318<212>PRT<213>人工序列<400>12GlyTrpGluGin1LeuGluGinCysGlyTyr510ProValGinArgLeuVal1528AlaLeulieArgAlalie50Al3Alei65AlaGlyArgAsnSerPheGinAla130HisGly145ArgAlaAlaGlyAspAlaProArg210AlaPro225ProLeuLeuGluProSerProSer290TyrAla305TyrAsn35ArgGluAlaTyrSer115HisThrArgAspArg195SerGluArgThrAla275SerSerLeuAlaAlaArg20AlaLeuAlaSerGluGinProGlu55SerGluArgPhe70AlaAsnGlyPro85Pro'ThrGlyAla100ThrArg.GlyThrArgGinLeUGlu■135PheLeuGluAla150SerGinAspLeu165ProAlaLeuAla180GlyArglieArgSerLeuProGly215AlaAlaGlyGlu230LeuAspAlalie245lieLeuGlyTrp260lieProThrAsplieProAspLys295GinProGlyLys310<210>13<211>334<212〉PRT<213>人工序列<400>13GlyTrpGluGinLeuGluGin15LeuSerTrpAsn25ProGlySerGly40GinAlaArgLeuValArgGinGly75AlaAspSerGly90GluPheLeuGly105GinAsnTrpThr120GluArgGlyTyrAlaGinSerlie155AspAlalieTrp170TyrGlyTyrAla185AsnGlyAlaLeu200PheTyrArgThrValGluArgLeu235ThrGlyProGlu250ProLeuAlaGlu265ProArgAsnVal280GluGinAlalieProProArgGlu315GinValGlyAsp45AlaiLeu60ThrGlyAspAlaA印GlyValGlu125ValPhe140ValPheArgGlyGinAspLeuArg205SerLeu220lieGlyGluGluArgThrGlyGly285SerAla300AspLeuAsp30LeuThrAsnLeuGly110ArgValGlyPheGin190ValThrHisGlyVal270AspLeuLysGinValGlyGluLeuAlaAspGlu80LeuGlu95AspValLeuCeuGlyTyrGlyVal160Tyrlie175GluProTyrValLeuAlaProLeu240GlyArg255VallieLeuAspProAspCysGlyTyrPro10AlaLeuTyrLeuAlaAlaArgLeuSerTrpAsn2025ValGinGinValArgAsp30LeuVal15GinVallieAlaAla65AlaAlaArgSerGin145HisArgAlaAspPro225AlaProLeuProPro305TyrArglie50AlaGly.GlyAsnPhe130AlaGlyAlaGlyAla210ArgProLeuGluSer290SerAlaAsnAla35ArgGluGluSerAlaAlaGluCys100TyrPro115SerThrHisArgThrPheArgSer180AspPro195ArgGlySerSerGluAlaArgLeu260Thrlie275AlalieSerlieSerGinLeuGinGluAsn85AlaThrArgGinLeu165GinAlaArgLeuAla245AspLeuProProPro325AlaSerProGlySerGlyGlyAspLeuGlyGlu4045ProGluGinAlaArgLeuAlaLeuThrLeuAla5560ArgPheValArgGinGlyThrGlyAsnAspGlu707580AlaAspValValSerLeuThrCysProValAla9095GlyProAlaAspSerGlyAspAlaLeuLeuGlu105110GlyAlaGluPheLeuGlyAspGlyGlyAspVal120125GlyThrGinAsnTrpThrValGluArgCeuLeu135140LeuGluGluArgGlyTyrValPheValGlyTyr150,155160GluAlaAlaGinSerlieValPheGlyGlyVal170175AspLeuAspAlalieTrpArgGlyPheTyrlie185190LeuAlaTyrGlyTyrAlaGinAspGinGluPro200205lieArgAsnGlyAlaLeuLeuArgValTyrVal215220ProGlyPheTyrArgThrSerLeuThrLeuAla230235240GlyGluValGluArgLeulieGlyHisProLeu250255AlalieThrGlyProGluGluGluGlyGlyArg265270GlyTrpProLeuAlaGluArgThrValVallie280285ThrAspProArgAsnValGlyGlyAsp丄euAsp295300AspLysGluGinAlalieSerAlaLeuProAsp310315—320GlyLysProProArgGluAspLeuLys330<210>14<211〉354<212>PRT<213>人工序列<400>14GlyGlySerLeu1LeuGluThrPhe20GluGinCysGlyAla5ThrTyrAlaLeuThrAlaHisGinAlaCysHisLeuPro1015ArgHisArgGinProArgGlyTrpGluGinLeu2530ProValGinArgLeuValAlaLeuTyrLeuAlaAlaAla65ProArgCysAlaGly145GluPhePheGlyAsp225ArgLeuGlyGluThr305GlyAlaLeuArg50SerGluPheProLeu130GlyArgValGlyPhe210GinValThrHisGly290ValAspLeuLys35LeuProGinValVal115LeuAspLeuGlyGly195TyrGluTyrLeuPro275GlyValLeuProSerGlyAlaArg100AlaGluValLeuTyr180VallieProValAla260LeuArglieAspAsp340TrpSerArg85GinAlaArgSerGin165HisArgAlaAspPro245AlaProLeuProPro325Tyr40AsnGinValAsp55GlyGlyAspLeu70LeuAlaLeuThrGlyThrGlyAsn105GlyGluCysAla120AsnTyrProThr135PheSerThrArg150Ala'HisArgGinGlyThr'PheLeu185AlaArgSer.Gin200GlyAspProAla215AlaArgGlyArg230ArgSerSerLeuProGluAlaAla265LeuArgLeuAsp280GluThrlieLeu295SerAlaliePro310SerSerlieProAlaSerGinPro345GinGlyLeu90AspGlyGlyGlyLeu170GluAspLeuliePro250GlyAlaGlyThrAsp330GlyValGlu75AlaAspProAlaThr155GluAlaLeuAlaArg235GlyGlulieTrpAsp315LysLyslie60AlaAlaValAlaGlu140GinGluAlaAspTyr220AsnPheValThrPro300ProGluPro45ArglieAlaValAsp125PheAsnArgGinAla205GlyGlyTyrGluGly285LeuArgGinProAsnArgGluSer110SerLeuTrpGlySer190lieTyrAlaArgArg270ProAlaAsnAlaArg350AlaGluSer95LeuGlyGlyThrTyr175lieTrpAlaLeuThr255LeuGluGluVallie335GluLeuGin80GluThrAspAspVal160ValValArgGinLeu240SerlieGluArgGly320SerAsp<210>15<211>376<212>PRT<213>人工序列<400〉15GluHisTrpSer1TyrGlyLeuArgProGlyHisMetAlaGluGluGly51015GlySerLeuAlaAlaLeuThrAlaHisGinAlaCysHisLeuProLeu202530GluThrPheThrArgHisArgGinProArgGlyTrpGluGinLeuGlu354045GinCysGlyTyrProValGinArgLeuValAlaLeuTyrLeuAlaAla505560ArgLeuSerTrpAsnGinValAspGinVallieArgAsnAlaLeuAla65707580SerProGlySerGlyGlyAspLeuGlyGluAlalieArgGluGinPro859095GluGinAlaArgLeuAlaLeuThrLeuAlaAlaAlaGluSerGluArg100105110PheValArgGinGlyThrGlyAsnAspGluAlaGlyAlaAlaAsnAla115120125AspValValSerLeuThrCysProValAlaAlaGlyGluCysAlaGly130135140ProAlaAspSerGlyAspAlaLeuLeuGluArgAsnTyrProThrGly145150155160AlaGluPheLeuGlyA印GlyGlyAspValSerPheSerThrArgGly165170175ThrGinAsnTrpThrValGluArgLeuLeuGinAlaHisArgGinLeu180185190GluGluArgGlyTyrValPheValGlyTyrHisGlyThrPheLeuGlu195200205AlaAlaGinSerlieValPheGlyGlyValArgAlaArgSerGinAsp210215220LeuAspAlalieTrpArgGlyPheTyrlieAlaGlyAspProAlaLeu225230235240AlaTyrGlyTyrAlaGinAspGinGluProAspAlaArgGlyArglie245250255ArgAsnGlyAlaLeuLeuArgValTyrValProArgSerSerLeuPro260265270GlyPheTyrArgThrSerLeuThrLeuAlaAlaProGluAlaAlaGly275280285GluValGluArgLeulieGlyHisProLeuProLeuArgLeuAsp—Ala290295300lieThrGlyProGluGluGluGlyGlyArgLeuGluThrlieLeuGly305310315320TrpProLeuAlaGluArgThrValVallieProSerAlalieProThr325330335AspProArgAsnValGlyGlyAspLeuAspProSerSerlieProAsp340345350LysGluGinAlalieSerAlaLeuProAspTyrAlaSerGinProGly355360365LysProProArgGluAspLeuLys370375說明書第28/33頁<210>16<211>375<212>PRT〈213>人工序列〈400〉16GluHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGlyHis1510GlySerLeuAlaAlaLeuThrAlaHisGinAla2025GluThrPheThrArgHisArgGinProArgGly3540GinCysGlyTyrProValGinArgLeuValAla5055ArgLeuSerTrpAsnGinValAspGinVallie657075SerProGlySerGlyGlyAspLeuGlyGluAla85■■恥GluGinAlaArgLeuAlaLeuThrLeuAlaAla100105PheValArgGinGlyThrGlyAsnAspGluAla115120AspValValSerLeuThrCysProValAlaAla130135ProAlaAspSerGlyAspAlaLeuLeuGluArg145150155AlaGluPheLeuGlyAspGlyGlyAspVal—Ser165170ThrGinAsnTrpThrValGluArgLeuLeuGin180185GluGluArgGlyTyrValPheValGlyTyrHis195200AlaAlaGinSerlieValPheGlyGlyValArg210215LeuAspAlalieTrpArgGlyPheTyrlieAla225230235AlaTyrGlyTyrAlaGinAspGinGluProAsp245250ArgAsnGlyAlaLeuLeuArgValTyrValPro260265GlyPheTyrArgThrSerLeuThrLeuAlaAla275280GluValGluArgLeulieGlyHisProLeuPro290295lieThrGlyProGluGluGluGlyGlyArgLeu305310315TrpProLeuAlaGluArgThrValValliePro325330MetAlaGluGluGly15CysHisLeuProLeu30TrpGluGinLeuGlu45LeuTyrLeuAlaAla60ArgAsnAlaLeuAla80lieArgGluGinPro95AlaGluSerGluArg110GlyAlaAlaAsnAla125GlyGluCysAlaGly140AsnTyrProThrGly160PheSerThrArgGly175■AlaHisArgGinLeu190Gly'ThrPheLeuGlu205AlaArg'SerGinAsp220GlyAspPro.AlaLeu240AlaArgGlyArglie255'ArgSerSerLeuPro270ProGluAlaAlaGly285LeuArgLeuAspAla300GluThrlieLeuGly320SerAlalieProThr335AspProArgAsnValGlyGly340LysGluGinAlalieSerAla355AspLeu360Leu345ProAspProSerSerAspTyrAlaSer365lieProAsp350GinProGlyLysProProLys370<210>17<211>375<212〉PRT<213〉人工序列<400>17GluHisTrpSer1AspGluLeu375GlySerLeuGluThrPhe35GinCysGly50ArgLeuSer65SerProGlyGluGinAlaPheValArg115AspValVal130ProAlaAsp145AlaGluPheThrGinAsnGluGluArg195AlaAlaGin210LeuAspAla225AlaTyrGlyArgAsnGlyGlyPheTyr275GluValGluTyrAlaLeu5Ala20ThrTyrTrpSerArg100GinSerSerLeuTrp180GlySerlieTyrAla260ArgArgAlaLeuArgHisProValAsnGin70GlyGly85LeuAlaGlyThrLeuThrGlyAsp150GlyAsp165ThrValTyrVallieValTrpArg230AlaGin245LeuLeuThrSerLeulieThrArgGin55ValAspLeuGlyCys135AlaGlyGluPhePhe215GlyAspArgLeuGlyArgAlaGin40Arg■AspLeuThrAsn120ProLeuGlyArgVal200GlyPheGinValThr280HisProHis25ProLeuGinGlyLeu105AspValLeuAspLeu185GlyGlyTyrGluTyr265LeuProGlyHisMet10GinAlaCysArgGlyTrpValAlaLeu60VallieArg75GluAlalie90AlaAlaAlaGluAlaGlyAlaAla.Gly140GluArgAsn155ValSerPhe170LeuGinAlaTyrHisGlyValArgAla220lieAlaGly235ProAspAla250ValProArgAlaAlaProLeuProLeuAlaHisGlu45TyrAsnArgGluAla125GluTyrSerHisThr205ArgAspArgSerGlu285ArgGluLeu30GinLeuAlaGluSer110AlaCysProThrArg190PheSerProGlySer270AlaLeuGluGly15ProLeuLeuGluAlaAlaLeuAla80GinPro95GluArgAsnAlaAlaGlyThrGly160ArgGly175GinLeuLeuGluGinAspAlaLeu240Arglie255LeuProAlaGlyAspAla34290lieThr305TrpProAspProLysGluLysPro370295GlyProGluGluGluGly310LeuAlaGluArgThrVal325ArgAsnValGlyGlyAsp340GinAlalieSerAla355Leu360GlyArgVallie330LeuAsp345ProAspProLysAspGluLeu375<210〉18<211〉368<212>PRT<213>人工序列〈400〉18GluHisTrp1GlySerGluThrGinCys50ArgLeu65SerProGluGinPheValProVal130LeuLeu145GlyAspArgLeuValGlyGlyGly210PheTyr225GinGluLeuPhe35GlySerGlyAlaArg115AlaGluValLeuTyr195VallieProSerAla20ThrTyrTrpSerArg100GinAlaArgSerGin180HisArgAlaAspLeu315ProProTyrTyrGlyLeuArgProGly510AlaLeuThrAlaHisGin25ArgHisArgGinProArg40ProValGinArgLeuVal55AsnGinValAspGinVal70GlyGlyAspLeuGlyGlu8590LeuAlaLeuThrLeuAla105GlyThrGlyAsnAspAsp120GlyGluCysAlaGlyPro135AsnTyrProThrGlyAla150PheSerThrArgGlyThr165170AlaHisArgGinLeuGlu185GlyThrPheLeuGluAla200AlaArgSerGinAspLeu215GlyAspProAlaLeuAla230AlaArgGlyArglieArg245250300GluThrlieSerAlalieSerSerlie350AlaSerGin365LeuGly320ProThr335ProAspProGlyHisAlaGlyAlalie75AlaAlaValAlaGlu155GinGluAlaAspTyr235AsnMetCysTrpLeu60ArglieAlaValAsp140PheAsnArgGinAla220GlyGlyAlaGluGluGly15HisLeuProLeu30GluGinLeuGlu45TyrLeuAlaAlaAsnAlaLeuAla80ArgGluGinPro95GluSerGluArg110SerLeuThrCys125SerGlyAspAlaLeuGlyAspGly160TrpThrVal'Glu175GlyTyrValPhe■190SerlieValPhe205lieTrpArgGlyTyrAlaGinAsp240AlaLeuLeuArg255ThrAsp330AspLys345GlyLysValTyrValProArgSerSerLeuProGly260265ThrLeuAlaAlaProGluAlaAlaGlyGlu275280HisProLeuProLeuArgLeuAspAlalie290295GlyGlyArgLeuGluThrlieLeuGlyTrp305310ValVallieProSerAlaliePro325AspLeuAspPrcrSerSerliePro340LeuProAspTyrAlaSerGinPro355360〈210〉19<211〉360<212〉PRT<213>人工序列<400>19GluHisTrpSerTyrGlyLeuArgProGly1510GlySerLeuAlaAlaLeuThrAlaHisGin2025GluThrPheThrArgHisArgGinProArg3540GinCysGlyTyrProValGinArgLeuVal5055ArgLeuSerTrpAsnGinValAspGinVaJ6570SerProGlySerGlyGlyAspLeuGlyGlu8590GluGinAlaArgLeuAlaLeuThrLeuAla100105PheValArgGinGlyThrGlyAsnA印Glu115120ProAlaAspSerGlyAspAlaLeuLeuGlu130135AlaGluPheLeuGlyAspGlyGlyA印Val145150ThrGinAsnTrpThrVaJGluArgLeuLeu165170GluGluArgGlyTyrValPheValGlyTyr180185AlaAlaGinSerlieValPheGlyGlyVal195200LeuAspAlalieTrpArgGlyPheTyrlie210215PheTyrArgValGluArg285ThrGlyPro300ProLeuAla315ProArgAsnGluGinAlaProProLys365ThrSerLeu270LeulieGlyGluGluGluGluArgThr320ValGlyGly335lieSerAla350AspGluLeuHisMetAlaAlaCysHisGlyTrpGlu45■AlaLeuTyr60lieArgAsn75Alalie'ArgAlaAlaGlu-AlaGlyAla125ArgAsnTyr140SerPheSer155GinAlaHisHisGlyThrArgAlaArg205AlaGlyAsp220GluGluGly15CeuProLeu30GinLeuGluLeuAlaAlaAlaLeuAla80GluGinPro95SerGluArg110Ala.AsnGlyProThfGlyThrArgGly160ArgGinLeu175PheLeuGlu190SerGinAspProAlaLeuAla225ArgGlyGlulieTrp305AspLysLysTyrAsnPheValThr290ProProGluProGlyGlyTyrGlu275GlyLeuArgGinPro355TyrAlaArg260ArgProAlaAsnAla340ArgAlaLeu245ThrLeuGluGluVal325lieGluGin230LeuSerlieGluArg310GlySerAspAspArgLeuGlyGlu295ThrGlyAlaLeuGinValThrHis280GlyValAspLeuLys360GluTyrLeu265ProGlyValLeuPro345ProAsp235ValPro250AlaAlaLeuProArgLeuAlsArgArgSerProGluLeuArg285GluThr300liePro315SerAlaSerSerAspTyrAlaSerAspPro330GlySerAla270LeulielielieGin350ArgLeu255AlaAspLeuProPro335Prolie240ProGlyAlaGlyThr320AspGly權(quán)利要求1、GnRH-PE突變體融合蛋白用于制備治療銀屑病的藥物的用途，其中所述GnRH-PE突變體融合蛋白選自1)GnRH突變體的C-末端與PE突變體的N-末端通過接頭序列以肽鍵相連形成的融合蛋白LLP，即GnRH突變體-接頭序列-PE突變體；和2)PE突變體的C-末端與GnRH突變體的N-末端通過接頭序列以肽鍵相連形成的突變體融合蛋白PLL，即PE突變體-接頭序列-GnRH突變體；3)具有1)或2)中所述突變體融合蛋白氨基酸序列中一個或幾個氨基酸的插入、缺失和/或替換的變體，前提是所述變體基本上保持1)或2)中所述突變體融合蛋白的生物學(xué)活性；以及4)與1)或2)中所述突變體融合蛋白氨基酸序列具有大于或等于90％序列同一性的變體，前提是所述變體基本上保持1)或2)中所述突變體融合蛋白的生物學(xué)活性；其中所述GnRH突變體是指其氨基末端第一位氨基酸替換成谷氨酸(Glu)的人促黃體生成激素釋放因子突變體；所述接頭序列由0-20個氨基酸所組成，如需要，可不使用所述接頭序列，或選擇使用由3個氨基酸殘基、5個氨基酸殘基、10個氨基酸殘基、15個氨基酸殘基，甚至20個氨基酸殘基組成的接頭序列；所述PE突變體選自a)假單胞菌外毒素A(PE)去掉N末端1-252位氨基酸后形成的缺失突變體PE40；b)將假單胞菌外毒素A(PE)的第253-364位，第381-613位兩段氨基酸序列按原順序相連得到蛋白PE38；c)將假單胞菌外毒素A(PE)的第280-364位，第381-613位兩段氨基酸序列按原順序相連得到蛋白PE35；d)將假單胞菌外毒素A(PE)的第280-613位氨基酸序列的片段蛋白PE37；和e)將假單胞菌外毒素A(PE)的第253-358位，第366-613位兩段氨基酸序列按原順序相連得到蛋白PE39。2、權(quán)利要求l所述的用途，其中所述接頭序列選自-His-Met-Ala-Glu-Glu-(SEQIDNO:3);-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-(SEQIDNO:4);和-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-(SEQIDNO:5)。3、權(quán)利要求1所述的用途，其中所述融合蛋白LLP中，所述PE突變體的C-末端還可以含有2-5個選自-XYEL或-REDLK的重復(fù)片段，即GnRH突變體—接頭序列-PE突變體-(XYEL)n，或GnRH突變體-接頭序列-PE突變體-(REDLK)n，其中n為2-5的整數(shù)；所述片段-XYEL中，X代表賴氨酸(Lys)或精氨酸(Arg)，Y代表天冬氨酸(Asp),谷氨酰胺(Gin)或谷氨酸(Glu)，E代表谷氨酸(Glu)，L代表亮氨酸(Leu);所述片段-REDLK為釆用單字母表示的氨基酸序列片段，其中，R代表精氨酸(Arg)，E代表谷氨酸(Glu)，D代表天冬氨酸(Asp),L代表亮氨酸(Leu),K代表賴氨酸(Lys)。4、權(quán)利要求1所述的用途，其中所述融合蛋白PLL中，所述GnRH突變體的C-末端還可以含有2-5個選自-XYEL或-REDLK的重復(fù)片段，即PE突變體-接頭序列-GnRH突變體-(XYEL)n或PE突變體-接頭序列-GnRH突變體-(REDLK)n，其中n為2-5的整數(shù)；所述片段-XYEL和-REDLK的定義如權(quán)利要求2中所述。5、權(quán)利要求l所述的用途，其中所述GnRH突變體進(jìn)一步的在其氨基末端第6位甘氨酸(Gly)任選的突變?yōu)楸彼?Ala)、色氨酸(Trp)或亮氨酸(Leu)。6、權(quán)利要求1所述的用途，其中所述PE突變體進(jìn)一步的在其C—末端的5個氨基酸一Arg-Glu-Asp-Leu-Lys突變?yōu)椤猉YEL。7、權(quán)利要求l所述的用途，其中所述GnRH-PE突變體融合蛋白選自GnRH-PE40、6Ala-GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE40KDEL、GnRH-PE39KDEL和GnRH-PE38。8、權(quán)利要求l所述的用途，其中所述銀屑病選自尋常型銀屑病、膿皰型銀屑病、關(guān)節(jié)病型銀屑病和紅皮病型銀屑病。9、GnRH-PE突變體融合蛋白，其選自1)GnRH-PE39K亂(SEQIDNO:18);2)具有1)中所述突變體融合蛋白氨基酸序列中一個或幾個氨基酸的插入、缺失和/或替換的變體，前提是所述變體基本上保持1)中所述突變體融合蛋白的生物學(xué)活性；以及3)與1)中所述突變體融合蛋白氨基酸序列具有大于或等于90%序列同一性的變體，前提是所述變體基本上保持1)中所述突變體融合蛋白的生物學(xué)活性。全文摘要本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，發(fā)明名稱為GnRH-PE突變體融合蛋白及其用途。具體而言，本發(fā)明涉及新的GnRH-PE突變體融合蛋白，及其用于制備治療銀屑病的藥物的用途。利用豚鼠銀屑病樣動物模型，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用所述GnRH-PE突變體融合蛋白，能夠有效治療銀屑病，包括尋常型銀屑病、膿皰型銀屑病、關(guān)節(jié)病型銀屑病與紅皮病型銀屑病。文檔編號A61K38/16GK101433713SQ20071018791公開日2009年5月20日申請日期2007年11月15日優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日發(fā)明者聶李亞,許松山,馬素永申請人:北京諾思蘭德生物技術(shù)有限責(zé)任公司