專利名稱：鹽酸替絡(luò)歐及其化學(xué)類似物在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鹽酸替絡(luò)歐及其化學(xué)類似物的一種新用途，特別是涉及它們在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝纖維化是指肝臟纖維結(jié)締組織的過度沉積，是纖維增生和纖維分解不平衡的結(jié)果。肝纖維化是多種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，其主要表現(xiàn)為肝組織內(nèi)細胞外基質(zhì)的過度沉積，分布異常，近年認為是細胞外基質(zhì)、特別是膠原合成的增加、降解減少。纖維增生是機體對于損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，各種病因所致反復(fù)或持續(xù)的慢性肝實質(zhì)炎癥、壞死可導(dǎo)致肝臟持續(xù)不斷的纖維增生而形成肝纖維化，從許多慢性肝病，特別是慢性病毒性肝炎的臨床及病理演變來看，肝纖維化和肝硬化是連續(xù)的發(fā)展過程，二者難以截然分開。一個人只要患有慢性肝病，必然伴有肝纖維化，如不及時治療將持續(xù)發(fā)展，直到引起肝硬化乃至死亡。調(diào)查顯示，肝硬化占據(jù)國際上疾病死亡病因的第六位?；诟卫w維化帶來的危害之重，國際現(xiàn)代肝臟病學(xué)的奠基人漢斯·鮑勃曾指出“誰能預(yù)防和治療肝纖維化，誰就能治愈大多數(shù)慢性肝病。”在國際上，“肝纖維化”一直是不可解的世界性醫(yī)學(xué)難題20世紀(jì)80年代前，肝纖維化被公認為“不可逆轉(zhuǎn)”；20世紀(jì)90年代起，病理學(xué)研究的進展提示肝纖維化“可逆轉(zhuǎn)”，趨向恢復(fù)正常。
化學(xué)合成藥2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴肟-9二鹽酸鹽(2.7-Bis[2-(biethylamino)ethoxy]fluorene-9-oxime Dihydrochloride)，分子式為C25H35N3O3.2HCl，分子量為498.49，商品名為鹽酸替絡(luò)歐，又稱矽寧。中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病研究所程玉海等完成國家科技攻關(guān)計劃項目新藥鹽酸替絡(luò)歐治療矽肺臨床試治研究，表明鹽酸替絡(luò)歐可以改善矽肺患者的臨床癥狀，提高機體免疫力，增強肺通氣功能，并延緩矽肺病變進展的療效作用。并且，該藥引起的臨床不良反應(yīng)不明顯，臨床應(yīng)用安全，對小鼠、大鼠和狗的毒性實驗以及Ames實驗表明，鹽酸替絡(luò)歐毒性低，無誘發(fā)突變和染色體畸變的副作用。另外，宋志芳等也報道了鹽酸替絡(luò)歐試驗性治療矽肺的臨床療效(矽寧治療矽肺的二年臨床療效觀察，職業(yè)衛(wèi)生與病傷1997，12(3)143-145)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供鹽酸替絡(luò)歐及其活性化學(xué)類似物的一種新用途。
本發(fā)明所提供的鹽酸替絡(luò)歐及其活性化學(xué)類似物的新用途，是它們在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
所述鹽酸替絡(luò)歐的活性化學(xué)類似物為2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴.二鹽酸鹽或2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9二鹽酸鹽。
所述抗肝纖維化藥物是以鹽酸替絡(luò)歐和/或其活性化學(xué)類似物為有效成分制備得到。
所述抗肝纖維化藥物的成人口服用量10-100mg有效成分(鹽酸替絡(luò)歐)/60kg體重/次，每天服一次，優(yōu)選為50mg有效成分(鹽酸替絡(luò)歐)/60kg體重/次。所述2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽(作為抗肝纖維化藥物的有效成分)的口服用量為10-100mg/60kg體重/次；所述2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽(作為抗肝纖維化藥物的有效成分)的口服用量為10-100mg/60kg體重/次。所述2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽(作為抗肝纖維化藥物的有效成分)和2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽(作為抗肝纖維化藥物的有效成分)的口服用量均優(yōu)選為50mg/60kg體重/次。
在制備所述抗肝纖維化藥物的時候，還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的輔料(載體)，所述輔料包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進劑、表面活性劑、潤滑劑、穩(wěn)定劑等，必要時還可加入香味劑、甜味劑及色素等制成各種不同的劑型；所述抗肝纖維化藥物的劑型可為膠囊、片劑(含包糖衣片等)、散(粉)劑、粒劑、丸劑、沖劑、口服液、注射液、輸液劑、噴霧劑、凝膠劑、混懸劑、緩釋制劑和控釋制劑等多種藥物形式，總之，藥學(xué)上可接受的劑型對本發(fā)明的藥物都是適用的。上述各種劑型的藥物均可按藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。
通過細胞水平和實驗動物的藥效和毒性實驗，表明以鹽酸替絡(luò)歐為有效成分的抗肝纖維化藥物，可預(yù)防和治療肝纖維化。通過肝纖維化實驗動物模型實驗的肝臟組織病理學(xué)觀察和血清學(xué)檢測的數(shù)據(jù)表明，該抗肝纖維化藥物能顯著改善小鼠實驗性肝纖維化程度。細胞學(xué)實驗顯示，抗肝纖維化藥物能顯著抑制人肝臟星形細胞系LX-2細胞的增殖，并顯著抑制與肝纖維化密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrixmetalloproteinases-2，MMP-2)與組織金屬蛋白酶抑制因子-1(Tissue inhibitorof metalloproteinase-1，TIMP-1)mRNA的細胞表達。
鹽酸替絡(luò)歐及其活性化學(xué)類似物作為預(yù)防和治療肝纖維化的藥物的有效成分，具有以下優(yōu)點1)抑制和改善肝纖維化效果顯著；2)毒性低、安全性高；3)用藥方便；4)制備該藥物的成本較低，從而可減輕病人的經(jīng)濟負擔(dān)。鹽酸替絡(luò)歐及其活性化學(xué)類似物可能成為一種有很好前景的抗肝纖維化新藥。
本發(fā)明的鹽酸替絡(luò)歐及其活性化學(xué)類似物的新用途為制備抗肝纖維化新藥提供了一條新途徑，在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。


圖1為肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察圖2為肝臟組織切片病理學(xué)觀察圖3為各組肝臟組織MMP-2 and TIMP-1 mRNA表達的凝膠電泳4為各組肝臟組織MMP-2 and TIMP-1蛋白表達的Western印跡5為鹽酸替絡(luò)歐對LX-2細胞的增殖的抑制作用圖6為LX-2細胞MMP-2，TIMP-1 mRNA表達的RT-PCR結(jié)果具體實施方式
下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
實施例1、鹽酸替絡(luò)歐抗肝纖維作用的動物實驗以鹽酸替絡(luò)歐直接作為抗肝纖維藥物(即有效成分的質(zhì)量含量為100％)為例，進行如下動物實驗，以鑒定該藥物的藥效和毒性。
鹽酸替絡(luò)歐2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴肟-9·二鹽酸鹽(2.7-Bis[2-(biethylamino)ethoxy]fluorene-9-oxime Dihydrochloride)，分子式為C25H35N3O3.2HCl，分子量為498.49，商品名為鹽酸替絡(luò)歐。鹽酸替絡(luò)歐均由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病研究所藥物合成實驗室提供。將體重18-22g的雄性昆明小鼠96只，分為8組，每組12只，分別為正常對照組(不進行肝纖維化造模，也不用鹽酸替絡(luò)歐處理)，模型對照組(進行肝纖維化造模，不用鹽酸替絡(luò)歐處理)，高劑量處理正常組(不進行肝纖維化造模，用鹽酸替絡(luò)歐按14.6mg/kg的量灌胃處理)、中劑量處理正常組(不進行肝纖維化造模，用鹽酸替絡(luò)歐按7.3mg/kg的量灌胃處理)、低劑量處理正常組(不進行肝纖維化造模，用鹽酸替絡(luò)歐按3.65mg/kg的量灌胃處理)、高劑量處理模型組(進行肝纖維化造模，用鹽酸替絡(luò)歐按14.6mg/kg的量灌胃處理)、中劑量處理模型組(進行肝纖維化造模，用鹽酸替絡(luò)歐按7.3mg/kg的量灌胃處理)、低劑量處理模型組(進行肝纖維化造模，用鹽酸替絡(luò)歐按3.65mg/kg的量灌胃處理)。
其中，肝纖維化實驗動物模型的造模方法為將小鼠，按0.05ml/10g(每只注射0.1-0.2ml)體重，皮下注射30％四氯化碳花生油溶液，每四天注射一次。共注射8周得到肝纖維化動物模型。造模過程中，每次注射四氯化碳后可見動物活動增多，攀越舔毛。注射四氯化碳次日，動物活動均減少，毛蓬松，三天后逐漸恢復(fù)常態(tài)，注射四氯化碳后24小時以內(nèi)，食量和飲水量明顯減少，48小時后增加。注射四氯化碳后24小時，動物體重下降，48-96小時回升。
鹽酸替絡(luò)歐灌胃處理小鼠的方法為肝纖維化造模2周后，將上述8組小鼠，除了正常對照組和模型對照組，其它6組，均進行灌胃鹽酸替絡(luò)歐處理，按照1/40，1/80，1/160 LD50設(shè)置三個藥物濃度組14.6mg/kg(高劑量處理正常組和高劑量處理模型組的灌胃劑量)，7.3mg/kg(中劑量處理正常組和中劑量處理模型組的灌胃劑量)，3.65mg/kg(低劑量處理正常組和低劑量處理模型組的灌胃劑量)，按照10ml/kg灌胃給藥(鹽酸替絡(luò)歐用生理鹽水溶解)，每天灌藥一次，持續(xù)灌胃六周，正常對照組，纖維化模型對照組分別灌胃相同體積的生理鹽水。于第8周處死動物，進行如下檢測。
1)鹽酸替絡(luò)歐處理對肝臟組織纖維化抑制作用的病理學(xué)觀察取步驟1所述各處理組處死的小鼠的肝組織取出，分別用質(zhì)量百分濃度為4％多聚甲醛固定，然后用石蠟包埋，切片，分別采用HE染色或VG染色。然后在光學(xué)顯微鏡(尼康，日本)400(40×10)倍下觀察照相。將纖維組織增生程度分為5個等級，0級無纖維化，肝細胞正常，肝細胞索排列正常；1級纖維結(jié)締組織局限于匯管區(qū)或匯管區(qū)擴大，膠原纖維有輕度延伸，肝索排列較亂；2級膠原纖維從匯管區(qū)或中央靜脈周圍向外延伸較明顯，但未互相包繞整個肝小葉；3級膠原纖維延伸明顯，但未互相包繞整個肝小葉，肝細胞脂肪樣變；4級膠原纖維延伸明顯，互相連接，包繞肝小葉，有假小葉形成，肝正常結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成，以大方形假小葉為主，肝內(nèi)廣泛纖維組織增生。
各組肝臟外觀變化部分結(jié)果如圖1所示，組織病理學(xué)變化見圖2，并根據(jù)上述纖維組織增生程度分級標(biāo)準(zhǔn)，進行評級，它們的纖維化程度見表1。實驗結(jié)果表明，正常對照組和高劑量、中劑量、低劑量處理正常組肝臟外觀光滑鮮潤，組織學(xué)上，肝細胞正常，肝細胞索排列正常，均未出現(xiàn)纖維樣變化和異常的病理變化。模型對照組，均顯示明顯的肝纖維化病變，膠原纖維延伸明顯，部分或完全包繞整個肝小葉，肝細胞脂肪樣變，纖維組織增生程度為3級或4級。而高劑量、中劑量、低劑量處理模型組隨著用藥劑量的升高，病情均有所好轉(zhuǎn)，病變纖維化程度逐漸減輕至二級。
表1 各組動物肝臟不同纖維化程度的動物數(shù)(只)

2)鹽酸替絡(luò)歐處理對肝臟組織纖維化小鼠的血清學(xué)指標(biāo)影響的檢測取步驟1所述的各處理組處死后的小鼠，眼眶取血，分別采用賴氏法測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)等肝功能指標(biāo)，采用競爭性放免分析法測定與肝纖維化密切相關(guān)的透明質(zhì)酸(HA)和IV膠原(CIV)。
各組動物的血清學(xué)指標(biāo)數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示，結(jié)果表明，模型對照組的上述各項肝功能指標(biāo)和HA與CIV均顯著高于正常組，模型對照組顯示了典型的肝纖維化引起的血清學(xué)改變。低、中、高劑量鹽酸替絡(luò)歐處理的正常對照組的上述各項指標(biāo)與正常對照組比較，沒有明顯的差異。在上述各個血清學(xué)指標(biāo)數(shù)據(jù)方面，各劑量鹽酸替絡(luò)歐處理模型組明確地顯示劑量-效應(yīng)的相關(guān)性，低劑量處理模型組的各項指標(biāo)沒有顯著改善，中高劑量處理模型組的各項指標(biāo)均顯著低于模型組，尤其高劑量處理模型組降低更大，反映中高劑量鹽酸替絡(luò)歐處理可以較明顯改善肝纖維化實驗?zāi)Ｐ托∈蟮母卫w維化程度。
表2 各組動物的血清學(xué)指標(biāo)數(shù)據(jù)

注cP＜0.01，相較于正常對照組；fP＜0.01，相較于模型對照組。
3)鹽酸替絡(luò)歐處理對肝臟組織纖維化小鼠的肝臟組織MMP-2(基質(zhì)金屬蛋白酶-2)和TIMP-1(金屬蛋白酶組織抑制因子-1)mRNA的表達量的影響檢測半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(半定量RT-PCR，Semi-quantitative reverse transcriptasepolymerase chain reaction)實驗提取各處理組小鼠肝臟組織總RNA，以MMP-2、TIMP-1和β-actin(內(nèi)參照)各自的引物(用于擴增的引物，MMP-2為5’-GATGTCGCCCCTAAAACAAGA-3’和5’-GCCCAAAGAACTTCTGCATCA-3’；TIMP-1為5’-CTGGCATCCTCTTGTTGCTA-3’和5’-AGGGATCTCCAGGTGCACAA-3’.β-actin為5’-TTCGTGGAT GCCACAGGACT-3’和5’-TCACCAACTGGGACGACATG-3’)，進行半定量RT-PCR，對各組肝臟組織MMP-2 and TIMP-1mRNA的表達予以測試。半定量RT-PCR實驗采用按照TOYOBO公司pervertra Ace-alpha反轉(zhuǎn)錄試劑盒，并按照該試劑盒說明書的程序進行。部分結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明，模型對照組肝臟組織MMP-2和TIMP-1mRNA的表達明顯高于正常對照組，而高劑量(14.65mg/kg鹽酸替絡(luò)歐)處理模型組肝臟組織MMP-2和TIMP-1mRNA的表達顯著低于肝纖維化模型對照組，結(jié)果表明鹽酸替絡(luò)歐能夠降低肝纖維化密切相關(guān)的MMP-2給我TIMP-1mRNA的表達。其中，圖3中a為正常對照組，b為模型對照組，c為高劑量處理模型組。β-actin(β-肌動蛋白)mRNA的表達為參照。
Western印跡實驗按照以抗MMP-2抗體探針的Western印跡實驗，對各組肝臟組織提取液中，未活化(靜息型)的MMP-2和活化的MMP-2的含量予以測試。所采用的兔抗小鼠MMP-2抗體和兔抗小鼠β-actin抗體的第一抗體和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗探針購自美國Calbiochem and Sigma公司。
部分Western印跡圖如圖4所示，結(jié)果表明，模型對照組肝臟組織未活化(靜息型)的MMP-2含量明顯高于正常對照組，并且有活化的MMP-2產(chǎn)生，而14.6mg/kg鹽酸替絡(luò)歐藥物處理組肝臟組織未活化(靜息型)的MMP-2和活化的MMP-2的含量均顯著低于肝纖維化模型對照組，表明，鹽酸替絡(luò)歐能夠抑制與肝纖維化密切相關(guān)的MMP-2尤其活化的MMP-2的產(chǎn)生。其中，圖4中a為正常對照組，b為模型對照組，c為高劑量處理模型組。β-actin mRNA的表達為參照。
實施例2、鹽酸替絡(luò)歐抗肝纖維化的細胞學(xué)實驗1、鹽酸替絡(luò)歐對細胞增殖的影響實驗采用經(jīng)典的四唑鹽(MTT)比色法(Mosmann T，Rapid colorimetric assay forcellular growth and survivalapplication to proliferation and cytotoxicityassays.J.Immunol.Meth.，1983(65)55-63)測定培養(yǎng)的人肝臟星形細胞系LX-2細胞的生長與增殖。人肝臟星形細胞系LX-2細胞接種于96孔板內(nèi)，加鹽酸替絡(luò)歐處理前12h小時換為無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后加入0.016、0.08、0.4、2μmol/L鹽酸替絡(luò)歐處理，48h后，每孔加入5mg/L MTT(購自上海生工院)20μl繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，輕微振蕩10min，紫外分光光度計490nm檢測OD值，顯示細胞的生長與增殖。
結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明，鹽酸替絡(luò)歐能夠劑量依賴性地抑制人肝臟星形細胞系LX-2細胞的增殖。同時平行設(shè)立其它三株非肝臟來源的細胞系(293T，3T3-L1，COS-7細胞系)為對照，按照上述培養(yǎng)方法，用鹽酸替絡(luò)歐處理293T，3T3-L1，COS-7細胞系，結(jié)構(gòu)表明鹽酸替絡(luò)歐對這三株細胞的增殖的抑制作用效果顯著弱于對肝細胞來源的LX-2細胞的作用，表明鹽酸替絡(luò)歐對細胞作用有細胞特異性，對人肝臟星形細胞系細胞增殖的抑制作用明顯。
2、鹽酸替絡(luò)歐對LX-2細胞MMP-2和TIMP-1表達量的影響實驗按步驟1)所述方法培養(yǎng)人肝臟星形細胞系LX-2細胞培養(yǎng)3天后，將培養(yǎng)的人肝臟星形細胞系LX-2細胞分組后，分別加入0μmol/L(對照組)、0.08μmol/L(0.08μmol/L藥物處理組)、0.4μmol/L(0.4μmol/L藥物處理組)或2.0μmol/L(2.0μmol/L藥物處理組)的鹽酸替絡(luò)歐，繼續(xù)孵育48h后過夜，提取各組細胞上清液的總RNA，按照實施例1中步驟3)的方法，以上述MMP-2、TIMP-1和β-actin各自的引物進行半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，對各個加入鹽酸替絡(luò)歐處理組和未加入鹽酸替絡(luò)歐處理的對照組的人肝臟星形細胞系LX-2細胞MMP-2和TIMP-1mRNA的表達予以測試。RT-PCR實驗中，提取細胞總RNA，調(diào)整所有樣品RNA濃度至同一水平，每樣本中取出1μg，按照TOYOBO公司pervertra Ace-alpha反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄，以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模版PCR擴增MMP-2與TIMP-1片段，所用引物為MMP-2上游5’-CACTTTCCTGGGCAACAAAT-3’，下游5’-TGATGTCATCCTGGGACAG A-3’；TIMP-1上游5’-TGCGGATACTTCCACAGGTCC-3’下游5’-TCAGGCTATCTGGGACCGCA-3’；β-actin上游5’-TTCGTGGA TGCCACAGACT-3’下游5’-TCACC AACTGGG ACGACATG-3’。
結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明加入鹽酸替絡(luò)歐處理過LX-2細胞的MMP-2和TIMP-1mRNA的表達明顯低于未加入鹽酸替絡(luò)歐處理組，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，表明，鹽酸替絡(luò)歐能夠抑制LX-2細胞表達與肝纖維化密切相關(guān)的MMP-2和TIMP-1 mRNA。其中，圖6中，1為對照組；2為0.08μmol/L藥物處理組；3為0.4μmol/L藥物處理組；4為2.0μmol/L藥物處理組。
實施例3、鹽酸替絡(luò)歐化學(xué)類似物2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽(C25H34N2O3.2HCl)抗肝纖維化作用的動物實驗以2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽(C25H34N2O3.2HCl)直接作為抗肝纖維藥物(即有效成分的質(zhì)量含量為100％)為例，進行如下動物實驗，以鑒定該藥物的藥效和毒性。
2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽(C25H34N2O3.2HCl)由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病研究所藥物合成實驗室提供。將體重18-22g的雄性昆明小鼠96只，分為8組，每組12只，分別為正常對照組(不進行肝纖維化造模，也不用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽處理)，模型對照組(進行肝纖維化造模，不用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽處理)，高劑量處理正常組(不進行肝纖維化造模，用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽按14.6mg/kg的量灌胃處理)、中劑量處理正常組(不進行肝纖維化造模，用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽按7.3mg/kg的量灌胃處理)、低劑量處理正常組(不進行肝纖維化造模，用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽按3.65mg/kg的量灌胃處理)、高劑量處理模型組(進行肝纖維化造模，用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽按14.6mg/kg的量灌胃處理)、中劑量處理模型組(進行肝纖維化造模，用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽按7.3mg/kg的量灌胃處理)、低劑量處理模型組(進行肝纖維化造模，用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽按3.65mg/kg的量灌胃處理)。
其中，肝纖維化實驗動物模型的造模方法為將小鼠，按0.05ml/10g(每只注射0.1-0.2ml)體重，皮下注射30％四氯化碳花生油溶液，每四天注射一次。共注射8周得到肝纖維化動物模型。造模過程中，每次注射四氯化碳后可見動物活動增多，攀越舔毛。注射四氯化碳次日，動物活動均減少，毛蓬松，三天后逐漸恢復(fù)常態(tài)，注射四氯化碳后24小時以內(nèi)，食量和飲水量明顯減少，48小時后增加。注射四氯化碳后24小時，動物體重下降，48-96小時回升。
2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽灌胃處理小鼠的方法為肝纖維化造模2周后，將上述8組小鼠，除了正常對照組和模型對照組，其它6組，均進行灌胃2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽處理，按照1/40，1/80，1/160LD50設(shè)置三個藥物濃度組14.6mg/kg(高劑量處理正常組和高劑量處理模型組的灌胃劑量)，7.3mg/kg(中劑量處理正常組和中劑量處理模型組的灌胃劑量)，3.65mg/kg(低劑量處理正常組和低劑量處理模型組的灌胃劑量)，按照10ml/kg灌胃給藥(2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽用生理鹽水溶解)，每天灌藥一次，持續(xù)灌胃六周，正常對照組，纖維化模型對照組分別灌胃相同體積的生理鹽水。于第8周處死動物，進行如下檢測。
2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽處理對肝臟組織纖維化抑制作用的病理學(xué)觀察取上述各處理組處死的小鼠的肝組織取出，分別用質(zhì)量百分濃度為4％多聚甲醛固定，然后用石蠟包埋，切片，分別采用HE染色或VG染色。然后在光學(xué)顯微鏡(尼康，日本)400(40×10)倍下觀察照相。將纖維組織增生程度分為5個等級，0級無纖維化，肝細胞正常，肝細胞索排列正常；1級纖維結(jié)締組織局限于匯管區(qū)或匯管區(qū)擴大，膠原纖維有輕度延伸，肝索排列較亂；2級膠原纖維從匯管區(qū)或中央靜脈周圍向外延伸較明顯，但未互相包繞整個肝小葉；3級膠原纖維延伸明顯，但未互相包繞整個肝小葉，肝細胞脂肪樣變；4級膠原纖維延伸明顯，互相連接，包繞肝小葉，有假小葉形成，肝正常結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成，以大方形假小葉為主，肝內(nèi)廣泛纖維組織增生。
根據(jù)上述纖維組織增生程度分級標(biāo)準(zhǔn)，進行評級，它們的纖維化程度見表3。實驗結(jié)果表明，正常對照組和高劑量、中劑量、低劑量處理正常組肝臟外觀光滑鮮潤，組織學(xué)上，肝細胞正常，肝細胞索排列正常，均未出現(xiàn)纖維樣變化和異常的病理變化。模型對照組，均顯示明顯的肝纖維化病變，膠原纖維延伸明顯，部分或完全包繞整個肝小葉，肝細胞脂肪樣變，纖維組織增生程度為3級或4級。而高劑量、中劑量、低劑量處理模型組隨著用藥劑量的升高，病情均有所好轉(zhuǎn)，病變纖維化程度逐漸減輕至二級。
表3.各組動物肝臟不同纖維化程度的動物數(shù)(只)

實施例4、鹽酸替絡(luò)歐化學(xué)類似物2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽(C25H34N2O3.2HCl)抗肝纖維化作用的動物實驗以2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽(C25H34N2O3.2HCl)直接作為抗肝纖維藥物(即有效成分的質(zhì)量含量為100％)為例，進行如下動物實驗，以鑒定該藥物的藥效和毒性。
2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽(C25H34N2O3.2HCl)也由中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院勞動衛(wèi)生與職業(yè)病研究所藥物合成實驗室提供。將體重18-22g的雄性昆明小鼠96只，分為8組，每組12只，分別為正常對照組(不進行肝纖維化造模，也不用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽處理)，模型對照組(進行肝纖維化造模，不用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽處理)，高劑量處理正常組(不進行肝纖維化造模，用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽按14.6mg/kg的量灌胃處理)、中劑量處理正常組(不進行肝纖維化造模，用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽按7.3mg/kg的量灌胃處理)、低劑量處理正常組(不進行肝纖維化造模，用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽按3.65mg/kg的量灌胃處理)、高劑量處理模型組(進行肝纖維化造模，用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽按14.6mg/kg的量灌胃處理)、中劑量處理模型組(進行肝纖維化造模，用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽按7.3mg/kg的量灌胃處理)、低劑量處理模型組(進行肝纖維化造模，用2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽按3.65mg/kg的量灌胃處理)。
其中，肝纖維化實驗動物模型的造模方法為將小鼠，按0.05ml/10g(每只注射0.1-0.2ml)體重，皮下注射30％四氯化碳花生油溶液，每四天注射一次。共注射8周得到肝纖維化動物模型。造模過程中，每次注射四氯化碳后可見動物活動增多，攀越舔毛。注射四氯化碳次日，動物活動均減少，毛蓬松，三天后逐漸恢復(fù)常態(tài)，注射四氯化碳后24小時以內(nèi)，食量和飲水量明顯減少，48小時后增加。注射四氯化碳后24小時，動物體重下降，48-96小時回升。
2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽灌胃處理小鼠的方法為肝纖維化造模2周后，將上述8組小鼠，除了正常對照組和模型對照組，其它6組，均進行灌胃2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽處理，按照1/40，1/80，1/160 LD50設(shè)置三個藥物濃度組14.6mg/kg(高劑量處理正常組和高劑量處理模型組的灌胃劑量)，7.3mg/kg(中劑量處理正常組和中劑量處理模型組的灌胃劑量)，3.65mg/kg(低劑量處理正常組和低劑量處理模型組的灌胃劑量)，按照10ml/kg灌胃給藥(2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽用生理鹽水溶解)，每天灌藥一次，持續(xù)灌胃六周，正常對照組，纖維化模型對照組分別灌胃相同體積的生理鹽水。于第8周處死動物，進行如下檢測。
2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽處理對肝臟組織纖維化抑制作用的病理學(xué)觀察取上述各處理組處死的小鼠的肝組織取出，分別用質(zhì)量百分濃度為4％多聚甲醛固定，然后用石蠟包埋，切片，分別采用HE染色或VG染色。然后在光學(xué)顯微鏡(尼康，日本)400(40×10)倍下觀察照相。將纖維組織增生程度分為5個等級，0級無纖維化，肝細胞正常，肝細胞索排列正常；1級纖維結(jié)締組織局限于匯管區(qū)或匯管區(qū)擴大，膠原纖維有輕度延伸，肝索排列較亂；2級膠原纖維從匯管區(qū)或中央靜脈周圍向外延伸較明顯，但未互相包繞整個肝小葉；3級膠原纖維延伸明顯，但未互相包繞整個肝小葉，肝細胞脂肪樣變；4級膠原纖維延伸明顯，互相連接，包繞肝小葉，有假小葉形成，肝正常結(jié)構(gòu)破壞，假小葉形成，以大方形假小葉為主，肝內(nèi)廣泛纖維組織增生。
根據(jù)上述纖維組織增生程度分級標(biāo)準(zhǔn)，進行評級，它們的纖維化程度見表4。實驗結(jié)果表明，正常對照組和高劑量、中劑量、低劑量處理正常組肝臟外觀光滑鮮潤，組織學(xué)上，肝細胞正常，肝細胞索排列正常，均未出現(xiàn)纖維樣變化和異常的病理變化。模型對照組，均顯示明顯的肝纖維化病變，膠原纖維延伸明顯，部分或完全包繞整個肝小葉，肝細胞脂肪樣變，纖維組織增生程度為3級或4級。而高劑量、中劑量、低劑量處理模型組隨著用藥劑量的升高，病情均有所好轉(zhuǎn)，病變纖維化程度逐漸減輕至二級。
表4.各組動物肝臟不同纖維化程度的動物數(shù)(只)

權(quán)利要求
1.鹽酸替絡(luò)歐及其活性化學(xué)類似物在制備抑制肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述抑制肝纖維化藥物是以鹽酸替絡(luò)歐和/或其活性化學(xué)類似物為有效成分制備的藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述鹽酸替絡(luò)歐的活性化學(xué)類似物為2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述鹽酸替絡(luò)歐的活性化學(xué)類似物為2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物中還含有藥學(xué)上可接受的載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中任意一項所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的劑型為藥學(xué)上可接受的任一一種劑型。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物的劑型為口服制劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述鹽酸替絡(luò)歐作為有效成分的藥物的口服用量為10-100mg鹽酸替絡(luò)歐/60kg體重/次；所述2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴·二鹽酸鹽作為有效成分的藥物的口服用量為10-100mg有效成分/60kg體重/次；所述2.7-雙[2-(二乙氨基)-乙氧基]-芴酮-9·二鹽酸鹽作為有效成分的藥物的口服用量為10-100mg有效成分/60kg體重/次。
全文摘要
本發(fā)明公開了鹽酸替絡(luò)歐及其化學(xué)類似物的一種新用途。該新用途，即鹽酸替絡(luò)歐及其化學(xué)類似物在制備抑制肝纖維化藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明為防治抗肝纖維化提供了一條新途徑，在醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號A61P1/16GK101028257SQ20071006509
公開日2007年9月5日 申請日期2007年4月3日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月3日
發(fā)明者蔡國平, 趙學(xué)文, 張雅鷗 申請人:清華大學(xué)深圳研究生院