專(zhuān)利名稱：：毛蘭素在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及毛蘭素的新用途。
背景技術(shù)：
：癌癥是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病。在全球，癌癥每年大約奪去600萬(wàn)人的生命，并有1000萬(wàn)人處于死亡的邊緣。世界衛(wèi)生組織預(yù)測(cè)21世紀(jì)癌癥將成為人類(lèi)的"第一殺手"。根據(jù)全國(guó)死因回顧調(diào)査表明，20年來(lái)中國(guó)的癌癥發(fā)病和死亡率逐年上升，每5個(gè)因病死亡的人中，就有l(wèi)個(gè)是死于癌癥，每200個(gè)家庭中，有l(wèi)個(gè)家庭因有癌癥病人而遭受磨難。在過(guò)去的幾十年中出現(xiàn)了多種癌癥治療方法，主要包括手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療、激素治療、基因治療和免疫治療。其中，手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)治療己成為主要手段。化學(xué)治療指運(yùn)用化學(xué)藥物來(lái)治療癌癥。化學(xué)藥物治療是腫瘤診療中發(fā)展最快的一個(gè)領(lǐng)域，大量的針對(duì)不同靶點(diǎn)的新藥開(kāi)始應(yīng)用于臨床，對(duì)藥物作用機(jī)制及藥代動(dòng)力學(xué)研究的進(jìn)展，也使臨床給藥途徑與方式更加適合于殺傷腫瘤細(xì)胞、保護(hù)正常組織。目前化學(xué)治療的藥物主要有影響核酸生物合成的藥物(抗代謝物)，如氟尿嘧啶、6-羥基嘌呤、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、羥基脲；直接破壞DNA并阻止其復(fù)制的藥物如烷化劑類(lèi)；抗腫瘤抗生素類(lèi)如順鉑及卡鉑；干擾轉(zhuǎn)錄過(guò)程阻止RNA合成的藥物，如放線菌素D、阿霉素、其他抑制轉(zhuǎn)錄過(guò)程的抗生素；影響蛋白質(zhì)合成的藥物，如長(zhǎng)春堿類(lèi)、鬼臼毒素類(lèi)、三尖杉酯堿、L-門(mén)冬酰胺酶；激素類(lèi)，如腎上腺皮質(zhì)激素、雌激素、雄激素、他莫西芬、氨魯米特。目前常用抗癌化療與放療的方法可造成對(duì)人體不利的嚴(yán)重毒副反應(yīng)。許多天然藥物的干擾微管蛋白聚合或解聚特性，被認(rèn)為是具有抗腫瘤的活性，包括長(zhǎng)春新堿，紫杉垸和大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗腫瘤藥。微管在細(xì)胞分裂中具有重要作用，開(kāi)發(fā)微管蛋白結(jié)合因子是基于他們具有干擾細(xì)胞增殖的能力。微管蛋白的解聚因子，如秋水仙素和長(zhǎng)春新堿，具有抗有絲分裂的作用，導(dǎo)致腫瘤血管閉合。但是這個(gè)使腫瘤血管閉合的作用只能在藥量接近MTD(最高耐受劑量)時(shí)產(chǎn)生。最新被發(fā)現(xiàn)的血管生成抑制因子Endostatin，對(duì)新生血管生成有抑制作用，而對(duì)已形成的血管并沒(méi)有明顯作用，對(duì)腫瘤血管也沒(méi)有明顯的耙向作用。近幾年發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)新型的微管蛋白解聚因子能解決這個(gè)問(wèn)題，它能在低于MTD的劑量下就能使血管閉合(ExpertOpinInvestigDrugs.2004Sep;13(9)1171-82)。LoicVincent等人在2005年提到了一類(lèi)具有類(lèi)似屬性的新型微管蛋白解聚因子，作為血管靶點(diǎn)因子(VTAs)能破壞微管蛋白骨架，文獻(xiàn)數(shù)據(jù)顯示血管靶點(diǎn)因子能選擇性誘導(dǎo)腫瘤血管的衰退，部分通過(guò)VE-cadherin信號(hào)通道。這類(lèi)微管蛋白解聚因子選擇性的破壞腫癯血管，并阻止新生腫瘤血管形成，而且對(duì)正常血管系統(tǒng)沒(méi)有影響。同時(shí)它能抑制微管蛋白的聚合、選擇性的導(dǎo)致腫瘤血管功能紊亂和結(jié)構(gòu)的破壞、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡，使得腫瘤細(xì)胞失去營(yíng)養(yǎng)和氧氣的支持，而發(fā)揮其殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。GillianM.Tozer等人于2005年曾在具影響力的雜志NatureRevCancer中報(bào)道，指出該類(lèi)化合物不但影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,也影響內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，快速改變血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，打斷血管中內(nèi)皮細(xì)胞的連接，從而迅速導(dǎo)致腫瘤血管功能紊亂和結(jié)構(gòu)的破壞。由于一般正常血管都是通過(guò)平滑肌細(xì)胞支撐的，這一類(lèi)化合物只作用于沒(méi)有平滑肌細(xì)胞支持的血管，對(duì)平滑肌支持的血管沒(méi)有影響，從而迅速并有選擇性的導(dǎo)致腫瘤血管功能紊亂和結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而能選擇性的作用于腫瘤細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞的毒性大大降低(NatRevCancer.2005Jun;5(6)423-35、J.Clin.Invest.，November1,2005;115(11):2992-3006)。這類(lèi)藥物目前被認(rèn)為是抗腫瘤最有前景的藥物之一。目前國(guó)外同時(shí)在開(kāi)展研究的該類(lèi)藥物只有CombretastatinA-4進(jìn)入臨床研究，由于通過(guò)雙鍵連接，在Combretastatin中芪類(lèi)單元的最有效破壞腫瘤血管是順式構(gòu)型，而反式構(gòu)型的芪類(lèi)化合物對(duì)腫瘤沒(méi)有抑制作用。由于存在順?lè)串悩?gòu)，極易發(fā)生異構(gòu)化等反應(yīng)，反式結(jié)構(gòu)不但沒(méi)有藥效，同時(shí)也會(huì)帶來(lái)一定的毒副作用(CombretastatinA-4LD50為500mg/kg)，使得CombretastatinA-4在保存和實(shí)際應(yīng)用中帶來(lái)了很大的困難。本發(fā)明中毛蘭素為合成的化合物，其結(jié)構(gòu)式如式(I):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>目前有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道毛蘭素對(duì)肝癌等的治療作用，如王天山等的研究結(jié)果(鼓槌石斛中化學(xué)成分對(duì)K562腫瘤細(xì)胞株生長(zhǎng)抑制作用體外試驗(yàn)，天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，1997，9(2)，13)表明，聯(lián)芐類(lèi)和菲類(lèi)化合物對(duì)體外培養(yǎng)的鼠類(lèi)L1210微管蛋白的聚集及有絲分裂、P388細(xì)胞株、多種人體腫瘤細(xì)胞株如A—549、MCF—7、HT—29、SKMEL—5、MLM、SK—OV—3、HL—60均有抑制作用。鼓槌石斛中的二氫聯(lián)芐類(lèi)和菲類(lèi)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞株K526的生長(zhǎng)具有不同程度的抑制作用，尤以毛蘭素(Erianin、DihydroCombretastatinA—4)的活性最強(qiáng)。毛蘭素對(duì)小鼠肝癌的作用最強(qiáng)，抑瘤率為50.82%。有關(guān)研究(中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，1994，25(3)，188-189)還推測(cè)毛蘭素的毒副作用遠(yuǎn)低于腫瘤化療藥物5FU。毛蘭素對(duì)許多腫瘤細(xì)胞有反質(zhì)子作用，其作用的靶點(diǎn)是細(xì)胞的微管蛋白。它能抑制微管蛋白的聚合，刺激依賴微管蛋白的GTP的水解，且和秋水仙堿競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合蛋白。李運(yùn)曼等的研究表明(毛蘭素誘導(dǎo)人白血病HL—60細(xì)胞的凋亡，中國(guó)藥理學(xué)報(bào)，2001，22(11))，毛蘭素顯著抑制人類(lèi)白血病HL—60細(xì)胞的生長(zhǎng)，其抑制作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和改變HL—60細(xì)胞的bcl—2和bax基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明主要是通過(guò)實(shí)驗(yàn)，對(duì)毛蘭素在新的癌癥等明顯的治療作用。本公司的毛蘭素是利用化學(xué)合成的，同樣作為腫瘤血管抑制劑，不同于CombretastatinA-4，兩個(gè)苯環(huán)是通過(guò)單鍵連接，使得毛蘭素和CombretastatinA-4結(jié)構(gòu)的不同、構(gòu)象、結(jié)合力、逆反等作用都不同，極大的提高了藥物的穩(wěn)定性(光能使CombretastatinA-4異構(gòu)為反式構(gòu)型。因此需要避光保存)，也提高了對(duì)微管蛋白的作用功能，同時(shí)具有了更低的毒副作用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供式(I)化合物，毛蘭素在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供式(I)化合物，毛蘭素在制備聯(lián)合抗腫瘤藥物的應(yīng)用。本發(fā)明所指的腫瘤可為實(shí)體腫瘤例如肉瘤和癌(例如纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝臟腫瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維耳姆斯氏瘤、頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)，也可為血液瘤例如白血病(例如急性白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病、急性髓母細(xì)胞白血病、急性前髓細(xì)胞白血病、急性髓單核細(xì)胞白血病、急性單核細(xì)胞細(xì)胞白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性髓細(xì)胞白血病、慢性淋巴細(xì)胞白血病)、真性紅細(xì)胞增多、淋巴瘤(何杰金氏病、非何杰金氏病)、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥、重鏈病。優(yōu)選地，為肉瘤、肝癌、肺癌、黑色素瘤、白血病、人食管癌、胃腺癌o研究表明，毛蘭素通過(guò)抑制微管蛋白的聚合、選擇性的導(dǎo)致腫瘤血管功能紊亂和結(jié)構(gòu)的破壞、誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)亡，使得腫瘤細(xì)胞失去營(yíng)養(yǎng)和氧氣的支持，而發(fā)揮其殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。毛蘭素還可以聯(lián)合其他治療方法，如化學(xué)治療、外科手術(shù)、放射治療、免疫療法、抗血管生成療法或者基因療法，顯著增加對(duì)腫瘤的治療效果。優(yōu)選地，所述另外的治療為使用抗腫瘤藥物的化學(xué)療法。更優(yōu)選地，所述另外的治療為使用細(xì)胞毒素和抗增殖、抑制血管生成的藥物的治療，優(yōu)選的藥物包括順鉑、氟尿嘧啶、阿霉素、瘤可寧、美法侖、紅豆杉醇、依立替康(irinotecan，CPT-11)、阿瓦斯汀(Avastin)、ZD6126(N-acetylcochinol-O-phosphate)和脈管鈣黏蛋白(vascularendothelial-cadherin)的抗體anti-VE隱cadherin(BV13)或againstVE-cadherin(E4G10)等。毛蘭素的低毒性的特性，使得其在具有對(duì)化療藥物的增效作用的同時(shí)，可以不增加化療藥物的毒性，使得其在與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用方面具備廣闊的前景。在本發(fā)明的毛蘭素和順鉑聯(lián)合用藥的實(shí)施例中，單獨(dú)用毛蘭素和毛蘭素與順鉑聯(lián)合用藥的實(shí)驗(yàn)組的組小鼠飲食正常，毛色光亮，活動(dòng)自如，未見(jiàn)其它異常表現(xiàn)，無(wú)一例鼠死亡；環(huán)磷酰胺的實(shí)驗(yàn)組的小鼠出現(xiàn)體型消瘦，精神萎靡，有豎毛現(xiàn)象。表明毛蘭素及其與DDP的聯(lián)合用藥對(duì)小鼠的毒性相比較單獨(dú)用環(huán)磷酰胺的要小。以毛蘭素為藥效成分，添加藥學(xué)上可接受的藥用輔料并通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)方法可以制備用于本發(fā)明的藥物制劑。本藥物制劑的劑型可以是口服給藥的劑型諸如片劑、膠囊(包括硬膠囊、軟膠囊、腸溶膠囊和微囊)、粉劑、顆粒劑和糖漿劑；非口服給藥的劑型諸如注射劑、凍干制劑、栓劑、丸劑、凝膠劑和貼劑。除這些常規(guī)劑型外，還可以將口服的速釋固體制劑(例如片劑、顆粒劑等)和用于口服或非口服給藥的緩釋制劑(片劑、顆粒、精細(xì)顆粒、丸劑、膠囊、糖漿、乳劑、懸浮液、溶液)用于本發(fā)明，通過(guò)常規(guī)方法也可以制備這些制劑。本發(fā)明中的制劑可以是包衣或未包衣的形式，視需要而定。本發(fā)明優(yōu)選的是將毛蘭素用于注射給藥和口服的劑型。本發(fā)明中的藥用輔料包括用于固體制劑的賦形劑、潤(rùn)滑劑、粘合劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、發(fā)泡劑、包衣劑等，或用于半固體制劑、液體制劑的溶劑、增溶劑、懸浮劑、等滲劑、緩沖劑、潤(rùn)膚劑、乳化劑等，此外，也可以根據(jù)需要使用其它藥用添加劑諸如防腐劑、抗氧化劑、著色劑、甜味劑和矯味劑等。下列實(shí)施例只用于說(shuō)明發(fā)明，而對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍無(wú)任何的限制。具體實(shí)施方式毛蘭素的制備實(shí)施例1毛蘭素的制備毛蘭素由浙江賽爾生物醫(yī)學(xué)研究有限公司提供，其他試劑材料如無(wú)特別說(shuō)明均為市售產(chǎn)品。毛蘭素的制備方法具體描述如下1、3，4，5-三甲氧基苯甲醇的制備250ml的三頸瓶中，加入3,4，5-三甲氧基苯甲醛15g(76.45mmol)，200ml的無(wú)水乙醇，加熱4(TC溶解，再加入硼氮化鈉1.48g(38.23mmd)，加熱回流45min后，TLC檢測(cè)，反應(yīng)完全后，冷卻至室溫，加入去離子水10ml(555.8mmo1)，淬滅后，抽濾，濾渣用20ml無(wú)水乙醇洗滌，合并濾液后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，加入100ml二氯甲烷溶解，用2N氫氧化鈉溶液50mlX2洗滌，再用去離子水50mlX2洗滌，加入適量的無(wú)水硫酸鎂干燥過(guò)夜。過(guò)濾，用20ml二氯甲烷洗滌濾渣，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得3,4,5-三甲氧基苯甲醇，無(wú)色油狀物14.05g，收率92.72%。得到的產(chǎn)物不需要進(jìn)一步純化，即可進(jìn)行下一步反應(yīng)。若想得到純品可以減壓蒸餾，收集BP216—218。C/12mmHg的餾分。2、3，4，5-三甲氧基芐溴的制備3，4,5-三甲氧基苯甲醇14.05g(70.89mmo1)，用100ml二氯甲烷溶解，加入到250ml的三頸瓶中，三溴化磷6.73ml(70.89mmo1)溶于25ml二氯甲烷中，室溫反應(yīng)50min后，冰浴冷卻，緩慢滴加18ml去離子水18ml(l.Omol)，淬滅反應(yīng)。然后再用100mlX2去離子水洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾，用20ml二氯甲垸洗滌濾渣，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，真空干燥，得3，4，5-三甲氧基節(jié)溴，淡黃色固體16.05g，收率84.44%。得到的產(chǎn)物不需要進(jìn)一步純化，即可進(jìn)行下一步反應(yīng)。若想得到純品可以用乙酸乙酯正己烷-l:3重結(jié)晶，得到白色片狀晶體。3、3，4，5-三甲氧基芐溴三苯基膦鹽的制備3，4，5-三甲氧基芐溴16.05g(61.47mmol)溶于150ml甲苯中，加入到250ml的三頸瓶中，加入三苯基瞵16.12g(61.47mmo1)，立即溶解，加熱回流lhr，有白色固體析出，冷卻到室溫，抽濾，濾餅用30ml甲苯洗滌，真空干燥后，得3，4,5-三甲氧基芐溴三苯基膦鹽，白色粉末固體27.81g，收率為86.44%得到的產(chǎn)物不需要進(jìn)一步純化，即可進(jìn)行下一步反應(yīng)。若想得到純品可以用丙酮洗滌固體，得白色粉末固體。4、芐基保護(hù)異香蘭素的制備250ml三頸瓶中，加入異香蘭素15g(98.59mmo1)，200ml無(wú)水乙醇，力口熱到40。C溶解，加入碳酸鉀9g(65.07mmo1)，攪拌下加入氯化芐15ml(130.13mmo1)，加熱回流lhr,TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，冷卻到5(TC，趁熱過(guò)濾，濾液放入冰箱中冷卻過(guò)夜，晶體析出，抽濾，濾餅用30ml無(wú)水乙醇洗滌，真空干燥后，得芐基保護(hù)異香蘭素，白色針狀晶體19.72g，收率為82.56%。得到的產(chǎn)物不需要進(jìn)一步純化，即可進(jìn)行下一步反應(yīng)。若想得到純品可以用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，得到白色柱狀晶體。5、順?lè)串悩?gòu)體的制備250ml三頸瓶中，加入3，4，5-三甲氧基芐溴三苯基磷鹽20.00g(38.21mmo1)，150ml四氫呋喃，攪拌懸浮液，芐基保護(hù)異香蘭素10.00g(41.27mmo1)溶于70ml四氫呋喃，放入100ml的滴液漏斗中。反應(yīng)瓶中加入固體叔丁醇鉀7.46g(66.49mmo1)，反應(yīng)體系變?yōu)檠t色，室溫?cái)嚢?min，緩慢滴加芐基保護(hù)異香蘭素的溶液，再室溫?cái)嚢?0min，TLC檢測(cè)反應(yīng)完全后，倒入500ml的分液漏斗中，加入140ml去離子水后，溶液分層，加入乙醚300mlX2萃取，合并乙醚層，用無(wú)水硫酸鎂干燥，過(guò)濾，濾餅用50ml乙醚洗滌，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得油狀物25g，加入20ml無(wú)水乙醇固化，抽濾得淡黃色固體12.50g，收率為80.48%。6、順?lè)串悩?gòu)體的重結(jié)晶50ml的圓底燒瓶中，加入順?lè)串悩?gòu)體12.50g(30.75mmo1),加入20ml無(wú)水乙醇，加熱部分固體溶解后，室溫?cái)嚢瑁闉V，濾餅用10ml的無(wú)水乙醚洗滌后，紅外燈干燥，得純順?lè)串悩?gòu)體9.27g，淡黃色粉末固體，收率為74.16%。7、毛蘭素的制備250ml的三頸瓶中，加入純順?lè)串悩?gòu)體5.14g(12.56mmo1)，溶于100ml乙酸乙酯和60ml無(wú)水乙醇中，淡黃色溶液，加入5。/。鈀炭0.50g后，攪拌下通氫氣，室溫?cái)嚢鑜hr，過(guò)濾，得無(wú)色濾液，》免轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，得油狀物4.05g，毛蘭素粗品，收率為100%。8、毛蘭素的精制500ml的圓底燒瓶中，加入毛蘭素粗品4.05g(12.72mmol)，用20ml無(wú)水乙醇溶解，若有不溶物，過(guò)濾除去，室溫靜止，有晶體析出，放置過(guò)夜，溶劑揮發(fā)完全，大量白色晶體析出。過(guò)濾，濾餅用乙醇洗滌，白色晶體3.56g，收率為100%。體外抗腫瘤細(xì)胞篩選實(shí)施例2毛蘭素細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)MTT(溴化二甲噻唑二苯四氮唑)化學(xué)式為3-(4，5-dimethylthiazd-zyl-2，5-diphenyltetrazolhimbromide)可被活細(xì)胞利用還原生成甲月替化合物，其產(chǎn)物形成顏色，可通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)得其細(xì)胞量。材料hepG2、Lewis、ECV、QGY、CEM、ECA109、BGC毛蘭素，為浙江賽爾生物醫(yī)學(xué)研究有限公司提供。1.細(xì)胞單層或懸浮均可，制成細(xì)胞懸液的濃度為10-20xl04/ml。2.MTT液濃度5mg/ml，溶解于生理鹽水，溶液儲(chǔ)存4。C，有效期為3周。3.溶解液含10%十二垸基硫酸鈉，5Q/。異丁醇及0.02mol/LHCl液。4.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液按常規(guī)配制(含滅活小牛血清及適量抗生素)。方法-.取96孔微量培養(yǎng)板，加入一定密度的細(xì)胞懸液90U1/孔(相當(dāng)于1-2x105/孔的細(xì)胞)，同時(shí)(指懸浮細(xì)胞)或37"C置4-6hr后(單層細(xì)胞)加入不同濃度試藥10iil/孔，每擋濃度設(shè)三復(fù)孔，陰性對(duì)照孔加入培養(yǎng)也來(lái)代替。另外，同時(shí)設(shè)無(wú)細(xì)胞無(wú)試劑100ii1純培養(yǎng)液/孔的空白對(duì)照1-2空作為調(diào)儀器的零點(diǎn)孔，然后振蕩使混合，置于37。C，5。/。C02培養(yǎng)箱(48或72hr)后再加入MTT液20ul/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4hr后，加入溶解液100lU/孔，在放置37'C培養(yǎng)箱中，次日，以A570波長(zhǎng)測(cè)各孔的光密度(可采用DG3022酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀)。各檔試液孔均值與陰性對(duì)照值比較得各檔濃度的百分抑制率(同時(shí)設(shè)一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗腫瘤藥作為陽(yáng)性對(duì)照)。計(jì)算公式為IC%=(C-T)/Cxl00%T為試液組OD值C為陰性對(duì)照組OD值然后根據(jù)各個(gè)檢測(cè)液各檔濃度的IC%，以回歸曲線求得IC50值。效果評(píng)價(jià)以半數(shù)抑制濃度表示(IC50值)，合成藥IC5(K10ng/ml，植物提取物IC50<50iig/ml認(rèn)為有抗腫瘤抑制作用。結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>毛蘭素與DDP聯(lián)合用藥對(duì)Lewfe肺癌小鼠模型抑瘤率實(shí)驗(yàn)實(shí)施例3毛蘭素與DDP聯(lián)合用藥對(duì)Lewis肺癌小鼠模型的腫瘤抑制作用一、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1、實(shí)驗(yàn)樣品(1)毛蘭素(EN):原料藥，由浙江賽爾生物醫(yī)學(xué)研究有限公司提供，批號(hào)060817。用DMSO(DMSO終濃度為2ml/kg)溶解，用生理鹽水稀釋為所需濃度。(2)順鉑注射用順鉑(DDP)，齊魯制藥有限公司，批號(hào)0503008;配制時(shí)用生理鹽水溶解。(3)對(duì)照品注射用環(huán)磷酰胺(CTX)，江蘇恒瑞制藥股份有限公司，批號(hào)04123021。配制時(shí)用生理鹽水溶解。2、動(dòng)物和瘤株(1)Lewis肺癌荷瘤C57BL/6J小鼠(2)C57BL/6J小鼠70只,雄性(ZCBC)，體重20-24g。3、實(shí)驗(yàn)方法(1)Lewis肺癌荷瘤C57BL/6J小鼠，無(wú)菌條件下取瘤，磨碎，用生理鹽水按照l(shuí):3(重量體積)的比例稀釋?zhuān)?.2ml/只給小鼠右前肢腋下皮下接種。次日將小鼠隨機(jī)均分為7組，每組10只。(2)動(dòng)物接種待腫瘤生長(zhǎng)致可觸及后開(kāi)始按體重給藥，靜脈0.5ml/20g，連續(xù)10天，根據(jù)體重給藥，接種后第19天處死，取瘤塊稱重，計(jì)算抑瘤率。(3)給藥劑量(mg/kg./d)及給藥途徑:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>(4)結(jié)果判定根據(jù)以下公式對(duì)照組瘤重一給藥組瘤重抑瘤率=-X100%對(duì)照組瘤重二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果EN與DDP聯(lián)合用藥抑制Lewis肺癥荷瘤鼠腫瘤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1、EN與DDP聯(lián)合用藥抑制Lewis肺癌荷瘤鼠腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>三、結(jié)果判定表明毛蘭素對(duì)抑制Lewis肺癌荷瘤鼠腫瘤有較好的作用，毛蘭素與DDP治療肝癌的聯(lián)合用藥具有很好協(xié)同治療作用，聯(lián)合用藥不但比DDP單獨(dú)給藥效果明顯，同時(shí)也達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照組(CTX)類(lèi)似的抑制腫瘤效果。其中，第5組小鼠飲食正常，毛色光亮，活動(dòng)自如，未見(jiàn)其它異常表現(xiàn)，無(wú)一例鼠死亡；第6組小鼠出現(xiàn)體型消瘦，精神萎靡，有豎毛現(xiàn)象。表明毛蘭素與DDP的聯(lián)合用藥對(duì)小鼠的毒性相比較單獨(dú)用環(huán)磷酰胺的要小。利用本發(fā)明實(shí)驗(yàn)作出各種改變，適用的所有實(shí)體瘤均在本發(fā)明要求的權(quán)利范圍之內(nèi)。以上對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。權(quán)利要求1.式(I)化合物，毛蘭素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用id="icf0001"file="A2007100634730002C1.gif"wi="66"he="48"top="40"left="70"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>2、權(quán)利要求l所述的應(yīng)用，其中所述的腫瘤為實(shí)體瘤。3、權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其中所述所有的實(shí)體腫瘤為肉瘤和癌。4、權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述肉瘤和癌為纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝臟腫瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎性癌、維耳姆斯氏瘤、頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、神經(jīng)鞘瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤或成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤。5、權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中所述腫瘤為肉瘤或肺癌。6、式(I)化合物，毛蘭素與抗腫瘤治療劑的組合在制備腫瘤藥物中的應(yīng)用OCH3(1)。7、權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其中所速抗腫瘤治療劑為化療藥物。8、權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其中所述化療藥物為順鉑、氟尿嘧啶、阿霉素、瘤可寧、美法侖、紅豆杉醇、依立替康、阿瓦斯汀、N-acetylcochinol-O-phosphate和脈管鈣黏蛋白的抗體anti-VE-cadherin或againstVE-cadherin。9、權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其中所述化療藥物為順鉑。全文摘要本發(fā)明涉及式(I)化合物毛蘭素在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。文檔編號(hào)A61K31/513GK101234098SQ20071006347公開(kāi)日2008年8月6日申請(qǐng)日期2007年2月1日優(yōu)先權(quán)日2007年2月1日發(fā)明者周丹萍,寧李,李亦平,陳立鉆申請(qǐng)人:浙江賽爾生物醫(yī)學(xué)研究有限公司