專利名稱：：重組人干擾素γ在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物技術(shù)藥物，具體涉及重組人干擾素Y(重組Y一IFN)在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：干擾素Y是Wheelock于1965年發(fā)現(xiàn)的，也稱為免疫干擾素，是由有絲分裂原或外來(lái)抗原誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，能增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞功能，加快免疫復(fù)合物的清除和提高吞噬異物功能，對(duì)淋巴細(xì)胞具有雙向調(diào)節(jié)功能，提高抗體依賴的細(xì)胞毒反應(yīng)，增強(qiáng)某些免疫活性細(xì)胞HLA-II類抗原表達(dá)。干擾素Y的生物活性主要包括以下幾方面1、抗病毒作用它通過(guò)細(xì)胞基因組編碼的一些蛋白質(zhì)來(lái)發(fā)揮作用。當(dāng)干擾素Y與細(xì)胞接觸時(shí)，它首選與靶細(xì)胞表面結(jié)合，然后進(jìn)入細(xì)胞，誘導(dǎo)基因組合成抗病毒蛋白。2、抑制細(xì)胞增殖作用干擾素Y對(duì)細(xì)胞有直接抑制作用，而且對(duì)分裂迅速的細(xì)胞有選擇性抑制。3、免疫調(diào)節(jié)作用可以激活效應(yīng)細(xì)胞，增加B細(xì)胞抗體產(chǎn)生和單核細(xì)胞的細(xì)胞毒性；增強(qiáng)免疫細(xì)胞表面抗原和受體的表達(dá)；刺激其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生。天然干擾素Y的分子量為3.5—7.0萬(wàn)，這是由于糖基化程度不同和形成聚合體的結(jié)果。重組人干擾素y是采用基因工程技術(shù)，由含有高效表達(dá)人干擾素Y基因的大腸桿菌，經(jīng)發(fā)酵、分離和高度純化所得。與天然干擾素Y相比，有同等的生物活性。目前，重組人干擾素Y臨床治療的適應(yīng)癥為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和肝纖維化。根據(jù)干擾素Y對(duì)分裂迅速的細(xì)胞有選擇性抑制作用，本發(fā)明人認(rèn)為其對(duì)快速分裂的腫瘤細(xì)胞可能產(chǎn)生抑制效果。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于研究重組人干擾素Y(重組Y—IFN)的抗腫瘤細(xì)胞作用，設(shè)計(jì)其在制藥中的應(yīng)用。本發(fā)明人對(duì)重組人干擾素Y抗腫瘤的藥效學(xué)進(jìn)行了體內(nèi)與體外的研究。體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)，重組人干擾素Y對(duì)于腫瘤有明顯的抑制作用，對(duì)小鼠S180肉瘤的抑瘤率可達(dá)42.2%;對(duì)EC實(shí)體瘤的抑瘤率可達(dá)48.2%。體外試驗(yàn)證實(shí)，重組人干擾素Y對(duì)體外培養(yǎng)的7種人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用，其中以對(duì)乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌的作用較強(qiáng)。因此，重組人干擾素Y對(duì)于某些腫瘤確有良好效果。本發(fā)明提供了重組人干擾素Y在制備治療腫瘤的藥物中應(yīng)用。本發(fā)明人進(jìn)行了重組干擾素Y的體內(nèi)外抗癌作用研究。臨床上用Y—干擾素治療毛細(xì)胞白血病，骨髓瘤和惡性淋巴瘤的療效較為肯定。對(duì)其他腫瘤的療效仍在繼續(xù)研究之中。1、本發(fā)明人對(duì)重組Y—IFN經(jīng)體外10多種人癌細(xì)胞株試驗(yàn)，證明對(duì)多種癌細(xì)胞有抑制生長(zhǎng)的作用，其中對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的作用更明顯。進(jìn)一步體內(nèi)試驗(yàn)表明，重組Y—IFN在500萬(wàn)U/kg時(shí)對(duì)實(shí)體腫瘤亦有療效，對(duì)S180的抑瘤率為40X以上，對(duì)EC實(shí)體瘤的抑瘤率為45X左右，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均有顯著性差異。以上說(shuō)明重組Y—IFN確具有明顯的腫瘤作用。2、本發(fā)明人對(duì)重組Y-干擾素(Y—IFN)的體內(nèi)抗癌作用研究試驗(yàn)，給荷瘤小鼠皮下注射重組Y—IFN7天觀察對(duì)S180肉瘤和EC實(shí)體瘤的生長(zhǎng)抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明重組y—IFN對(duì)小鼠S180肉瘤的抑瘤率250萬(wàn)U/kg時(shí)為21.3%，500萬(wàn)U/kg時(shí)為42.1%，750萬(wàn)u/kg時(shí)為42.2%;重組y—IFN對(duì)ec實(shí)體瘤的抑瘤率，250萬(wàn)u/kg時(shí)為12.1%，500萬(wàn)U/kg時(shí)為43.2%，750萬(wàn)U/kg時(shí)為48.2%。重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果相似。顯示重組y—IFN在500萬(wàn)u/kg,750萬(wàn)u/kg對(duì)小鼠s180肉瘤和ec實(shí)體瘤有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。因此，本發(fā)明的重組人干擾素Y能用于制備治療腫瘤的藥物。它可與藥用輔料按常規(guī)方法制成注射劑(包括注射液及注射用無(wú)菌粉末)。本發(fā)明提供的重組人干擾素Y在治療腫瘤上的新用途，在臨床有較大的應(yīng)用價(jià)值，為癌癥患者的治療增強(qiáng)信心，是一種應(yīng)用前景好的治療腫瘤的生物藥物。具體實(shí)施例方式y(tǒng)—干擾素的體外抗癌作用研究試驗(yàn)?zāi)康囊訫TT比色法檢測(cè)此藥對(duì)體外培養(yǎng)的多種腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性，了解它的體外抗癌作用特點(diǎn)，為體內(nèi)抗癌療效試驗(yàn)提供依據(jù)。受試藥物名稱y—干擾素提供單位上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司批號(hào)0015劑型粉針劑配制方法實(shí)驗(yàn)前以生理鹽水溶解。腫瘤細(xì)胞名稱白血病HL-60,人早幼粒白血病細(xì)胞；肺癌A549，人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞腎癌786-0，人腎癌細(xì)胞肝癌Bel-7402，人肝癌細(xì)胞胃癌SGC-7901，人胃癌細(xì)胞結(jié)腸癌LoVo，人結(jié)腸癌細(xì)胞乳癌MCF-7人乳腺癌細(xì)胞MCF-7adr人乳腺癌耐藥細(xì)胞宮頸癌HeLa，人宮頸癌細(xì)胞卵巢癌3AO，人卵巢癌細(xì)胞試驗(yàn)試劑及儀器RPMI-1640,購(gòu)自Sigma公司，小牛血清MTT為華美公司產(chǎn)品。免疫酶聯(lián)酶標(biāo)儀DG3022為南京華東電子管廠生產(chǎn)。5-氟尿嘧啶(5-FU)為上海海普藥業(yè)公司出品。試驗(yàn)方法選擇體外實(shí)驗(yàn)選用MTT比色法。試驗(yàn)主要步驟細(xì)胞以含10%的小牛血清培養(yǎng)，傳代時(shí)貼壁細(xì)胞以0.2%的胰酶消化液消化，使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。,試驗(yàn)時(shí)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接種18(^1，濃度為5X104cells/ml的細(xì)胞懸液。于37'CC02培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)5小時(shí)。,預(yù)培養(yǎng)后，每孔加20ul藥物培養(yǎng)液。藥物作用細(xì)胞5天。藥物作用結(jié)束后，貼壁細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入濃度為5mg/ml的MTT工作液1(^1,37'C孵育4小時(shí)，棄上清液，貼壁細(xì)胞加10(Hil純DMSO，懸浮細(xì)胞用加三聯(lián)液在540nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。療效評(píng)價(jià)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率對(duì)照組OD值一用藥組OD值--X100%對(duì)照組OD值劑量設(shè)置對(duì)細(xì)胞作用時(shí)，Y—干擾素設(shè)5個(gè)以上濃度，主要在lX10Mxi()Sunit/ml范圍內(nèi)。生物統(tǒng)計(jì)根據(jù)藥物在不同濃度下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率以Logit方法計(jì)算IC5o值。與空白對(duì)照組比較計(jì)算P值。生物統(tǒng)計(jì)軟件程序來(lái)源于《藥理學(xué)計(jì)算與程序》一書(shū)，人民衛(wèi)生出版社1988年版，張文貴主編。試驗(yàn)對(duì)照空白對(duì)照孔加20nl培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照藥應(yīng)用5-氟尿嘧啶(5-FU)。試驗(yàn)結(jié)果Y—干擾素對(duì)多種體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果見(jiàn)表l一表10表l.Y一干擾素對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表2.2Y—干擾素對(duì)腎癌786-0細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表3.3Y—干擾素對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用組別藥物濃度(unit/ml)OD值抑制率(％)IC50(unit/ml)空白對(duì)照1.36±0.01Y—干擾素1X1050.92±0.0232*>1X1051X1041.00±0.05261X1031.06±0.01221X1021.25±0.0481X101L19±0.03125-FUg/ml0.27±0.0180*O.l^g/mll|xg/ml0.30±0.0478*0.lug/ml0.68±0.0450**p<0.01表4Y一干擾素對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用組別藥物濃度(unit/ml)OD值抑制率(％)IC50(unit/ml)空白對(duì)照1.44±0.03Y—干擾素lxlO50.62±0.0157*5.7x1045xl040.84±0.0342*lxlO40.96±0.01335xl031.09±0.0724lxlO31.28±0.06105xl021.39±0.0935-FUlug/ml0.05±0.0196*<0.lug/ml0.5pg/ml0.06±0.0196*0.lug/mlO.ll士O.Ol92**P<0.01重復(fù)實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表4.2-4.3表4.2Y—干擾素對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>重復(fù)實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表5.2—5.3表5.2Y一干擾素對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*P<0.01表5.3Y—干擾素對(duì)結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表6.2Y—干擾素對(duì)卵巢癌3AO細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表8.2Y—干擾素對(duì)肝癌BeL-7402細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表10.2Y—干擾素對(duì)乳腺癌MCF-7^耐藥細(xì)胞株生長(zhǎng)的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>應(yīng)用10種人腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行體外培養(yǎng)，以不同濃度的Y—干擾素和陽(yáng)性對(duì)照藥5-FU處理。試驗(yàn)結(jié)果表明干擾素對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)抑制作用較強(qiáng)，對(duì)腎癌細(xì)胞786-0，胃癌細(xì)胞SGC-7卯1，白血病細(xì)胞HL-60，肝癌細(xì)胞BeL-7402及宮頸癌細(xì)胞HeLa也有一定的生長(zhǎng)抑制作用，但對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo，卵巢癌細(xì)胞3AO和乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7^無(wú)明顯生長(zhǎng)抑制作用。在試驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照藥5-FU的抑制率多呈量一效關(guān)系。而Y—干擾素的量一效關(guān)系不明顯，此種結(jié)果與其它免疫型抗腫瘤藥的作用特點(diǎn)相似。干擾素(Y—TNF)的體內(nèi)抗癌作用研究一.摘要給荷瘤小鼠皮下注射Y—IFN7天觀察對(duì)S180肉瘤和EC實(shí)體瘤的生長(zhǎng)抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明y-IFN對(duì)小鼠S180肉瘤的抑瘤率250萬(wàn)U/kg時(shí)為21.3%，500萬(wàn)U/kg時(shí)為42.1X，750萬(wàn)U/kg時(shí)為42.2%;y—IFN對(duì)EC實(shí)體瘤的抑瘤率，250萬(wàn)U/kg時(shí)為12.1X，500萬(wàn)U/kg時(shí)為43.2%，750萬(wàn)U/kg時(shí)為48.2%。重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果相似。顯示y—IFN在500萬(wàn)U/kg，750萬(wàn)U/kg對(duì)小鼠S180肉瘤和EC實(shí)體瘤有明顯的生長(zhǎng)抑制作用。二.實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠^察不同劑量Y—IFN對(duì)動(dòng)物腫瘤的生長(zhǎng)抑制作用三.受試藥物Y—干擾素(Y—IFN):上海克隆公司提供，為同一批號(hào)的臨床應(yīng)用產(chǎn)品。提供單位上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司批號(hào)0015制劑白色水溶性粉針劑配制方法用0.9%無(wú)菌生理鹽水配制成lml=25萬(wàn)U，lml=50萬(wàn)U，lml:75萬(wàn)U，臨用臨配，陽(yáng)性對(duì)照環(huán)磷酰胺(CTX)用0.9%無(wú)菌生理鹽水配制成lml=3mg。劑量設(shè)置參考臨床用量折算小鼠治療量為250萬(wàn)U/kg,500萬(wàn)U/kg,750萬(wàn)U/kg,CTX為30mg/kg。四.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源種屬昆明種小鼠由中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供合格證號(hào)中科動(dòng)管會(huì)005號(hào)體重18—22g性別？，各組動(dòng)物數(shù)對(duì)照組11一12只，給藥組每組10只，CTX組10—12只五.實(shí)驗(yàn)方法瘤株實(shí)驗(yàn)采用本所保種之小鼠S180腹水瘤和艾氏(EC)腹水癌。接種在無(wú)菌條件下取腫瘤生長(zhǎng)良好之7天腹水瘤小鼠，用碘酒和75%酒精依次消毒小鼠腹部皮膚，以注射針頭抽取腫瘤腹水，用0.9%滅菌生理鹽水稀釋成(1:3—1:5)瘤細(xì)胞懸液，取稀釋液0.21111接種小鼠右側(cè)腋窩皮下。分組:接種后次日隨機(jī)分成空白對(duì)照0.9X生理鹽水組,Y—IFN250萬(wàn)U/kg，500萬(wàn)U/kg和750萬(wàn)U/kg三組和陽(yáng)性對(duì)照CTX30mg/kg組，對(duì)照組每組鼠數(shù)10—12只，藥物治療組每組用10只小鼠，每鼠體重相差士2g。給藥分組后開(kāi)始給藥每天1次連續(xù)給藥7天，每次(X2ml。給藥途徑空白對(duì)照組和Y—IFN組，均于接種對(duì)側(cè)腋窩皮下給藥。CTX組腹腔給藥。療效評(píng)價(jià)連續(xù)給藥7天，第8天稱每組體重，逐個(gè)解剖取瘤稱重，計(jì)算腫瘤抑瘤率，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。六.實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.不同劑量Y—IFN對(duì)小鼠S180肉瘤的生長(zhǎng)抑制作用，參見(jiàn)表1一3及圖1。實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次。Y—IFN的抑瘤率為250萬(wàn)U/kg:21.3%，18.9%,11%500萬(wàn)U/kg:42.1%，45.5%,42%750萬(wàn)U/kg:42.2%，47.2%，43%2.不同劑量Y—IFN對(duì)小鼠EC實(shí)體瘤的生長(zhǎng)抑制作用，參見(jiàn)表4一6及圖2。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Y—IFN的抑瘤率為250萬(wàn)U/kg-12.1%,14.4°/。，11.5%500萬(wàn)U/kg:43.2%,48.6%,40%750萬(wàn)U/kg:48.2%，48.2%，42%以上結(jié)果表明Y—IFN250U/kg對(duì)小鼠S180肉瘤和EC實(shí)體瘤抑瘤率不明顯。500萬(wàn)U/kg和750萬(wàn)U/kg對(duì)小鼠S180肉瘤和EC實(shí)體瘤均有明顯的抑制作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異。表l.Y—IFN對(duì)小鼠S180肉瘤的生長(zhǎng)抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表3.Y—IFN對(duì)小鼠S180肉瘤的生長(zhǎng)抑制作用(第2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表4.Y—IFN對(duì)小鼠EC實(shí)體瘤的生長(zhǎng)抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表5;y'一IFN對(duì)小鼠EC實(shí)體瘤的生長(zhǎng)抑制作用(重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>表6j—IFN對(duì)小鼠EC實(shí)體瘤的生長(zhǎng)抑制作用(第2次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>***P<0.01討論本發(fā)明研究的重組Y—IFN，經(jīng)體外10多種人癌細(xì)胞株試驗(yàn)，證明對(duì)多種癌細(xì)胞有抑制生長(zhǎng)的作用，其中對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7及非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549的作用更明顯。進(jìn)一步體內(nèi)試驗(yàn)表明，Y—IFN在500萬(wàn)U/kg時(shí)對(duì)實(shí)體腫瘤亦有療效，對(duì)S180的抑瘤率為40%以上，對(duì)EC實(shí)體瘤的抑瘤率為45%左右，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均有顯著性差異。以上說(shuō)明Y—IFN確具有明顯的腫瘤作用。權(quán)利要求1、一種重組人干擾素γ在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組人干擾素Y在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述藥物為重組人干擾素Y與藥用輔料按常規(guī)方法制成的注射劑，包括注射液及注射用無(wú)菌粉末。3、根據(jù)權(quán)利要求'l所述的一種重組人干擾素Y在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述治療腫瘤病癥為乳腺癌，非小細(xì)胞肺癌，腎癌，胃癌，白血病，肝癌及宮頸癌。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了重組人干擾素γ在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明經(jīng)體內(nèi)外抗癌作用研究顯示重組人干擾素γ在500萬(wàn)U/kg、750萬(wàn)U/kg對(duì)小鼠S180肉瘤和EC實(shí)體瘤有明顯的生長(zhǎng)抑制作用；體外試驗(yàn)顯示其對(duì)體外培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用，其中對(duì)乳腺癌和非小細(xì)胞肺癌的作用較強(qiáng)。本發(fā)明的重組人干擾素γ能用于制備治療腫瘤的藥物。它可與藥用輔料按常規(guī)方法制成注射劑(包括注射液及注射用無(wú)菌粉末)。本發(fā)明提供的重組人干擾素γ在治療腫瘤上的新用途，在臨床有較大的應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)A61P35/00GK101376021SQ20071004535公開(kāi)日2009年3月4日申請(qǐng)日期2007年8月29日優(yōu)先權(quán)日2007年8月29日發(fā)明者穎厲,周永春申請(qǐng)人:上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司;上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司