專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于治療高脂蛋白血癥的低密度脂蛋白吸附材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物分離工程技術(shù)領(lǐng)域。特別涉及到合成了具有牛磺酸及吲哚乙酸兩種吸附功能基的低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein，LDL)吸附材料，并在高脂蛋白血癥病人血漿中進(jìn)行了吸附試驗(yàn)。
背景技術(shù)：
心血管疾病是威脅人類(lèi)健康的三大疾病之一，全世界每年約有800萬(wàn)-1000萬(wàn)人死于動(dòng)脈硬化引起的心血管疾病和中風(fēng)。流行病學(xué)研究表明，心血管疾病與血液中LDL濃度過(guò)高有著密切關(guān)系。
LDL在血液中起到運(yùn)輸脂類(lèi)尤其是膽固醇的作用，它由肝臟產(chǎn)生并釋放入血液。LDL中含19-21％蛋白質(zhì)，37-43％膽固醇酯，8-11％未酯化的膽固醇，4-11％甘油三酯，22％磷脂以及約1％糖類(lèi)。其數(shù)均分子量為2.7×106。LDL的平均尺寸和密度存在個(gè)體差異，這些差異主要由于遺傳和飲食因素所引起。
如果血液中LDL濃度過(guò)高，則會(huì)造成血液粘稠度上升，在血管破損或狹窄處，被氧化的LDL容易和其它蛋白形成斑塊，繼續(xù)積累從而造成動(dòng)脈粥樣硬化。降低血液中LDL含量能夠明顯改善心血管的流變性，因此成為降低心血管疾病發(fā)病率的重要措施。利用血液凈化療法能夠直接降低血液中的LDL濃度，治療效果快速、顯著，對(duì)于飲食控制和藥物治療沒(méi)有效果的嚴(yán)重的遺傳性高膽固醇血癥患者尤為適用。高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein，HDL)同樣是血液中富含膽固醇的脂蛋白，它的生理功能是將膽固醇運(yùn)輸?shù)礁闻K，進(jìn)行分解、排出，使血液中保持著適宜的膽固醇含量，對(duì)緩解心血管疾病有著十分有益的作用。在進(jìn)行LDL血液凈化時(shí)，應(yīng)最大程度的減少吸附材料對(duì)HDL的非特異性吸附。
在合成LDL吸附材料方面，研究者們做了大量的工作，已有一些產(chǎn)品問(wèn)世。根據(jù)材料與LDL的作用機(jī)理，大體可分為離子型吸附劑、疏水型吸附劑和免疫吸附劑，目前商品化的有硫酸右旋糖酐纖維素吸附劑(離子型吸附劑)和LDL抗體吸附劑(免疫吸附劑)，其他處于研究中的吸附劑包括以肝素、多肽、氯磺酸等分子為配基的吸附材料。已經(jīng)商業(yè)化的LDL吸附劑仍存在很多缺陷需要改進(jìn)。如硫酸右旋糖酐纖維素吸附劑(專(zhuān)利號(hào)JP61165330)是通過(guò)吸附材料帶有的負(fù)電荷與LDL的受體結(jié)合區(qū)域作用，達(dá)到吸附LDL的目的，但硫酸右旋糖酐可激活第十二凝血因子，治療過(guò)程需要非常慎重；免疫吸附劑(專(zhuān)利號(hào)CA2001358)通過(guò)把LDL抗體偶聯(lián)到吸附材料表面，使其特異性吸附LDL，吸附劑選擇性高、吸附效果明顯。但由于抗體來(lái)源困難、價(jià)格昂貴、不易保存，使得此吸附劑的售價(jià)達(dá)到12萬(wàn)元，大大限制了使用人群。近些年來(lái)，人們一直試圖研制其它對(duì)LDL具有較高選擇性、較大吸附容量、價(jià)格低廉、血液相容性好的吸附劑，雖然研究較多，但離實(shí)際應(yīng)用還有很大距離。如模擬抗LDL抗體和LDL結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列設(shè)計(jì)的以絲氨酰柼於 濱 谷氨酸三肽為配基的吸附材料(余喜訊等。航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程，2002，15(4)300-302)，在膠血比為1∶2時(shí)，靜態(tài)吸附2小時(shí)后，血漿中LDL的去除率為28.77％，HDL的去除率約10％，可見(jiàn)LDL吸附率低，對(duì)HDL的非特異性吸附也較高，說(shuō)明利用簡(jiǎn)單的小肽很難模擬抗元抗體間的相互作用。又如以氯磺酸為配基的吸附材料(徐建寬，高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2002，23(7)1421~1424)與硫酸右旋糖酐纖維素吸附劑的作用機(jī)理相似，膠血比為1∶1時(shí)，靜態(tài)吸附2小時(shí)，可除去病人血漿中50％的LDL和9％的HDL，但此實(shí)驗(yàn)吸附所采用的膠血比遠(yuǎn)低于臨床常規(guī)1∶10的比例，因此折算一下，實(shí)際吸附容量不高。
總之，目前使用低密度脂蛋白吸附劑治療高脂血癥存在以下關(guān)鍵問(wèn)題需要解決(1)選擇性不高。在清除致病性分子LDL的同時(shí)，許多血液中有益的物質(zhì)同時(shí)也被除去，如HDL，容易產(chǎn)生治療副作用；(2)選擇性高的吸附材料治療費(fèi)用昂貴。
為了解決現(xiàn)有吸附材料存在的問(wèn)題，應(yīng)主要從以下兩方面入手(1)綜合分析LDL的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及LDL與其受體相互作用的方式，通過(guò)一定的合成手段，使吸附劑最大程度的模擬LDL的受體結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)LDL更高的選擇性；(2)采用廉價(jià)、易得的基質(zhì)和化合物合成吸附劑，從而降低成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要合成一種血液相容性好，價(jià)格低廉，對(duì)LDL具有較高選擇性和較大吸附能力的LDL吸附材料，以克服現(xiàn)有LDL吸附材料存在的對(duì)LDL吸附能力差，選擇性較低、制備成本較高的缺陷。
本發(fā)明的技術(shù)方案是選擇血液相容性好的瓊脂糖凝膠為載體，在材料表面引入枝狀間隔臂，在枝狀間隔臂分子上偶聯(lián)兩種對(duì)LDL具有不同作用方式的功能基團(tuán)做為配基，這兩種功能基團(tuán)分別是對(duì)LDL具有離子作用的磺酸基和具有疏水作用的吲哚基團(tuán)，其選擇根據(jù)是(1)LDL表面存在豐富的游離膽固醇及膽固醇酯疏水區(qū)域，能夠與疏水功能基團(tuán)產(chǎn)生吸附作用；(2)LDL上載脂蛋白Ap0B-100的受體結(jié)合區(qū)域氨基酸殘基序列為Arg-X-X-Arg-Lys-Arg-X-X-Arg/Lys，是一個(gè)正電荷集中區(qū)，可以與帶有負(fù)電荷的功能基團(tuán)產(chǎn)生吸附作用；(3)半胱氨酸、絲氨酸等小分子同時(shí)具有三個(gè)活性基團(tuán)，可以通過(guò)這些分子作為間隔臂同時(shí)偶聯(lián)兩種配基。希望通過(guò)吸附材料表面兩種功能基團(tuán)與LDL的吸附作用，實(shí)現(xiàn)提高吸附劑對(duì)LDL的選擇性，減少對(duì)血液中其它有益成分非特異性吸附的目的。
具體的實(shí)驗(yàn)步驟如下第一步，選擇血液相容性好的瓊脂糖凝膠作為吸附劑基質(zhì)，使用N，N’羰基二咪唑(CDI)活化其表面羥基；第二步，利用雙氨基試劑合成帶有功能基團(tuán)氨基的瓊脂糖凝膠；第三步，將半胱氨酸的巰基與具有氨基末端的瓊脂糖凝膠相連，合成的材料表面帶有半胱氨酸枝狀間隔臂，其末端活性基團(tuán)為氨基和羧基；第四步，分別在材料表面枝狀分子攜帶的兩種活性基團(tuán)--氨基和羧基上偶聯(lián)不同的配基。最終制備同時(shí)偶聯(lián)負(fù)電型配基?；撬岷褪杷浠胚嵋宜岬奈讲牧稀?br> 按照上述實(shí)驗(yàn)構(gòu)思，本發(fā)明提供了一種用于治療高脂蛋白血癥的低密度脂蛋白吸附材料，包括選用瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，采用N，N’羰基二咪唑作為活化試劑活化載體，以半胱氨酸為枝狀間隔臂，具有?；撬峒斑胚嵋宜醿煞N配基，對(duì)低密度脂蛋白具有較高吸附選擇性的吸附材料的合成過(guò)程，其特征在于1)利用N，N’羰基二咪唑活化瓊脂糖凝膠，其中瓊脂糖凝膠在溶液中的體積百分比為30~50％，N，N’羰基二咪唑的質(zhì)量濃度為60~220g/L，反應(yīng)溫度25~37℃，反應(yīng)時(shí)間1~2小時(shí)；2)利用雙氨基試劑合成帶有功能基團(tuán)氨基的瓊脂糖凝膠。其中雙氨基試劑在溶液中的體積百分比為2~20％，反應(yīng)溫度25~37℃，反應(yīng)時(shí)間2~4小時(shí)，帶有氨基功能基團(tuán)的瓊脂糖凝膠在溶液中的體積百分比為30~50％；3)占體積百分比為30~50％的瓊脂糖凝膠表面的氨基首先在20~60g/L碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)的催化下與濃度為80~160g/L溴乙酸的羧基反應(yīng)，再與濃度為80~160g/L的半胱氨酸的巰基反應(yīng)，兩步反應(yīng)的溫度均為25~37℃，反應(yīng)時(shí)間均為2~4小時(shí)，合成的材料表面帶有半胱氨酸枝狀分子，其末端活性基團(tuán)為氨基和羧基；4)利用末端活性基團(tuán)為氨基和羧基的瓊脂糖凝膠合成具有牛磺酸及吲哚乙酸兩種配基的低密度脂蛋白吸附材料，具體合成方法是帶有氨基的載體先與體積百分比為3~25％的雙醛基試劑反應(yīng)，在室溫下反應(yīng)2~18小時(shí)，再與0.2~1.0mol/L的?；撬岱磻?yīng)，室溫反應(yīng)2~24小時(shí)。用雙氨基試劑在碳二亞胺鹽酸鹽的催化下先與載體表面的羧基反應(yīng)，再進(jìn)一步與吲哚乙酸反應(yīng)，其中，吲哚乙酸的濃度為0.2~1.0mol/L，反應(yīng)時(shí)間2~24小時(shí)。
5)吸附材料1ml，加入LDL濃度為129.12mg/dl的高脂蛋白血癥病人的血漿10ml，在30癈，150rpm的搖床中震蕩2.5小時(shí)，吸附材料對(duì)LDL的清除率為33.5％-46.6％，對(duì)HDL的清除率為1.3％-4.2％。
本發(fā)明的效果和益處是通過(guò)一個(gè)具有三個(gè)活性基團(tuán)的枝狀連接臂分子--半胱氨酸，將靜電功能基和疏水功能基同時(shí)鍵合到材料表面，一方面增加了配基的密度，可以提高吸附劑對(duì)LDL的吸附容量，另一方面，能夠提高選擇性。由于吸附劑對(duì)LDL具有兩種不同的識(shí)別方式，從而能夠更好的將LDL和與它具有相似結(jié)構(gòu)的其它脂蛋白，特別是與有益的HDL區(qū)分開(kāi)來(lái)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，對(duì)LDL的選擇性好于目前的非免疫型LDL吸附劑。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合技術(shù)方案，詳細(xì)敘述本發(fā)明的細(xì)節(jié)和最佳實(shí)施例。
實(shí)施例1CDI活化瓊脂糖凝膠的制備取瓊脂糖凝膠0.6~1.0L，用去離子水經(jīng)過(guò)真空抽濾4-5次除去凝膠中的防腐劑，依次以30％、70％、100％的丙酮清洗凝膠，稱(chēng)取60~220g的CDI溶于的1.0L丙酮中，然后把洗好的凝膠加到該溶液中，在25~37℃、150轉(zhuǎn)/分鐘搖床中反應(yīng)1~2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用6~10倍體積的丙酮反復(fù)清洗已活化的凝膠，真空抽濾，除去反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的咪唑。
實(shí)施例2氨基瓊脂糖凝膠的制備在1.0L的丙酮中加入0.021~0.25L的雙氨基試劑(如二氨基二丙基亞胺、己二胺、乙二胺等)，再加入0.6~1.0L用N，N’羰基二咪唑活化的瓊脂糖凝膠，在溫度25~37℃，150轉(zhuǎn)/分的搖床中反應(yīng)2~4小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用6~10倍體積的去離子水反復(fù)清洗反應(yīng)后的凝膠，然后再用0.15mol/L、pH8.2的硼酸緩沖液清洗膠樣。此時(shí)瓊脂糖凝膠表面的氨基密度50~107mmol/L凝膠。
實(shí)施例3半胱氨酸枝狀分子與瓊脂糖凝膠的偶聯(lián)將80~160g溴乙酸溶解在1L水中，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至4.5~7.5，把0.6~1.0L氨基瓊脂糖凝膠加入此溶液中，再加入20~60g的EDC作為縮合劑，在25~37℃，150轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中反應(yīng)2~4小時(shí)；反應(yīng)完畢后使用水和0.1mol/L pH8.0的磷酸緩沖液沖洗凝膠；將該凝膠進(jìn)一步加入到1L溶有半胱氨酸的磷酸緩沖液中，其中半胱氨酸的濃度為80~160g/L，磷酸緩沖液的濃度為0.1mol/L，pH為8.0，在25~37℃，150轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中反應(yīng)2~4小時(shí)。
實(shí)施例4偶聯(lián)?；撬岷瓦胚嵋宜岬腖DL吸附材料的制備首先利用凝膠表面半胱氨酸的氨基通過(guò)雙醛基試劑偶聯(lián)牛磺酸。具體反應(yīng)是將0.6~1.0L偶聯(lián)有半胱氨酸的凝膠分散到1.0L 0.15mol/L pH8.2的硼酸緩沖液中，再加入雙醛基試劑(如戊二醛、乙二醛)0.03~0.25L，在25~37℃，150轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中反應(yīng)2~4小時(shí)；取出反應(yīng)體系內(nèi)的凝膠，用蒸餾水反復(fù)清洗，抽濾，然后用2mol/L的醋酸和0.15mol/LpH8.2的硼酸緩沖液清洗凝膠。將該凝膠加入到1.0L 0.2~1mol/L?；撬岬呐鹚峋彌_液中，在25~37℃，150轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中反應(yīng)2~24小時(shí)；使用硼氫化鈉還原凝膠至白色，至此，?；撬岱肿颖慌悸?lián)到吸附材料表面。
進(jìn)一步利用凝膠表面半胱氨酸的羧基通過(guò)雙氨基試劑偶聯(lián)吲哚乙酸。具體反應(yīng)是取偶聯(lián)?；撬岬沫傊悄z0.6~1.0L，分散到1.0L 0.1mol/L pH4.5的MES緩沖溶液中，加入20~60g的EDC作為縮合劑，再加入0.021~0.25L的雙氨基試劑(如二氨基二丙基亞胺、己二胺、乙二胺等)，在溫度25~37℃，150轉(zhuǎn)/分的搖床中反應(yīng)2~4小時(shí)，反應(yīng)完畢后，取出凝膠，用6~10倍體積的去離子水反復(fù)清洗，此凝膠再分散到1.0L 0.1mol/L pH4.5的MES緩沖溶液中，加入20~60g的EDC作為縮合劑，再加入35~175g吲哚乙酸，在溫度25~37℃，150轉(zhuǎn)/分的搖床中反應(yīng)2~24小時(shí)。取出凝膠，用6~10倍體積的去離子水反復(fù)清洗干凈，備用。至此，偶聯(lián)?；撬岷瓦胚嵋宜岬腖DL的吸附材料制備完畢。
實(shí)施例5偶聯(lián)?；撬岷瓦胚嵋宜岬腖DL吸附材料的體外靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)取合成的LDL吸附材料1ml，加入10ml患有高脂蛋白血癥病人的血漿，吸附前血漿中LDL、HDL初始濃度分別為129.12mg/dl和18.59mg/dl，在30℃，150轉(zhuǎn)/分鐘的搖床中震蕩2.5小時(shí)后，吸附劑對(duì)LDL的清除率為33.5％~46.6％，HDL的清除率為1.3％~4.2％，選擇性好于目前的非免疫型LDL吸附劑。
權(quán)利要求
1.一種用于治療高脂蛋白血癥的低密度脂蛋白吸附材料，包括選用瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，采用N，N’羰基二咪唑作為活化試劑活化載體，以半胱氨酸為枝狀間隔臂，具有?；撬峒斑胚嵋宜醿煞N配基，對(duì)低密度脂蛋白具有較高吸附選擇性的吸附材料的合成過(guò)程，其特征在于a)利用N，N’羰基二咪唑活化瓊脂糖凝膠，其中瓊脂糖凝膠在溶液中的體積百分比為30~50％，N，N’羰基二咪唑的質(zhì)量濃度為60~220g/L，反應(yīng)溫度25~37℃，反應(yīng)時(shí)間1~2小時(shí)；b)利用雙氨基試劑合成帶有功能基團(tuán)氨基的瓊脂糖凝膠，其中雙氨基試劑在溶液中的體積百分比為2~20％，反應(yīng)溫度25~37℃，反應(yīng)時(shí)間2~4小時(shí)，帶有氨基功能基團(tuán)的瓊脂糖凝膠在溶液中的體積百分比為30~50％；c)占體積百分比為30~50％的瓊脂糖凝膠表面的氨基首先在20~60g/L碳二亞胺鹽酸鹽的催化下與濃度為80~160g/L溴乙酸的羧基反應(yīng)，再與濃度為80~160g/L的半胱氨酸的巰基反應(yīng)，兩步反應(yīng)的溫度均為25~37℃，反應(yīng)時(shí)間均為2~4小時(shí)，合成的材料表面帶有半胱氨酸枝狀分子，其末端活性基團(tuán)為氨基和羧基；d)利用末端活性基團(tuán)為氨基和羧基的瓊脂糖凝膠合成具有?；撬峒斑胚嵋宜醿煞N配基的低密度脂蛋白吸附材料，具體合成方法是帶有氨基的載體先與體積百分比為3~25％的雙醛基試劑反應(yīng)，在室溫下反應(yīng)2~18小時(shí)，再與0.2~1.0mol/L的牛磺酸反應(yīng)，室溫反應(yīng)2~24小時(shí)。用雙氨基試劑在碳二亞胺鹽酸鹽的催化下先與載體表面的羧基反應(yīng)，再進(jìn)一步與吲哚乙酸反應(yīng)，其中，吲哚乙酸的濃度為0.2~1.0mol/L，反應(yīng)時(shí)間2~24小時(shí)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于治療高脂蛋白血癥的低密度脂蛋白吸附材料，其特征還在于吸附材料1ml，加入LDL濃度為129.12mg/dl的高脂蛋白血癥病人的血漿10ml，在30℃，150rpm的搖床中震蕩2.5小時(shí)，吸附材料對(duì)LDL的清除率為33.5％-46.6％，對(duì)HDL的清除率為1.3％-4.2％。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物分離工程技術(shù)領(lǐng)域。特別涉及到合成了具有?；撬峒斑胚嵋宜醿煞N吸附功能基的低密度脂蛋白(LowDensity Lipoprotein，LDL)吸附材料，并在高脂蛋白血癥病人血漿中進(jìn)行了吸附試驗(yàn)。生物分離工程領(lǐng)域一種治療高脂蛋白血癥的低密度脂蛋白吸附材料，選用瓊脂糖凝膠為基質(zhì)，以半胱氨酸為枝狀間隔臂，具有牛磺酸及吲哚乙酸兩種配基。其特征在于1ml的吸附材料，對(duì)于10ml的LDL濃度為129.12mg/dl的高脂蛋白血癥病人血漿，2.5小時(shí)的LDL的清除率為33.5％－46.6％，HDL的非特異性清除率為1.3％－4.2％。本發(fā)明的效果和益處是對(duì)病人血漿中的低密度脂蛋白具有較高的吸附容量，對(duì)高密度脂蛋白的非特異性吸附較小。
文檔編號(hào)A61M1/38GK1876225SQ20061020009
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月27日
發(fā)明者賈凌云 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)