專利名稱：一氧化氮及其生物醫(yī)學(xué)重要作用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了用于產(chǎn)生一氧化氮的材料及方法。
具體而言，本發(fā)明涉及從植物組織及材料分離的低分子量水溶性分子，以及利用這些分子在哺乳動物細胞及組織中誘導(dǎo)產(chǎn)生一氧化氮。
背景技術(shù)：
一氧化氮(NO)是在哺乳動物免疫、心血管以及神經(jīng)系統(tǒng)中的一種主要信號分子18，26，37，56，57，109。在一個位點產(chǎn)生的NO能夠影響相隔一定距離的組織24，70。NO是通過酶——一氧化氮合酶(NOS)由L-精氨酸產(chǎn)生55，57。NOS以3種形式存在內(nèi)皮的(e)，神經(jīng)元的(n)以及誘導(dǎo)型(i)NOS。前兩種形式是組成型表達，而且是Ca2+依賴性的。誘導(dǎo)型(i)NOS不依賴于Ca2+。這3種形式的NOS是由7，12以及17染色體上的3個不同基因編碼18，26，37，54。一般說來，n-和e-NOS取決于胞內(nèi)鈣的瞬時濃度，并且在nM范圍內(nèi)釋放NO，而iNOS則在一個誘導(dǎo)/潛伏期后以μM范圍在持續(xù)時間內(nèi)釋放NO18，26，28，37，56，57，70，105，109。組成型和誘導(dǎo)型NOS的存在表明它們可能具有不同的功能。
可以根據(jù)見到NO水平增加所需的時間長度以及這些升高的水平能夠維持的時間長度鑒別c-和i-NOS。來自cNOS的NO可能以兩種功能型存在第一個是始終以低“調(diào)”或“基礎(chǔ)”的水平存在；這個基礎(chǔ)水平可響應(yīng)某些信號而被短暫地略微增強，如乙酰膽堿(ACH)56。cNOS來源的NO這種暫時增強的釋放具有深遠的生理作用，在NO已經(jīng)回到了基礎(chǔ)水平之后這種作用還會延續(xù)明顯較長的一段時間50。例如，短暫暴露于嗎啡和eNOS的內(nèi)皮細胞其形狀會從細長變?yōu)閳A形，該過程會持續(xù)數(shù)個小時50。
iNOS可由多種信號分子誘導(dǎo)，如促炎癥細胞因子(proinflammatorycytokines)。i-NOS的誘導(dǎo)通常在3-4小時的延遲后觀察到；iNOS能夠產(chǎn)生NO24-48小時73，105。這些數(shù)據(jù)表明NO始終存在，并且NO的水平可根據(jù)生物體的需求被迅速或者緩慢地調(diào)控。存在的不同調(diào)控過程意味著NO具有不同的功能，并且/或者NO的水平必須漸進性地增加，以發(fā)揮其功能。
NO作為血管、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)的信號分子發(fā)揮作用，還具有通常的抗菌、抗病毒作用，能夠下調(diào)促炎癥作用(proinflammatory events)38-39，41-42，60，90，105-106。在血管和免疫系統(tǒng)中，免疫應(yīng)答中的一個關(guān)鍵階段是白細胞經(jīng)內(nèi)皮募集并活化。內(nèi)皮對白細胞的活化作用是分階段發(fā)生的。初始階段是將這些白細胞吸引到內(nèi)皮。然后增強白細胞的附著作用并改變形狀，最后遷移越過內(nèi)皮90。隨著這些細胞的變化，調(diào)控著細胞基質(zhì)相互作用的分子的合成作用也按時變化3，46，52，87。
通常未活化的白細胞沿著內(nèi)皮滾動(roll)。這兩種細胞類型之間的相互作用并不牢固，且是可逆的，由被稱為選擇素的粘附分子家族介導(dǎo)。白細胞的活化作用是響應(yīng)幾種趨化劑的釋放而發(fā)生的，所述趨化劑包括白細胞三烯(leukotriene)B4和白介素8(IL-8)。在存在這些物質(zhì)的情況下，免疫細胞停止?jié)L動(roll)，成為“活化的”它們開始變平并以更高的強度粘附到內(nèi)皮的內(nèi)層?；罨饔檬怯杀唤凶稣纤氐恼掣椒肿蛹易褰閷?dǎo)，如ICAM-1和VCAM-1。存在PECAM-1時，粘附的免疫細胞能夠貫穿內(nèi)皮而轉(zhuǎn)移3，46，52，87。這種免疫細胞-內(nèi)皮的相互作用可被NO下調(diào)。NO會抑制血小板和嗜中性粒細胞的聚集作用并能夠減低白細胞及內(nèi)皮細胞的粘附和活化作用水平41，1，50，109。NOS抑制劑能增強血小板的粘附作用并提高白細胞的粘附作用72，82。于神經(jīng)系統(tǒng)免疫應(yīng)答的小神經(jīng)膠質(zhì)細胞中NO發(fā)揮類似的作用83-84。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的獨特之處在于它可利用NOS的所有三種同種型(isoforms)產(chǎn)生NO。在正常的CNS中發(fā)現(xiàn)了e-和n-NOS組成型同種型；但是在健康CNS中并不表達iNOS20。病理狀態(tài)，如菌髓(trama)，腦缺血和神經(jīng)元疾病會升高e-和nNOS的水平并誘導(dǎo)iNOS的活性21。通過抑制NF-κB對促炎癥細胞因子的活化作用，cNOS來源的NO能夠下調(diào)促炎癥作用。
NO可上調(diào)幾種參與免疫調(diào)節(jié)的酶， 包括中性內(nèi)肽酶(endopeptidese)24.11(CALLA，急性成淋巴細胞白血病抗原，腦啡肽酶(enkephalinase))或CD1076。因此cNOS來源的NO可刺激那些加工蛋白質(zhì)基因產(chǎn)物的酶，暗示在涉及NO的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程和天然存在的抗菌肽之間存在聯(lián)系。NO控制并調(diào)節(jié)負責(zé)釋放這些具有前活性(proactive)保護性功能的重要分子的酶101。
還有證據(jù)表明NO在神經(jīng)遞質(zhì)釋放中發(fā)揮作用102。嗎啡和cNOS來源的NO可釋放來自大鼠腦碎片的生長激素和ACTH；這些神經(jīng)肽與壓力應(yīng)答有關(guān)。因此，NO涉及血管舒張、抗菌和抗病毒的應(yīng)答、信號分子釋放和免疫細胞粘附到內(nèi)皮的抑制作用。
似乎低調(diào)(tonal)或基礎(chǔ)水平的NO也會發(fā)揮顯著的生理學(xué)作用。來自非胰島素依賴的糖尿病患者的內(nèi)皮沒有表現(xiàn)出低調(diào)水平的NO117，在這些個體中血管病導(dǎo)致殘疾并最終死亡14。許多研究人員將血管病部分地歸因于eNOS來源的NO的變化，有些研究人員推測其可能是由于生成的自由基有所增高59?；A(chǔ)NO水平的降低還可能會增強血小板作用，導(dǎo)致各種神經(jīng)病變(neuropathies)32，68。
因此，看來tonal或基礎(chǔ)水平的NO在限制神經(jīng)、免疫及脈管組織的激發(fā)度方面十分重要。這種tonal NO可通過影響經(jīng)由NF-κB的粘附介導(dǎo)過程而證明它本身。雌激素也可以通過這種過程發(fā)揮有益的血管保護作用，因為它也釋放cNOS來源的NO70，99。在哺乳動物內(nèi)皮細胞上發(fā)現(xiàn)的大麻素(cannabinoid)CB1受體類型118，119以及在人血管內(nèi)皮細胞上發(fā)現(xiàn)的μ鴉片受體鞏固了這種假設(shè)(已經(jīng)描述了細胞表面阿片樣物質(zhì)受體的三種常見種類(κ，δ和μ)。
對嗎啡顯示出高結(jié)合特異性的受體已被指定為μ阿片樣物質(zhì)受體)。詳細分析顯示存在多種μ阿片樣物質(zhì)受體亞型。在1999年5月20日公開的PCT專利出版物WO99/24471中詳細公開了編碼不同μ受體的分離核酸序列和含有μ受體(本文稱之為″μ3阿片樣物質(zhì)受體″)的多肽。
還可參見，μ3分子鑒定和功能性的表達，一種新的替代性人μ阿片接受基因剪接變體。
因此，促進NO以正?；蚵晕⒃鰪姷乃缴煽赡芫哂兄匾慕】狄饬x。公知多種植物具有促進健康的效果，但在分子水平上很少了解如何促進以及為什么會促進。參見Stefano和Miller，動物細胞和它們攝取的植物營養(yǎng)之間的關(guān)系植物-動物從屬性以及信號傳導(dǎo)(綜述)，Intl J Mol Medicine 10413-21(2002)，并入本文作為參考。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及從不同植物中提取的一氧化氮(NO)刺激提取物。這種提取物含有被稱為healthinI和healthinII的化合物。本發(fā)明具體提供部分純化的具有NO刺激活性的植物提取物，分離和部分純化這種植物提取物的方法。另外，本發(fā)明還提供用于治療那些需要改進NO細胞水平的疾病和病癥的方法和物質(zhì)，例如與炎癥有關(guān)的疾病和病癥。
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)通過對某些植物品種進行提取和化學(xué)分析鑒定得到一類物質(zhì)，該物質(zhì)能夠在哺乳動物細胞和組織內(nèi)刺激產(chǎn)生NO。這種NO刺激劑會在培養(yǎng)的哺乳動物血管內(nèi)皮細胞和/或神經(jīng)元細胞中刺激產(chǎn)生組成型一氧化氮合酶。
因此，本發(fā)明提供分離自植物組織和材料的活性化學(xué)物質(zhì)，其可刺激足神經(jīng)節(jié)(pedal ganglia)和人內(nèi)皮細胞產(chǎn)生一氧化氮。來自下列任何植物的部分純化的提取物含有不同數(shù)量的該活化物質(zhì)。
另外，本發(fā)明提供用于鑒定具有NO刺激活性的來自其它植物的額外植物性NO刺激物質(zhì)的方法和材料，以及可用于治療需要改善NO細胞水平的疾病和病癥的方法和材料。
本發(fā)明的這些植物性物質(zhì)還可表征為具有(i)刺激足神經(jīng)節(jié)細胞中一氧化氮在15nM到100nM范圍內(nèi)釋放的能力；
(ii)刺激內(nèi)皮細胞中一氧化氮在50nM到100nM范圍內(nèi)釋放的能力；(iii)在10nM氯化鈉，0.5 mM EDTA，100mM乙酸鈉和50％乙腈，pH 5.0條件下，高效液相色譜層析圖譜上具有單一主峰。
本發(fā)明的NO刺激植物性物質(zhì)可以進一步具有以下特征水溶性的，具有約50到約5000道爾頓，或約50到約2500道爾頓，或約50到約1000道爾頓之間，或約50到約500道爾頓的分子量。
本發(fā)明的植物性物質(zhì)可從以下植物提取冰草屬(Agropyrumspp.)，白柳(Salix alba)，鴉蔥(Allium vineale)，皺葉歐芹(Petroselinium crispum)，藥用蒲公英(Taraxacum officinale)，芝麻(Sesamum indicum)，苜蓿屬(Medicago spp.)，卡瓦胡椒(Pipermethysticum)，春黃菊屬(Anthemis spp.)，達迷草(Turnera diffusa)，Verbascum densiflorum，羅勒屬(Ocimum spp.)，竹芋(Marantaarundinaceae)，芫荽(Coriandrum Sativum)，狹葉青蒿(Artemesiadracunculus)，薰衣草(Lavendula augustifolia)，唇萼薄荷(Menthapulegium)，積雪草(Centella asiatica)，銀杏(Ginko biloba)和葡萄(Vitus vinifera)。
因此，本發(fā)明一方面是由至少一種下述植物的低分子量水溶性提取物構(gòu)成的藥物組合物鴉蔥，白柳，冰草屬，皺葉歐芹，藥用蒲公英，芝麻，苜蓿屬，卡瓦胡椒，春黃菊屬，Verbascum densiflorum，羅勒屬，竹芋，芫荽，狹葉青蒿，薰衣草，唇萼薄荷，積雪草，銀杏和葡萄，該提取物能夠刺激哺乳動物細胞產(chǎn)生一氧化氮。這些物質(zhì)還可表征為具有刺激足神經(jīng)節(jié)細胞中一氧化氮在15nM到100nM范圍內(nèi)釋放的能力和/或具有刺激內(nèi)皮細胞中一氧化氮在50nM到100nM范圍內(nèi)釋放的能力。這些提取物的特征還在于除去那些分子量大于5000道爾頓后的組分，即只含有50到5000道爾頓范圍內(nèi)的低分子量水溶性組分。更優(yōu)選除去大于2500道爾頓的組分而包含約50到約2500道爾頓范圍內(nèi)的水溶性組分。最優(yōu)選除去大于1000道爾頓的組分而包含約50到約1000道爾頓范圍內(nèi)的水溶性組分。特別優(yōu)選的提取物具有約50到約500道爾頓范圍內(nèi)的水溶性組分。這些提取物還可具有下述特征在10nM氯化鈉，0.5mM EDTA，100mM乙酸鈉和50％乙腈，pH 5.0條件下，高效液相色譜層析圖譜上具有單一主峰。
這些提取物可以根據(jù)已知的方法和技術(shù)，例如在Remington的Pharmaceutical Sciences，A.R.Gennaro，ed.，Mack Publ.Co.Easton，PA，1985所述被干燥并制成藥物組合物的形式，包括粉末，藥片，poltices，軟膏，乳膏劑，膏藥，膠囊劑等等，可含有或者不含有藥學(xué)可接受的賦形劑和/或助劑。
本發(fā)明另一方面提供一種用于鑒定和分離來自上面所列的至少一種植物的低分子量提取物的方法，該提取物具有在哺乳動物細胞中NO刺激活性。
本發(fā)明另一方面提供一種來自上面所列的至少一種植物的低分子量提取物的使用方法，該提取物顯示出在哺乳動物細胞中NO刺激活性。
本發(fā)明另一方面是制備來自上述所列至少一種植物的NO刺激提取物的方法，該方法是通過制備水提取物而實現(xiàn)，該水提取物具有約50到約5000道爾頓，或約50到約2500道爾頓，或約50到約1000道爾頓，或約50到約500道爾頓分子量的水溶性組分。
根據(jù)以下詳細說明、附圖和權(quán)利要求可以更加明確地了解本發(fā)明的其他特點和優(yōu)點。


圖1是實施例1中所述的冰草(wheat grass)提取物的HPLC色譜圖。
圖2是實施例2中所述的白柳樹皮提取物的HPLC色譜圖。
圖3是實施例3中所述的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)打印圖。
圖4是實施例4中所述的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)打印圖。
圖5和圖6說明如在實施例5中所述的冰草屬植物提取物對足神經(jīng)節(jié)和內(nèi)皮細胞的刺激結(jié)果。
圖7和圖8說明實施例6所述的白柳提取物對足神經(jīng)節(jié)和內(nèi)皮細胞的刺激結(jié)果。
圖9說明實施例7所述的藥用蒲公英(Taracum officinale)提取物對足神經(jīng)節(jié)細胞的刺激結(jié)果。
圖10說明實施例8所述的葡萄(Vitus)提取物對足神經(jīng)節(jié)細胞的刺激結(jié)果。
詳細說明本發(fā)明提供分離自植物組織和材料的活性化學(xué)物質(zhì)，其可刺激足神經(jīng)節(jié)和人內(nèi)皮細胞產(chǎn)生一氧化氮。來自下列任一植物的低分子量水溶性提取物含有不同數(shù)量的能夠刺激產(chǎn)生NO的活性化學(xué)物質(zhì)。另外，本發(fā)明提供用于鑒定和分離具有NO刺激活性的來自其它植物的額外NO刺激植物性物質(zhì)的方法和材料，以及可用于治療需要改善NO細胞水平的疾病和病癥的方法和材料。
本發(fā)明的植物性提取物的特征還在于具有(iv)刺激足神經(jīng)節(jié)細胞中一氧化氮在15nM到100nM范圍內(nèi)釋放的能力；(v)刺激內(nèi)皮細胞中一氧化氮在50nM到100nM范圍內(nèi)釋放的能力；和/或(vi)在10nM氯化鈉，0.5mM EDTA，100mM乙酸鈉和50％乙腈，pH 5.0條件下，高效液相色譜層析圖上具有單一主峰。
本發(fā)明的NO刺激植物性物質(zhì)特征還在于水溶性的，具有約50到約5000道爾頓，或約50到約2500道爾頓，或約50到約1000道爾頓，或約50到約500道爾頓的分子量。
本發(fā)明的提取物可從選自下述的植物中分離鴉蔥，白柳，冰草屬，皺葉歐芹，藥用蒲公英，芝麻，苜蓿屬，卡瓦胡椒，春黃菊屬，達迷草，Verbascum densiflorum，羅勒屬，竹芋，芫荽，狹葉青蒿，薰衣草(Lavendula augustifolia)，唇萼薄荷，積雪草，銀杏和葡萄。
為獲得活性組分而進行的分離和提取的方法包括在酸性溶液中勻漿干燥的植物材料，然后醇抽提并離心用于過濾分離固體物料。干燥上清液，然后溶于含有三氟乙酸的水溶液中，再經(jīng)歷固相抽提。收集洗脫液，用高效液相層析法進一步純化。
可通過質(zhì)譜分析進一步鑒定并表征提取的活性組分。
本發(fā)明的NO刺激性植物性物質(zhì)的鑒定方法包括在酸性溶液中勻漿干燥的植物材料，然后醇抽提并離心用于過濾分離固體物料。干燥上清液，然后溶于含有三氟乙酸的水溶液中，再經(jīng)歷固相抽提。收集洗脫液并用高效液相層析法進一步純化，通過質(zhì)譜分析鑒定該提取的低分子量NO刺激劑。
這些提取物可用于制備治療抗微生物感染的藥物組合物，例如哺乳動物特別是人中的細菌性感染和病毒性感染，及哮喘和/或其它炎癥病癥。
如下所述，該提取物顯示出抗菌、抗炎癥和抗癌的效果。因此，含有這種提取物的藥物組合物能夠用于治療需要抗菌、抗炎癥或抗癌效果的不同疾病和病癥，例如微生物感染?；蛘撸景l(fā)明的藥物組合物可以用作預(yù)防劑。為了將該提取物形成藥物組合物，可以根據(jù)眾所周知的方法和技術(shù)，例如在Remington的Pharmaceutical Sciences，A.R.Gennaro，ed.，Mack Publ.Co.Easton，PA，1985所述將其單獨或以不同組合干燥，并形成藥物組合物，包括粉末，藥片，poltices，軟膏，乳膏劑，膏藥、膠囊劑等等，可含有或者不含有藥學(xué)可接受的賦形劑和/或助劑。
下面的實施例進一步描述了本發(fā)明，但并不是限制權(quán)利要求所述的范圍。
在實施例中，除非另作說明，該植物提取物均由植物的葉片制成。
具體實施例方式
實施例實施例1.從冰草(Wheat Grass)提取Healthin I。
在1N HCl(0.5g/ml)中勻漿1克干燥的冰草種植物(冰草屬)。所獲的勻漿液用5ml氯仿/異丙醇9∶1萃取。在室溫下放置5min后，以3000rpm離心勻漿液15min。收集上清液并用Centrivap Console(Labconco，Kansas City，MO)干燥。然后將干燥的提取物溶于0.05％三氟乙酸(TFA)水中，然后固相提取。樣品上樣于已用100％乙腈活化并用0.05％TFA-水清洗的Sep-pak Plus C-18柱上(Waters，Milford，MA)上樣。用10％乙腈溶液(水/乙腈/TFA，89.5％10％0.05％，v/v/v)進行嗎啡洗脫。用Centrivap Console干燥該洗脫樣品并溶于水，然后在高效液相層析法分析(HPLC)。
用Waters 626泵(Waters，Milford，MA)，在C-18 Unijet微孔柱(BAS，West Lafayette，IN)上進行乙腈梯度反相HPLC分析。使用0.025g干重上述冰草的提取物。流動相是緩沖液A10mM氯化鈉，0.5mM EDTA，100mM乙酸鈉，pH 5.0；緩沖液B10mM氯化鈉，0.5mM EDTA，100mM乙酸鈉，50％乙腈，pH5.0。以1/9的分流比，利用流式分離機(BAS)獲得該微孔柱需要的低容積流量。以0.5ml/min運轉(zhuǎn)該泵，形成大約50μl/min的微孔柱流速。注射體積是5μl。運行條件是0min 0％緩沖液B；10min，5％緩沖液B；25min，50％緩沖液B；30min，100％緩沖液B。兩種緩沖液均通過Waters 0.22μm過濾器過濾，該系統(tǒng)的溫度維持在25℃。從冰草提取的活性物質(zhì)(Healthinl)具有15.8min的滯留時間(參見圖1上的箭頭)。在5次提取物中均重復(fù)該結(jié)果。在運行5次樣品的各樣品之間運行幾個空白，以防止洗脫的活性組分殘留在層析中。
用電流檢測器LC-4C(BAS)進行活性組分檢測。將微孔柱直接連接到檢測室以最小化無用容積。該電化學(xué)檢測系統(tǒng)使用玻璃碳-工作電極(3mm)和0.02 Hz濾波器(500mV；range10nA)。室體積(cell volume)減少了16μm襯片(gasket)。通過Waters Millennium chromatographyManager V3.2軟件控制層析系統(tǒng)，用色譜儀軟件(Waters)整和色譜圖。從峰面積推斷濃度。5種樣品中的平均濃度為1μg/gm干重。測定之間運行的空白沒有顯示攜帶殘余。收集5個運行的每一個的洗脫液，干燥并應(yīng)用在如下所述的NO組織試驗中。結(jié)果在圖1中說明。
純化的另一方法是通過甲醇提取然后按下述在Spherisorb柱上HPLC純化。在50％甲醇、50％凈化水中勻漿1克冰草屬冰草，50％甲醇萃取，真空干燥。樣品儲藏在-20℃。用雙溶劑系統(tǒng)進行HPLC純化緩沖液A由下述組成10mM 1-庚烷磺酸鈉鹽和10mM磷酸二氫鈉水，pH 3；緩沖液B由下述組成10mM 1-庚烷磺酸，鈉鹽和10mM磷酸二氫鈉，50％甲醇。注射體積是10微升。運行條件是0-10min，50％緩沖液B；10-20min，緩沖液B從50％增加到100％；25min，100％緩沖液B；35min，50％緩沖液B。試樣注射之后0到30分鐘內(nèi)收集級分。真空干燥收集的級分并儲藏在-20℃。從冰草提取的活性物質(zhì)具有16min的滯留時間(參見圖1a上的箭頭)。
實施例2.從白柳樹皮中提取Healthin II。
用0.02克(干重)白柳(Salix alba)的白柳樹皮進行同樣的過程，從白柳樹皮中提取的活性物質(zhì)(Healthin2)滯留時間為16.50min。5種樣品中的平均濃度為0.3μg/gm干重。參見圖2。
實施例3.質(zhì)譜鑒定來自冰草屬的活性物質(zhì)在Micromass Q-TOF系統(tǒng)(Micromass，UK)中，按下述使1/100微升含有NO釋放活性的來自上面實施例1所述最初純化過程的HPLC級分進行毫微電噴霧(nano electrospray)電離雙四極正交加速度飛行時間質(zhì)譜分析法(Q-TOF-MS)。將1μl含有樣品的乙腈(acetonitril)/水/甲酸(50∶49∶1，v/v/v)上樣到鍍金涂層的毛細管MicromassF型針中。以30nl/min的流速噴灑樣品，在MS質(zhì)譜過程中指定延長的分析時間并獲得幾個MS/MS質(zhì)譜。在MS/MS或串聯(lián)的質(zhì)譜測定法過程中，通過碰撞-誘導(dǎo)的解離(CID)從選定前體離子形成了碎片。
因為并非所有的離子碎片都具有相同的效率，所以碰撞能量通常在20到35V之間變化，因此母離子破碎為足夠數(shù)目的不同子代離子。針電壓(Needle voltage)設(shè)置為950而錐形電壓(cone voltage)設(shè)置為25。該儀器以陽性模式運轉(zhuǎn)。結(jié)果在圖3中說明。從冰草樣品分離和純化的活性物質(zhì)Healthin I，在353.28和119.05道爾頓產(chǎn)生主要信號。
實施例4.質(zhì)譜鑒定來自白柳的活性物質(zhì)用1克白柳的白柳樹皮進行實施例3中的相同過程。該結(jié)果如圖4所示。從白柳樹皮樣品分離和純化的活性物質(zhì)Healthin II，在353.28和192.15，109.09和97.1道爾頓產(chǎn)生主要信號。
實施例5.冰草屬提取物在足神經(jīng)節(jié)和內(nèi)皮細胞中的NO刺激作用將十種解剖自活體動物的Mytilus edulis足神經(jīng)節(jié)置于帶有990μl磷酸鹽緩沖液(PBS)的1.5ml Eppendorf管中。4℃下在PBS中洗滌培養(yǎng)的人靜脈內(nèi)皮細胞(ATCC#；CRL 1730)。該靜脈內(nèi)皮細胞被分為大約106細胞的各組，置于4℃下的990μl PBS中。如上面所述用HPLC純化1克冰草屬的冰草，收集并干燥相應(yīng)于Healthin1滯留時間的級分。然后該級分在20μl PBS中重組(reconstituted)。向含有神經(jīng)節(jié)或內(nèi)皮細胞或僅僅PBS(對照)的管中加入10μl。使用備有200μM傳感器的分離的一氧化氮測量計Mark II(World PrecisionInstruments，Sarasota，F(xiàn)L)測定NO產(chǎn)量。如果在僅僅含有PBS的管中檢測到反應(yīng)，則從含有組織樣品的管中所檢測到的數(shù)量值中減去該數(shù)量。
該結(jié)果如圖5和6所示。足神經(jīng)節(jié)管的細胞釋放了17nM NO(圖5)，人內(nèi)皮細胞釋放了91nM NO(圖6)。對照管中加入的相同體積產(chǎn)生了＜3nM的NO產(chǎn)量。
實施例6.白柳提取物在足神經(jīng)節(jié)和內(nèi)皮細胞中的NO刺激作用用1毫克來自實施例2從白柳樹皮純化的物質(zhì)進行上面實施例5所述的過程。該結(jié)果如圖7和8所示。足神經(jīng)節(jié)管的細胞釋放了19nMNO(圖7)，人內(nèi)皮細胞釋放了87nM NO(圖8)。加入到對照管的相同體積產(chǎn)生了＜3nM的NO產(chǎn)量。
實施例7.不同種植物的NO釋放分析使用上述分離和純化技術(shù)，分析各種草本植物在足神經(jīng)節(jié)和公眾可獲得的SK-N-MC(ATCC#HBT-10)和PC-12(ATCC#CRL1721)細胞中釋放cNOS來源一氧化氮的能力。這些結(jié)果列于下面表I，II和III。在表I中，加號表示檢測到至少1nM一氧化氮。負號表示未檢出或檢測出小于1nM一氧化氮。在表II中，列出了SK-N-MC細胞系中的結(jié)果；標明了所用的植物材料濃度和檢測的NO數(shù)量。在表III中，列出了使用神經(jīng)節(jié)細胞系進行相同過程的結(jié)果。標明了所用的植物材料類型，例如花，葉片，根，根莖，莖，樹皮。未標明的則使用了葉片。圖9顯示一個示范性的結(jié)果。
表I.用各種植物提取物處理的神經(jīng)節(jié)，SK-N-MC和PC-12細胞的NO測定數(shù)據(jù)，空白顯示在該細胞系中未測試植物。神經(jīng)節(jié) SK-N-MC PC-12

表II.用各種植物提取物處理的SK-N-MC細胞的NO測定數(shù)據(jù)

*Quercetine(獲自Sigma Chemicals)是在多種植物特別在果實中發(fā)現(xiàn)的一種植物黃烷類(flavanoid)。
表III.用各種植物提取物處理的神經(jīng)節(jié)細胞的NO測定數(shù)據(jù)

實施例8.葡萄皮提取物和NO釋放將葡萄的十克(濕重)黑色葡萄皮置于帶有15ml甲醇或乙醇和水的1∶1混合物的50ml Falcon管中。在室溫下過夜振蕩該管，將所獲提取物分為等分試樣，1ml每管，分到十二個1.5ml Eppendorf管中。在speedvac中蒸干該管然后在1ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中重組。用10μg該溶液處理無脊椎動物神經(jīng)組織足神經(jīng)節(jié)(參見上面實施例5)，用測量NO的特定電流探針實時測定NO釋放量。甲醇中提取的葡萄皮在處理15秒鐘之內(nèi)引起NO的釋放(參見圖10)，而在乙醇提取中的葡萄皮則沒有(在相同時限內(nèi))。當(dāng)該提取物(甲醇或者乙醇提取的)僅僅加入到PBS中時未觀察到NO釋放。
實施例9.提取物對細胞的抗微生物效果測試在上面實施例1中制備的冰草提取物和白柳樹皮提取物的1∶1干燥粉末狀混合物制劑在培養(yǎng)物中抑制細菌繁殖的能力。在10ml LB肉湯(Amersham Biosciences，Inc.)中重組制劑。然后將E.coli細菌接種到肉湯并在37℃孵育5和24小時。在LB瓊脂平板上劃線接種20μl該培養(yǎng)物并在37℃過夜孵育。同對照相比(單獨的LB肉湯)，在5和24小時細菌培養(yǎng)物中沒有觀察到生長。
用已知的抗菌劑SNAP進行附加的對照實驗。將1μg/ml SNAP加入LB肉湯中。然后將E.coli細菌接種到肉湯并在37℃孵育5和24小時。在LB瓊脂平板上劃線接種20μl該培養(yǎng)物并在37℃過夜孵育。同對照相比，在5和24小時的SNAP培養(yǎng)物中細菌繁殖有所減少。
該實驗表明本發(fā)明的冰草/白柳提取物比已知的抗菌劑SNAP表現(xiàn)出更高的抗菌活性。
實施例10.提取物對SK-N-MC細胞的抗癌癥效果用在RPMI培養(yǎng)基中的0.005g/ml大蒜(鴉蔥)或者歐芹(Petroselinium crispum)提取物孵育SK-N-MC細胞兩天。然后用臺盼藍指示劑(Invitrogen Corp.)染色該細胞并以200X在研究顯微鏡下觀察。健康的細胞不會允許指示劑進入細胞壁，而變藍的細胞是已死或?qū)⑺赖募毎驗樵噭┮呀?jīng)進入細胞質(zhì)。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，大蒜和歐芹的兩種處理細胞顯示幾乎100％的細胞是死細胞。用1N的毛蕊花(Verbascum densiflorum)，卡瓦胡椒(Piper methysticum)，甘菊(春黃菊屬)和達迷草(Turnera diffusa)溶液觀察到了類似的結(jié)果。制備其它植物提取物并以類似方式測試，能夠在SK-N-MC細胞中誘導(dǎo)細胞死亡的是Bilberry(Vaccinium myrtillus)，Enchinaceaepurpurae，大蒜(鴉蔥)，Goldenseal(Hydrastis candensis)，歐芹(Petroselenium crispum或C.petroselenium)，Paul d’arco bark(Tabebuia impetiginosa)，迷迭香(Rosmarinus officinalis)，滑榆(Ulmus rubra或加州滑榆)以及白柳樹皮(白柳)。大蒜和歐芹具有最強烈的抗癌癥效果。
制備植物提取物并以同樣方式測試，在SK-N-MC細胞中沒有表現(xiàn)出抗癌癥效果的包括懸鉤子(懸鉤子屬)，辣薄荷(辣薄荷)，Shavegrass(Equisetum hyemale)，玉米穗絲(玉蜀黍花)，蒲公英(藥用蒲公英)，苜蓿(苜蓿屬)，百里香(Thymus屬)和滑榆(Ulmus rubra和加州滑榆)。
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權(quán)利要求
1.一種用于刺激哺乳動物細胞中一氧化氮產(chǎn)生的藥物組合物，所述組合物含有有效量的植物水溶性提取物，所述植物為冰草屬(Agropyrum spp.)。
2.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述提取物具有刺激在足神經(jīng)節(jié)細胞中一氧化氮在15nM到100nM范圍內(nèi)釋放的能力。
3.權(quán)利要求1的藥物組合物，其中所述提取物具有刺激在內(nèi)皮細胞中一氧化氮在50nM到100nM范圍內(nèi)釋放的能力。
4.權(quán)利要求2的藥物組合物，其中所述提取物含有分子量為約50-約5000道爾頓的水溶性組分。
5.權(quán)利要求3的藥物組合物，其中所述提取物含有分子量為約50-約500道爾頓的水溶性組分。
6.權(quán)利要求4的藥物組合物，還可表征為在10nM氯化鈉，0.5mMEDTA，100mM乙酸鈉和50％乙腈，pH5.0條件下，高效液相色譜層析圖譜上具有單一主峰。
7.權(quán)利要求5的藥物組合物，還可表征為在10nM氯化鈉，0.5mMEDTA，100mM乙酸鈉和50％乙腈，pH5.0條件下，高效液相色譜層析圖譜上具有單一主峰。
8.冰草屬的提取物在制備用于治療哺乳動物炎癥的藥物中的用途。
9.冰草屬的提取物在制備用于治療哺乳動物細菌性感染的藥物中的用途。
10.冰草屬的提取物在制備用于治療哺乳動物病毒感染的藥物中的用途。
11.冰草屬的提取物在制備用于治療哺乳動物哮喘的藥物中的用途。
12.能夠在哺乳動物細胞中刺激NO產(chǎn)生的冰草屬的植物材料的低分子量水提取物的制備方法，包括(a)在水和酸中勻漿冰草屬的植物部分，形成勻漿液；(b)用氯仿和醇的混合物抽提所述勻漿液；(c)離心抽提的勻漿液；(d)對上清液進行固相提取以洗脫低分子量組分。
13.權(quán)利要求12的方法，其中提取物被干燥并制成粉末。
14.權(quán)利要求12的方法，其中植物部分包括葉子，花，樹皮或根莖。
15.用于治療哺乳動物細菌性感染、病毒感染、哮喘和/或炎癥的藥物組合物，所述組合物包含有效量的在藥學(xué)可接受載體中的冰草屬的提取物，其制備方法包括(a)勻漿冰草屬植物部分；(b)從所述冰草屬植物部分制備提取物；以及(c)從所述提取物中基本上去掉分子量大于約5000道爾頓的組分。
16.權(quán)利要求15的組合物，其中植物部分包括葉片、花、樹皮或根莖。
全文摘要
本發(fā)明涉及從多種植物中提取的一氧化氮(NO)刺激作用提取物。這種提取物含有被稱為healthin I和healthin II的化合物。本發(fā)明具體提供部分純化的具有NO刺激活性的植物提取物，分離和部分純化這種來自植物材料的提取物的方法。另外，本發(fā)明還提供用于治療那些需要改進NO細胞水平的疾病和病癥的方法和物質(zhì)，例如與炎癥有關(guān)的疾病和病癥。
文檔編號A61P31/04GK1951411SQ20061014857
公開日2007年4月25日 申請日期2003年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月23日
發(fā)明者G·B·司提法諾, W·朱, K·曼緹尼 申請人:紐約州立大學(xué)研究基金會